laporan bioreg nyicil 2

ENZIM POLIGALAKTURONASE

PADA BUAH TOMAT MATANG

Oleh :

Anggia Rose S. (101810301004)

Fani Atrica S. (101810301007)

Agita Raka P. (101810301013)

Luluk Masnia (101810301032)

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS JEMBER

2012

Enzim poligalakturonase

H2O

I. Tujuan:

- Mengisolasi enzim poligalakturonase pada buah tomat matang

- Mengkarakterisasi enzim poligalakturonase pada buah tomat matang

II. Dasar Teori

Enzim poligalakturonase terdapat di daging buah tomat matang tepatnya di

dalam sel. Berdasarkan letak enzim, enzim poligalakturonase termasuk kelompok

endo. Enzim poligalakturonase diproduksi mulai dari proses pematangan buah

tomat. Enzim poligalakturonase berfungsi mengkatalis proses perusakan dinding

sel dengan cara memutuskan ikatan glikosida dari polisakarida penyusun dinding

sel. Reaksi enzim poligalakturonase adalah sebagai berikut:

Protein katalitik poligalakturonase diproduksi selama pematangan buah

tomat (Bird et al, 1988). Enzim poligalakturonase aktif pada saat proses

pematangan (Dellapenna et al, 1989). Meskipun hanya satu jenis polipeptida

enzim poligalakturonase yang dihasilkan, dua isoenzim poligalakturonase

sebagian besar diekstrak dari dinding sel buat tomat matang. Enzim

poligalakturonase 1 dan 2 mampu mendegradasi dinding sel pektin secara in vitro

( Pressey and Avants, 1973; Tucker et al., 1980). Enzim poligalakturonase stabil

pada pH 4,5 – 5,6 dengan pH optimum 5,5. Suhu optimum dari enzim ini adalah

42 oC.

Enzim poligalakturonase terlibat pada proses pelunakan di beberapa buah

seperti tomat, persik, pear, alpukat dan mangga. Enzim ini termasuk dalam enzim

hidrolase. Enzim ini terdiri dari dua enzim yakni ekso poligalakturonase (ekso

PG) dan endo poligalakturonase (endo PG) (Ghazahl, HM and Leong,CK (1987)

FoodChem 24 147).

Bahan yang akan digunakan untuk praktikum adalah buah tomat yang

tingkat kematangannya sempurna. Hal ini dicirikan dengan warna buah tomat

agak kemerah-merahan dan teksturnya tidak terlalu lunak. Oleh karena itu perlu

dilakukan persiapan penyediaan bahan.

III. Metodologi Percobaan

3.1 Alat

- Neraca Analitik

- Blender

- Pisau

- Labu Ukur 100 mL 1 buah

- Gelas Ukur 100 mL 2 buah

- Beaker Glass 150 mL 4 buah

- Sentrifuge

- Tabung Sentrifuge 10 buah

- Pipet Mohr 10 mL 2 buah

- Pipet Tetes 3 buah

- Erlenmeyer 150 mL 2 buah

- Termometer

- pH meter

- Penangas

- Botol Semprot 1 buah

- Batang Pengaduk

- Spatula

- Oven

- Stopwatch

- Spektrofotometer UV-Vis 1 unit

- Komputer 1 unit

3.2 Bahan

- Buah Tomat Matang

- Ammonium Sulfat

- Larutan NaCl 5%

- Aquades

- Aquademin

- Larutan Buffer Tris-HCl

- Larutan buffer 4

- Larutan buffer 5

- Larutan buffer 6

- Larutan HCl 1%

- Larutan PP

- Alkohol 95%

- Larutan HCl pekat

3.3 Metode Percobaan

Metode percobaan yang dilakukan pada praktikum enzim

poligalakturonase ini antara lain:

a. Penyiapan bahan

b. Penyiapan dan perlakuan sampel

c. Pemisahan enzim

d. Ektraksi sampel

e. Pengujian enzim

a. Penyiapan bahan

1. Pemilihan bahan

Buah tomat yang dipilih adalah buah tomat yang matang dengan tanda

kulit dan daging buahnya kemerah-merahan serta teksturnya tidak

terlalu lunak.

2. Membuat larutan 600 mL NaCl 5%. Selanjutnya diletakkan dalam

lemari es.

3. Membuat 500 ml larutan buffer Tris-HCL.

a. Pengenceran Tris

- Ditimbang 0,6 gr Tris lalu dimasukkan ke dalam beker glass.

- Diencerkan menjadi 50 mL dengan aquades.

b. Pengenceran HCl

- Diambil 1,98 mL HCl 12,6 M.

- dimasukkan ke dalam beker glass.

- Diencerkan menjadi 250 mL dengan aquades.

c. Pembuatan Buffer

- Dimasukkan larutan Tris yang sudah dibuat sebelumnya ke

dalam beker glass.

- Ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M sampai menunjukkan

pH yang diinginkan yaitu pH 4, 5 dan 6.

b. Penyiapan sampel dan perlakuan sampel

1. Buah tomat dibelah dan dikeluarkan isinya

2. Diambil daging buah tomat dengan ukuran tinggi x panjang x tebal =

4 x 8 x 0,5 cm dan diambil 150 gr.

3. Daging buah dipotong kecil dan ditambahkan larutan NaCl 5% dingin

dengan perbandingan (1:9) kemudian diblender sampai mencair dan

halus. Proses ini perlu dijaga jangan sampai suhu meningkat diatas

10oC.

4. Cairan hasil blender, didiamkan sampai terbentuk dua fase (bagian

endapan dan larutan).

5. Larutan dari slory di sentrifuse kecepatan max 4000 rpm selama max

20 menit.

c. Pemisahan enzim

1. Pemisahan enzim berdasarkan BM

Pemisahan enzim didasarkan BM yang mengendap dalam medium

amonium sulfat.

2. Pemisahan enzim dalam medium (NH4)2SO4 18%, dilakukan dengan

cara sentrifugasi supernatan (kecepatan 8000 rpm selama20 menit).

3. Pelet 1 yang dihasilkan dicuci dengan buffer Tris-HCl.

4. Supernatan 1 dipindahkan ke dalam tabung dan ditambah lagi

(NH4)2SO4 menjadi 28% kemudian disentrifugasi kembali (kecepatan

8000 rpm selama 20 menit).

5. Pelet 2 yang dihasilkan dicuci dengan buffer Tris-HCL.

d. Isolasi Pektin

1. Preparasi

Tomat dicuci sampai bersih dan dikeluarkan isinya.

Tomat dipotong kecil-kecil.

Tomat tersebut diblender dengan sedikit air agar cepat halus.

Hasil blender dioven hingga kadar airnya konstan dan enzimnya

menjadi tidak aktif lagi.

2. Ekstraksi pektin

Bahan hasil pengovenan diberi aquades hingga menjadi encer

dengan diaduk.

Ditambahkan larutan HCl 1% hingga pH menjadi 1,5.

Dipanaskan sampai 70-80 oC sambil diaduk selama 1 jam.

Disaring untuk memisahkan filtratnya. Filtrat tersebut adalah

filtrat pektin.

Dipanaskan filtrat pektin pada suhu 95-97 oC sambil diaduk

hingga volumenya menjadi setengah volume semula. Hasilnya

disebut filtrat pekat.

Filtrat pekat tersebut didinginkan.

3. Pengendapan pektin

Dibuat larutan alkohol asam dari larutan etanol 95% yang

ditambah dengan larutan 2 mL HCl pekat.

Filtrat pektin pekat ditambahkan dengan alkohol asam sambil

diaduk sampai merata. Setiap 100 mL filtrat pektin ditambahkan

150 mL alkohol asam.

Filtrat kemudian didiamkan selama 10-14 jam (semalam).

Dipisahkan endapan pektin dari filtrat dengan menggunakan

kertas saring. Hasilnya disebut endapan pektin.

Endapan pektin dilarutkan dalam aquademin.

e. Pengujian Enzim

1. Dasar pengujian E + S ES

Enzim yang akan diuji adalah enzim poligalakturonase dengan

substrat. Grafik enzim tanpa subtrat akan diperoleh titik yang tinggi,

setelah ditambahkan substrat maka absorbansi akan menurun karena

enzim akan berikatan membentuk kompleks ES. Pada keadaan

tertentu grafik absorbansi akan kembali meningkat karena lepasnya

kompleks ES. Peningkatan absorbansi tidak akan sama seperti awal

pengukuran, hal ini dimungkinkan masih ada ikatan antara enzim

dengan substrat.

2. Persiapan pengujian enzim

- Mengencerkan pellet 1 dan 2 yang telah diperoleh sebanyak

larutan sampel enzim yang dibutuhkan.

- pH

i. pH : < pH 4, larutan enzim 0,4 mL x 3 kali pengulangan

= 1,2 mL

ii. pH : = 5, larutan enzim 0,4 mL x 3 kali pengulangan =

1,2 mL

iii. pH : > 6, larutan enzim 0,4 mL x 3 kali pengulangan =

1,2 mL

Jumlah larutan enzim yang dibutuhkan = 3,6 mL

3. Persiapan alat

- Digunakan spektrometer UV-Vis yang dihubungkan dengan

komputer dengan software khusus.

- Dinyalakan spektrometer

- Diatur panjang gelombang 280-290 nm.

4. Pengujian enzim

- Dimasukkan larutan enzim sebanyak 0,4 mL ke dalam kuvet.

- Dimasukkan substrat sebanyak 0,6 mL

- Diletakkan dalam spektrometri

- Diukur absorbansinya

- Dihidupkan stopwatch ketika substrat dimasukkan dan dijalankan

kembali program.

- Dihentikan stopwatch dan program ketika diperoleh grafik

absorbansi yang konstan.

- Diperoleh nilai Km

SOP Spektrometri

Adapun prosedur yang dapat dijalani dalam pemakaian Spektrofotometer UV-

Visible antara lain:

1. Hubungi Teknisi untuk minta ijin pemakaian Spektrofotometer UV-

Visible

2. Mengisi buku penggunaan Spektrofotometer Uv-Visible

3. Membaca prosedur penggunaan

4. Siapkan kuvet 1,5 ml

5. Masukkan sampel ke dalam kuvet dengan menggunakan pipet

6. Dalam kuvet tersebut terlihat dua buah sisi yang berbentuk gerigi,

sedangkan dua sisi yang lain tumpul

7. Ketika ingin membawa kuvet, pegang pada sisi yang bergerigi

8. Nyalakan spektrofotometer, pastikan alat telah terhubung dengan sumber

listrik (stop kontak)

9. Lakukan kalibrasi spektrofotometer dengan menggunakan larutan

blank (Blanking spektrofotometer)

10. Ubah skala spektrofotometer ke dalam satuan nanometer

11. Setting ke dalam 390 nanometer

12. Ubah lagi skala spektrofotometer ke dalam absorbansi

13. Masukkan kuvet berisi air ke dalam spektrofotometer

14. Pastikan sisi yang mulus menghadap ke depan dan sisi yang bergerigi

berada di samping

15. Tekan tombol nol pada spektrofotometer

16. Untuk menganalisis sampel dimulai dengan letakkan sampel ke dalam

spektrofotometer

17. Pastikan sisi mulus menghadap ke depan dan bergerigi menghadap ke

samping

18. Catat hasil yang keluar

19. Buat data dalam bentuk kurva kalibrasi dan absorban sampel yang diplot

lewat konsentrasi

20. Tekan tombol off untuk mematikan spektrofotometer

DiirisDitambah larutan NaCl 5%Diblender DidiamkanDisentrifuse

SupernatanPelet

Ditambahkan Ammonium sulfat 18%Disentrifuse

Supernatan 1Pelet 1

Dicuci dengan menambahkan larutan buffer Tris-HClUji Spektrometri

Ditambahkan Amonium Sulfat 28%Disentrifuse

Pelet 2 Supernatan 2

Dicuci dengan menambahkan larutan buffer Tris-HClUji Spektrometri

Diuji aktivitas Variasi pH

V. Cara membuktikan:

NB : Masing-masing residu dan supernatan di uji biuret

150 gram Daging Buah Tomat Matang

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Percobaan

4.1.1 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1 dan pH 4

t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A

3 0,767 51 0,771 99 0,763 147 0,774 195 0,7496 0,77 54 0,774 102 0,764 150 0,793 198 0,7499 0,779 57 0,779 105 0,762 153 0,796 201 0,74912 0,785 60 0,78 108 0,771 156 0,804 204 0,74915 0,783 63 0,776 111 0,78 159 0,81 207 0,74918 0,785 66 0,785 114 0,78 162 0,81 210 0,74921 0,783 69 0,783 117 0,776 165 0,819 213 0,74924 0,779 72 0,779 120 0,769 168 0,815 216 0,74927 0,779 75 0,782 123 0,773 171 0,8 219 0,74930 0,78 78 0,778 126 0,774 174 0,773 222 0,74933 0,785 81 0,769 129 0,77 177 0,768 225 0,74936 0,786 84 0,769 132 0,765 180 0,765 228 0,74939 0,785 87 0,761 135 0,771 183 0,757 231 0,74942 0,784 90 0,753 138 0,77 186 0,751 234 0,74945 0,768 93 0,752 141 0,763 189 0,749 237 0,74948 0,771 96 0,758 144 0,762 192 0,749

4.1.2 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1, pH 4 dan substratt (s) A t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A

3 0,946 51 0,903 99 0,884 147 0,884 195 0,8716 0,933 54 0,901 102 0,881 150 0,883 198 0,8889 0,918 57 0,896 105 0,895 153 0,884 201 0,88812 0,899 60 0,900 108 0,890 156 0,886 204 0,88815 0,895 63 0,895 111 0,885 159 0,900 207 0,88818 0,900 66 0,900 114 0,874 162 0,904 210 0,88821 0,894 69 0,896 117 0,877 165 0,899 213 0,88824 0,897 72 0,883 120 0,879 168 0,893 216 0,88827 0,891 75 0,891 123 0,879 171 0,891 219 0,88830 0,897 78 0,888 126 0,880 174 0,888 222 0,88833 0,912 81 0,890 129 0,883 177 0,890 225 0,88836 0,920 84 0,887 132 0,881 180 0,900 228 0,88839 0,927 87 0,884 135 0,880 183 0,912 231 0,88842 0,921 90 0,885 138 0,880 186 0,891 234 0,88845 0,911 93 0,887 141 0,884 189 0,876 237 0,88848 0,905 96 0,888 144 0,885 192 0,877 195 0,871


t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A3 0,635 45 0,641 87 0,647 129 0,6426 0,638 48 0,641 90 0,647 132 0,6429 0,640 51 0,638 93 0,646 135 0,64212 0,642 54 0,641 96 0,640 138 0,64215 0,640 57 0,643 99 0,638 141 0,64218 0,638 60 0,640 102 0,641 144 0,64221 0,643 63 0,632 105 0,639 147 0,64224 0,652 66 0,640 108 0,638 150 0,64227 0,641 69 0,642 111 0,641 153 0,64230 0,636 72 0,647 114 0,648 156 0,64233 0,638 75 0,640 117 0,653 159 0,64236 0,638 78 0,648 120 0,65439 0,639 81 0,641 123 0,64642 0,639 84 0,647 126 0,642

4.1.4 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1, pH 5 dan substrat

t (s) A t (s) A t (s) A3 0,809 39 0,827 75 0,8246 0,792 42 0,826 78 0,8249 0,795 45 0,818 81 0,82412 0,807 48 0,819 84 0,82415 0,822 51 0,820 87 0,82418 0,817 54 0,821 90 0,82421 0,822 57 0,821 93 0,82424 0,827 60 0,822 96 0,82427 0,829 63 0,823 99 0,82430 0,826 66 0,823 102 0,82433 0,826 69 0,824 105 0,82436 0,827 72 0,824 108 0,824


t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A

3 0,672 54 0,697 105 0,700 156 0,6986 0,686 57 0,695 108 0,689 159 0,7009 0,688 60 0,692 111 0,692 162 0,70412 0,692 63 0,688 114 0,696 165 0,70415 0,714 66 0,696 117 0,701 168 0,70418 0,702 69 0,698 120 0,701 171 0,70421 0,688 72 0,705 123 0,696 174 0,70424 0,684 75 0,704 126 0,700 177 0,70427 0,679 78 0,700 129 0,703 180 0,70430 0,682 81 0,704 132 0,694 183 0,70433 0,685 84 0,700 135 0,689 186 0,70436 0,681 87 0,694 138 0,695 189 0,70439 0,678 90 0,700 147 0,699 192 0,70442 0,675 93 0,704 150 0,697 195 0,70445 0,679 96 0,704 141 0,698 198 0,70448 0,687 99 0,709 144 0,69751 0,692 102 0,710 153 0,695


t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A3 0,825 48 0,832 93 0,810 141 0,7946 0,822 51 0,831 96 0,806 144 0,7929 0,833 54 0,829 102 0,793 147 0,79112 0,830 57 0,829 105 0,791 150 0,79115 0,826 60 0,819 108 0,796 156 0,79118 0,833 63 0,815 111 0,792 159 0,79121 0,830 66 0,820 114 0,793 162 0,79124 0,837 69 0,821 117 0,793 165 0,79127 0,839 72 0,822 120 0,793 168 0,79130 0,833 75 0,822 123 0,795 171 0,79133 0,818 78 0,820 126 0,797 174 0,79136 0,815 81 0,818 129 0,798 177 0,79139 0,820 84 0,814 132 0,800 180 0,79142 0,829 87 0,817 135 0,803 183 0,79145 0,834 90 0,819 138 0,801 186 0,791


t (s) A t (s) A3 0,373 42 0,3726 0,373 45 0,372

9 0,372 48 0,37212 0,372 51 0,37315 0,372 54 0,37318 0,371 57 0,37321 0,371 60 0,37324 0,372 63 0,37327 0,372 66 0,37330 0,372 69 0,37333 0,372 72 0,37336 0,372 75 0,37339 0,372


t (s) A t (s) A3 0,498 45 0,4976 0,497 48 0,4979 0,497 51 0,49712 0,497 54 0,49815 0,497 57 0,49818 0,497 60 0,49821 0,497 63 0,49824 0,497 66 0,49827 0,496 69 0,49830 0,496 72 0,49833 0,496 75 0,49836 0,497 78 0,49839 0,496 81 0,49842 0,497


t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A3 0,281 33 0,281 63 0,28 93 0,286 0,281 36 0,281 66 0,28 96 0,28

9 0,281 39 0,281 69 0,28 99 0,2812 0,281 42 0,281 72 0,28 102 0,2815 0,281 45 0,281 75 0,279 105 0,2818 0,281 48 0,281 78 0,279 108 0,2821 0,281 51 0,28 81 0,279 111 0,2824 0,281 54 0,28 84 0,279 114 0,2827 0,281 57 0,28 87 0,2830 0,281 60 0,28 90 0,28


t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A3 0,416 51 0,415 99 0,413 147 0,414 195 0,4166 0,414 54 0,414 102 0,413 150 0,414 198 0,4169 0,412 57 0,413 105 0,413 153 0,414 201 0,41612 0,412 60 0,413 108 0,413 156 0,414 204 0,41615 0,412 63 0,413 111 0,413 159 0,414 207 0,41618 0,412 66 0,412 114 0,413 162 0,414 210 0,41621 0,412 69 0,413 117 0,413 165 0,414 213 0,41624 0,412 72 0,413 120 0,414 168 0,414 216 0,41627 0,412 75 0,413 123 0,413 171 0,414 219 0,41630 0,413 78 0,413 126 0,413 174 0,415 222 0,41633 0,412 81 0,413 129 0,413 177 0,415 225 0,41636 0,414 84 0,413 132 0,414 180 0,415 228 0,41639 0,415 87 0,413 135 0,414 183 0,415 231 0,41642 0,415 90 0,413 138 0,414 186 0,415 234 0,41645 0,415 93 0,413 141 0,414 189 0,41648 0,415 96 0,413 144 0,414 192 0,416

4.1.

t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A3 0,752 54 0,763 105 0,774 156 0,7816 0,754 57 0,764 108 0,774 159 0,7819 0,755 60 0,764 111 0,775 162 0,78212 0,756 63 0,765 114 0,775 165 0,78215 0,757 66 0,766 117 0,776 168 0,78218 0,757 69 0,766 120 0,776 171 0,78221 0,758 72 0,767 123 0,776 174 0,78224 0,758 75 0,768 126 0,777 177 0,78227 0,758 78 0,768 129 0,777 180 0,782

30 0,759 81 0,769 132 0,777 183 0,78233 0,76 84 0,769 135 0,778 186 0,78236 0,761 87 0,77 138 0,778 189 0,78239 0,761 90 0,771 141 0,778 192 0,78242 0,761 93 0,772 144 0,778 195 0,78245 0,762 96 0,773 147 0,779 198 0,78248 0,762 99 0,773 150 0,779 201 0,78251 0,762 102 0,773 153 0,78 204 0,782

4.1

t (s) A t (s) A t (s) A3 0,991 48 0,987 93 0,9896 0,99 51 0,988 96 0,9899 0,989 54 0,987 99 0,98912 0,988 57 0,987 102 0,98915 0,988 60 0,987 105 0,98918 0,987 63 0,987 108 0,98921 0,986 66 0,987 111 0,98924 0,985 69 0,988 114 0,98927 0,985 72 0,989 117 0,98930 0,986 75 0,99 120 0,98933 0,986 78 0,99 123 0,98936 0,986 81 0,99 126 0,98939 0,986 84 0,989 129 0,98942 0,987 87 0,989 132 0,98945 0,987 90 0,989 135 0,989

4.2 Pembahasan

Enzim poligalakturonase merupakan enzim yang berperan dalam

pelunakan buah pada proses pematangan. Enzim ini bekerja dengan cara

memutuskan ikatan glikosida pada polipeptida penyusun dinding sel buah. Reaksi

enzim poligalakturonase adalah sebagai berikut :

5.

6.

7.

8.

Enzim poligalakturonase

H2O

9.

10.

Percobaan kali ini menggunakan buah tomat ( Solanum lycopersicum )

sebagai bahan utama. Enzim Poligalakturonase terdapat di dalam sel daging buah

tomat. Buah tomat yang digunakan adalah buah tomat yang matang dengan ciri

kulit dan daging buahnya kemerah-merahan dan teksturnya tidak terlalu lunak.

Penyiapan sampel diawali dengan pencucian buah tomat, dikeluarkan

isinya dan dipotong daging buahnya menjadi bagian kecil dengan ukuran 4 x 8 x

0,5 cm. Setelah dipotong buah tomat tersebut ditimbang sebanyak 150 gram dan

ditambahkan larutan NaCl 5% dingin dengan perbandingan (1:9). Campuran ini

ditunjukkan pada gambar dibawah ini:

Gambar 1. Campuran tomat dan larutan NaCl 5%

Campuran buah tomat dengan larutan NaCl disimpan dalam freezer selama

24 jam. Fungsi penambahan NaCl 5 % adalah sebagai pelarut enzim agar enzim

terdispersi sempurna. Campuran buah tomat dengan larutan NaCl 5% dingin

diblender untuk mengeluarkan enzim poligalakturonase dari dalam sel. Keadaan

dingin diberikan untuk menonaktifkan enzim. Gambar di bawah ini menunjukkan

proses pemblenderan tomat :

Gambar 2. Proses pemblenderan tomat dengan larutan NaCl 5%

Gambar 3. Hasil Blender

Cairan hasil blender disaring dengan kain saring untuk memisahkan ampas

dengan filtratnya. Filtrat didiamkan sampai terbentuk dua fase. Setelah diperoleh

dua fase, fase endapan dan cairan. Bagian cairan diambil dengan cara dekantasi.

Cairan hasil dekantasi adalah sebagai berikut:

Gambar 4. Ampas dan Hasil Dekantasi

Cairan hasil dekantasi disentrifuse dengan kecepatan maksimal 4000 rpm selama

10 menit. Supernatan diambil dan dipisahkan dari peletnya.

Supernatan ini kemudian ditambahkan dengan amonium sulfat 18%.

Penambahan amonium sulfat ini berfungsi sebagai medium pengendap enzim

poligalakturonase. Amonium sulfat menghilangkan garam yang mendispersi

enzim. Larutan disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit.

Sentrifuse akan menghasilkan supernatan 1, pelet 1 dan endapan pengotor yang

sangat sedikit. Supernatan 1 diambil dan disisihkan. Pelet 1 yang ada di dinding

tabung sentrifuse diambil dengan cara dikerok dengan spatula dan dilarutkan

dalam aquademin serta disimpan dalam lemari es agar enzim tidak rusak. Gambar

pelet 1 yang akan diuji aktivitasnya dengan Spektrofotometri UVadalah sebagai

berikut:

Supernatan 1 diuji dengan biuret. Jika terdapat enzim maka larutan akan

berwarna ungu. Warna ungu terbentuk karena reagen biuret bereaksi dengan

ikatan peptida pada enzim. Hasil uji biuret terhadap supernatan 1 berwarna ungu

yang menunjukkan terdapatnya enzim.

Gambar 5. Pelet 1

Gambar 6. Hasil Uji Biuret Supernatan 1

Supernatan 1 ditambah dengan amonium sulfat 28% karena dalam

supernatan 1 ini masih terdapat enzim yang masih terdispersi. Setelah

penambahan amonium sulfat, supernatan 1 disentrifuse lagi dengan kecepatan

4000 rpm selama 10 menit. Hasil yang diperoleh yakni supernatan 2, pelet 2 dan

endapan pengotor yang sangat sedikit.

Gambar 7. Pelet 2 dan Hasil Sentrifuse

Supernatan 2 dan endapan pengotor diambil dan dibuang. Pelet 2 diambil

dengan cara dikerok dengan spatula dan dilarutkan dalam aquademin serta

disimpan dalam lemari es agar enzim tidak rusak. Pelet 2 disimpan untuk uji

aktivitas enzimnya.

Uji aktivitas enzim poligalakturonase dilakukan dengan penambahan

substrat pektin dan variasi pH. Substrat pektin yang diperoleh dengan cara

ekstraksi pektin dari buah tomat. Buah tomat dibelah, dikeluarkan isinya dan

dicuci dengan air untuk menghilangkan kotoran. Buah tomat yang sudah bersih

diblender sampai halus untuk mengeluarkan pektin dari dinding sel. buah Buah

tomat yang sudah diblender ditambahkan air dan HCl 1% serta pemanasan pada

pH 1.5 yang berfungsi untuk menghidrolisis protopektin menjadi pektin. Hasil

dari penasan berupa bubur yang kemudian disaring untuk mendapatkan filtrate

pektin. Filtrat pektin yang diperoleh dipekatkan dengan cara dipanaskan kembali

sampai volume filtrate menjadi setengahnya. Alkohol asam yang dibuat dari

campuran etanol 99% dan HCl pekat ditambahkan untuk memisahkan pektin dari

filtrat dengan cara diendapkan. Filtrat didiamkan selama 14 jam untuk

mendapatkan hasil endapan pektin yang sempurna. Endapan pektin yang

terbentuk kemudian disaring menggunakan kertas saring dan dilarutkan dengan

aquademin. Pektin yang terlarut dalam aquademin disimpan dalam lemari

pendingin untuk pengujian aktivitas enzim yang berfungsi sebagai substrat dari

enzim poligalakturonase. Berikut ini merupakan sebagian dari tahap isolasi pektin

dari buah tomat:

Gambar 7. Isolasi Pektin dari Buah Tomat

Pengujian enzim poligalakturonase dilakukan dengan menggunakan

spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 290 nm. Pelet 1 dan pelet 2

yang berisi enzim diuji absorbansinya dengan memberikan variasi pH disekitar

pH optimal dan menggunakan substrat pektin. Berikut ini merupakan gambar dari

spetrofotometri UV-Vis dan kuvetnya :

Gambar 8. Spektrofotometer UV-Vis dan kuvetAktivitas katalitik enzim poligalakturonase dapat diamati dengan

penambahan substrat ke dalamnya dan memberikan variasi pH di sekitar pH

optimal. pH optimal enzim poligalakturonase adalah 5,5. Pada percobaan kali ini

variasi pH yang diberikan yaitu pH 4, 5 dan 6.

Enzim pada pelet 1 diukur absorbansinya, diambil 2 mL dan diletakkan

dalam kuvet. Kemudian ditambahkan buffer Tris-HCl dengan pH 4 sebanyak 0,5

mL ke dalam kuvet. Campuran enzim-pH diukur absorbansinya setiap 3 detik

hingga konstan. Setelah diperoleh absorbansi yang konstan, substrat pektin

ditambahkan ke dalam kuvet sebanyak 0,5 mL. Kemudian campuran enzim-

substrat diukur absorbansinya setiap 3 detik hingga absorbansinya konstan. Proses

ini diulangi untuk variasi pH 5 dan 6 serta untuk pelet 2 dengan variasi pH 4,5,6.

0 50 100 150 200 2500.7

0.72

0.74

0.76

0.78

0.8

0.82

0.84

Enzim + pH 4 + Subtrat (pelet 1)

Series2

t (sekon)

Abso

rban

si

0 50 100 150 200 2500.82

0.84

0.86

0.88

0.9

0.92

0.94

0.96

Enzim + pH 4 (pelet 1)

Series2

t (sekon)

Abso

rban

si

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800.620

0.625

0.630

0.635

0.640

0.645

0.650

0.655

0.660


Series2

t (sekon)

Abso

rban

si

0 20 40 60 80 100 1200.770

0.780

0.790

0.800

0.810

0.820

0.830

0.840


Series2

t/sekon

Abso

rban

si

0 50 100 150 200 2500.650

0.660

0.670

0.680

0.690

0.700

0.710

0.720


Series2

t (sekon)

Abso

rban

si

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000.7600.7700.7800.7900.8000.8100.8200.8300.8400.850


Series2

t (sekon)

Abso

rban

si

0 10 20 30 40 50 60 70 800.37

0.3705

0.371

0.3715

0.372

0.3725

0.373

0.3735


Series2

t (sekon)

Abso

rban

si

0 10 20 30 40 50 60 70 80 900.495

0.4955

0.496

0.4965

0.497

0.4975

0.498

0.4985

Enzim + pH 4 ( pelet 2)

Series2

t ( sekon)

Abso

rban

si

0 20 40 60 80 100 1200.278

0.2785

0.279

0.2795

0.28

0.2805

0.281

0.2815


Series2

t (sekon)

Abso

rban

si

0 50 100 150 200 2500.409

0.41

0.411

0.412

0.413

0.414

0.415

0.416

0.417

Enzim + pH 5 ( pelet 2 )

Series2

t ( sekon)

Abso

rban

si

0 50 100 150 200 2500.7350.74

0.7450.75

0.7550.76

0.7650.77

0.7750.78

0.785

Enzim + pH 6 + Substrat (pelet 2)

Series2

t (sekon )

Abso

rban

si

0 20 40 60 80 100 120 140 1600.9820.9830.9840.9850.9860.9870.9880.9890.99

0.991

Enzim + pH 6 ( pelet 2 )

Series2

t (sekon)

Abso

rban

si

V. PENUTUP

V.1Kesimpulan

V.2Saran

DAFTAR PUSTAKA

Bird et al. 1988. Fruit quality characteristics of transgenic tomato fruit with

altered polygalacturonase activity. USA: HortScience.

DellaPenna, D. 1989. Polygalacturonase isozymes and pectin depolymerization in

transgenic rin tomato fruit. New York: Plant Physiol.

Ghazahl, HM and Leong, CK. 1987. Methodology for Enzyme. ePlantscience:

FoodChem.

Pressey, R and Avants. 1973. Extraction and assay of tomato polygalacturonases.

USA: HortScience.

Documents

laporan bioreg nyicil 2