Upload
autumn-bennett
View
200
Download
12
Embed Size (px)
Citation preview
Manipulasi Ekspresi Gen
TUJUAN KLONING GENMemperoleh produk gen target (protein)Slide 5DNA sisipan replikasi, transkripsi, translasi PROTEINKloning ke dalam VEKTOR EKSPRESI VEKTOR Slide 3Slide 6
Vektor Kloning
KLONING GENSlide 4
KLONING GEN (lanjutan)Slide 2
Slide 2
Keberhasilan ekspresi gen ?Kebutuhan komersial ?Dipengaruhi oleh bbrp faktor Slide 2Diperlukan manipulasi ekspresi genSlide 7
ORGANISASI GEN PROKARIOTKOMPONEN:TRANSKRIPSI : promotor, terminator, situs inisiasi transkripsiTRANSLASI : RBS, kodon start, kodon stopSlide 11
VEKTORSecara garis besar, vektor terbagi atas:Vektor kloningVektor ekspresi : komponen vektor kloning + promotor + RBSVektor shuttle : vektor yang bisa tumbuh di dua jenis sel inang, memp.dua ori yang dikenali sel inangnya, cth : bakteri & ragiSlide 9
Vektor Ekspresi
Vektor kloningVektor ekspresiSlide 10
KOMPONEN LAIN VEKTOR EKSPRESIMULTIPLE CLONING SITE (MCS)MARKA SELEKSIURUTAN NUKLEOTIDA PENGKODE UNTUK MEMPERMUDAH PEMURNIAN PROTEIN REKOMBINANSlide 23Slide 2
KOMPONEN REGULASI
PromotorTerminator HARUS DIKENALI OLEH SEL INANGRBS
Untuk tujuan ekspresi : promotor, RBS, Terminator KUATSlide 12
PROMOTOR, TERMINATOR & RBS Kekuatan promotor : efisiensi inisiasi transkripsiPromotor kuat : frekuensi transkripsi tinggiKekuatan terminator : efisiensi terminasi transkripsiTerminator kuat : transkripsi segera berhenti ketika mencapai terminatorKekuatan RBS : efisiensi translasiRBS kuat : efisiensi translasi tinggi
Slide 13
ORF HARUS TETAP DIPERTAHANKANMalE--- ATC GAG GGA AGG TTT TTA GTT GCT GAT C--- Ile Glu Gly Arg Phe Leu Val Ala Asp
MalE--- ATC GAG GGA AGG TTT TAG TTG CTG ATC --- Ile Glu Gly Arg Phe StopSlide 14
Slide 15
REGULASI DNA SISIPAN Penggunaan promotor kuat Protein rekombinan yang dihasilkan dapat toksik terhadap sel Ekspresi gen perlu diregulasi Penggunaan promotor yang diregulasi Slide 17Slide 29
CONTOH PROMOTOR YANG DIGUNAKAN PADA VEKTOR EKSPRESISlide 18
REPRESOR & INDUCERSlide 16
VEKTOR EKSPRESISenyawa penginduksi : IPTG (analog laktosa)Slide 19Slide 23
Regulasi operon lac pada plasmid pETSlide 20Slide 33
Lac Operon (Negative Regulation)Catabolic EnzymeRepressorInducerOperon
PEMILIHAN SISTEM EKSPRESI Sifat protein Tujuan penggunaan proteinSlide 22
SIFAT VEKTOR EKSPRESISlide 10
MARKA SELEKSIAMPR, TETRNEOR, Dihidrofolat reduktasePROMOTORTrp-lac; t7; nirB-aktin; CMV IE; SV40 earlyKEUNGGULANTingkat ekspresi Manipulasi mudahmurahTingkat ekspresi Modifikasi; sekresi folding; aktivitasKETERBATASANMasalah sekresiModifikasi sangat terbatasLambatmahalPROKARIOTEUKARIOT
TUJUAN PROTEIN FUSI Mempermudah proses pemurnian Direkayasa pada tingkat DNA Slide 24 OVERPRODUKSI Hasil transkripsi dan translasi adalah protein fusi yang dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas Slide 26
PROTEIN FUSI NCHisHisHisHisHisHis(His-Tag)Ssisi restriksi Faktor XaProtein targetHis-Tag : untuk pemurnian dengan kolom afinitas Ni2+Sisi restriksi Faktor Xa : sisi pemotongan yang dikenali oleh Faktor Xa yang akan memotong setelah arginin dari Gly-Arg dengan tujuan untuk mendapatkan protein target murni tanpa His-Tag Protein target : hasil ekspresi dari gen yang diklon ke dalam vektor ekspresi yang digunakanPada plasmid pET 16b :Slide 18
OVERPRODUKSIOD600nm = 0,6-0,7370C, 150 rpm1%NI Glukosa 0,2%NI I I 370C,150rpmonPanen sel7000rpm,10,40CpeletResuspensi dlm PBS, 7000rpm, 10, 40CpeletHasil sonikasi10000rpm, 15Ekstrak proteinSDS PAGESTARTERSlide 23
PEMURNIAN MENGGUNAKAN KOLOM AFINITAS KOLOM Ni2+Slide 27
RECOVERY FUSION PROTEINSlide 28
Keterangan :Marker proteinNon induksiInduksi 0,3 mMInduksi 0,5 mMInduksi 0,8 mMInduksi 1,0 mMHasil : optimal pada induksi 0,5 mM IPTGOptimasi Overproduksi Menggunakan Variasi Konsentrasi IPTGSlide 19
MASALAH PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN PADA E.coliProblem yang berasal dari urutan gen asing Slide 30Problem yang disebabkan oleh E. coli Slide 32Slide 21
PROBLEM YANG BERASAL DARI URUTAN GEN ASING Gen asing tersebut kemungkinan mangandung intron Gen asing tersebut kemungkinan mampunyai urutan yang dikenali sebagai signal terminasi bagi E.coli Codon usage gen asing tersebut mungkin saja tidak sama dengan transalasi pada E. coliSlide 31
Slide 29
PROBLEM YANG DISEBABKAN OLEH E.coli E.Coli mungkin saja tidak memproses protein rekombinan dengan benar Folding protein rekombinan pada E.coli mungkin saja tidak benar E. Coli dapat mendegradasi protein rekombinan
Slide 21