LÔØI MÔÛ ÑAÀUi.vietnamdoc.net/data/file/2015/Thang06/22/nghien_cuu... · Web viewẢnh chụp kính hiển vi điện tử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 –

Lời cảm ơn

LỜI CẢM ƠN

Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Tuân, thầy đã hướng dẫn em suốt quá trình

thực hiện đề tài này. Trong quá trình làm việc cùng với thầy, em đã học hỏi được nhiều điều

bổ ích, không chỉ là những kiến thức chuyên môn mà còn cả những kinh nghiệm khi làm việc.

Khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài, thầy đã kịp thời hướng dẫn, chỉ bảo tận

tình.

Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thị Ngọc Anh, những lời truyền đạt của cô

thật sự bổ ích cho em trong quá trình em làm luận văn tại trường.

Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô đã giúp đỡ chúng em về mặt hóa

chất phục vụ cho việc thực hiện đề tài.

Em cảm ơn cô Thùy Dương - bộ môn Công nghệ Sinh học của trường Đại học Bách

khoa thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em về nguồn vi sinh vật sử dụng trong đề tài.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm,

trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất về mọi mặt giúp

chúng em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp.

Tôi cũng muốn bày tỏ sự cảm ơn đến tất cả các bạn bè của tôi, họ đã giúp đỡ, đặc biệt

là cho tôi thấy được sự gắn bó, sự chia sẻ, sự cảm thông cũng như là những giây phút thư giãn

trong khi làm việc.

Tôi xin cảm ơn với tất cả lòng chân thành.

Tp. HCM, ngày 07 tháng 01 năm 2008

Phan Anh Tuấn

i

Tóm tắt luận văn

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Acetobacter xylinum (A. xylinum) là một vi khuẩn Gram âm, có thể sản xuất một loại

polysaccharide ngoại bào được gọi là cellulose vi khuẩn. Cellulose vi khuẩn có khả năng

được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và các lĩnh vực khác. Để ứng dụng

cellulose vi khuẩn một cách rộng rãi, đòi hỏi có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào

và ổn định. Gần đây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm đã được phát hiện

và ứng dụng thực tế. Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao

thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới

điều kiện tĩnh, chúng tôi thực hiện khảo sát các yếu tố sau:

- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên môi trường Hestrin-

Schramm (HS).

- Cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum.

Để khảo sát sự sinh tổng hợp cellulose, A. xylinum được nuôi cấy dưới điều kiện tĩnh

trên môi trường HS ở các điều kiện khác nhau nhằm rút ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho

chủng A. xylinum có sẵn. Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với quá trình tạo cellulose của vi

khuẩn A. xylinum được tiến hành và thấy rằng, trong khoảng pH từ 4,0 đến pH 5,5, hiệu suất

tổng hợp cellulose của chủng A. xylinum này là thích hợp nhất, lượng cellulose đạt được có

thể ~5,2 gl-1. Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon bằng cách thay đổi

nguồn carbon trong thành phần môi trường nuôi cấy, chọn được nguồn carbon thích hợp nhất

cho chủng A. xylinum sinh tổng hợp cellulose là mannitol. Lượng cellulose đạt được ~7,4 gl -1.

Để chọn ra nguồn nitơ tốt nhất cho sự tổng hợp cellulose, một thí nghiệm được thực hiện với

nguồn carbon là mannitol, nguồn nitơ được thay đổi, kết quả cho thấy cao nấm men cho kết

quả tạo cellulose tốt nhất. Lượng cellulose đạt được ~8 gl-1 g. Khi khảo sát ảnh hưởng đồng

thời của mannitol và cao nấm men lên quá trình tổng hợp cellulose của A. xylinum, hàm lượng

cellulose thu được có thể đạt được ~8,5 gl-1 khi thành phần môi trường HS được điều chỉnh

với hàm lượng mannitol 15,5 gl-1 và hàm lượng cao nấm men là 6,5 gl-1, pH môi trường được

chỉnh xung quanh giá trị 5,0.

Với kết quả thu được trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum

có tại Phòng Thí nghiệm Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh với

mục đích thu nhận cellulose nên bao gồm các thành phần sau: 15,5 gl -1 mannitol; 6,5 gl-1 cao

nấm men; 5,0 gl-1 Na2HPO4; 1,115 gl-1 acid citric; pH được điều chỉnh về 5,0 là thích hợp cho

ii

Tóm tắt luận văn

quá trình nuôi cấy. Các kết quả quả thí nghiệm này cung cấp những thông tin hữu ích cho sự

phát triển khả năng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp.

iii

Mục lục

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................................i

TÓM TẮT LUẬN VĂN............................................................................................................ii

MỤC LỤC ............................................................................................................................iv

DANH MỤC HÌNH..................................................................................................................vi

DANH MỤC BẢNG................................................................................................................vii

DANH MỤC VIẾT TẮT.......................................................................................................viii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU..........................................................................................................1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................3

2.1 CELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULOSE.........................32.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn................................32.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn..................................32.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose.........................................................................6

2.2 SINH TỔNG HỢP CELLULOSE TỪ VI KHUẨN A. XYLINUM....................................102.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A. xylinum............................................102.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn......................................................112.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose...............................13

2.3 ỨNG DỤNG CỦA CELLULOSE VI KHUẨN..............................................................242.3.1 Thực phẩm....................................................................................................242.3.2 Y học.............................................................................................................252.3.3 Các ngành công nghiệp khác........................................................................25

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................................28

3.1 NGUYÊN LIỆU.......................................................................................................283.1.1 Chủng vi sinh vật..........................................................................................283.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật....................................................................28

3.2 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM.........................................................................................293.2.1 Khảo sát quá trình nhân giống......................................................................293.2.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose...................................................303.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A.

xylinum..........................................................................................................303.2.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp

cellulose của vi khuẩn A. xylinum.................................................................313.2.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng

hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum..........................................................313.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH...........................................................................33

3.3.1 Số lượng vi khuẩn.........................................................................................33

iv

Mục lục

3.3.2 Hiệu suất cellulose........................................................................................333.3.3 Phân tích thống kê.........................................................................................34

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..........................................................................35

4.1 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI KHUẨN A. XYLINUM.............................354.2 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CELLULOSE..........................................364.3 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE

CỦA VI KHUẨN A. XYLINUM..................................................................................384.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ LÊN HIỆU SUẤT SINH

TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A. XYLINUM...........................................404.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon.......................................................................404.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ...........................................................................43

4.5 TỐI ƯU HOÁ NỒNG ĐỘ NGUỒN CARBON VÀ NITƠ...............................................45

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................49

5.1 KẾT LUẬN.............................................................................................................495.2 ĐỀ NGHỊ................................................................................................................49

TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................................51

PHỤ LỤC ...........................................................................................................................55

v

Danh mục hình

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn..................................................................................4

Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b)..........................................................6

Hình 2.3: SEM của A. xylinum....................................................................................................8

Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum.......................................................11

Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn..................................................................12

Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A. xylinum......................................13

Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và có khuấy đảo................15

Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo ...........................16

Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của A. xylinum..................................................................35

Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH tại các ngày lên men

thứ 4, 5, 6, 7 ............................................................................................................36

Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum ..............39

Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn carbon thay đổi.....................................42

Hình 4.5: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn nitơ thay đổi..........................................44

vi

Danh mục bảng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose..........................................................7

Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC .........................................................................16

Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC của A. xylinum IFO 13693 ..........................................17

Bảng 2.4: Aûnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của.................................23

Bảng 2.5: Các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cellulose vi khuẩn......................................26

Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon và nguồn nitơ..................................33

Bảng 3.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát.....................................................34

Bảng 4.1: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu ...............................................................................47

Bảng 4.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát.....................................................47

vii

Danh mục viết tắt

DANH MỤC VIẾT TẮT

- Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới

điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo)

- A. xylinum: Acetobacter xylinum

- A. xylinus: Acetobacter xylinus

- ATP: adenosine triphosohate

- BASYC®: bacterial synthesised cellulose

- Cel-: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose.

- cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc

- CS: cellulose synthase

- CSL: corn steep liquor

- DAP: diamon phosphate

- DP: degree of polymerization

- FK: Fructosekinase

- FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase

- Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate

- Fru-6-P: Fructose-6-phosphate

- GK: Glocosekinase

- G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase

- Glc-6-P: Glucose-6-phosphate

- Glc-1-P: Glucose-1-phosphate

- HS: Hestrin-Schramm

- HR/MAS 1H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear magnetic

resonance.

- PGI: Phosphoglucoisomerase

viii

Danh mục viết tắt

- PGM: Phosphoglucomutase

- PTS: Phosphatransferase

- PGA: Phosphogluconic acid

- S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích

- SEM: Scanning electronic microscopy

- St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều

kiện nuôi cấy tĩnh)

- SA: Sulfate amon

- UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase

- UDPG: Uridine diphosephoglucose

- YPM: Yeast extract Peptone Mannitol

- YE: Yeast extract – cao nấm men

ix

Chương 1. Mở đầu

Chương 1: MỞ ĐẦU

Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đến với vai trò là bộ khung xương

quan trọng trong cơ thể thực vật. Không những cellulose được tổng hợp bởi thực vật, mà

cellulose còn được tổng hợp nên bởi vi sinh vật, với tên gọi là cellulose vi khuẩn. Một trong

những loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose rất tốt đó là A. xylinum. Cellulose vi

khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành

khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước

thải, bảo vệ môi trường… Gần đây, khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng được

nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới (Otomo et al., 2000).

Trong công nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm

nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, một ứng dụng của

cellulose vi khuẩn mới được phát hiện gần đây là khả năng ứng dụng làm màng bao thực

phẩm chống vi sinh vật rất hiệu quả (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993). Việc ứng

dụng cellulose vi khuẩn vào sản xuất công nghiệp nói chung và làm màng bao thực phẩm nói

riêng đòi hỏi phải có được các nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn định, và phù

hợp với tính chất của các ứng dụng. Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy khi nuôi cấy dưới

điều kiện có khuấy đảo thì hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum sẽ cao hơn khi

nuôi cấy tĩnh. Tuy nhiên, với mục đích sử dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi

sinh vật trong công nghệ thực phẩm, yêu cầu cellulose thu được phải ở dạng màng. Với mục

đích đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter

xylinum” dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh với mong muốn thu được các kết quả hữu ích cho các

nghiên cứu trong tương lai.

Trong nội dung thực hiện, chúng tôi tập trung khảo sát các yếu tố sau:

- Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trên môi trường

HS.

- Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum trên

môi trường HS.

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A.

xylinum.

1

Chương 1. Mở đầu

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A.

xylinum.

- Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men thu nhận cellulose vi khuẩn nhằm nâng cao

hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum.

Với kết quả thu được, phần nào sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho các nghiên

cứu tiếp theo, đầy đủ hơn để có thể ứng dụng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công

nghiệp.

2

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn.

Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum lần đầu tiên được

báo cáo bởi Brown et al. (1986). Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic, Brown đã phát

hiện và quan sát thấy một khối rắn mà theo ông lúc đó khối rắn này không nằm trong các kết

quả nghiên cứu ông dự định trước. Khối rắn này khó bị phân hủy và giống với mô động vật.

Hợp chất đó sau này được xác định là cellulose và vi khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium

xylinum (Brown et al., 1986).

Đến nửa thế kỷ XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều về cellulose vi

khuẩn. Đầu tiên, Hestrin et al. (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi

khuẩn A. xylinum. Ông đã chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng đường để tổng hợp

cellulose. Sau đó, Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng

hợp trong môi trường có đường và ATP. Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cấu trúc

của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi polymer do các

glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan.

Saxena (1990) đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của A. xylinum bằng việc giải

trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose. Ông đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đến

quá trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa. Từ đó đến nay đã có nhiều công trình

nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng… của cellulose vi khuẩn.

1.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn

1.1.2.1 Cellulose vi khuẩn

Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên

kết β-1,4-glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành thớ sợi

thứ cấp, có bề rộng 1,5 nm. Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi

cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loài thực vật. Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành

những vi sợi, những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 3 –

4 nm, và chiều dài 130 – 177 nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải siêu mịn của cellulose vi

3


khuẩn có chiều dài từ 1 µm đến 9 µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ

các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al., 2001)

Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000)

1.1.2.2 Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization - DP)

Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose bao

gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hoá khác nhau. DP của cellulose thực

vật khoảng 13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 – 6000. Tuy nhiên, trong

một số trường hợp DP của cellulose vi khuẩn có thể đạt 16000 đến 20000 phân tử glucose

(Watanabe et al., 1998). Đường kính của bacterial cellulose chỉ vào khoảng 1/100 đường kính

của cellulose thực vật (Bielecki et al., 2001) (hình 2.2).

1.1.2.3 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn.

Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúc

của cellulose vi khuẩn. Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định được kích thước

và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn. Những kỹ thuật khác như phổ hồng ngoại, phổ

Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose

(Bielecki et al., 2001).

Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi hai loại cấu

trúc tinh thể riêng biệt, cellulose Iα và Iβ. Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai loại

cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993). Trong khi hầu hết tinh thể Iβ tinh khiết thu

được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các tinh thể Iα tinh khiết từ

nguồn này. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A. xylinum chứa nhiều tinh thể Iα

4


hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60%. Tỉ lệ này có thể

dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường

(Yamamoto & Horii, 1994). Ngược lại Iβ chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành

nên thành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai. Ở đó, cellulose Iα chỉ

chiếm khoảng 20%.

Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tố quan trọng trong việc xác

định các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có rất ít các nghiên cứu về sự

tương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng biệt của cellulose được thực hiện.

1.1.2.4 Tính chất của cellulose vi khuẩn (El-Saied et al., 2004; Bielecki et al.,

2001)

- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành

phần tỉ lệ Iα cao.

- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I.

- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc.

- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và

hemicellulose.

- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể

phục hồi.

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.

- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao,

ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao.

- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một số

sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian. Đặc biệt vi khuẩn

có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ

cực nhỏ.

- Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách

tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Từ đó có thể kiểm

soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose.

5


Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001)

1.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose.

Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A. xylinum

được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và

được tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh

vật khác nhau là khác nhau. Sau đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả năng

tổng hợp cellulose.

Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose

(Jonas et al., 1998)

Vi sinh vật Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học

Acetobacter Lớp màng ngoại bào

Dải cellulose

Để giữ vi khuẩn trong môi trường

hiếu khí

Achromobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Aerobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Agrobacterium Sợi ngắn Tham gia vào mô thực vật

Alcaligenes Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải

Pseudomonas Các sợi không tách biệt Sự kết bông trong nước thải

Rhizobium Sợi ngắn Tham gia vào hầu hết thực vật

Sarcina Cellulose dị hình Không rõ

Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc Sự kết bông trong nước thải

6


Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản xuất

cellulose. Đặc biệt là A. xylinum vì những đặc điểm ưu việt của nó như: năng suất tạo

cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng…

1.1.3.1 Phân loại A. xylinum

A. xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các

giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia.

Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter

xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter

xylynus.

A. xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau như từ nước quả (Kahlon &

Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ (Faparusi et al., 1974), từ giấm

(Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa (Bernado et al., 1998), từ nấm Kombucha và trà

(Hermann et al., 1928).

1.1.3.2 Đặc điểm hình thái của A. xylinum.

A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di

động, không sinh bào tử. Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng riêng rẽ hay

xếp thành chuỗi.

Nếu A. xylinum phát triển trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chúng biến đổi

thành dạng có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh

hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính một

cách đáng kể.

Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần giữa

khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn

lạc nhẵn.

7


Hình 2.3: SEM của A. xylinum (Forge & Preston, 1977)

1.1.3.3 Đặc điểm sinh lý của A. xylinum (Jonas et al., 1998)

Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O.

Phản ứng catalase dương tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men.

Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer.

Chuyển hóa glucose thành acid gluconic.

Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton.

Không sinh sắc tố nâu.

Tổng hợp cellulose.

8


1.1.3.4 Đặc điểm sinh trưởng của A. xylinum

Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biến dưỡng, vận chuyển chất

dinh dưỡng và oxi đến tế bào. Tuy nhiên lớp màng này có thể giữ nước nên giúp vi khuẩn có

thể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại tia UV.

A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng vi

khuẩn mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chẳng hạn chủng A. xylinum BPR 2001 sử

dụng fructose tốt nhất (Matsuoka et al., 1993) trong khi chủng A. xylinum IFO 13693 sử dụng

glucose hiệu quả hơn (Masaoka et al., 1993)… A. xylinum có thể chuyển hóa glucose thành

acid gluconic, điều này là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2

đơn vị trong quá trình nuôi cấy.

Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển từ 250C đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3. Theo

Hestrin (1947) thì pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 5,5 và không phát triển ở nhiệt độ

370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Maccormide et al. (1996) cho rằng A.

xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến 8, nhiệt độ từ 120C đến 350C và có thể

phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên tới 10%.

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc còn non khuẩn lạc mọc riêng lẻ, khuẩn lạc

nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già tế bào mọc dính thành cụm, và chúng

mọc theo đường cấy giống.

A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta thường bổ sung thêm acid

acetic hay acid citric vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ và tăng hiệu suất

tổng hợp cellulose.

1.1.3.5 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A. xylinum.

Màng cellulose được sản xuất bởi A. xylinum đóng nhiều vai trò cho sự phát triển và

tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên.

Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn (Bielecki et

al., 2001).

Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A. xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới được bề mặt

giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí. Do đó chỉ những tế bào gần ranh giới

lỏng khí của môi trường mới sản xuất cellulose (Krystynowicz et al., 2002;

Watanabe et al., 1998)

9


Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A. xylinum trên cơ chất và bảo

vệ vi khuẩn trước những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất.

Vì độ nhớt và đặc tính ưa nước của lớp cellulose nên khả năng chống chịu với

những thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi sinh vật gây

bệnh…) trong môi trường sống tăng lên.

Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV. 23% vi khuẩn acetic

được bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiếu tia UV

(Bielecki et al., 2001).

1.2 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A. xylinum

1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A. xylinum

Theo Ross et al. (1991), con đường sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn từ glucose thành

các sợi kết tinh đòi hỏi phải có sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDP-Glucose), sau đó

là một phản ứng tổng hợp cellulose và cuối cùng là sự tập hợp lại thành sợi cellulose nhỏ để

hình thành nên các dải tinh thể cellulose.

UDP-Glucose là một nucleotide tiền thân của sự tổng hợp cellulose trong A. xylinum.

Như sơ đồ duới đây, quá trình sinh tổng hợp UDP-Glucose từ glucose là một quá trình trải

qua 3 bước có sự tham gia của 3 loại enzyme. Những bước này là sự phosphoryl hoá của

glucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase thành glucose-6-phosphate, sự izomer hoá của

glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate bởi phosphoglucomutase, và sự tổng hợp

UDP-Glucose bởi UDP-Glucose pyrophosphorylase. UDP-Glucose pyrophosphorylase đóng

vai trò then chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trong khi các chủng

A. xylinum đột biến không có khả năng tổng hợp cellulose bị thiếu enzyme này (Valla &

Kjosbakken, 1981).

10


Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum (Canon & Anderson, 1991)

1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn

Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên được chia thành hai giai đoạn

chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh.

1.2.2.1 Giai đoạn polymer hóa

Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose

thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Sau đó enzyme phosphoglucomutase (PGM) tiếp tục

chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thông qua phản ứng

isomer hóa. Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase chuyển hóa

thành UDP-Glucose. Cuối cùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành cellulose và cellulose

được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase

(Iguchi et al., 2000).

Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạo cellulose

theo con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành

fructose–1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hóa thành fructose-1,6-

biphosphate nhờ enzyme fructose–1-phosphatekinase. Sau đó, enzyme phosphoglucose

isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6-

phosphate. Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như

trên để tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000).

11


Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn (Iguchi et al., 2000)

1.2.2.2 Giai đoạn kết tinh

Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucan. Các chuỗi glucan kết

hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals. Lớp chuỗi

glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết

hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau

tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi và được

phun ra ngoài môi trường thông qua các lỗ trên bề mặt của vi khuẩn (hình 2.6). Ảnh chụp

kính hiển vi điện tử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 – 80 lỗ sắp xếp thành hàng dọc

chiều dài của tế bào (Ross et al., 1991). Các lỗ này chính là các vị trí sinh tổng hợp cellulose

trên bề mặt tế bào. Đây là những lỗ có đường kính khoảng 3,5 nm sắp xếp song song theo

đường thẳng dọc trục vi khuẩn. Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm chứa enzym tổng hợp

cellulose. Mỗi tiểu phần 10 nm tạo ra các chuỗi glucan hình thành vi sợi 1.5 nm.

12


Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A. xylinum

(Iguchi et al., 2000)

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose.

1.2.3.1 Kiểu nuôi cấy

Có 2 kiểu nuôi cấy thường được sử dụng để sản xuất cellulose vi khuẩn, đó là nuôi cấy

tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo.

a) Nuôi cấy tĩnh

Đối với nuôi cấy tĩnh, người ta sử dụng những khay nhựa đã chuẩn bị môi trường và

tiến hành nuôi cấy chủng A. xylinum ở điều kiện tĩnh.

Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, những thớ sợi thứ cấp liên tục được lộ ra từ lỗ sắp xếp

thẳng hàng trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết thành những vi sợi, lắng sâu xuống môi

trường sinh trưởng, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn với nhau tạo thành tấm cellulose

trên bề mặt canh trường dinh dưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu oxy.

Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôi cấy tĩnh cho sản lượng thấp và

mang tính thủ công. Do đó, để sản xuất công nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ thống sản xuất

hàng loạt sử dụng kĩ thuật nuôi cấy hiệu quả hơn (Edwards, 1995).

b) Nuôi cấy có khuấy đảo

13


Tiến hành nuôi cấy trong thiết bị lên men chứa dung dịch môi trường, có cánh khuấy,

thổi khí oxy hoặc lắc. Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dịch và phát triển theo chiều sâu

của môi trường. Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu, elip…

Đây là kĩ thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứng

dụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ mới

được sản xuất với sản lượng thấp. Sản xuất cellulose từ A. xylinum bằng phương pháp nuôi

cấy có khuấy đảo gặp phải một số trở ngại, trở ngại lớn nhất cho đến nay là tính không ổn

định khi nuôi cấy. Tính không ổn định được thể hiện bởi sự mất khả năng sản xuất cellulose

và thay thế dần tế bào sản xuất cellulose bằng chủng đột biến không có khả năng sản xuất

cellulose (Hai-Peng et al., 2002; Chao et al., 1997).

Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế bào A. xylinum được gắn

vào những phần tĩnh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn, Vandamme et

al. (1998) đã giới thiệu “điểm dính đa chức năng” trong bình nuôi cấy bằng cách cung cấp

vào môi trường những phần tử nhỏ không tan như diatonit, silicagel, cát biển, những hạt thủy

tinh nhỏ, đất mùn, cellulose thực vật được giã nhỏ... Nồng độ phần tử nhỏ đưa vào được tối

ưu tuỳ theo mức độ khuấy, cũng như mức độ lắc của khay (Yoshinaga et al., 1997).

Sự lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy phụ thuộc vào mục đích thương mại của polymer sinh

học, hơn nữa cấu trúc cellulose và đặc tính cơ lý của nó bị ảnh hưởng rất lớn của phương pháp

nuôi cấy (Hai-Peng et al., 2002). Trong điều kiện nuôi cấy bề mặt, màng cellulose dày được

tạo thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Trong khi dưới điều kiện nuôi cấy chìm, cellulose

lại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, những khối không đều, dạng viên kết hay

dạng cầu kích thước từ 10 µm đến 1000 µm.

14


Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (trái) và có khuấy đảo (phải)

(El-Saied et al., 2004)

Hình 2.8 thể hiện sự khác biệt về cấu trúc của cellulose khi nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy

có khuấy đảo.

Những phần tử hình cầu mịn của cellulose trong nuôi cấy chìm (Agitated bacterial

cellulose – Ag-BC) có cấu trúc mắt lưới tương tự cấu trúc mắt lưới của màng mỏng cellulose

thu được khi nuôi cấy bề mặt (Static bacterial cellulose – St-BC). Tuy nhiên có vài sự khác

biệt về hình thái trong những sợi nhỏ và trong cấu trúc này giữa St-BC và Ag-BC. Sợi

cellulose của St-BC duỗi thẳng trong khi sợi cellulose Ag-BC cong và rối, làm cấu trúc mắt

lưới dày hơn so với cấu trúc St-BC. Bên cạnh đó, chiều rộng sợi Ag-BC mỏng hơn so với St-

BC, mặc dù rất khó xác định chính xác kích thước của mỗi sợi. Hình thái này có được có thể

do dòng chảy rối loạn và áp lực do dịch chuyển không ngừng của môi trường khi nuôi cấy

dưới điều kiện có khuấy đảo. Những thay đổi về hình thái học có liên quan đến những thay

đổi trong cấu trúc vi mô như trọng lượng phân tử, độ kết tinh, thành phần Iα, bảng 2.2 cho

thấy rõ điều này.

15


Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (a) và nuôi cấy có khuấy đảo (b)

(Watanabe et al., 1998)

Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC (Watanabe et al., 1998)

Đặc tính cấu truùc Ag-BC St-BC

Chỉ số kết tinh a 63 71

Kích thước tinh thể b 6.9 7.4

Sự kết tinh c (%) 72 80

Cellulose Iα c (%) 61 73

Ñoä polymer hoaù 10900 14400

a. Xaùc ñònh baèng phöông phaùp chuïp nhieãu xaï tia X.

b. Öôùc löôïng baèng phöông phaùp chuïp nhieãu xaï tia X kích thöôùc cuûa maët

phaúng tinh theå hoïc.

c. Xaùc ñònh baèng CP/MAS 13C NMR.

Do nhöõng khaùc bieät veà caáu truùc maø St-BC vaø Ag-BC coù nhöõng tính chaát

coù lieân quan tôùi nhöõng öùng duïng thöông maïi cuõng khaùc nhau nhö trình baøy ôû

baûng 2.3.

Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC (Watanabe et al., 1998)

16


Đặc trưng Ag-BC St-BC

Young module cuûa maøng (GPa) 28,3 33,3

Khaû naêng giöõ nöôùc (g nöôùc/g

cellulose)

170 45

Chức năng giúp duy trì lọc (%) 43 38

Chỉ số ổn định nhũ tương (%) 83 60

Khả năng giữ nước của cellulose vi khuẩn là khối lượng nước được giữ lại trên một

đơn vị khối lượng của sợi cellulose, lượng nước này được giữ trên bề mặt và trong những

phần tử tạo nên sợi cellulose.

Giá trị của chức năng duy trì lọc được định nghĩa là lượng phân tử CaCO3 bị giữ trên

tờ giấy cellulose. Phân tử nhỏ hơn và phân tán hơn của Ag-BC bị phân hủy có hiệu quả hơn

phân tử của St-BC trong việc giữ lại các hột nhỏ vì phân tử của Ag-BC bị phân hủy có bề mặt

hiệu dụng rộng hơn suốt quá trình lọc trong sản xuất giấy. Trong trường hợp của chất ổn định

nhũ tương, phân tử Ag-BC bao phủ bề mặt của những giọt dầu rộng hơn và nhũ tương chứa

trong Ag-BC ổn định hơn.

Do đó, Ag-BC thể hiện nhiều đặc tính phù hợp hơn cho những ứng dụng công nghiệp

hơn St-BC (Watanabe et al., 1998).

1.2.3.2 Ảnh hưởng của thiết bị đến năng suất tạo thành cellulose vi khuẩn

Phương pháp sản xuất cellulose vi khuẩn truyền thống là nuôi cấy tĩnh, nhưng phương

pháp này đòi hỏi phải có diện tích lên men lớn và thời gian lên men dài. Do đó một số phương

pháp khác được khảo sát để thay thế cho phương pháp nuôi cấy tĩnh.

Thùng lên men khuấy trộn được dùng rộng rãi trong sản xuất cellulose vi khuẩn, nuôi

cấy liên tục có bổ sung ethanol làm tăng tốc độ tổng hợp cellulose gấp 2 lần so với nuôi cấy

mẻ. Hơn nữa trong điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo, dễ dàng kiểm soát các yếu tố môi

trường. Tuy nhiên, khó khăn của quá trình nuôi cấy lắc là cellulose sinh ra tích lũy trong môi

trường làm cho môi trường có độ nhớt cao dẫn đến khó kiểm soát quá trình khuấy trộn và sục

khí. Các viên huyền phù cellulose có độ giữ nước cao, nhanh chóng choáng hết thể tích môi

trường, gây khó khăn cho vi sinh vật phát triển tạo cellulose (Klemm et al., 2001; Yoshinaga

et al., 1997).

17


Một số thiết bị lên men sản xuất cellulose vi khuẩn:

a) Ajinomoto

Được đặt tên theo tên một công ty, phương pháp này sử dụng môi trường bề mặt nhằm

cải thiện sự tổng hợp của cellulose. Các tế bào đầu tiên được nhân giống trong thiết bị có sục

khí trước khi được cho vào các khay tĩnh. Sau 3 ngày trong thiết bị suc khí, mật độ tế bào vào

khoảng 2x107 (tế bào/ml). Lúc này, dịch lên men được chuyển vào các khay có sục khí. So

sánh với quá trình lên men thông thường tạo cellulose thì thiết bị nay fcho năng suất cao hơn

140%. Sản phẩm có khả năng giữ nước thấp và chứa khoảng 10% lượng sucrose ban đầu

(Okiyama et al., 1992).

b) Weyerhauser

Được đặt tên theo tên của một công ty Mỹ phát minh ra, một quá trình được phát triển

để sản xuất sợi có kích thước nhỏ, khoảng 1/300 kích thước của bột gỗ. Sử dụng các chất gây

đột biến đổi hóa học để thay đổi các mức độ tác động của enzyme, chủng A. xylinum được

phân lập để làm giảm lượng chất phụ sinh ra trong quá trình sản xuất, bao gồm gluconic acid

với việc điều chỉnh pH thấp hơn. Rõ rằng hơn, chủng vi sinh vật được phân lập để sản xuất

cellulose khi khuấy đảo. Trước đây, khuấy đảo một dịch lên men để cung cấp oxy, và sự trao

đổi chất, tổng hợ cellulose không ngừng. Tuy nhiên, sản phẩm tạo ra từ phương pháp này là

một dịch huyền phù sệt, nhớt, tên thương mại là Cellulon (Black et al., 1990).

c) ICI

ICI (Imperial Chemical Industry) bao gồm 4 bước và sản xuất một chất sệt giống với

hệ thống Weyerhauser. Bước đầu tiên là bước tích lũy. Khi đó vi khuẩn được phép phát triển

trong một thiết bị phản ứng có khuấy đảo đến khi nguồn carbon được tiêu thụ hết. Sau đó bổ

sung nguồn carbon với tốc độ phù hợp cho sự tổng hợp cellulose. Bước cuối cùng là loại đi

các huyền phù từ thiết bị phản ứng và sau đó tách các tế bào vi sinh vật ra khỏi sản phẩm

(Serafica et al.,1998).

d) Gengiflex®, Biofill® và BASYC®

Chủng A. xylinum thích hợp được đưa vào một thiết bị, trong đó tạo điều kiện tối ưu

cho chúng phát triển. Các điều kiện tối ưu cho sự sản xuất cellulose sau đó được áp dụng cho

dịch lên men. Tất cả các quy trình đều được phát triển trên môi trường cơ bản của Schramm

và Hestrin (1954).

18


Gengiflex® được áp dụng trong công nghiệp nha khoa, cụ thể là được áp dụng để giúp

hồi phục lại mô bao quanh răng (Novaes et al., 1997).

Biofill®, được sử dụng như là một dải băng, có thể được ứng dụng băng các vết

thương trong trường hợp bị phỏng hay bị loét. Biofill® được sử dụng như da nhân tạo cho con

người. Mặt hạn chế lớn nhất của sản phẩm là bị giới hạn bởi tính co giãn khi ứng dụng để làm

các vết băng tai những vùng có cường độ vận động cao. Ngược lại, ưu điểm của nó là giúp hồi

phục nhanh chóng vết thương, và khả năng chống nhiễm trùng tốt. Cellulose trong suốt cho

phép kiểm tra, theo dõi vết thương dẽ dàng trong khi Biofill® sẽ tách ra khi vết thương hồi

phục. Với việc rút ngắn thời gian và chi phí điều trị, Biofill® được đánh giá rất cao (Fontana

et al,. 1990).

Một nhóm các nhà hóa học, sinh vật học và giải phẫu học đã phát triển một sản phẩm

gọi là BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose). BASYC® là một sản phẩm dạng ống

dùng thay cho các mạch máu. Các ống có đường kính trong khoảng 1mm và dài 5mm, được

sử dụng thay thế cho mạch máu. Công dụng khác của loại sản phẩm này là bề mặt trong của

ống BASYC® nhẵn và trơn hơn các vật liệu tổng hợp khác khi sử dụng cùng mục đích

(Klemm et al,. 2001).

e) Thiết bị thu nhận cellulose liên tục

Thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm. Sử dụng một dụng cụ có độ sâu không

lớn để lượng môi trường cần thiết là tối thiểu, các sợi cellulose được thu bởi một trục quay

liên tục với tốc độ 35 mmh-1. Sau một thời gian thu nhận cellulose thì đem cellulose đi xử lý.

Ưu điểm lớn nhất của dạng thiết bị này là cellulose có thể được thu nhân liên tục và môi

trường mới được bổ sung sau mỗi 12 giờ (Sakairi et al., 1997).

f) Thiết bị phản ứng có sục khí tuần hoàn và khuấy đảo

Trong môi trường tĩnh, thời gian nhân đôi số lượng tế bào là từ 8 – 10 giờ, trong khi

trong điều kiện có lắc đảo, thời gian này là 4 – 6 giờ (Canon và Anderson, 1991). Bằng cách

tăng khuấy đảo và cung cấp oxy cho môi trường nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng tế bào cũng tăng

lên. Do đó, khả năng sản xuất với tỷ lệ lớn là có thể, thiết bị lên men có khuấy đảo và có sục

khí được nghiên cứu và mong muốn tạo ra cellulose dạng II. Độ nhớt cao của môi trường và

sức cản mạnh là trở ngại của phương pháp. Với phương pháp này thì sợi cellulose tạo ra có

cấu trúc không bình thường (Kouda et al., 1997).

19


1.2.3.3 Aûnh hưởng của áp suất oxy đến quá trình tổng hợp cellulose vi khuẩn

Sự hình thành cellulose diễn ra tại vị trí mặt phân cách giữa không khí và lớp màng

cellulose chứ không phải tại mặt phân cách giữa môi trường và cellulose. Do đó oxy là nhân

tố quan trọng cho quá trình tổng hợp cellulose (Borzano & Desouza et al., 1995).

Watanabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy ảnh hưởng đến cả sự hình

thành cellulose cũng như sức sản xuất màng. Cellulose tăng trưởng dưới áp suất oxy thấp có

sự phân nhánh nhiều hơn so với cellulose tăng trưởng trong điều kiện áp suất cao hơn. Điều

này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến tính dai của lớp màng. Hơn nữa, với áp suất oxy là 10%

tính sản xuất cellulose cao hơn 25% mà không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tế bào. Sự

tổng hợp cellulose tại áp suất 10% và 15% cao hơn so với điều kiện áp suất khí quyển. Tuy

nhiên, hàm lượng oxy cao trên 50% lại hạn chế khả năng tổng hợp cellulose của vi sinh vật.

(Yamanaka & Watanabe et al., 1995).

1.2.3.4 Aûnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sản phẩm cellulose vi khuẩn

1. Ảnh hưởng của pH

Sự chuyển hóa glucose thành acid gluconic trong quá trình tổng hợp cellulose là

nguyên nhân chính của sự giảm pH của môi trường lên men. pH ảnh hưởng rất lớn đến sự

phát triển của tế bào và sự hình thành cellulose (Hwang, J.W et al., 1999). Các báo cáo trước

đây đã đưa ra các kết luận cho thấy pH tối ưu cho sự tổng hợp cellulose từ A. xylinum là trong

khoảng 4 – 7. Trong khi đó, trong báo cáo của mình, Fiedler et al. (1989) đưa ra khảng pH tối

ưu là 5 - 7. Masaoka et al. (1993) thì thấy rằng khoảng này là 4 - 6. Qua các kết quả nghiên

cứu đó cho chúng ta kết luận rằng pH thấp hơn 7 là thích hợp cho sự tổng hợp cellulose và sự

phát triển của tế bào vi sinh vật A. xylinum.

A. xylinum đồng thời tổng hợp cả cellulose và cellulase. Cellulase ít được tổng hợp ở

pH thấp (pH < 5) và được tổng hợp nhiều hơn ở pH cao. Độ bền cơ học của tấm cellulose

nuôi cấy tại pH 4 cao hơn độ bền của tấm cellulose nuôi ở pH 6 (Toda et al., 1997).

2. Ảnh hưởng của nhiệt độ

Sự tổng hợp cellulose phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt độ. Nhiệt độ từ 25 - 300C là thích

hợp cho sự tổng hợp cellulose (Canon & Anderson, 1991). Hầu hết các nghiên cứu đều sử

dụng khoảng nhiệt độ từ 25 - 300C.

Sự thay đổi nhiệt độ không những chỉ thay đổi hiệu suất tổng hợp cellulose mà còn

thay đổi cả cấu trúc của cellulose, đặc biệt là khả năng giữ nước và mức độ polymer hóa.

20


cellulose được sản xuất ở 300C có mức độ polymer hóa thấp hơn và khả năng giữ nước cao

hơn so với cellulose được sản xuất ở nhiệt độ thấp hơn (Geyer et al., 1994).

Nhiệt độ cao (khoảng 1000C trong 3 giờ) không gây ảnh hưởng cho cấu trúc cellulose

nhưng nhiệt độ thấp (-20 0C) sẽ làm tăng tính mềm dẻo của cellulose vi khuẩn (Zou et al.,

2006).

1.2.3.5 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy

1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về quá trình tổng hợp cellulose của chủng A.

xylinum là môi trường do Hestrin và Schramm (1954) thiết lập, có nguồn nitơ là dịch chiết

nấm men và peptone với tỉ lệ tương ứng là 5:3. Từ khi thành phần môi trường này được đưa

ra, nó đã trở thành môi trường cơ bản cho hầu hết các nghiên cứu về sản xuất cellulose vi

khuẩn. Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau đã có sự thay đổi thành phần môi trường liên quan

đến phần trăm của nitơ từ các nguồn khác nhau như dịch chiết nấm men, CSL (corn steep

liquor), peptone, trypton, cao thịt, proteopeptone…Tất cả các nguồn nitơ này đều được ứng

dụng, trong đó CSL là nguồn nitơ được cho là có hiệu quả nhất, tác động tăng trưởng tế bào

và tốc độ tạo cellulose cao so với các nguồn nitơ khác và đây cũng là nguồn nitơ có giá thành

tương đối rẻ (Klemm et al., 2001; Jonas et al., 1998; Toda et al., 1997).

Một vài amino acid bắt buộc phải có là methionine và glutamate. Masaoka et al.

(1993) đã chứng minh methionine có tác dụng quan trọng đến sự tăng trưởng tế bào và tăng

hiệu suất tạo cellulose so với môi trường không có amino acid này.

Các vitamin pyridoxine, nicotinic acid, p-aminobezoic acid và biotin được xác định là

cần thiết cho sự tăng trưởng và tổng hợp cellulose, trong khi pantothanate và riboflavin cho

kết quả ngược lại (Yang et al., 1998).

2. Ảnh hưởng của nguồn carbon.

Rất nhiều cơ chất được sử dụng làm nguồn carbon cho sự hình thành cellulose bởi vi

khuẩn A. xylinum. Các chủng vi khuẩn khác nhau tổng hợp cellulose với những lượng khác

nhau đối với các cơ chất khác nhau.

Glucose được xem là nguồn carbon tốt nhất cho A. xylinum IFO 13693 tổng hợp

cellulose, lượng cellulose có thể đạt được lên tới 0,6 g/g glucose/ngày sau 2 - 4 ngày lên men

21


(Masaoka et al., 1993). Tuy nhiên, hàm lượng cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum Ku-1

khi sử dụng nguồn cơ chất là mannitol và arabitol cao hơn 3 lần so với khi sử dụng cơ chất là

glucose (Oikawa et al., 1995). Bên cạnh đó, fructose lại là nguồn cơ chất thích hợp nhất cho

A. xylinum BPR2001 tổng hợp cellulose (Matsuoka et al., 1996).

Jonas & Farah (1998) đã so sánh lượng cellulose tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum

IFO 13693 khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau, glucose được chọn làm nguồn carbon để

đối chứng (bảng 2.4).

Bảng 2.4: Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của

A. xylinum IFO 13693 (Jonas & Farah, 1998)

Nguồn Carbon Năng suất tổng hợp cellulose (%)

Monosaccharides

D-Glucose

D-Fructose

D-Galactose

D-Xylose

D-Arabinose

D-Sorbose

Disaccharides

Lactose

Malnose

Sucrose

Cellobiose

Polysaccharides

Tinh bột

Ethanol

Ethylene glycol

Propylene glycol

Glycerol

D-Arabitol

D-Mannitol

Acid hữu cơ

100

92

15

11

14

11

16

7

33

7-11

18

4

1

8

93

620

380

22


Citrate

L-Malate

Succinate

Những chất khác

Glucono-lactate

O-methyl-glucose

20

15

12

62

0.5

1.2.3.6 Tỷ lệ diện tích bề mặt – thể tích (S/V)

Bởi vì sự hình thành cellulose diễn ra trên mặt tiếp xúc giữa không khí và môi trường

(Masaoka et al.,1993) nên tỉ lệ diện tích bề mặt tiếp xúc và thể tích môi trường là nhân tố có

vai trò khá quan trọng trong sự hình thành và tổng hợp cellulose. Tỉ lệ tốt nhất đối với các

chủng vi khuẩn khác nhau và điều kiện môi trường đang sử dụng khác nhau là khác nhau.

Vandamme et al. (1998) đưa ra kết luận tỉ lệ S/V khoảng 2,2 cm-1 cho kết quả tốt nhất khi

khảo sát trên dải tỉ lệ từ 1 đến 3 cm-1. Trong khi đó, lượng cellulose thu được cao nhất khi S/V

bằng 0,7 cm-1 khi khảo sát trên dải tỉ lệ từ 0,27 đến 2,13 cm-1 (Krystynowicz et al., 2002).

1.3 Ứng dụng của cellulose vi khuẩn.Mặc dù bản chất hóa học tương tự cellulose thực vật nhưng nhờ sản xuất dễ dàng, đặc

tính cơ học cao, tính ổn định dưới hóa chất và nhiệt độ cao, cellulose vi khuẩn là vật liệu được

chọn cho nhiều ứng dụng (Watanabe et al., 1998).

1.3.1 Thực phẩm

Các loại vi khuẩn gây thối rữa là nguyên nhân làm cho thực phẩm bị hư hỏng và làm

giảm thời gian sử dụng của sản phẩm thực phẩm. Vấn đề bảo quản sản phẩm thực phẩm tránh

khỏi các vi sinh vật gây hư hỏng được đặc biệt quan tâm. Có nhiều cách để bảo quản sản

phẩm, ví dụ như dùng các hoá chất bảo quản chống vi sinh vật là một cách khá phổ biến. Tuy

nhiên, với cellulose vi khuẩn, người ta có thể ứng dụng để làm màng bao chống vi sinh vật.

Theo đó, chất chống vi sinh vật sẽ được kết hợp với màng, làm các chất bảo quản này tập

trung trên màng bao làm thành bức tường bảo vệ thực phẩm, đồng thời giảm lượng hoá chất

bảo quản trong thực phẩm, khi sử dụng sản phẩm, màng này có thể được loại bỏ dễ dàng. Ứng

dụng làm màng bao bảo quản thực phẩm là một trong những ứng dụng quan trọng của

cellulose vi khuẩn trong ngành công nghệ bao bì trong những năm gần đây (Yoshinaga et al.,

1997).

23


Một sản phẩm thực phẩm được biết đến khá nhiều mà bản chất là cellulose vi khuẩn

đó là thạch dừa (Nata de coco). Nata de coco là một chất màng màu trắng hoặc màu vàng

kem được tổng hợp trong quá trình lên men của A. xylinum trên bề mặt của môi trường có

đường và acid, ví dụ nhu nước trái cây. Nata de coco được cho rằng có thể làm thực phẩm ăn

kiêng giúp chống lại bệnh ung thư ruột, chứng xơ cứng động mạch, chứng nhồi máu cơ tim và

nhiều bệnh khác (El-Saied et al., 2004). Nata de coco đã trở thành món ăn truyền thống của

Philippine và rất phổ biến ở nhiều quốc gia khác, trong đó có Việt Nam (Lapuz et al., 1967).

1.3.2 Y học

Vì khả năng giữ nước cao nên cellulose vi khuẩn có thể được sử dụng như tấm da

nhân tạo tạm thời để chữa phỏng. Hơn nữa, cellulose vi khuẩn còn làm tăng khả năng phát

triển tế bào da người. Sản phẩm ứng dụng màng cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực y học là

làm da tạm thời khá phổ biến như chế phẩm Biofill®. Tại Việt Nam, bộ môn Vi sinh khoa

Dược trường Đại học Y dược nghiên cứu sản xuất màng trị phỏng bằng màng cellulose vi

khuẩn có tẩm dầu mù u và mang lại hiệu quả cao khi sử dụng cho bệnh nhân.

Một nhóm các nhà khoa học, sinh học và giải phẫu học phát triển sản phẩm là

BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose). BASYC® là ống sản xuất theo phương pháp

tĩnh được sử dụng thay thế mạch máu. Nghiên cứu này bắt nguồn từ cấu trúc mạng sợi siêu

mịn, tính chất bền cơ cao và độ trương phồng cao của cellulose vi khuẩn (Klemm et al.,

2001).

1.3.3 Các ngành công nghiệp khác

Sản xuất cellulose vi khuẩn quy mô lớn của Weyerhaeuser Co. (Tacoma, Washington

USA) và Cetus Co. (Emeryville, California, USA) đưa tới sự phát triển của cellulon® với

nhiều ứng dụng rộng rãi. Ví dụ bao gồm ứng dụng trong bộ phận khai mỏ, trong ứng dụng nối

và phủ để cố định màng và như thành phần thực phẩm để làm chất độn, chất kết cấu hay làm

giảm celorie.

Ứng dụng của cellulose vi khuẩn làm chất cố định tế bào được Friedleer et al mô tả.

Biopolymer Research Co. Ltd, Japan thiết lập mục đích xa hơn của kỹ thuật ứng dụng công

nghiệp của polymer sinh học và bây giờ đang tập trung nghiên cứu “Biocellulose”. Tính chất

của polymer hiệu dụng có nguồn gốc vi sinh vật cũng đang được xem xét (Watanabe et al.,

1998).

24


Cellulose vi khuẩn hiện được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với những ứng dụng

thú vị và đang tiếp tục nghiên cứu, phát triển sản xuất hàng loạt.

Các lĩnh vực ứng dụng cellulose vi khuẩn được trình bày trong bảng 2.5

Bảng 2.5: Ứùng dụng cellulose vi khuẩn trong nhiều lĩnh vực khác nhau

Lĩnh vực Sản phẩm

Thực phẩm Thực phẩm tráng miệng (Nata de coco, kem, kẹo, snack, khoai tây chiên ít calorie)

Thực phẩm giảm cân

Thịt nhân tạo

Bao bọc thịt và xúc xích

Giảm huyết thanh cholesterol

Thuốc rượu Kombucha hay trà Manchurian

Y tế Màng trị thương, màng trị phỏng

Tác nhân vận chuyển thuốc

Da nhân tạo

Mạch máu nhân tạo

Màng bao sụn

Mỹ phẩm Kem thoa da

Chất laøm se, chất ổn đñịnh

Màng nhân tạo

Chất làm dày và tăng cứng cho thuốc đánh bòng móng tay

Môi trường Vật liệu hút vết dầu tràn hay chất độc hại

Màng siêu lọc làm sạch nguồn nước

Dầu mỏ Vật liệu thu hồi và tái sinh khoáng chất và dầu

Da giầy Da nhân tạo

Thể thao ngoài

trời

Lều dùng một lần và đồ dùng cắm trại

Tiện ích công Màng thẩm thấu ngược

25


cộng

Chăm sóc trẻ

em

Tã giấy dùng một lần có khả năng tái sinh

Aâm thanh Màng rung chuyển đổi âm thanh

Công nghiệp gỗ Chất tăng cứng cho gỗ nhân tạo

Chất bổ sung làm giấy

Thùng chứa chịu lực cao

Công nghiệp

giấy

Giấy lưu trữ hồ sơ

Giấy làm tiền tệ

Giấy điện tử

Máy móc tự

động và máy

bay

Thân xe hơi

Yếu tố cấu trúc cho máy bay

Màng bao tàu vũ trụ

Phòng thí

nghiệm

Giá thể nuôi cấy mô tế bào thực vật

Lĩnh vực khác Màng composite

26

Chương 3. Nguyên liệu và phương pháp

Chương 3: NGUYÊN LIỆUVÀ PHƯƠNG PHÁP

1.4 Nguyên liệu

1.4.1 Chủng vi sinh vật

Chủng vi sinh vật được sử dụng để sinh tổng hợp cellulose là chủng của vi khuẩn A.

xylinum được cung cấp bởi phòng Thí nghiệm Sinh học, trường Đại học Bách khoa thành phố

Hồ Chí Minh. Chủng vi sinh vật được giữ trên thạch nghiêng ở 40C trong môi trường tự nhiên

có thành phần chính là nước dừa.

1.4.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Các thí nghiệm đều sử dụng môi trường cơ bản là môi trường Hestrin – Schramm

(HS) bao gồm thành phần như sau: glucose 20 gl-1, cao nấm men 5 gl-1, peptone 3 gl-1,

Na2HPO4 5 gl-1, acid citric 1,15 gl-1, nếu môi trường đặc thì có thêm agar 20 gl-1, nước cất vừa

đủ 1 lít (Schramm et al., 1954).

- Môi trường nhân giống được chuẩn vị bằng cách lấy một khuẩn lạc riêng rẽ, cho

vào 10 ml môi trường HS trong ống nghiệm đã được tiệt trùng ở 1210C, 20 phút.

Nuôi cấy 3 ngày, sau đó lọc để tách lấy dịch giống đi nhân giống cấp 2.

- Môi trường nhân giống cấp 2 cũng có thành phần dinh dưỡng như đối với môi

trường nhân giống cấp 1, tuy nhiên được chuẩn bị trong bình erlen 250 ml chứa 90

ml môi trường HS. Thể tích giống cấp 1 cho vào là 10% (v/v).

- Môi trường lên men được chuẩn bị vào các erlen 250 ml chứa 90 ml môi trường

HS và được thanh trùng ở nhiệt độ 1000C, thời gian 20 phút. Lượng dịch giống sử

dụng lên men là 10% (v/v).

Kế hoạch thí nghiệm xây dựng như phần thiết kế thí nghiệm sau.

27


1.5 Thiết kế thí nghiệm

1.5.1 Khảo sát quá trình nhân giống.

Chủng A. xylinum từ ống nghiệm thạch nghiêng được bảo quản trong tủ lạnh. Chuẩn

bị môi trường HS vào các hộp Petri. Cấy giống vi khuẩn từ ống thạch nghiêng lên các hộp

Petri đó nhằm phân lập, đảm bảo nguồn giống đưa vào sử dụng được phát triển từ một khuẩn

lạc. Sau khoảng 30 ngày tiến hành phân lập lại một lần nhằm đảm bảo giống có hoạt tính sinh

học cao nhất.

Sau 2 ngày, các khuẩn lạc đã phát triển trên hộp Petri thành từng khuẩn lạc riêng rẽ.

Từ một khuẩn lạc đó, cấy lên các ống nghiệm chứa 10 ml môi trường nhân giống cấp 1, nuôi

NỘI DUNG THÍ NGHIỆM

Thí nghiệm 1: Khảo sát quá trình phát triển của chủng vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS.

Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum.

Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa môi trường bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm.

Thí nghiệm 2: Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS.

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose trên môi trường HS.

Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum.

28


cấy trong tủ ấm tại nhiệt độ 280C, thời gian 3 ngày. Sau thời gian 3 ngày, lọc dịch nhân giống

trong điều kiện vô trùng để tách các sợi cellulose, thu dịch giống cấp 1 . Sau đó dùng dịch

giống đó tiến hành nhân giống cấp 2.

Chuẩn bị 90 ml môi trường HS đã tiệt trùng vào erlen 250 ml, cho 10 ml dịch giống

cấp 1 vào, lắc đều và để ở nhiệt độ 280C, không khuấy đảo. Tiến hành xác định mật độ tế bào

ngay sau khi bắt đầu nhân giống cấp 2 và sau mỗi khoảng thời gian 24 giờ.

Mục đích của thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng phát triển của chủng A. xylinum

hiện có trong điều kiện môi trường hoá học, từ đó chọn thời gian lên men cho các thí nghiệm

tiếp theo.

1.5.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose.

Nuôi cấy thu nhận cellulose từ với chủng vi khuẩn đã được nhân giống cấp 2, xây

dựng thí nghiệm như sau:

Cho 10ml dịch giống cấp 2 vào erlen 250 ml chứa 90 ml môi trường HS đã thanh

trùng ở nhiệt độ 1000C, thời gian 20 phút. Sau khi cấy giống, để ở nhiệt độ 280C, không lắc

đảo. Đến ngày thứ 5 thì bắt đầu thu cellulose, khảo sát khối lượng cellulose thu được tại các

ngày thứ 4, thứ 5, thứ 6, thứ 7.

Chỉ tiêu theo dõi:

- Khối lượng cellulose thu được ở các ngày thứ 4, 5, 6, 7.

- pH của môi trường trong thời gian 4, 5, 6, 7 ngày.

1.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi

khuẩn A. xylinum

Nhằm đánh giá tác động của pH lên khả năng tổng hợp cellulose của chủng A. xylinum

hiện tại, chúng tôi tiến hành nuôi cấy thu cellulose tại các giá trị pH ban đầu khác nhau, từ đó

rút ra khoảng pH tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulose của chủng vi khuẩn này.

Phương pháp thí nghiệm như sau: nuôi cấy A. xylinum trên môi trường cơ bản HS trong erlen

250 ml, tỉ lệ giống cấy là 10%, thay đổi pH ban đầu từ 3 đến 7, nuôi cấy ở nhiệt độ 28 0C. Sau

khi kết thúc quá trình lên men, thu nhận cellulose và nhận xét ảnh hưởng của pH lên khả năng

tổng hợp cellulose của chủng vi khuẩn A. xylinum.

29


1.5.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất

tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum

Sau khi đã xác định được thời gian nhân giống cho chủng vi khuẩn A. xylinum, thực

hiện khảo sát tác động độc lập của nguồn carbon và nitơ đến hiệu suất sinh tổng hợp

cellulose. Đây là thí nghiệm nhằm chọn lựa nguồn carbon và nitơ tốt nhất cho chủng A.

xylinum hiện tại.

Dịch giống sau khi nhân giống cấp 2 sẽ được lên men trong các môi trường được

chuẩn bị với các thành phần như môi trường HS nhưng nguồn carbon và nguồn nitơ được

thay đổi, các thành phần khác của môi trường được giữ nguyên. Cụ thể, nguồn carbon được

thay đổi giữa các chất sau: mannitol, glucose, fructose, sucrose. Nguồn nitơ được sử dụng

gồm: cao nấm men, cao thịt, peptone, tryptone, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4. Sau khi thu nhận

cellulose, so sánh kết quả, đánh giá hiệu suất của các nguồn cơ chất trên đối với khả năng sinh

tổng hợp cellulose của A. xylinum.

1.5.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nguồn carbon và nitơ lên hiệu

suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum

Sau khi đã xác định được nguồn carbon và nguồn nitơ thích hợp nhất làm thành phần

cho môi trường cho chủng A. xylinum này tổng hợp cellulose, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng

đồng thời của hai nguồn cơ chất carbon và nitơ lên khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn

A. xylinum.

Nguồn carbon thích hợp nhất và nguồn nitơ thích hợp nhất theo kết quả của thí

nghiệm trên sẽ được khảo sát tại nhiều hàm lượng khác nhau, đánh giá hiệu suất thu nhận

cellulose tại các hàm lượng đó, từ các số liệu thực nghiệm, xây dựng phương trình hồi quy,

rút ra hàm lượng nguồn carbon và nitơ thích hợp nhất cho A. xylinum tổng hợp cellulose.

Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tìm điểm tối ưu cho thành phần môi

trường lên men. Thiết kế thí nghiệm như bảng 3.1 và 3.2.

Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon và nguồn nitơ

T

N

Biến y y

*x1 x2

30


1 -1 0

2 -1 +1

3 0 -1

4 0 +1

5 +1 0

6 +1 +1

7 -1 -1

8 +1 -1

9 0 0

1

0

0 0

1

1

0 0

Trong đó, y là hàm lượng cellulose trung bình thực tế thu được trong các thí nghiệm,

y* là hàm lượng cellulose thu được theo phương trình hồi quy trong các thí nghiệm, x1 là yếu

tố ảnh hưởng thứ nhất (nguồn carbon), x2 là yếu tố ảnh hưởng thứ hai (nguồn nitơ).

Các biến độc lập sẽ được tiến hành thu số liệu ở 3 giá trị nồng độ: mức trên (+) và

mức dưới (-) và mức trung bình (0).

Đối với nguồn nitơ:

- Nếu peptone được sử dụng làm nguồn nitơ thì hàm lượng được cho ở mức 8 gl-1.

- Nếu peptone và cao nấm men cùng được sử dụng làm nguồn nitơ thì chọn tổng

hàm lượng là 8 gl-1 với tỉ lệ 1:1

Bảng 3.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát

Kí hiệu Nguồn carbon Nguồn nitơ

31


x1 (gl-1) x2 (gl-1)

0 25 8

-1 20 6

+1 30 10

1.6 Các phương pháp phân tích.

1.6.1 Số lượng vi khuẩn

Số vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch. Dịch lên

men được pha loãng với 0,1% peptone (pH 5). Cho 0,1 ml dịch lên men đã pha loãng lên đĩa

chứa môi trường agar HS, nuôi cấy ở 280C. Số khuẩn lạc được xác định sau 3 ngày nuôi cấy

(Koula et al., 1997).

1.6.2 Hàm lượng cellulose

Cellulose ướt thu được từ bình lên men được rửa với nước cất để loại bỏ các thành

phần môi trường còn sót lại. Sau đó, khối cellulose ướt được xử lý với dung dịch NaOH 0,5M

ở 90oC trong thời gian 1 giờ để loại bỏ hoàn toàn các tế bào vi khuẩn còn sót. Sau đó, khối

cellulose được rửa lại bằng nước cất đến khi pH dung dịch nước rửa về trung tính. Sấy

cellulose sạch thu được ở 1050C đến khi khối lượng không đổi. Cân xác định khối lượng của

cellulose thu được (Son et al., 2001).

1.6.3 Phân tích thống kê

Số liệu nghiên cứu được biểu diễn bằng trung bình kết quả của 3 lần lặp lại với sai số

tương đối. Sự khác nhau của các giá trị riêng lẻ được kiểm định bằng t – test bằng phần mềm

R cho Windows® với mức ý nghĩa 5% (P < 0,05).

32

Chương 4. Kết quả và bàn luận

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN1.7 Khảo sát quá trình nhân giống vi khuẩn A. xylinum

Nhân giống cấp 2 với tỉ lệ giống cấy cấp 1 là 10%, trong môi trường cơ bản HS trong

bình erlen 250 ml chứa 90 ml môi trường, nhiệt độ nuôi cấy 280C, thời gian 7 ngày. Mật độ tế

bào vi khuẩn A. xylinum được xác định ngay từ khi bắt đầu tính thời gian nhân giống.

Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn A. xylinum đang sử dụng trong thí

nghiệm này thu được như sau.

7

7.2

7.4

7.6

7.8

8

8.2

8.4

8.6

8.8

9

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Thời gian nhân giống (giờ)

Mật

độ

tế b

ào (l

og c

fu m

l-1)

Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của A. xylinum

Thời gian 24 giờ đầu của quá trình nhân giống, dưới đáy erlen bắt đầu xuất hiện những

sợi nhỏ, mỏng, lơ lửng, đó là những dải sợi cellulose đầu tiên do A. xylinum tạo ra trong môi

trường, sau đó các dải cellulose này sẽ chồng chập, xoắn lại với nhau, bắt đầu tạo thành lớp

màng cellulose mỏng, màu trắng đục trên bề mặt môi trường sau ngày thứ ba, thứ tư của quá

trình nhân giống.

33


Thời gian tổng hợp cellulose và khả năng tổng hợp cellulose có liên quan đến số lượng

tế bào vi khuẩn A. xylinum. Mật độ tế bào ban đầu được xác định ngay khi dịch giống được

lắc đều trong bình nhân giống (7,39 ± 0,05 log cfu ml-1) và tại các thời điểm xác định sau mỗi

24 giờ. Mật độ này liên tục tăng lên trong quá trình nhân giống, đạt số lượng 8,73 ± 0,06 (log

cfu ml-1) sau 96 giờ phát triển.

Mật độ tế bào tăng nhanh trong 24 giờ đầu của quá trình nuôi cấy, tương ứng với thời

gian tế bào đang ở pha thích nghi. Đến giai đoạn pha sinh trưởng thì mật độ tế bào bắt đầu

tăng chậm lại, sự tăng chậm lại này diễn ra vào khoảng thời gian từ 24 giờ đến 96 giờ nhân

giống. Mật độ tế bào đạt số lượng lớn nhất tại 96 giờ, sau đó giữ ổn định ở pha cân bằng rồi

giảm dần khi vào pha suy vong. Từ đường cong sinh trưởng, ta sử dụng dịch giống sau 96h

nhân giống để tiến hành lên men thu cellulose là tốt nhất.

Vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy, trên môi trường hoá học, chủng A. xylinum này

cũng có khả năng phát triển tốt như trên môi trường tự nhiên với thành phần chính là nước

dừa.

1.8 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose.

Sau khi xác định được thời gian nhân giống thích hợp, cần xác định thời gian kết thúc

quá trình lên men cho các thí nghiệm sao cho phù hợp. Do đó, chúng tôi thực hiện khảo sát

quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum nhằm chọn thời điểm kết thúc quá

trình lên men một cách thích hợp nhất.

Sử dụng dịch giống cấp 2 với tỉ lệ giống cấy là 10% để nuôi cấy thu nhận cellulose

trên môi trường cơ bản HS trong bình erlen 250 ml chứa 100 ml dịch lên men, nhiệt độ nuôi

cấy là 280C. Trong quá trình nuôi cấy, khảo sát hàm lượng cellulose được được tổng hợp

trong các khoảng thời gian khác nhau, đồng thời xác định pH của dịch lên men.

Kết quả thu được cho thấy, trong suốt quá trình lên men, A. xylinum liên tục tổng hợp

cellulose, tương ứng với quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn.

Ở ngày đầu tiên, do vừa chuyển từ môi trường nhân giống sang môi trường lên men

nên có sự thay đổi đột ngột về môi trường, số lượng tế bào trong môi trường chưa đủ lớn nên

sự tạo thành cellulose hầu như chưa có. Sau 2 ngày xuất hiện những sợi cellulose mảnh lơ

lửng trong môi trường và trên bề mặt bắt đầu xuất hiện một lớp màng cellulose mỏng, màu

trắng. Sang ngày thứ 3 tốc độ tạo cellulose tăng lên đáng kể khi bề mặt bình lên men có một

lớp màng cellulose khá dày. Tuy nhiên, lượng cellulose tạo ra sau 3 ngày lên men vẫn rất ít

34


nên chưa thể xác định được khối lượng. Lượng cellulose tăng nhanh từ ngày lên men thứ tư

đến ngày thứ sáu. Đây là thời gian vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose mạnh nhất sau khi đã

thích nghi với môi trường và số lượng tế bào đã đủ lớn. Lượng cellulose thu được tăng lên từ

4,9 ± 0,3 gl-1 lên 7,4 ± 0,3 gl-1. Sang ngày thứ sáu thì tốc độ tăng lên của cellulose được sinh

tổng hợp ra đã giảm dần, sự chênh lệch là 0,6 gl-1/ngày thay vì 1,19 gl-1/ngày như sự chênh

lệch giữa ngày thứ tư và ngày thứ năm. Đến ngày thứ bảy thì lượng cellulose thu được hầu

như không tăng hơn so với ngày lên men thứ sáu, đạt 7,5 ± 0,4 gl -1. Sự tăng lên này là không

đáng kể. (P = 0,21 > 0,05).

0123456789

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Thời gian lên men (giờ)

Trọn

g lư

ợng

cel

lulo

se k

hô (g

l-1)

00.511.522.533.544.55

pH m

ôi tr

ườ

ng

BC pH

Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH

tại các ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7

Mặt khác, trong quá trình lên men, pH của dịch lên men giảm dần từ pH ban đầu là 5

tới pH sau ngày thứ bảy là 3,52. Kết quả cho thấy, song song với sự tổng hợp cellulose, lượng

cellulose càng tăng lên thì pH của dịch lên men giảm. Sự giảm pH này có nguyên nhân được

xác định rằng trong quá trình sinh trưởng và phát triển, A. xylinum đã sử dụng đường để tạo ra

acid gluconic (Tahara et al., 1997). Tuy nhiên, đến ngày thứ 6 thì pH bắt đầu trở nên ổn định,

ít thay đổi. Quá trình chuyển hoá đường thành acid gluconic đã giảm. Cũng khảo sát biến

động của pH trong quá trình tổng hợp cellulose, trong nghiên cứu của mình, Vandame et al.

(1998) thấy rằng, pH dịch lên men giảm rõ rệt vào ngày thứ tư và thứ năm của quá trình lên

35


men, đó cũng là khoảng thời gian cellulose được vi khuẩn tổng hợp mạnh nhất. Khảo sát sự

chuyển hoá của đường, Vandame et al. (1998) thấy rằng A. xylinum sử dụng gần 50% lượng

glucose trong môi trường chỉ sau ngày lên men thứ hai, và phần lớn lượng glucose này được

chuyển hoá thành gluconate và acid gluconic. Bên cạnh đó, Hai-Peng et al. (2002) nghiên cứu

trên chủng A. xylinum sucrofermentans BPR2001 cũng cho thấy, sau giai đoạn thích nghi,

glucose được chuyển thành acid gluconic rất mạnh và pH dịch lên men giảm rõ rệt. Mặt khác,

sự oxy hóa glucose, acid gluconic được tạo ra và giải phóng ra trong môi trường nuôi cấy.

Nếu quá trình này xảy ra mạnh sẽ là nguyên nhân làm cho pH môi trường giảm từ 1 tới 3 đơn

vị trong quá trình nuôi cấy, và kiềm chế sự tạo thành cellulose (Krystynowicz et al., 2002).

Do đó, khi pH ổn định cũng có thể là dấu hiệu kết thúc quá trình lên men.

Kết quả cho thấy, tuy trọng lượng cellulose thu được sau 7 ngày lên men là cao nhất

nhưng so với ngày thứ sáu thì sự chênh lệch đó không đáng kể (P > 0,05). Do đó, để rút ngắn

thời gian lên men, chọn thời gian kết thúc lên men thống nhất cho các thí nghiệm tiếp theo là

sau 6 ngày lên men.

1.9 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp

cellulose của vi khuẩn A. xylinum

Tiến hành lên men thu nhận cellulose khi nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trên môi

trường HS như thí nghiệm trên tại các điểm pH ban đầu khác nhau. Các giá trị pH được khảo

sát là 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 và 7. Khảo sát hàm lượng cellulose thu được, đánh giá ảnh

hưởng của pH lên khả năng tạo cellulose của vi khuẩn. Từ đó chọn pH tốt nhất cho môi

trường lên men.

Kết quả thu được cho thấy, tại các giá trị pH khác nhau lượng cellulose thu được là

khác nhau, điều này chứng tỏ pH là một yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp cellulose

của A. xylinum.

Khoảng pH cho chủng A. xylinum trong thí nghiệm này là khoảng từ 4 – 5,5, lượng

cellulose thu được ~5,1 gl-1. Lượng cellulose tạo ra tại các giá trị pH khác nhau trong khoảng

trên thì sự khác biệt không rõ ràng (P > 0,05). Ngoài khoảng pH trên thì khả năng tổng hợp

cellulose của A. xylinum giảm chỉ đạt từ 3,5 gl-1 đến 4,6 gl-1.

Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose, xem hình 4.3

36


0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6 7 8pH

Trọn

g lư

ợng

cel

lulo

se v

i khu

ẩn (g

l-1)

Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum

Song song với quá trình tổng hợp cellulose, A. xylinum còn tổng hợp cả cellulase. Khi

cellulase được tạo ra nhiều thì khả năng polymer hóa tạo cellulose của vi khuẩn giảm, lượng

cellulose được tạo ra ít hơn. Khi pH cao (pH > 5), lượng cellulase được tạo ra nhiều hơn làm

cho cellulose giảm, khi pH thấp (pH < 5) cellulase tạo ra ít, sự tạo thành cellulose tăng lên.

Theo nghiên cứu của Tahara et al. (1997) đối với chủng A. xylinum BPR2001, tại pH 4 mức

độ polymer hóa của cellulose vào khoảng 14000 – 16000, nhưng với pH 5, DP giảm từ 16800

xuống còn 11000. Độ bền cơ học của cellulose được tổng hợp tại pH 4 cũng cao hơn độ bền

cơ của cellulose được sản xuất tại pH 5 (Tahara et al., 1997).

Theo nghiên cứu của Hutchen et al. (2006), với chủng vi khuẩn Gluconacetobacter

hansenii, nguồn carbon là mannitol thì khi pH đầu là 5,5 lượng cellulose được tạo ra cao hơn

đáng kể so với khi pH 6,5. Nhưng cũng trong nghiên cứu này, nếu thay đổi nguồn carbon là

glucose thì pH 6,5 lại giúp chủng vi khuẩn này tổng hợp cellulose tốt hơn tại pH 5,5.

Mặt khác, trong quá trình tổng hợp cellulose, sự oxy hóa glucose xảy ra cung cấp cho

quá trình trao đổi chất các điện tử làm cho phần glucose dùng cho việc tạo thành cellulose

giảm. Các sản phẩm phụ được tạo ra khi glucose bị oxy hóa bởi một số enzyme cũng có thể

giải thích tại sao các nguồn carbon khác nhau thì các chủng vi sinh vật khác nhau có hiệu suất

sinh tổng hợp cellulose khác nhau tại các giá trị pH khác nhau (Krystynowicz et al., 2002).

37


Như vậy, pH cũng là một yếu tố có thể gây ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp

cellulose của vi khuẩn. Vi khuẩn A. xylinum tổng hợp cellulose tốt hơn ở môi trường có pH

thấp hơn 5.

1.10 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất

sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum

1.10.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose, A.

xylinum được nuôi cấy trên môi trường HS với các nguồn carbon khác nhau: glucose,

mannitol, sucrose, fructose. Sau 6 ngày lên men ở nhiệt độ 280C, cellulose được thu nhận và

xử lý, phân tích hiệu suất.

Sau 6 ngày lên men, chiều dày lớp cellulose thu được trong trường hợp môi trường có

nguồn carbon là mannitol xấp xỉ bằng chiều cao của lớp dịch môi trường ban đầu. Đây cũng

được coi là lượng cellulose lớn nhất thu được trong quá trình lên men so với các nguồn

carbon khác (P < 0,05). Khối lượng cellulose đạt được 7,6 ± 0,4 gl-1 (hình 4.4). Mặt khác,

cellulose ướt tạo thành có cấu trúc đều, bề mặt nhẵn, khối cellulose chắc, hiệu suất thu

cellulose sau khi sấy khô cao.

Glucose là nguồn carbon cho kết quả tạo cellulose ở mức trung bình, hiệu suất tổng

hợp cellulose khá ổn định, lượng cellulose đạt được ~5,7 ± 0,5 gl -1. Hai nguồn carbon khác là

fructose và sucrose không thích hợp với chủng vi khuẩn A. xylinum này nên khả năng sử dụng

hai nguồn carbon này kém. Lượng cellulose chỉ đạt khoảng 3,5 gl-1.

Bằng việc thay đổi nguồn carbon sử dụng, kết quả cho thấy rằng chủng vi khuẩn này

có thể sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau nhưng các nguồn carbon khác nhau có sự thích

hợp cho khả năng tạo cellulose của chủng vi khuẩn cũng khác nhau. Mỗi chủng vi sinh vật A.

xylinum khác nhau sẽ thích hợp với một nguồn carbon khác nhau, tùy chủng vi sinh vật mà

các nguồn carbon sẽ thay đổi để sử dụng cho phù hợp, từ đó tạo ra hiệu suất tổng hợp

cellulose cao nhất. Kết quả cho thấy sự sai khác về khả năng sử dụng nguồn cơ chất carbon

của chủng vi khuẩn A. xylinum này so với các chủng A. xylinum đã được nghiên cứu. Chẳng

hạn, với kết quả này, chủng vi khuẩn A. xylinum sử dụng trong các thí nghiệm này sử dụng

nguồn cơ chất carbon thích hợp nhất là mannitol, không giống như kết quả mà Masaoka et al.

(1993) đã đạt được, kết quả của ông cho thấy rằng, glucose mới là nguồn carbon thích hợp

nhất cho sự tạo thành cellulose của vi khuẩn A. xylinum IFO 13693, lượng cellulose có thể đạt

38


được lên tới 0,6 g/g glucose/ngày sau 2 - 4 ngày lên men. Matsuoka et al. (1996) thấy rằng

fructose là nguồn carbon thích hợp nhất cho A. xylinum BPR2001. Fructose cũng được xem là

nguồn carbon tốt nhất cho A. xylinum E22 tổng hợp cellulose (Krystynowicz et al., 2002).

Tuy nhiên, kết quả trong nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Oikawa

et al. (1995) với vi khuẩn A. xylinum Ku-1, hàm lượng cellulose được tổng hợp bởi A.

xylinum Ku-1 khi sử dụng nguồn cơ chất là mannitol cao hơn 3 lần so với khi sử dụng cơ chất

là glucose. Hutchens et al. (2006) với chủng A. xylinum hansenii, kết quả của các ông cũng

thấy rằng mannitol là nguồn carbon thích hợp nhất cho các chủng A. xylinum đó tổng hợp

cellulose.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Glucose Fructose Sucrose Mannitol

Nguồn carbon

Trọn

g lư

ợng

cellu

lose

vi k

huẩn

(g

l-1)

Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn carbon thay đổi

Trong quá trình tổng hợp cellulose, sự oxy hóa glucose xảy ra cung cấp cho quá trình

trao đổi chất các điện tử làm cho phần glucose dùng cho việc tạo thành cellulose giảm, do đó

cần giảm thiểu quá trình thất thoát glucose do quá trình oxy hóa này. Có thể giảm sự oxy hóa

glucose bằng cách thêm ethanol hay glycerol vào môi trường nuôi cấy như là một nguồn điện

tử dồi dào nhằm tăng khả năng sử dụng cơ chất carbon cho mục đích tạo cellulose, từ đó tăng

hiệu suất sinh tổng hợp cellulose (Park et al., 2003). Mannitol, một polyol, cung cấp điện tử

cho sự trao đổi chất của vi khuẩn và kích thích sự tạo thành cellulose tốt hơn so với glucose,

điều này đã được báo cáo trong nghiên cứu của Brown et al. (1986).

39


Khi môi trường được cung cấp nguồn carbon là mannitol, sự acid hóa không xảy ra

trong quá trình nuôi cấy, điều này phù hợp với con đường trao đổi chất của vi khuẩn sử dụng

mannitol, mannitol được A. xylinum chuyển hóa thành fructose (Matsushita et al., 2003), sau

đó oxy hóa tiếp thành 5-keto-d-fructose trước khi hấp thu (Mowshoitz et al., 1973). Với việc

hạn chế sự tạo thành acid, glucose ít bị tổn thất, lượng cellulose tạo thành cũng cao hơn.

Khi các yếu tố môi trường khác được giữ cố định, thay đổi nguồn carbon, đối với

chủng A. xylinum sử dụng trong nghiên cứu này, mannitol là nguồn carbon thích hợp nhất cho

khả năng tạo cellulose của vi khuẩn.

1.10.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Sau khi chọn được nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng A. xylinum hiện có để tổng

hợp cellulose, khảo sát tiếp theo nhằm đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hiệu suất tổng

hợp cellulose. Cũng chuẩn bị môi trường HS, nguồn carbon được giữ cố định là manitol và

nguồn nitơ được thay đổi: cao nấm men, cao thịt, peptone, (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4, nuôi ở

280C, thời gian 6 ngày.

Kết quả cho thấy, khi lấy tryptone làm nguồn nitơ thì sự tổng hợp cellulose rất yếu,

không đáng kể (0,5 ± 0,1 gl-1). Chứng tỏ đối với chủng vi khuẩn A. xylinum trong thí nghiệm

này, nguồn nitơ trên không phù hợp cho chúng sinh tổng hợp cellulose.

Hai hợp chất khác được dùng làm nguồn nitơ trong thí nghiệm là (NH4)2SO4 và

(NH4)2HPO4, lượng cellulose thu được cao hơn đối với tryptone nhưng hiệu suất tạo cellulose

cũng rất thấp, chỉ đạt 2,5 ± 0,6 gl-1 và 2,3 ± 0,6 gl-1.

Đối với peptone, trọng lượng cellulose tạo ra ở mức trung bình (4,7 ± 0,3 gl -1), đđiều

này cho thấy peptone là nguồn nitơ phù hợp cho chủng A. xylinum này hơn (NH4)2SO4 và

(NH4)2HPO4 (P < 0,05).

Khi nguồn nitơ được thay bằng cao nấm men và peptone với tỉ lệ 5:3 hoặc cao thịt thì

khả năng tạo cellulose của vi khuẩn tăng lên đáng kể, đạt tương ứng 6,8 ± 0,5 gl-1 và 6,1 ± 0,5

gl-1.

Lượng cellulose đạt được cao nhất khi sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men (8,1 ± 0,8

gl-1). Điều này cho phép kết luận rằng, đối với chủng vi khuẩn A. xylinum đang khảo sát thì

nguồn nitơ tốt nhất trong môi trường lên men để tạo cellulose là cao nấm men.

40


0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

YE

YE +

Pep

Pep

Tryp

(NH

4)2S

O4

ME

(NH

4)2H

PO

4

Nguồn nitơ

Trọn

g lư

ợng

cel

lulo

se v

i khu

ẩn (g

l-1)

Các kí hiệu: YE + Pep – Cao nấm men và peptone

YE - Cao nấm men Pep – Peptone

Tryp – Tryptone ME – Cao thịt

Hình 4.5: Trọng luợng cellulose thu được khi thay đổi nguồn nitơ

Nitơ là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với A. xylinum. Cũng như đối với nguồn

carbon, nguồn nitơ đóng vai trò quyết định đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh

vật, đặc biệt đối với quá trình chuyển hóa tổng hợp cellulose. Nguồn nitơ hữu cơ tốt hơn cho

vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Do đó, nguồn nitơ hữu cơ cũng tốt cho A. xylinum tổng

hợp cellulose hơn khi so sánh với nguồn nitơ vô cơ.

Với việc thay đổi các nguồn nitơ khác nhau, kết quả cho thấy rằng chủng vi khuẩn A.

xylinum nghiên cứu cũng có khả năng sử dụng nhiều nguồn cơ chất nitơ khác nhau. Với

những nguồn nitơ tôi tìm được và thử nghiệm trong nghiên cứu này, nấm men là nguồn nitơ

thích hợp nhất cho chủng vi khuẩn A. xylinum phát triển và tạo cellulose. Một số nghiên cứu

khác cho thấy corn steep liquor (CSL) là nguồn nitơ thích hợp nhất để A. xylinum tạo

cellulose. Ví dụ, CSL là nguồn nitơ thích hợp nhất cho chủng A. xylinus BRC5 (Yang et al.,

1998), A. xylinus BPR2001 (Matsuoka et al., 1996). Cao nấm men là nguồn nitơ hữu cơ,

41


ngoài thành phần nitơ ra, còn chứa các thành phần dinh dưỡng khác tốt cho vi khuẩn phát

triển và hỗ trợ sự tạo thành ATP trong quá trình phát triển của vi khuẩn (Sakairi et al., 1998)

Tóm lại, qua các thí nghiệm trên, nguồn carbon và nguồn nitơ thích hợp nhất cho môi

trường nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum để thu nhận cellulose là mannitol và cao nấm men, các

thí nghiệm sau đều sử dụng nguồn carbon là mannitol và nguồn nitơ là cao nấm men cho môi

trường lên men tổng hợp cellulose. Vấn đề đặt ra là cần phải chọn hàm lượng nguồn carbon

và nitơ với hàm lượng như thế nào là tốt nhất cho môi trường lên men. Để giải quyết yêu cầu

này, cần tiến hành thí nghiệm tiếp theo, tìm điểm tối ưu của thí nghiệm.

1.11 Tối ưu hoá nồng độ nguồn carbon và nitơ.

Nguồn carbon thích hợp nhất là mannitol và nguồn nitơ thích hợp nhất theo kết quả

của thí nghiệm trên là cao nấm men được khảo sát với các nồng độ khác nhau, đánh giá hiệu

suất thu nhận cellulose tại các hàm lượng đó, từ các số liệu thực nghiệm, xây dựng phương

trình hồi quy, rút ra hàm lượng nguồn carbon và nitơ thích hợp nhất cho A. xylinum tổng hợp

cellulose.

Chuẩn bị môi trường HS, nguồn carbon là mannitol, nguồn nitơ là cao nấm men với

nồng độ theo mô hình thí nghiệm tối ưu như bảng 4.1 và 4.2.

Sau khi thu được kết quả thí nghiệm, số liệu được xử lý theo phương pháp quy hoạch

thực nghiệm để tìm điểm tối ưu cho thành phần môi trường lên men.

Phương trình hồi quy bậc hai biểu diễn sự biến động của các yếu tố ảnh hưởng đến các

kết quả thí nghiệm có dạng sau đây:

Trong đó:

y – khối lượng cellulose khô (g)

x1 , x2 - các yếu tố ảnh hưởng

b - các hệ số của phương trình hồi quy.

Bảng 4.1: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu

TN Biến y

42


x1 x2

1 -1 0 0,737

2 -1 +1 0,793

3 0 -1 0,801

4 0 +1 0,733

5 +1 0 0,807

6 +1 +1 0,817

7 -1 -1 0,807

8 +1 -1 0,713

9 0 0 0,811

10 0 0 0,820

11 0 0 0,791

Bảng 4.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát

Kí hiệu Nguồn carbon

x1 (gl-1)

Nguồn nitơ

x2 (gl-1)

0 25 8

-1 20 6

+1 30 10

Trong thí nghiệm này, số lượng các yếu tố cần tối ưu là 2 yếu tố, đó là hàm lượng

nguồn carbon (mannitol – x1) và hàm lượng nguồn nitơ (cao nấm men - x2). Các yếu tố khác

được giữ không thay đổi.

43


Sau khi hoàn thành thí nghiệm, các số liệu được xử lý thống kê và xác định các hệ số

của phương trình hồi quy.

Các hệ số của phương trình hồi quy trên đã được kiểm tra tính ý nghĩa theo tiêu chuẩn

Student với t0.05(2) = 2,12 đã loại đi các hệ số không có ý nghĩa thống kê.

Sau khi bỏ đi các hệ số không ý nghĩa, loại đi các hệ số b1 của biến x1 và b11 của biến

x12, phương trình hồi quy thu được như sau:

Phương trình hồi quy được kiểm tra sự tương thích với thực nghiệm theo tiêu chuẩn

Fisher (F). Kiểm tra hệ số F với giá trị F0,05(f1, f2). f1, f2 tương ứng là các bậc tự do, f1 = 7; f2 =

2.

Sau khi kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm cho thấy

Ftính = 3,7 , F0,05 (7;2)= 4,7. Như vậy phương trình tương thích với thực nghiệm.

Chuyển phương trình hồi quy thu được (dạng mã hóa) về dạng phương trình trong hệ

trục tự nhiên. Ta được phương trình như sau:

Tối ưu hóa thực nghiệm được thực hiện bằng phương pháp đường dốc nhất, bắt đầu từ

điểm không, là mức cơ sở: x1 = 15 và x2 = 6

Chọn bước chuyển động của yếu tố x2 là , suy ra bước chuyển động của yếu tố

x1 là .

Sau khi khảo sát các giá trị thực nghiệm tối ưu hóa theo phương trình hồi quy cho thấy

tại vị trí x1 = 15,5 gl-1; x2 = 6,5 gl-1 cho hiệu suất sinh tổng hợp cellulose là cao nhất, y* = 8,76

gl-1. Đó chính là điểm tối ưu thỏa mãn yêu cầu của thí nghiệm.

Để kiểm tra sự sai lệch giữa lý thuyết và thực nghiệm, một thí nghiệm nuôi cấy thu

nhận cellulose với thành phần môi trường lên men như điều kiện tối ưu lý thuyết trên. Kết quả

cho thấy hiệu suất thu nhận cellulose không đạt được như lý thuyết, tuy nhiên tại điều kiện đó,

lượng cellulose thu được cũng cao hơn tại các điều kiện khác. Lượng cellulose đạt được ~8,3

gl-1. Như vậy, kết quả lý thuyết thu được có sự chênh lệch so với thực tế (5,5%), tuy nhiên sự

chênh lệch này có thể chấp nhận được.

44


Mannitol là một polyol, nó vừa đóng vai trò là cơ chất cho sự tổng hợp cellulose, vừa

là nguồn năng lượng cho sự sản sinh ATP, giúp tế bào tăng trưởng và tăng khả năng tạo thành

cellulose (Naritomi et al., 1998). Với nồng độ mannitol 15,5 gl-1, nồng độ cao nấm men 6,5 gl-

1, lượng cellulose thu được có thể đạt ~8,7 gl-1. Tuy nhiên, nồng độ của mannitol cao hơn 16

gl-1 và nồng độ cao nấm men cao hơn 6,5 gl-1 lại không làm tăng lượng cellulose tạo thành mà

ngược lại, lượng cellulose tạo ra lại có xu hướng giảm khi nồng độ mannitol quá cao. Điều

này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác, chẳng hạn Masaoka et al.

(1993), Oikawa et al. (1995), hay S.A. Hutchens et al. (2006). Điều này có thể giải thích bởi

sự ức chế A. xylinum tại nồng độ cơ chất quá cao.

Như vậy, qua các thí nghiệm đã thực hiện, lượng cellulose được tổng hợp tốt nhất

với môi trường hoá học, lượng cellulose có thể đạt được ~8,3 gl -1 khi A. xylinum được nuôi

cấy dưới điều kiện môi trường gồm có 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5 gl-1

Na2HPO4; 1,15 gl-1 acid citric; tại pH 5 và nhiệt độ 280C.

45

Tài liệu tham khảo

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ1.12 Kết luận

Như vậy, khi khảo sát quá trình sinh trưởng của chủng vi khuẩn A. xylinum được cung

cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh học, giữ giống ở 4oC trên môi trường có thành phần dinh

dưỡng tự nhiên mà thành phần chính có bổ sung nước dừa, cho thấy chủng A. xylinum này có

khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường hoá học.

Kết quả khảo sát cũng cho thấy rằng, chủng A. xylinum này có khả năng sinh tổng hợp

cellulose tốt trên môi trường hoá học và hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum bị

tác động nhiều bởi các yếu tố điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy, trong đó có pH,

nguồn carbon và nguồn nitơ. Có thể nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum

bằng cách tác động đến các yếu tố ảnh hưởng này. Cụ thể, chọn pH cho môi trường nuôi cấy

thích hợp, loại nguồn carbon, loại nguồn nitơ thích hợp nhất đồng thời chọn nồng độ các

nguồn carbon và nitơ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Ví dụ, có

thể điều kiện nuôi cấy được điều chỉnh như sau: 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5

gl-1 Na2HPO4; 1,15 gl-1 acid citric; tại pH 5 và nhiệt độ 280C.

1.13 Đề nghị

Một số yếu tố khác có thể tác động đến khả năng tạo cellulose của A. xylinum chưa

được khảo sát trong luận văn này: các nguồn cơ chất khác, các chủng vi sinh vật khác, điều

kiện nuôi cấy có bổ sung oxy, khả năng tạo cellulose của các chủng A. xylinum đột biến …

Vì thế, một số đề nghị nghiên cứu như sau:

- Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhằm tìm ra các nguồn cơ

chất hiệu quả mà rẻ tiền, giảm chi phí sản xuất.

- Khảo sát khả năng tạo cellulose của các chủng A. xylinum mới khác để tìm ra

nguồn giống vi sinh vật tốt hơn.

- Khảo sát tính chất vật lý và hóa học của các sản phẩm cellulose tạo thành dưới

các điều kiện nuôi cấy tĩnh nhằm nâng cao các tính chất cần thiết cho việc ứng dụng cellulose

vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật trong thực phẩm.

- Nghiên cứu thêm các khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩn trong thực phẩm

và sinh học: màng bao thực phẩm chống vi sinh vật, cố định vi sinh vật, thực phẩm chức năng

…

46


TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bae, S., Sugano, Y. & Shoda, M. (2004) Improvement of becterial cellulose production by

addition of agar in a jar fermentor. Journal of Bioscience and Bioengineering. 97: 33-38.

Bielecki, S., Krystynowicz, A. Turkiewicz, M. Kalinowska, H (2001) Bacterial cellulose.

Institute of Technical Biochemistry, Technical Chemistry of Lódz, Stefanowskiego: 37-46

Brown, R.M., Willison, J.H. & Richarson, C.L (1986) Cellulose biosynthesis in

Acetobacter xylinum - Visualization of site of synthesis and direct measurement of in vivo

process. Proceeding of the National Academic of Sciences of the United States of America.

73: 4565 - 4569.

Chao, Y., Ishida, Sugano, Y. & Shoda, M. (2000) Bacterial cellulose production by

Acetobacter xylinum in a 50L internal-loop airlift reactor. Biotechnol Bioeng. 68: 345– 352.

Chao, Y.P., Sugano. Y., Kouda, T., Yoshinaga, F., Shoda, M. (1997) Production of

Bacterial cellulose by Acetobacter xylinum with an air lift reactor. Biotechnology Techniques.

11: 829-832

El-Saied, H., Basta, A.H., & Gobran, R.H. (2004) Research progress in friendly

invironmental technology for the production of cellulose products (bacterial and its

application). Polymer-plastic Technology and Engineering. 43: 797-820.

DeWulf, P., Joris., & Vandamme, K. (1996) Improved cellulose formation by an

Acetobacter xylinum mutant limited In (Keto)Gluconate synthesis. Journal of Chemical

Technology and Biotechnology. 67: 376-380.

Galas, E., Kristynowicz, A. Tarabasz - Szymanska (1999) Optimization of the production

of Bacterial cellulose using multivariable linear regression analysis. Biotechnology. 19: 251-

260.

George, J., Ramana, K.V., Sabapathy, S.N., Bawa, A.S. (2005) Physico-mechanical

properties of chemically treated bacterial (Acetobacter xylinum) cellulose membrane.

Microbiology and Biotechnology. 21: 1323-1327.

Gindl, W., Keckes, J. (2004) Tensile properties of cellulose acetate butyrate composites

reinforce with bacterial cellulose. Composites science and Technology. 64: 2407-2413.

Hai Peng, C. (2002) Cultivation af Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in

a modified airlift reactor. Biotechnol. Appl. Biochem: 25-132.

47


Hestrin, S., & Schramm, M. (1954) Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum 2.

Preparation of freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose. Biochem J. 58:

345–352.

Hwang, J.W., Hwang, J.K., Pyun, Y. R., Kim, Y.S. (1999) Effects of pH and dissolved

oxygen on cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 in agitated culture. J Ferment

Bioeng. 88: 183–188.

Iguchi, M., Yamanaka, S., Budhiono, A. (2000) “Bacterial cellulose - a masterpiece of

nature's arts,” Journal Of Materials Science 35 (2): 261-270

Jonas, R.F., Luiz (1998) Production and application of microbial cellulose. Polymer

Degradation and Stability. 59: 101-106.

Klemm D., Udhardt, U., Marsch, S.P (2001) Bacterial cellulose - artificial blood vessels for

microsurgery. Progress in Polymer Science. 26: 1561-1603.

Klemm, C. (2006) Influence of protective agents for preservation of Gluconacetobacter

xylinus on its cellulose production. Cellulose 13: 485 –492.

Krystynowicz, A., Czaja, W., Wiktorowska-Jezierska, M., Goncalves-Miskiewicz, M.,

Turkiewicz and Bielecki, S. (2002) Factors affecting the yield and properties of bacterial

cellulose. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 29: 189 – 195

Lê Văn Việt Mẫn & Lại Mai Hương (2006) Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm. Nhà

xuất bản Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.

Masaoka, S. (1993) Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum. Journal of

fermentation and bioengineering. 75: 18-22.

Nguyễn Cảnh (2004) Quy hoạch thực nghiệm. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí

Minh.

Nguyễn Thị Diễm Chi, Hoàng Tuyền Yến Linh và Nguyễn Vũ Thanh (2002) Nghiên cứu

nuôi cấy Acetobacter xylinum làm màng sinh học trị phỏng và các tổn thương da. Y học

Tp.HCM. 6: 139-141.

Nguyễn Thúy Hương (2006) Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo

cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở quy mô pilot. Luận án tiến sĩ.

48


Naritomi, T., Kouda, T., Yano, H., Yoshinaga, F (1998) Effect of ethanol on Bacterial

cellulose production from fructose in continous culture. Fermentation and Bioengineer. 85:

598-603.

Sakairi, N., Asano, M., Ogawa., Nishi, N., & Tokura, S (1998) A method for direct harvest

of bacterial cellulose filaments during continuous cultivation of Acetobacter xylinum.

Carbohydrate Polymers. 35: 233–237.

Schramm, M., & Hestrin, S. (1954) Factors affecting production of cellulose at the air liquid

interface of a culture of Acetobacter xylinum. Journal of Genneral Microbiology. 11: 123 –

129.

Son, H.J., Heo, M.S., Kim, Y.G., Lee, S.J. (2001) Optimization of fermentation conditions

for the production of Bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp.A9 in shaking

cultures. Biotechnology and Applied Biochemistry. 33: 1-5.

Toda, K., Asukua, T. (1997) Cellulose production by acid acetic-resistant Acetobacter

xylinum. Fermentation and Bioengineering. 84: 228-231.

Vandamme, E.J., De Baets, S., Vanbaelen, A., Joris, K. & De Wulf, P. (1998) Improved

production of bacterial cellulose and its application potential. Polymer Degradation and

Stability. 59: 93-99

Watanabe K., T.M., Morinaga Y., Yoshinaga F. (1998) Structure features and properties of

Bacterial cellulose produced in agitated culture. Cellulose. 5: 187-200.

Yang, L.Z. (2007) Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by

Acetobacter xylinum. J Ind Microbiol Biotechnol. 34: 483–489.

Yang, Y.K. (1998) Cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 under agitated

condition. Fermentation and Bioengineering. 85: 312-317.

Yoshinaga, T.T. (1997) Production of Bacterial cellulose by agitation culture systems. Pure

and application chemistry. 69: 2453-2458.

Zou, K., Wu, S.C., Wu, W.T. (2006) A hybrid model combining hydrodynamic and

biological effects of bacterial cellulose with a pilot scale airlift reactor. Biochemical Engineer

29: 81-90.

49


50

Phụ lục

PHỤ LỤC

Các công thức sử dụng để tính toán trong thí nghiệm:

Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng:

Trong đó: b là các hệ số

Số hệ số của phương trình hồi quy được tính theo công thức:

Trong đó, m là số hệ số của phương trình, k là số yếu tố ảnh hưởng

Tính toán các hệ số của phương trình:

Phương sai của các hệ số:

Kiểm tra tính ý nghía của các hệ số của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Student, so sánh ttính với ttra

Kiểm tra sự tương thích với thực nghiệm của phương trình hồi quy bằng tiêu chuẩn Fisher, so sánh Ftính với Ftra

F được tính theo công thức:

Trong đó:

51

Phụ lục

N là số thí nghiệm, l là số hệ số của phương trình hồi quy, s i là các phương sai của các thí nghiệm, y là khối lượng cellulose ở các thí nghiệm.

52

Documents

LÔØI MÔÛ ÑAÀUi.vietnamdoc.net/data/file/2015/Thang06/22/nghien_cuu... · Web viewẢnh chụp kính hiển vi điện tử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 –