PEWARNAAN BAKTERII. TUJUAN Mengetahui apa itu pewarnaan sederhana dan differensial Mengetahui cara pewarnaa sederhana dan diferensial

II. LANDASAN TEORIMikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Jimmo, 2008).Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang, 2003)Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Rizki, 2008).

Langkah-langkah utama teknik pewarnaan adalah1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial, pengecatan khusus (struktural)dan pengecatan negatif.1. Pewarnaan sederhanaPewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

2. Pewarnaan differensial Pewarnaan diferensial merupakan pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna, dan merupakan prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe. Pewarnan diferensial dibagi menjadi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. a. Pewarnaan GramPewarnaan Gram adalah suatu tehnik untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu : Zat warna utama (violet kristal) Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri.

b. Pewarnaan Tahan Asam Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA).Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen.(anonymous,2009)

3. Pewarnaan khusus Pewarnaan khusus adalah pewarnaan untuk melihat struktur tertentu bakteri : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul.

Pewarnaan SporaSpora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan.Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium .Prinsip kerja:Spora kuman mempunyai dinding yang tebal sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar zat warna fuchsin dapat masuk, dengan pencucian pori-pori kembali mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue.Pewarnaan flagel Flagel merupakan komponen tambahan dari sel yang menyerupai benang, terdiri dari protein Flagelin. Dikenal 4 jenis flagel : Monotrikh, flagel tunggal pada salah satu ujung, missal : Vibrio sp. Lofotrikh, terdapat 1/lebih flagel disalah satu ujung , Alcalingenes sp Amfitrikh, terdapat 1/lebih flagel di kedua ujung, cth: Alcalingenes sp Peritrikh, flagel terbesar diseluruh badan kuman, cth: Pruteus vulganis

Flagel merupakan organel sel yang tidak dapat dilihat dengan pewarnaan biasa. Untuk itu pewarnaan khusus atau dengan mikroskop electron. Salah satu pewarnaan yang digunakan untuk melihat flagel adalah pewarnaan Gray serta beberapa pewarnaan lain diantaranya pewarnaan Novel, Zattnow, dan Fontana-Tribondeau dengan menggunakan impregnasi Ag.

Pewarnaan kapsulPewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri pewarnaan Neisser (granula volutin) pewarnaan yodium (granula glikogen).5. Pewarnaan negatif Pewarnaan negatif dilakukan untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta (Treponema, Leptospira dan Borrelia)Cara pewarnaan negatif- Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskopMetode pewarnaan negatif ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat negrosin dan tinta cina.Pewarna negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin. Pewarna asam memeiliki negative charge kromogen, tidak akan menembus atau berpenetrasi kedalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. Oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.

III. PRINSIP KERJA1. Pewarnaan sederhanaMengoleskan suspensi bakteri diatas objek glas (membuat sediaan) dan melakukan pewarnaan dengan safranin selama 1menit, keringkan dan amati dibawah mikroskop2. Pewarnaan diferensialMembuat sediaan dan melakukan pewarnaan dengang pewarnaan gram (pengecatan gram, keringkan dan amati dibawah mikroskop

IV. ALAT DAN BAHAN1. Alat Objek glas Ose tumpul Mikroskop Lampu bunsen dan korek api

2. Bahan Koloni bakteri (padat dan cair) Pz Pewarna gram Safranin Oil imersi Tissue

V. CARA KERJA1. Pewarnaan sederhana (pada koloni bakteri padat) Fiksasi objek glas dengan lampu bunsen Teteskan pz diatas objek glas secukupnya Ambil koloni bakteri dengan ose yang telah dipanaskan Oleskan sampai diameter lk.1 cm Fiksasi dengan bunsen / Keringkan dengan bunsen dengan mengangin-anginkannya Cat dengan safranin Tunggu Bilas/cuci dengan air mengalir, dengan menggenangkannya sehingga merata cat tidak menumpuk disatu tempat yang akan menyulitkan pengamatan Keringkan dengan angin atau bisa dengan tissue Amati dibawah mikroskop dimulai dari perbesaran objektif 10 sampai 100 (tambah oil imersi)2. Pewarnaan diferensial (pada koloni bakteri cair) Fiksasi objek glas dengan lampu bunsen panaskan ose Ambil koloni bakteri dengan ose yang telah dipanaskan (tunggu dingin) Oleskan sampai diameter lk.1 cm Fiksasi dengan bunsen / Keringkan dengan bunsen dengan mengangin-anginkannya di atasnyala Cat dengan gram 1 (gention violet/kristal violet), tunggu 1 menit lalu bilas/cuci Cat dengan gram 2 (lugol/iodin), tunggu 1 menit lalu bilas/cuci Cat dengan gram 3 (alkohol), tunggu 30 detik lalu bilas/cuci Cat dengan gram 4 (safranin), tunggu 1 menit Cuci/bilas dengan air mengalir Keringkan dengan angin/penganginan atau dengan tissue Amati dibawah mikroskop dimulai dari perbesaran objektif 10 sampai 100 (tambah oil imersi)

VI. PEMBAHASANPada praktikum ini dilakukan pengecatan / pewarnaan bakteri dengan tehnik pewarnaan sederhana dan deferensial (pewarnaan gram). Pada tehnik pengecatan/pewarnaan sederhana, dilakukan dengan pewarna safranin dengan sampel koloni bakteri cair (stphilococcus) dan pada pewarnaan deferensial dengan pengecatan gram menggunakan sampel koloni bakteri padat (basil). Pewarnaan sederhana dilakukan dengan membuat olesn koloni bakteri cair dengan ose tumpul, lalu dikeringkan dengan nyala api. Setelah kering lansung dilakukan pewarnaan dengan safranin. Cat safranin digenangkan diatas olesan bakteri, tunggu 1 menit. Sediaan dicuci diatas air mengalir dengan tehnik penggenangan, sehingga cat tercuci merata. Setelah itu, dikeringkan dengan mengangin-anginkannya atau bisa juga dengan menggunakan tissue. Setelah kering diamati dibawah mikroskop mulai dengan perbesaran objektif 10x sampai dengan 100x (diteteskan oil imersi). Pengecatan dengan safranin membuat sediaan berwarna merah.Pewarnaan diferensial, cat gram negatif. Dalam pengecatan dengan menggunakan cat gram negatif digunakan 4 macam pewarna. Pewarna 1 adalah kristal violet, berfungsi sebagai cat utama. Pewarna 2 adalah iodin, berfungsi sebagai penguat warna cat utama. Pewarna 3 adalah alkohol 96 %, berfungsi sebagai peluntur yang akan melunturkan cat utama. Dan pewarna 4 adalah safranin, cat pembanding yang akan menggantikan cat utama yang luntur.Setelah olesan bakteri siap, lansung dilakukan pengecatan pertama,dilakukan dengan cra yang sama dengan pada pewarnaan sederhana. Cat diteteskan diatas sediaan dengan merata tunggu 1 menit cuci dan cat dengan cat kedua, tunggu lagi 1 menit, cuci dan cat lagi dengan cat ketiga (cat peluntur), tunggu 30 detik, cuci dan cat kembali dengan cat pembanding safranin tunggu 1 menit, cuci dan keringkan. Karena sampel yang digunakan merupakan jenis bakteri gram negatif, sediaan berwarna merah, karena warna ungu kristal violet telah luntur pada pengecatan ke 3. Setelah kering, diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran objektif 100 x dengan penambahan oil imersi. Pada pewarnaan sederhan didapatkan bakteri coccus yang bertumpuk-tumpuk seperti anggur (sthapilococcus) dan pada pewarnaan deferensial ditemukan bakteri basil yang menyendiri (monobasil).

VII. HASIL Dari pengamatan yang dilakukan, dapat dilihat bahwa bakteri yang ada pada sampel koloni bakteri padat dengan pewarnaan gram adalah bakteri yang berbentuk basil dengan penataan sendiri-sendiri dan sifat pewarnaan merah (gram negatif), dan pada sampel koloni bakteri cair engan ewarnaan sederhana adalah bakteri berbentuk coccus, penatan bertumpuk-tumpuk dengan sifat pewarnaan merah.

VIII. KESIMPULANBerdasarkan praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa bakteri pada sampel koloni bakteri padat adah monobasil, dan pada sampel koloni bakteri cair adalah bakteri streptobasil.