LUCIFERAZE

“THE SWISS ARMY KNIFE OF MOLECULAR BIOLOGY”

Da se upoznamo sa glavnim terminima

➢ LUMINESCENCIJA je hladno zračenje svetlosti, ali ne kao

posledica pretvaranja toplotne E u svetlosnu nego drugih izvora

energije. U zavisnosti od izvora E razlikujemo različite tipove

luminescencije.

➢ BIOLUMINESCENCIJA je proces u kome živi organizam

emituje svetlost kao posledica enzimske reakcije koju

katalizuje enzim LUCIFERAZA.

LUCIFERIN + O2

PEROKSIDNI

INTERMEDIJER[OXILUCIFERIN]*

OXILUCIFERIN + SVETLOST

Bioluminescencija – hemijska reakcijamora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska u stabilno nepobuđeno stanje.

Fluorescencija ili fosforescencija je suprotan proces u kome je potrebno da dođe do apsorpcije energije koja će kao rezultat dati emisiju svetlosti.

SUPSTRAT

Luciferini - klasa malih molekula koji pri oksidaciji oslobađaju svetlost

Vibrio, Photobacterium Dinoflagellata Kolenterazin – Ctenophora,

Radiollaria , Cnidaria

Latia Vargulin – Ostracodes, Poricthys Lampyridae

Widder, 2017, Science

KOJI ORGANIZMI IMAJU SPOSOBNOST BIOLUMINESCENCIJE

• Više od 700 rodva, 2500 vrsta, a od toga 80% su morski organizmi

• Bakterije – Gammaproteobacteria rodovi Vibrio, Aliivibrio, Photobacterium

• Kopneni zglavkari i insekti: Myriapoda, Geophila, Hexapoda, Collembola, Diptera, Colepotera

• Dva od tri najčešće korišćena reporter sistema koji se zasnivaju na mehanizmu bioluminescencije u molekularnoj biologiji su izolovana iz kopnenih organizama (Photinus pyralis – svitac, Photorhabdus luminescens – crevni patogen), a najnovija okarakterisana koja je ušla u primenu je luciferaza izolovana i Gaussia princeps, morska kopepoda

• 2008. godine – Nobelova nagrada za hemiju Osamu Shimomura za otkriće i razvoj GFP sa još dva američka naučnika

Widder, 2017, Science

NEPOŽELJAN PLEN –PHOTOBACTERIUM LEIOGNATHI

BAKTERIJSKE LUCIFERAZE

➢ Heterodimeri, α -subjedinica (40 kDa) i β-subjedinica (35 kDa)

MEHANIZAM DEJSTVA VIBRIO FISCHERI

FMNH2 + O2 + RCHO → FMN + RCOOH + H2O + SVETLOST

LUX SISTEM

Organizacija LUX operona različitih bakterijskih vrsta.

Jezgro operona čine luxCDABE geni, dok se prisustvo ostalih gena

razlikuje od vrste do vrste.

LUX SISTEM

luxA i luxB – heterodimer luciferaze, luxC, luxD i luxE – multienzimski

kompleks reduktaza masnih kiselina, luxF – flavoprotein homolog

subjedinici luciferaze, luxG – flavin reduktaza, luxH – protein

najverovatnije uključen u sintezu FMN.

QUORUM SENSING...

• Komunikacija i koordinisano “ponašanje” populacije zavisno od koncetracije signalnog molekula (primer na slici kod Vibrio fischeri)

INSEKTI I BIOLUMINESCENCIJA

➢ Najbogatija i najraznovrnija grupa organizama

➢Od identifikacije luciferina svica 60 i 70-tih godina prošlog

veka do danas je okarakterisano još šest luciferina iz različitih

grupa organizama

• Razlike u emisiji nastaju kao posledica različitih supstrata i

rekcije koju katalizuje luciferaza

JAPANESE FIREFLY

U zavisnosti od amino kiselina u okviru aktivnog mesta

enzima zavisiće i osobine emitovane svetlosti. Ciljanom

mutagenezom moze se menjati aminokiselinski sastav

aktivnog mesta i tako modifikovati talasnu dužinu svetlosti

koja će se emitovati tokom reakcije.

INSEKTI I BIOLUMINESCENCIJA

A.Photinus pyralis, Mg2+ za hirdrolizu ATP

B. Renilla reniformis, Ca2+

PHOTINUS PYRALIS – SVITAC

➢ Najbolje proučena luciferaza, izolovana i okarakterisana 1976. god.

➢ Gen je u jednoj kopiji, ima 7 egzona i 6 introna; protein 62 kDa

MEHANIZAM KODPHOTINUS PYRALIS

Luciferin+ ATP → Luciferin adenilat + PPi

Luciferin adenilat + O2 → Oksiluciferin + AMP + SVETLOST + H2O + CO2

EVOLUCIJA LUCIFERAZA

• Na osnovu raznovrsnosti enzima, supstrata i mehanizama uključenih u bioluminescenciju pretpostavka je da je bioluminiscencija evoluirala nezavisno bar 40 puta urazličitim organizmima.

• Većina napora da se objasni evolucija se svodi na dva osnovna koji su usemreni na selektivni pritisak na supstrat ili enzim.

• U prvom slučaju selektivni pritisak je mogao da bude zaštiti organizme od rastuće koncentracije toksičnog kiseonika. Dok je moguća i hipoteza da su nastale od oksigenaza sa mešovitom funkcijom koje su uključene u oksidaciju rastuće koncentarcije organiskih jedinjenja.

• Sve ovo može da se odnosi samo na bakterijske luciferaze.

• Trenutno stanovište je da je većina luciferaza nastala de novo.

• Nastale od predačkog kalmodulin vezujućeg proteina, acil-CoA sintetaze, aminoacil-tRNK sintetaze, itd.

EVOLUCIJA LUCIFERAZAINSEKATA

-Polipeptidi 545-550 AK- ~60 kDa- na C-kraju SKL tripeptid (SerLysLeu)- 66-99% identičnosti

- od slabo luminescentnihligaza, formiranje aktivnogmesta luciferaze, koevolucija sa fotocitama do današnjih luciferaza

• Različita zastupljenost i kod bakterija iste vrste.

• Sekvenca Lux operona konzervirana kod svih luminescentnih bakterijskih vrsta.

• Prvo je povezana sa reparacijom DNK, a zatim sa quorum sensing (QS) sistemom. Međutim, QS nije karakterističan samo za bioluminescenciju (BL) – Šta je nastalo prvo BL ili QS?

• Bakterijske luciferaze kod bakterija koje žive u simbiozi su koevoluirale sa domaćinom i/ili njegovim organom za proizvodnju svetlosti.

• Najnoviji okarakterisani luciferazni sistemi kod dinoflagelata govore o mogućem gubitku odnosno redukciji luminescentnog potencijala i konvergentnoj evoluciji.

EVOLUCIJA LUCIFERAZABAKTERIJA

PRIMENA I ZNAČAJ

➢ Reporter geni u bakterijskim i eukariotskim ćelijskim linijama

➢ identifikacija promotora

➢ detekcija bakterija u uzorku

➢ in vivo praćenje bakterijske i virusne infekcije

➢ in vivo praćenje ekpresije gena u eksperimentalnim životinjama

➢ in vivo praćenje tumora

GFP vs. Luciferazni reporter geni

- drastično kraći poluživot luciferze

- nema posttranslacionih modifikacija

- ne zavise od egzogenih supstrata ili ekscitatora

- više puta ponovljeno merenje

- talasna dužina emitovane svetlost je duža, a E manja

- brži, manje zahtevni i jeftiniji

• Autoindukujući reporter sistem – V. harveyi za praćenje komunikacije između bakterija različite vrste

• Ekspresija bakterijskih gena

• Vizualizacija kontaminacije u uzorcima hrane i okolini

• Detekcija bakterija u ciljnim tumorima, a u sklopu antitumorskog tretmana

• Praćenje ekspresije eukariotskih gena primenom eukariotskih luci ruc luciferaznih reporter gena

• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin

PRIMENA I ZNAČAJ

• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin

PRIMENA I ZNAČAJ

Guo et al., 2013, Anti. Agents Chem.

PRIMENA I ZNAČAJ

• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin

van Zyl et al., 2015, Gut Microbes

• Kontrolisani koncentracijom toksičnih metala (npr. arsena) ili prisustvom patogenih bakteria u podlozi

...I BIOSENZORI

Prindle et al., Nature, 2012

• "sequencing by synthesis "

• Ronaghi i Nyrén 1996.

PIROSEKVENCIRANJE

• Sve zavise od O2

• Veoma je važno kako se ovi reporter geni ubace u organizam koji se analiziran, ali i jedna hromozomska kopija je bolja od plazmidno lociranih gena

• Nezamenljive u molekularnoj biologiji

• Kombinuju sposobnost da mere aktivnost promotora i u isto vreme određuju lokaciju bakterija i kvantifikaciju bakterija u kulturi, u kulturi eukariotskih ćelija, tkivima ex vivo i in vivo

ZAKLJUČAK

Teme za prezentacije:

- Pirosekvenciranje

- Bioluminiscencija kod Dinoglagellata

- Primer primene luciferaza u živim sistemima