MARIE-EVE PROULX - Bienvenue au site Web … leishmaniose est une maladie causée par le protozoaire Leisimania. La forme viscérale de la maladie est responsable d'une infection des

MARIE-EVE PROULX

EFFICACITÉ DE LA CAMPTOTHECINE LIBRE ET LIPOSOMALE DANS UN MODELE MURIN DE LEISHMANIOSE VISCÉRALE

Mémoire présente

la Faculté des études supérieures de l'université Laval

pour i'obtention du grade de maître e s sciences (M.Sc.)

Microbiologie - Immunologie FACULT& DE M~DECINE

URWERSIT~ LAVAL Q ~ B E C

Mai 2001

O Marie-Eve Proulx, 200 1

AcquWons and Acquisibions et Biiraphic Services services b i b i i i i q u e s

The author has granted a non- L'auteur a accordé une licence non exciusive licence aiiowing the exclusive permettant à la National Li'brary of Canada to Bibliothèque nationale du Canada de reproduce, loan, distn'bute or sen reprodriue, prêter, distribuer ou copies of this thesis in microfonn, vendre des copies de cette thèse sous paper or electronic formats. la forme de mmicrofiche/nIm, de

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La leishmaniose est une maladie causée par le protozoaire Leisimania. L a

forme viscérale de la maladie est responsable d'une infection des

macrophages d u foie et de la rate. La carnptothécine (CPT) pourrait pallier a

i'émergence de résistance du parasite aux médicaments conventionnels. Cet

inhibiteur de la topoisomérase I interfère avec la réplication du parasite in

vitro. In duo, l'utilisation des liposomes comme transporteurs de médicament

est une approche logique afin de concentrer la CPT dans le foie et la rate. Une

formulation stable de camptothécine tiposomale a été mise au point au

laboratoire. Les études de distribution tissulaire du médicament ont

démontre une plus grande accumulation de la forme liposomale au niveau du

foie et de la rate comparativement a la forme libre. L'injection intrapéritonéale

s'est avérée le meilleur mode d'administration pour concentrer Iddrogue dans

ces organes. Toutefois, l'efficacité de la CPT libre et liposomale sur les

parasites en culture et chez un modèle murin furent similaires selon le régime

de traitement utilisé.

Marie-Eve Proulx

Je tiens a remercier Dr. Michel G. Bergeron, mon directeur de recherche, de

m'avoir permis d'étudier à la maitrise dans son prestigieux centre de

recherche.

J e remercie tout particulièrement Dr. André Désormeaux pour le temps et la

confiance qu'il m'a accordé, pour les conseils judicieux au niveau de

l'orientation de mon projet et pour l'encouragement. Merci au Dr. Martin

Olivier pour avoir accepté de me codiriger, pour m'avoir donné de son temps

et de ses brillants conseils.

Merci a toute l'équipe Liposome-Gel ainsi qu'a Jean-François Marquis de

l'équipe du Dr. Martin Olivier pour m'avoir aidé à mener mon projet à terme.

J'ai eu beaucoup d'agrément a travailler avec vous au cours des deux

dernières années.

Merci aussi a Stéphane Paquet pour son soutien moral au cours de la

dernière annee, pour son aide à la mise en page de mon mémoire et pour son

appui dans mes décisions.

1.4.5 Interactions liposomes-cellule ...................................... 31 1.4.6 Liposomes et Leishmania ............................................. -32 1.4.7 Liposomes stériquement stabilisés et camptothécine .... 34

CHAPITRE Ik TRAITEMENT DE LA LEISHMAHIOSE VISCERALE A L'AIDE DE LA CAMPTOTH~INE INCORPORÉE DANS LES L ~ S O M E S STELUQUEMENT STABILISES

2.1 Résumé .................................................................................... 39 2.2 Summary .................................................................................. 40 2.3 Introduction ..................................... .,. ..................................... 41 2.4 Experimental Design ................................................................. 44 2.5 Results ..................................................................................... 47 2.6 Discussion ................................................................................ 50 2.7 Acknowledgment ....................................................................... 53 2.8 References ................................................................................ 54

CHAPITRE III: CONCLUSION GÉNÉRALE

3.1 Conclusion .............................................................................. 62 3.2 Perspectives ............................................................................. -66

REFERENCES DE L'INTRODUCTION ET DE LA CONCLUSION ..... 69

LISTE DES TABLEAOlf

CHAPITRE 1

Table 1: Espèces de Leishmania associées aux différentes formes de

leishmaniose.. . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5

CHAPITRE II

Table 1: Hematologic changes on days 6 and 14 after intraperitoneal

administrations of free or liposomal CPT (2.5 mg/kg) every

two days during 14 days to uninfected BALB/c mice.

Untreated mice were used as controls .................................. 58

vii

USTE DES FiGURES

CHAPITRE 1

Figure 1: Répartition mondiale des diverses formes de leishmaniose. Les

zones ombragées indiquent les régions affectées par la maladie

Figure 2: Cycle cellulaire de Leishnuznia. Le schéma montre la transmission

de la maladie d'un mammifère a un autre par l'intermédiaire de

l'insecte vecteur (la mouche de sable) ........................................ 8

Figure 3: Structure de la camptothécine sous sa forme lactone (active) et

sous sa forme carboxylate (inactive). Dans le cas de la 20 (S)-

carnptothécine, les radicaux R i , Ra et & sont des atomes

d'hydrogène. tes autres dérives de la camptothécine portent des * ................................................................ radicaux differents. -2 1

Figure 4: Structure d'un liposome unilamellaire incorporant differents types * . ................................................................. de medicamen ts.,*. -26

Figure 5: Les différents types de Iipsomes. ............................................ .3 1

Figure 6: Types d'interaction des liposomes avec Ies cellules ..................... 32

Figure 1: Proliferation of L. donovani promastigotes following incubation

with 0.1 pM (O), 0.5 pM (a), 1 pM (O), 2.5 PM ( ) , 5 pM (A) and 10

pM (A) of free CPT (Panel A), liposome-encapsulated CPï (Panel B)

or corresponding drug-free liposomes (Panel C) a t 25OC for a 6 day

period. Proliferation of L. donovani promastigotes in absence ol

any treatment was used as controls (+). The growth of parasites

was evaluated from determination of the optical density at 600 nm

on days 0, 2, 4 and 6. The parasite growth is expressed as % of

optical density when compared with control. Values represent the

mean (î SEM) of 3 independent experiments. .....,. . . .. . . .. ..... . . . .. . .59

Figure 2: Tissue distribution of free (0) and liposome-encapsulated

camptothecin (m) at 6 h (Panel A) and 48 h (Panel B) after a4ingie

subcutaneous (s.c.) or intraperitoneal (i. p.) administration in

uninfected BALB/c mice. Values represent the mean (I SEM)

obtained from 6 animals per group per time point. *, p < 0.05 and

**, p c 0.01 when compared with free CPT in the same tissue. #, p

c 0.05 and ##, p < 0.01 when compared with mode of

administration in the same tissue ..... .. ... ..... ... .. .. ........ ..... , ....... ..60

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ADN: CPT: CR3: DM=: DPPC: DPPG: DSPE: Fab: FBS: Fc: gp63: Hb: Ht: HDL: h: IC50:

II- 1: DNA: kDNA: kg: ECPT: LW: LW. M: MFR: mg: ml: MLV: MPs: aw: OMS: PEG. PKC:

Acide désoxyribonucléique 20(S)-camp tothécine Récepteur pour le composant 3 d u complément Dimethyl sulfoxide, diméthyl sulfoxyde Dipalmitoylp hosphatidylcholine Dipalmitoylphosphatidylglyce rol Distearoylphosphatidylethanolarnine

Fragment variable de l'anticorps Fetal bovine semm, sérum de veau foetal Fragment cristallisable de l'anticorps Glycoprotéine 63 Hemoglo bin, hémoglobine Hematocrit, hémotocrite High density lipoprotein, lipoprotéine de haute densité Hour, heure 50% inhibition concentration, concentration inhibant 50% Interleukine- 1 Desoxyribonucleic acid , acide désoxyribonucléique Acide désoxyribonucléique du kinétoplaste Kilogram, kilogramme 20(S)-Camptothécine liposomale Lipophosphoglycan Large unilamellar vesicle, liposome unilamellaire de grande taille Molar, molaire Mannose-fucose receptor, récepteur du mannose-fucose Milligram, milligramme Millilitre Multilamellar vesicle, liposome muitilamellaire Monocyte-phagocyte system, système monocyte-macrophage Nanomolar, nanomolaire Organisation Mondiale de la Santê Polye thylène glycol Protéine kinase C

RBC: RES:

S m TOPO-1: T o p E pci:

ril: Cim: WH: WBC: WHO:

Red blood cell, globules rouges Reticuloendotheliai system, système réticulo-endothélial Srnall unilamellar vesicle, Iiposome unilamellaire de petite taille Topoisornérase 1 Topoisornérase II Microcurie Microlitre Micron Virus de l'immunodéficience humaine White blmd cell, globules blancs World Health Organisation, Organisation mondiale de la santé

CHAPITRE 1

INTRODUCTION GENÊRALE

Chapitre 1: Introduction générale 2

Les maladies tropicales constituent un grave problème dans les pays en voie

de développement. Elles comprennent les infections a protozoaires (malaria,

leishmaniose, trypanosomiase), à helminthes (schistosomase, filariose,

onchocearcose) et à mycobactéries (tuberculose). Près de la moitié des 500

millions d'individus affectés par ces maladies tropicales souffrent d'infections

parasitaires (Remme et al., 1993). Les taux de mortalité associés à ces

maladies sont élevés. La leishmaniose se trouve au septième rang des

maladies tropicales affectant le plus grand nombre d'individus (Rernme et al.,

1993).

En premier lieu, mon mémoire traitera de la description de la leishmaniose et

de l'agent causal de la maladie, des traitements conventionnels, des

caractéristiques la camptothecine et en dernier lieu de l'utilisation de la

camptothecine liposomale dans le traitement de cette maladie.


1.2.1 Statistiques et historique

L a leishmaniose est une maladie parasitaire dont l'agent causal est

Leishmania. Ce parasite est un protozoaire flagellé de la famille des

Trypanosomatidae de l'ordre des Kinetoplastidae. II cause des infections chez

les mammifères dont l'homme. Plus de 12 millions d'individus dans le monde

en sont affectés et 400 000 nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année

(Ashford et al., 1992). L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) estime que

350 millions d'individus risquent d'être infectés par l'une ou l'autre des

espèces de Leishmania. A ce jour, la leishmaniose est présente sur 4

continents et est à l'état endémique dans 88 pays dont 72 sont des pays en

voie de développement (OMS, 2000).

Bien que cette maladie est connue depuis des siècles, une des descriptions

les plus exhaustives de la leishmaniose cutanée a été faite par Russell en

1756. Dans le nouveau monde, constitué des Amériques, cette maladie fut

connue sous plusieurs noms dont l'ulcère d'Alep, le mal des vallées et le mal

des Andes. Lorsque les muqueuses étaient touchées, elle était surnommée la

lèpre blanche (Peters, 1988).

Dans l'ancien monde, constitue de l'Afrique, l'Asie et l'Europe, le terme kala

azar, signifiant fièvre noire, était attribue à la leishmaniose viscérale. En

1901, Leishman identifia les micro-organismes dans la rate d'un patient

ayant succombé à l'infection. En 1903, Donovan les différencia des

trypanosomes mais ce n'est que plus tard que Ross associa ce parasite au

kala azar. Ces organismes héritèrent du nom de Leishmania donovani (Peters,

1988).


1.2.2 Les diverses formes de la leishmaniose

II existe trois formes de leishmaniose, toutes causées par le protozoaire du

genre Leishrnania mais par des espèces différentes. Le tableau 1 présente les

espèces et sous-espèces de Leishrnunia associées aux différentes formes de

leishmaniose. Le tropisme des différentes espèces pour leurs différents tissus

n'est, à ce jour, pas encore élucidé.

La leishmaniose cutanée est principalement causée par l'espèce L. major. La

forme cutanée se manifeste par une papule à l'endroit de la piqûre pour

ensuite créer un ulcère (El-Safi et al., 1991). Plus souvent qu'autrement, la

lésion se résorbe suite à une réponse immunitaire appropriée. Ces individus

seront, par la suite, immunisés contre cette maladie s'ils y sont exposés a

nouveau (Wright et El Amin, 1989). Toutefois, lorsque la réponse

immunitaire est insuffisante, les ulcérations cutanées peuvent s'étendre pour

couvrir une partie du corps plus grande et laisser des cicatrices. A ce stade,

la maladie porte le nom de leishmaniose cutanée diffuse (Magill, 1995).

La leishmaniose mucocutanée est principalement causée par L. brasiliensis

(Evans, 1993). Elle débute, elle aussi, par une lésion devenant ulcereuse a

l'endroit de la piqûre. Les lésions uIcéreuses s'étendent aux muqueuses du

nez, de la bouche et du pharynx pour aboutir à une destruction tissulaire

partielle ou totale (Evans, 1993; OMS, 2000).

L. donovani, espêce responsable de la leishmaniose viscérale (kala-azar) chez

l'homme et le chien, a comme synonyme L. infanhm dans le cas de la

leishmaniose splénique infantile méditerranéenne, La maladie débute par

une papule à l'endroit de la piqûre. L'invasion des viscères se fait sur

plusieurs mois pendant lesquels le malade maigrit et s'affaiblit. Cette forme

de la maladie se caractérise par de fortes poussées de lièvre intermittentes,

une anémie, une hypertrophie du foie, de la rate et des ganglions (Pearson et

Chapitre I: Introduction générale 5 - - .

Sousa, 1990). Dans presque la totalité des cas, en absence de traitement, la

mort s'en suit. Chez les sujets traités, une leishmaniose cutanée post kala-

azar se manifeste un à deux ans après l'infection sous forme de nodules

cutanés (Blackwell et Plant, 1986).

Table 1 Espèces de Leishmania associées aux différentes formes de

leishmaniose.

1 Forme de leishmaniose

Cutanée

Espèce

L. aethiopica*

L. brasiliensis

L. major

L. mexicana*

;. brasiliensis

,. donovani

Sous-espèce

L. b. guyanensis

L. b. panamensis

L. m. amazonensis

L. m. garnhami

G. m. mexicana

I. m. pfanoi

5. m. venezuelensis

;. b. brasiliensis

,, d. donovani

,. d. infantum**

Note : leishmaniose cutanëe et cutanée diffuse

** leishmaniose viscérale infantile


1.2.3 Répartition géographique des divemes leishmanioses

La figure 1 montre la répartition mondiale des diverses formes de

leishmanioses. Les leishmanioses sont retrouvées dans l'ancien monde

(Afrique, Asie, Europe) et dans le nouveau monde (Amériques). Les différentes

formes de cette maladie sont retrouvées dans les régions tropicales de ces

continents.

Dans l'ancien monde, le Soudan, le Kenya, le Sénégal et le Congo sont les

pays les pIus touchés de l'Afrique. La forme viscérale et cutanée y sont

présentes (Evans, 1993). La région du bassin méditerranéen est

principaIement touchée par la forme cutanée (nord de l'Afrique) et par la

forme viscérale (sud de l'Europe) (Dedet et Pratlong, 2000). La forme cutanee

prédomine dans la région du centre asiatique (l'Anatolie et les régions

environnantes) alors que la forme viscérale affecte l'Asie du sud-est

(Birmanie, Ceylan, Chine, Indes et Thaïlande) (Magill, 1995).

Dans le nouveau monde, l'Amérique centrale est principalement touchée par

la leishmaniose cutanée abrs que la L'Amérique du Sud est affectée par la

forme mucocutanée mais aussi cutanée et viscérale (Evans, 1993).

Chapitre 1: Introduction génerale 7

Fi- 1: Répartition mondiale des diverses formes de leishmaniose. Les

zones ombragees indiquent les régions affectées par la maladie.

1.2.4 Cycle cellulaire de Ldshmonia

La figure 2 schématise le cycle cellulaire du parasite Leishmania. Le parasite

du genre Leishmania est un protozoaire de la famille des Trypanosomatidae.

Quelque soit l'espèce de Leishmania, deux stades développementaux

caractérisent son cycle de réplication. Ce parasite est transmit par

l'intermédiaire d'un vecteur nommé la mouche de sable. Cet insecte pique

une personne par heure et une piqûre sur 300 000 cause la leishmaniose

(Ashford, 1988). Dans l'ancien monde, c'est Ia mouche de sable du genre

Phlebotornus qui transmet Ia maladie à divers mammifères alors que dans le

nouveau monde, il s'agit du genre Lutzomiya (Ashford, 1996).

1.2.4.1 Stade amasiiaote

Lors du repas sanguin chez l'hôte, la mouche de sable rejete des parasites

dans la circulation sanguine. Ces derniers se retrouvent ensuite à l'intérieur


des neutrophiles et des cellules phagocytaires mononuclées. Ce n'est

toutefois qu'à l'intérieur des phagolysosomes des macrophages que les

parasites survivent. Les prornastigotes se différencient sous la forme

amastigote plus adaptée et résistante au pH acide de 4.3 et à la température

élevée de 37°C (Moore et Matlashewski, 1994). Ce stade intracellulaire

obligatoire est de forme arrondie mesurant de 2 à 3 pm de diamètre, non

flagellé et non mobile (Bard, 1989; Wright et El Amin, 1989).

Figure 2: Cycle cellulaire de Lekhanid Le schéma montre la

transmission de la maladie d'un mammifère a un autre par

l'intermédiaire de l'insecte vecteur (la mouche de sable).

1.2.4.2 Stade promasdibote

Lorsqu'une mouche de sable femelle saine prend un repas sanguin chez cet

hôte infecté pour nourrir ses (EU&, elle absorbe des macrophages contenant


des parasites sous sa forme amastigote. Ces amastigotes se différencient

sous le stade promastigote dans l'intestin de l'insecte afin de s'adapter à

l'augmentation du pH et à la diminution de la température. En effet, le pH

environnant est de 7.3 et la température de 25°C.

11 existe plusieurs morphotypes de promastigotes dont le pararnastigote,

l'haptomonade, le promastigote infectieux et finalement le nectomonade qui

se retrouvent a différents niveaux du tube digestif du vecteur (Schlein et al.,

1987; Schlein et al., 1992). C'est à cet endroit que les promastigotes non

infectieux (stade logarithmique) se multiplient. À la fin de la réplication, les

parasites deviennent infectieux (stade métacyclique) (Mahoney et al., 1999)-

Le promastigote est de forme allongé et très mobile grâce à son flagelle

antérieur. Les cellules mesurent de 12 à 16 pm de longueur et de 1,5 à 3,s

pm de largeur (Bard, 1989). Les promastigotes métacycliques (infectieux) ont

acquis des caractéristiques les rendant pIus vinilen ts et leur permettant

d'infecter efficacement leur ho te. Parmi ces caractéristiques se retrouvent

I'augmentation de la résistance a la lyse, une augmentation de l'expression

de la protéine de surface gp63 et du lipophosphoglycan (LPG) (Handman et

Goding, 1985; Mahoney et al., 1999). Ces dernières molécules ont plusieurs

fonctions dont celle de se lier aux cellules phagocytaires de l'hôte permettant

ainsi l'infection (Handman et Goding, 1985; Russell et Wilhelm, 1986). Les

promastigotes métacycliques migrent par la suite vers les structures

buccales de l'insecte (Pimenta et al., 1992). Des parasites sont rejetés dans la

circulation sanguine de Ibôte lors d'un repas sanguin subséquent. Le cycle

cellulaire est alors complété.


1.2.5 Facteurs impliqués dams l'infection

Le promastigote infectieux posedent des molécules de surface qui lui permet

de se lier aux macrophages en plus d'échapper à certaines composantes du

système immunitaire. Les plus importantes dans la liaison aux macrophages

sont la glycoprotéine gp63 et le lipophosphoglycan (LPG). Une fois phagocyté,

le parasite Leishmania, transformé sous sa forme amastigote, passe au stade

de réplication au cours duquel tes topoisornérases entrent en jeu.

1.2.5.1 Molécules implisuées dans la liaison aux rnacrophaaes

i ) La glycoprotéine gp63: L'infectivité du promastigote infectieux (phase

stationnaire) est corrélée avec l'augmentation de l'expression de la

glycoprotéine gp 63. La gp 63 est une protease glycolipidique qui joue un r6le

crucial dans l'initiation de l'infection. Elle permet au promastigote de se Iier

aux récepteurs du mannose-fucose (MFR), de la fibronectine (FnR) et du

composant du complement 3 (CR3) a la surface du macrophage (Bogdan et

Rollinghoff, 1998; Russell et Talamas-Rohana, 1989). Ces liaisons

entraîneront la phagocytose du parasite et l'infection de la cellule. La gp 63

possède une activité enzymatique qui lui permet d'inactiver plusieurs

composantes du complément (C3, CS et Cg) en les phosphorylant. Les voies

classique et alternative de la cascade du complément sont alors inhibées

(Hermoso et al., 199 1; Sacerdoti-Sierra et al., 1997). Chez l'arnastigote, elle

facilite la survie a l'intérieur des phagolysosomes.

ii) Le l@ophosphoglycan: Le lipophosphoglycan (LPG) est un glycoconjugué

qui recouvre plus de 25% de la surface du parasite (Wright et El Amin, 1989).

Il facilite l'attachement du promastigote au macrophage en se liant au

récepteur du troisième composant du complément (CR3) et au récepteur du

mannose-fucose (MFR) (Blackwell, 1985; Bogdan et Rdlinghoff, 1998). Le


LPG joue deux autres rôles importants; soient la liaison du promastigote a

l'épithélium intestinal de la mouche de sable et la protection de l'amastigote

dans les cellules phagocytaires (Sacks et ai., 2000; Wright et El Amin, 1989).

A l'intérieur du phagolysosome, le LPG protège le parasite des enzymes

hydrolytiques comme la P-galactosidase en agissant comme une bamère

physique (Bogdan et Rôllinghoff, 1998). IR LPG diminue aussi l'activité de la

PKC menant à la réduction de la chimiotaxie et de la production de

l'interleukine- 1 (IL- 1) (Descoteaux et Turco, 1993).

1.2.5.2 To~oisomérases et rêpiication

A l'intérieur du phagolysosome, les parasites doivent non-seulement contrer

les mécanismes de défense de la cellule phagocytaire mais doivent également

s'y répliquer pour produire une infection active. Les gènes importants,

comme le gène A2 (Charest et Matlashewski, 1994; Zhang et Matlashewski,

1997) jouant un rôle dans la survie chez les vertébrés et 1'ATPasel b (Meade

et al., 1989) essentiel dans le maintien du pH interne neutre, seront

répliqués, transcrits puis traduits pour produire les protéines nécessaires à

la survie intracellulaire du parasite.

Les topoisomérases ont un rôle essentiel dans la replication, la

recombinaison et la transcription de I'ADN (Wall et al., 1986). Ces enzymes

nucléaires forme un lien non-covalent avec I'ADN double brin. Elles coupent

ensuite les liens phosphodiesters de l'ADN et entraînent la relaxation pour

permettre la réplication (D'Arpa et al., 1990; Malonne et Atassi, 1997). Elles

liguent aussi les brins à la fin de la réplication (Kjeldsen et al., 1992). Le ou

les brins d'ADN sont coupés suite à une transestérisfication pendant laquelle

l'enzyme forme un lien phosphotyrosyl covalent avec l'ADN via le site actif de

la tyrosine (Wang, 1996).

Chapitre 1: Introduction générale 12 . ..

Les topoisomérases peuvent ëtre divisées en deux classes soient la

topoisomérase 1 (Topo-1) et la topoisomérase II (Topo-II). L a Topo-1 est un

monomère qui coupe un seul brin et qui catalyse la relaxation de la double

hélice par rotation des segments d'ADN (Wang, 1996). La Topo-II est un

homodimère qui catalyse la relaxation de l'ADN en coupant les 2 brins

(Gellert, 198 1). Il existe deux types de Topo-1 soient, le type IA qui est présent

chez les procaryotes (bactéries) et le type IB qui est présent chez les

eucaryotes (Broccoli et al., 1999).

Les topoisomérases 1 et II ont été détectées chez plusieurs trypanomastidea

tel chez Leishmania donovani (Chakraborty et al., 1993; Melendy et Ray,

1987). Chez plusieurs kinetoplastidae, l'activité de la Topo4 est retrouvee au

niveau de I'ADN mitochondrial (appelé ADN du kinetoplaste; kDNA) et

nucléaire alors que l'activité de la Topo-II n'est retrouvée qu'au niveau de

l'ADN mitochondrial (Bodley et Shapiro, 1995). 11 a été démontré que I'ADN

du kinétoplaste n'est pas nécessaire à la survie du parasite (Burri et al.,

1996). Les résultats obtenus par Bodley et al. révèlent que l'activité de la

Topo-l est détectable dans les mitochondries et le noyau du parasite

Leishmania (Bodley et al., 1995).

1.2.6 Modilles animaux d'infection

Il existe plusieurs modèles animaux pour produire une infection in vivo dans

le but d'effectuer des recherches. Le choix de l'animal pour produire une

véritable infection est capital pour la réussite de l'étude puisque les

pathogènes n'infectent qu'un nombre limité d'hôtes et d'animaux. Dans le

cas de l'infection à Leishmania donouani, les deux modèles animaux les plus

couramment utilisés pour effectuer des recherches sur Ia leishmaniose

viscérale sont la souris BALB/c et le hamster doré (Mesocricetus auratus)


liposomale (à une dose de 0.8 mg/kg) s'accumule 100 fois plus dans le foie et

8 fois plus dans la rate que la drogue libre (Paul et aL, 1997). Dans le cas de

l'injection intrapéritonéale, l'incorporation du PEG dans les liposomes permet

de diffuser plus aisément la cavitk péritonéale afin de rejoindre la circulation

puis le foie et la rate (Bestman-Smith et al., 2000; Gregoriadis, 1995). Cette

molécule permet de prolonger la durée de vie des liposomes avant d'être

captés par les cellules du système réticulo-endothélial (Lasic, 1998). Ceci

permet une longue durée d'action du médicament et des administrations

moins fréquentes (Désormeaux et Bergeron, 1998).

Les traitements des maladies parasitaires comme la leishmaniose viscérale

engendrent de hauts niveaux de toxicité et des risques de surdosage. De

plus, la biodisponibilité de ces médicaments est souvent faible étant donné

leur liaison aux protéines plasmatiques, leur dégradation protéolytique et

leur faible pénétration dans les cel1ules infectées. L'encapsulation de ces

médicaments dans les liposomes pourrait améliorer leurs propriétés

pharmacologiques ainsi que le ciblage du foie et de la rate. Ainsi, il est

possible de concentrer les médicaments a l'intérieur de ces organes pour

augmenter l'efficacité et réduire la toxicité reliées à ces derniers (Croft, 1986).

L'équipe du Dr. Alving a démontré que I'encapsulation de l'antimoine dans

des liposomes réduisait substantiellement sa toxicité et augmentait

l'efficacité contre la leishmaniose de 700 fois comparativement a l'antimoine

libre (Alving et al., 1978). A ITnstitut Indien de Biochimie à Calcutta, il a été

démontré que des liposomes greffés de mannose contenant des pentamidines

permettaient de diminuer la charge parasitaire au niveau de la rate de 85%

comparativement à 47% et 19% pour les liposomes conventionnels et la

drogue libre (Bane jee et al., 1996). Ici, le mannose permet de cibler les

récepteurs de mannose sur les macrophages. Par ailleurs, l'utilisation d'une

formulation liposomale d'amphotéricine B a permis d'augmenter l'efficacité,


(Anjili et al., 1996; Baumann et al., 199 1). Les souris sont habituellement

infectées par une injection de parasites dans la veine de la queue alors que

chez les hamsters, les parasites sont injectés par voie intracardiaque

(Banerjee et al., 1996; Baumann et al., 199 1 ) .


1.3.1 Les traitements conventionnels

Les trois catégories de médicaments les plus utilisées pour traiter la

leishmaniose viscerale sont les suivantes : les dérivés d'antimoine,

l'arnphotéricine B et les diamidines-pentamidines. Or, les drogues utilisées

dans le traitement de la leishmaniose sont souvent toxiques, présentent des

problèmes d'efficacité variable et de résistances et possèdent des limitations

comme de longues périodes d'administration parentérale (Croft, 1999).

1.3.1.1 Les dénués d'antimoine

i) Description : L'antimoine est un élément atomique (Stibium, Sb). Les

catégories d'antimoine les plus connues sont les dérives pentavalents comme

le gluconate de sodium d'antimoine (~lucantime@) et le meglumine

d'antimoine (pentostamQ) et les dérivés trivalents. Tous ces médicaments

sont présentement utilises pour traiter la leishmaniose à l'exception des

dérivés trivalents qui sont inefficaces et toxiques (Henvaldt et Berrnan, 1992)-

itj Mode d'action : Le mode d'action de l'antimoine sur le Leishmania n'est pas

parfaitement élucidé. Lfiypothèse la plus probable est la stabilisation d'un

complexe clivable d'ADN - topoisornerase dans les parasites (Chakraborty et

Majumder, 1988; Lucumi et al., 1998). La topoisomérase a pour fonction de

cliver un (ou les deux) brin d'ADN menant à une relaxation qui permettra la

réplication et la liaison des brins une fois la réplication terminée (Uehling et

al., 1995).

iii) Traitement : Le traitement est d'une durée approximative de 20 jours. Ces

traitements contre la leishmaniose viscérale sont administrés par voie

intramusculaire.

Chapitre 1: Introduction génëraIe 15

iv) Effets indésirables et inconvénients : Une toxicité cumulative engendrée

par la conversion du dérivé pentavalent en dérivé trivalent in uiuo (Sereno et

al., 1998). Les symptômes suivants peuvent mener à l'arrêt du traitement :

myalgie, douleurs articulaires, anorexie et dysfonctionnement hépatique. Un

empoisonnement caractérisé par de la fièvre et une toxicité neurologique,

hépatique, pancréatique, cardiaque (arythmie fatale) et rénale peut survenir

chez certains patients (Berman, 1988; de Lalla et al., 1993; Olliaro et

Bryceson, 1993). Chez les enfants et chez les patients souffrant

d'embonpoint ou ayant des lésions au foie, au cœur ou aux reins, le

traitement est contre-indiqué. Des êtudes rkcentes ont démontré que les

doses d'antimoine pour traiter la leishmaniose viscérale doivent être plus

élevées qu'auparavant (Anabwani et al., 1983; Thakur et al., 1988).

Actuellement, après un traitement à l'antimoine, les cas de rechute et de

résistance sont fréquents (de Rossel1 et al., 1992).

En effet, les traitements nécessitent des doses de plus en plus élevées

d'antimoine et les cas d'échec a ce traitement de première ligne augmentent

en flèche en Asie (Lira et al., 1999). La résistance semble être causée par plus

d'une mutations. Elle implique une amplification des gènes codant pour la

régulation de la biosynthèse des thiols, ce qui se traduit par une

augmentation du trypanothione, un des thiols réduits le plus important chez

les Trypanomastidae (Haimeur et al., 1999). Il y a aussi amplification des

gènes codant pour le transporteur ABC PgpA impliqué dans le transport du

médicament (Kundig et ai., 1999). Le gène ORF19 confère aussi un haut

niveau de résistance a l'antimoine mais le mécanisme conféré par ce gène est

encore peu compris.


i) Description : L'amphotéricine BI un antibiotique polyène macrolide produit

par Streptomyces nodosus (Deneshmed et Warnock, 1983), permet de traiter

non seulement les infections fongiques, mais aussi les infections

parasitaires. Les médicaments de cette classe les plus utilisés

commercialement sont Fungizonea et la forme tiposomale (~rn~isome@). La

forme liposomale réduit les effets indésirables de l'arnphotéricine B (Paul et

aL, 1997). Des cas de leishmaniose viscérale résistante à l'antimoine ont été

traitées avec succès avec cette dernière formulation (Maingon et ai., 1995).

ii) Mode d'action : L'amphoténcine B se lie aux stérols, surtout à l'ergostérol,

de la membrane plasmatique du parasite menant à la formation de pores par

lesquels les ions s'échappent (Ramos et al., 19961. Cette fuite d'ions mène à

la destruction du parasite (Ali et al., 1997).

iii) Traitement: La durée du traitement varie en fonction du résultat.

L'administration est parentérale et l'infusion doit être donnée sur une période

variant de 8 à 10 h a tous les 2 jours (Olliaro et Bryceson, 1993).

iv) Effets indésirables et inconvénients : Sa toxicité aiguë et son faible index

thérapeutique restreint son utilisation pharmacologique (Yardely et Croft,

1997). La faible tolérance locale et systémique (fièvre, anémie,

thrombocytopenie, phlébite, convulsion, anaphylaxie, insuffisance rénale), la

néphrotoxicité, l'arythmie cardiaque et l'administration intraveineuse de

longue durée rend l'utilisation de ce médicament aussi moins intéressante

(Mullen et al., 1997; Sawaya et al., 1995). Pour ces raisons, l'arnphotéricine B

n'est utilisé que dans les cas d'échec au traitement a l'antimoine (Bryceson,

1987).


L'ergostérol, la principale cible de l'arnphotéricine B, est absent chez les

lignées de parasites résistants a ce médicament (Mbongo et al., 1998). Cette

modification est aussi accompagnee dpune augmentation de la fragilité et de

la fluidité de la membrane ainsi que d'une surexpression de la glycoprotéine

P (Espuelas et al., 2000).

1.3.1.3 Les diamidines et les pentamidines

i) Lkscnption: La série des diamidines aromatiques sont des composés

hypoglycémiques. Les molécules de cette famille possèdent toutes une chaîne

centrale alkane (Sands et al., 1985). Les deux sels de pentamidine utilisés

sont le mesylate de pentamidine (hmidinem) et I'isothionate de pentamidine

(Sands et al., 1985).

ii) Mode d'action : Le mode d'action de ces médicaments n'est encore que

partiellement compris toutefois, ils entraînent des bris dans le complexe

d'ADN mitochondrial du kinétoplaste et entraînent la fragmentation de Ia

membrane (Croft et Brazil, 1982).

iii) 7hiternent: La durée du traitement varie d'un mois et demi à 6 mois.

L'injection intramusculaire du médicament se fait tous les 2 jours (Olliaro et

Bryceson, 1993).

iv) Effets indésirables et inconvénients : L'utilisation de ces médicaments est

limitée à cause de la faible tolérance locale (douleur et abcès) et des effets

indésirables comme la cardiotoxicité manifestée par de l'hypotension

artérielle et de la tachycardie, l'hématotoxicité caractérisée par une anémie,

une leucopénie et une thrombocytopénie, la néphrotoxicité, l'hypoglycémie et

le diabète irréversible (Bouchard et al., 1982). Ces médicaments sont

efficaces pour traiter les cas résistants à l'antimoine mais sont trop toxiques


pour être considérés comme un premier plan de traitement (Oliiaro et

Bryceson, 1993).

11 existe toutefois des cas de résistances aux pentamidines. 11 semble que

cette résistance ne serait pas liée à la résistance aux autres médicaments.

Elle implique des mécanismes spécifiques dont une diminution des sites de

liaison du médicament s'expliquant par la diminution de régions riches en AT

dans l'ADN du kinétoplaste [Basselin et al., 1998). Aussi, chez les

promatigotes résistants aux pentamidines, les membranes cytoplasmiques et

mitochondriale sont fortement dtérées. Ceci se traduit donc par une

diminution de la pénétration du médicament à l'intérieur du parasite et de la

mitochondrie, une augmentation de son expulsion et une altération ou la

perte de sa cible intracellulaire (Basselin et al., 1997). Il y a donc diminution

de la concentration de pentamidine ii l'intérieur de la mitochondrie; une cible

importante de ce mëdicament.

1.3.1.4 Les autres traitements

L'utilisation des autres traitements contre la leishmaniose viscérale est

moins fréquente. Des antifongiques autres que l'amphotéricine B peuvent

aussi présenter une efficacité intéressante comme le kétoconamle (~izoral')

qui démontre une bonne activité in vitro et qui s'est revélë aussi efficace que

l'antimoine dans le cas de leishmanioses cutanées sud-américaines mais

efficace que chez un petit nombre de patients atteints de la leishmaniose

viscérale (Olliaro et Bryceson, 1993). L'allopurinol (~~lor ic@), un analogue de

l'hypoxantine, peut être utilise seul ou en combinaison avec l'antimoine

durant une période de 2 à 8 semaines et prévient l'apparition de

leishmaniose cutanée après le traitement. L'aminosidine (~aromomycine~) est

un antibiotique de la famille des aminosides qui présente une grande

efficacité contre la leishmaniose viscérale et une faible toxicité. Malgré le fait


qu'il potentialise I'effcacite de l'antimoine, Iorsqu'utilisé en concomitance,

son utilisation n'est pas généralisée (Chunge et al., 1990). 11 existe aussi des

mécanismes de résistance à la ~aromom~cine" qui s'expliquent par une

diminution de l'incorporation du médicament à l'intérieur du parasite causée

par une altération de la composition membranaire (Maarouf et al., 1998).

Bien qu'il existe des médicaments pour pallier aux résistances a l'antimoine,

ces traitements sont souvent insatisfaisan ts et toxiques. De plus, puisque

l'incidence de la maladie est sans cesse grandissante, la demande pour

trouver d'autres molécules efficaces est grande.

1.3.2 La camptothécine

i) Description : La camptothecine est un alkaloide isole de l'arbre chinois

Camptotheca acuminata pour la première fois par Wall (Wall et al., 1986). ta

20(S)-camptothécine (CPT), dont la structure est illustrée a la figure 3, est la

molécule primaire à partir de laquelle d'autres molécules ont été dérivées

pour faire de la camptothecine un médicament plus hydrosoluble et moins

cytotoxique. Parmi ces molécules se trouvent, la 9-aminocamptothécine, la 9-

nitrocamptothecine, et deux dérivés de la 1 0-hydroxy-campto thëcine soit

I'irinotécan, ou CPT- 1 1 (camptosar@) et le topotécan ( ~ ~ c a m t i n q .

ii) Indication : Ce médicament a une activité anticancéreuse (leucémies et

tumeurs) (Miki et al., 1998; Wiseman et Markham, 1996). camptosara est

utilisé pour traiter le cancer du colon et ~ ~ c a m t i n @ , le cancer des ovaires.

Les applications à d'autres cancers sont présentement à l'étude comme le

cancer du sein (Clements et al., 1996; Jones et al., 1997). Ce médicament est

administré par infusion intraveineuse.

La CET inhibe aussi la réplication des promastigotes kishmania donouani in

vitro (Bodley et Shapiro, 1995). Une concentration de 2'2 )rM de 2019-


camptothécine est cytotoxique pour 50% des promastigotes kishmania

donovani in uitro après 48 h d'incubation (Bodley et al., 1995). Ceci suggère

que la CPT pourrait aussi avoir des applications dans le traitement de la

leishmaniose.

iii) Raitement : Les 2 médicaments commerciaiisés, soit ~ a m ~ t o s a r @ et

~ ~ c a m t i n " , sont administrés respectivement comme suit : une perfusion

intraveineuse de 90 minutes par semaine pendant 4 semaines suivi de 2

semaines de repos (Iyer et Ratain, 1998; Wiseman et Markham, 1996) et une

perfusion intraveineuse de 30 minutes par jour pendant 5 jours suivi de 16

jours de repos (Iyer et Ratain, 1998). Dans les études précliniques,

l'administration intrapéritoneale de la CPT chez la souris est plus efficace et

moins toxique que l'administration intraveineuse (Guichard et al., 1998).

iv) Mode d'action : La CPT est un inhibiteur de topoisomérase IB (Hsiang et

al., 1985). Chez le parasite Leishmania, la topoisornerase 1 est une bonne

cible puisqu'elle permet la réplication de l'ADN nucléaire nécessaire à sa

survie. La CPT se lie à la topoisomerase 1 pour former un complexe CPT - topoisomérase 1 - ADN (Hsiang et al., 1989). Cette association empêche la

topoisomérase 1 de religuer les simples brins précédemment coupés. Lorsque

la fourche de réplication de I'ADN rencontre le complexe, il en résulte un bris

des deux brins d'ADN et par conséquent, un arrêt de la réplication de I'ADN

(Hsiang et al., 1989). te complexe clivable mène finalement a la mort du

parasite (Ray et al., 1998).

v) Caractéristiques biochimiques : La CPT est métabolisée au niveau du foie et

des tumeurs (dans le cas de traitement de tumeurs cancéreuses) en son

métabolite actif, le SN-38. La molécule de la CPT est composé de cinq cycles

dont un cycle lactone (Nabiev et al., 1998). Le cycle lactone [fermé) est

important pour pénétrer à l'intérieur de la cellule et pour interagir avec la

Chapitre 1: Introduction générale 2 1

topoisornérase I (Hertzberg et al., 1989). Or, le cycle lactone (CPT active)

s'hydrolyse (s'ouvre) rapidement et complètement en cycle carboxylate (CPT

inactive) dans les conditions physiologiques du sérum humain (pH 7.4, 37°C)

alors que l'hydrolyse est retardée dans le sang puisque le cycle lactone, très

hydrophobe, s'enfouit dans la membrane cellulaire des globules rouges. La

forme active (lactone) est donc retrouvée lorsque la CPT est dans une

solution à pH acide ou lorsque que le cycle est enfoui à l'intérieur d'une

membrane lipidique (Burke et Mi, 1994; Burke et al., 1992).

Forme Lactone Forme Carboxylate

Figure 3: Structure de la camptothécine sous sa forme lactone (active) et

sous sa forme carboxylate (inactive). Dans le cas de la 20 (9- camptothécine, les radicaux Ri, RZ et h sont des atomes

d'hydrogène. Les autres dérivés de la camptothecine portent des

Ra

H

H

'C2H5

radicaux différents.

RP

H

-CH2-N(CH&

H

Radicaux

Camptothécine

Topotecan

Irinotecan

R i

H

OH

CI. Of* O


vi) Effets uidésirables et inconvénients : L'hydrolyse rapide de la forme Iactone

(active) de la CPT en forme carboxylate aux conditions physiologiques limite

le temps d'action de la drogue (Burke et Mi, 1994). Le traitement est

constitué de longues perfusions. Les effets indésirables de tous les dérivés de

la CPT sont l'anémie, la leucopénie, la neutropénie, la diarrhée tardive, la

destruction des villi composant la section intermédiaire de l'intestin, les

douleurs abdominales, les nausées et les vomissements (Erickson-Miller et

al., 1997; Shinohara et al., 1998; van Warmerdam et al., 1995; Wiseman et

Markham, 1996). Or, la destruction des villi ont lieu lors de traitements

chroniques à long terme alors que les modifications hématologiques

apparaissent rapidement.

La myéIosupression est reliée a une exposition prolongée et a une

concentration élevée de CPT et de ses dérivés dans la circulation sanguine

(Ohdo et al., 1997). L'hématotoxicité de la CPT est amplifiée lorsque l'activité

des topoisomérases 1 de l'ADN des cellutes de la moelle osseuse est

augmentée (Stewart et al., 1994). Les mécanismes intracellulaires impliqués

dans la toxicite sont les mêmes que ceux expliqués dans la section #Mode

d'action* ci-hau t (O hdo et al., 1997).

Au niveau de la toxicité intestinale et de la diarrhée, la CPC implique

plusieurs mécanismes. Tout d'abords, il y a la concentration élevée de la CPT

et de son métabolite actif (SN-38) au niveau de l'intestin ainsi que la durée

d'exposition des cellules de l'épithélium intestinal à ces molécules (Araki et

al., 1993; Kurita et al., 2000). Certaines cellules entrent en apoptose alors

que d'autres entrent dans un processus de différenciation cellulaire

(hypersécrétrices) (Ikuno et al., 1995). II semble que le métabolite SN-38 soit

plus impliqué que le médicament lui-mëme au niveau de la diarrhée

entrainée par la prise de ce médicament. En effet, l'inhibition de la P-

Chapitre 1: introduction générale 23

glucoronidase, enzyme impliquée dans le rnékbolisme de la CPT, engendre

un retardement et une diminution de cet effet indésirable. Par ailleurs, la

CFT entraitraine une augmentation de la prostaglandine Ez [PGE2) qui a pour

effet d'amplifier cet eRet secondaire. Cette augmentation de PGEz entraine

une augmentation du préristahisrne intestinal, une hypersécrétion de

mucus, une diminution de l'absorption des éIectrolytes causée par une

inhibition des pompes a sodium et à potassium et une sécrétion d'ions

chlorure (Kurita et al., 2000).

I l existe un problème, autre que la toxicité, dans l'administration de la 20(S)-

camptothecine. En effet son hydrophobicité la rend difficile à administrer.

Chapitre 1: introduction généraie 24

1.4 LESLIKISOMES

1.4.1 Historique

L'emploi de certains médicaments est souvent limité par leur faible index

thérapeutique, leur toxicité, leur faible spkcificité et leur courte durée

d'action dans le milieu biologique. t'utilisation des liposomes constitue une

approche intéressante pour réduire la toxicité, prolonger la durée d'action,

améliorer la biodistribution et la stabilité de ces médicaments (Lasic, 1993).

En 1965, Bangham et ses collègues ont observé qu'un mélange de

phospholipides naturels provenant de jaunes d'œuf, formait instanbnement

des vésicules en milieux aqueux (Bangham et al., 1965). Ces vésicules,

appelées subséquemment liposomes, encapsulaient une partie du soluté

dissout dans le milieu. Leur composition et leur structure semblable à celle

des ceflules s'est avéré un excellent modële pour étudier les structures et

[onctions des membranes biologiques (Bangharn et al., 1965). C'est au début

des années 1970 que lYutiIisation des liposomes comme transporteurs de

mo1écuIes et de médicaments comme des enzymes, des anticancéreux et des

antimicro biens a été suggérée (Gregoriadis, 1976).

Les premières études sur l'utilisation des liposomes comme véhicuIe de

medicament ont été decevantes : instabilité biologique de la membrane et

faible taux d'incorporation de la drogue (Lasic, 1998). L'appréciation des

liposomes dans le domaine de l'industrie pharmaceutique était en déclin. À la

fin des années 1980, les compagnies qui ont poursuivi leurs recherches pour

améliorer la composition des liposomes, ont aujourd'hui phsieurs

médicaments liposomaux sur Ie marche. En 1998, plus d'une vingtaine de

préparations antimicrobiennes et anticancéreuses étaient sur le marché ou

en cours d'études chiques avancées (Lasic, 1998). Des préparations


Liposomaies d'amphoténcine B (~mbisome) , de doxorubicine (~oxil? et de

daunorubicine ( ~ a u n o ~ o m e @ ) sont commercialisées dans le traitement

d'infections fongiques et dans le traitement du cancer (Désormeaux et

Bergeron, 1998). Dans le domaine médical, les liposomes sont aussi utilisés

à d'autres fins comme l'immunomodulation, la thérapie génique et la

vaccination (Bergers et al., 1995; Torchilin, 1985). Les liposomes ont aussi

des applications dans l'industrie des cosmétiques. Ils entrent dans la

composition de nombreuses crèmes pour la peau et écrans solaires (Lasic,

1996).

1.4.2 Structure et composition des liposomes

La structure des liposomes contenant différents types de médicaments est

illustrée a la figure 4 (Lasic, 1992; Lasic, 1998). Les liposomes sont

généralement constitués de phospholipides. Les phospholipides sont

composés d'une tête polaire hydrophile et de deux chaînes non polaires

hydrophobes. Dans un milieu aqueux, ces lipides, de par leurs propriétés

amphiphiles, vont naturellement former une structure sphérique composée

de plusieurs bicouches lipidiques. Les têtes polaires sont orientées vers le

milieu aqueux extérieur et intérieur (cavité) alors que les chaînes

hydrocarbonées sont orientées les unes vers les autres de façon à fuir le

milieux aqueux (Lasic, 1992). En se formant, les liposomes incorporent du

milieu aqueux dans leur cavité, ce qui facilite l'encapsulation de

médicaments. Les médicaments hydrophiles se logent dans la cavité

intérieure du liposome, les médicaments hydrophobes s'enfouissent au

niveau de la membrane lipidique alors que les médicaments amphiphiles se

retrouvent de part et d'autre de la membrane lipidique (Gregoriadis, 1976).

De plus, des médicaments portant une charge peuvent s'adsorber au niveau

des têtes polaires,

Chapitre 1: introduction générale 26

Médicaments hydrophobes

Médicaments amphiphiles

Médicaments hydrophiles

Figure 4: Structure d'un liposome unilamellaire incorporant différents types

de médicaments.

1.4.3 Taille des liposomes

Les liposomes peuvent être constitués de plusieurs bicouches lipidiques

(MLV, multilameZlar vesicfes) ou d'une seule bicouche. Les liposomes

unilamellaires sont classés selon leur taille soit de grande taille (LUV, large

unilamellar vesicles) ou de petite taille (SUV, small unilamelfar vesicles). Les

petites vésicules de taille homogène (100 a 200 nm) ont de la facilite à passer

dans les petites fenestrations des vaisseaux et tissus favorisant ainsi une

meilleure distribution tissulaire que les liposomes de grande taille. Les petits

liposomes circulent aussi plus longtemps que les gros liposomes (1 à 3 pm)

puisque les interactions avec les protéines plasmatiques telles les opsonines

Chapitre 1: Introduction génerale 27

sont diminuées. Ces Liposomes sont par conséquent captés moins

rapidement par le système réticulo-endothélial (Gregoriadis, 1995). Toutefois,

les gros liposomes composés de plusieurs bicouches de lipides encapsulent

une plus grande quantité de médicament (Lasic, 1993). Or, les liposomes

mesurant entre 80 et 200 nm présentent un compromis entre les propriétés

biologiques des liposomes de petite taille et les proprietés physiques des

liposomes de taille supérieure [Lasic, 1998). Pour produire des liposomes

unilamellaires de cette taille et homogène, les deux méthodes considérées les

plus efficaces sont l'extrusion (passage sous pression sur membranes

poreuses) et la sonication (émission d'ultrasons) (Lasic, 1998).

1.4.4 Les differents types de liposomes

Les différents types de liposomes sont illustrés a la figure 5. Les liposomes

peuvent posséder une ou plusieurs couches de lipides, être composes de

lipides chargés ou neutres, être greffés de polyéthylène glycol ou d'anticorps

(Gregoriadis, 1991). Le comportement des liposomes in vivo dépend de leurs

caractëristiques (Lasic, 1996).

1.4.4.1 Li~osomes conventionnels

Les liposomes conventionnels possèdent généralement une courte demi-vie

plasmatique puisqu'ils sont capturés naturellement et rapidement par le

système réticulo-endothélial (RES) (Désormeaux et Bergeron, 1998). Le

ciblage passif des cellules du RES s'avère intéressant dans le traitement

d'infections affectant ces celIules (virus de l'immunodéficience humaine - VIH, le parasite Leishrnania, la bactérie Listena). Tout d'abord, les opsonines

se f ~ e n t a la surface des liposomes et facilitent la reconnaissance et la

phagocytose par les cellules du RES menant ainsi a l'accumulation au niveau


du foie et de la rate (Gregoriadis, 1988; Senior, 1987). Les liposomes

conventionnels peuvent aussi être désintégrés et libérer leur contenu

prématurément suite à l'interaction des phospholipides avec les lipoprotéines

de haute densité (HDL) (Gregoriadis, 1995). Un autre inconvénient de cette

forme de liposomes est qu'ils ont tendance à s'accumuler au site &njection

et à s'agglomérer lors d'une administration par voie sous-cutanée.

L'introduction de phospholipides chargés comme le phosphatidylglycérol ou

le phosphatidylsérine augmente la stabilité des liposomes et prévient les

contacts entre eux et l'agglutination qui peut en résulter grâce aux forces

électrostatiques (Lasic, 1992). Ces phospholipides vont d'ailleurs favoriser

l'adsorption de médicament portant une charge opposée. Les liposomes

cationiques encapsulent efficacement l'ADN. L'ajout de lipides non chargés

comme le phosphatidylcholine et le cholestérol peut toutefois améliorer la

rigidité de la membrane lipidique et réduire l'adsorption des opsonines

ralentissant le processus de phagocytose (Gregoriadis, 1995).

1.4.4.2 Immunoliposomes

Dans le cas des infections touchant des tissus ne faisant pas parti du RES, il

est intéressant d'utiliser des moyens pour cibler spécifiquement les cellules

infectées, La f ~ a t i o n d'anticorps monoclonaux a la surface des Iipusomes est

un moyen efficace pour cibler certaines cellules et pour y libérer

spécifiquement le médicament (Allen, 1994; Allen e t Moase, 1996). Toutefois,

les immunoliposomes s'accumulent dans le foie et la rate puisque les

fragments Fc des immunoglobulines a la surface des liposomes stimulent le

RES via l'opsonisation (Debs et al., 1987; Wolff et Gregoriadis, 1984). Pour

diminuer l'immunogênicité de ce type de liposomes, il est possible d'enlever le

fragment Fc tout en conservant la spécificité avec le fragment Fab (Dufresne

et aL, 1999). De plus, la furation de molécules de polyéthylène glycol (PEG) à


la surface de ces Liposomes réduit considérablement la capture par le RES et

allonge la demi-vie en circulation (Allen, 1995). Les immunoliposomes se sont

avérés intéressants pour cibler les cellules affectées comme dans le cas de

carcinomes ovariens (Kirpotin et aL, 1997) et driection au VIH (Bestman-

Smith et al., 2000).

1.4.4.3 Liposomes sténauement stabilisés

La demi-vie des liposomes étant encore insatisfaisante, certains chercheurs

se sont penchés sur L'ajout de molécules en surface. Plusieurs méthodes ont

étê développées pour prolonger leur demi-vie. La première méthode consiste

à ajouter des lipides, comme le choIestéro1, dans la bicouche lipidique pour

en augmenter la rigidité (Bakker-Wouden berg, 19%). Subséquemment, la

première génération de liposomes stériquement stabiIisés était basée sur un

principe différent soit sur le fait que l'acide sialique et les glycolipides

retrouvés à la surface des globules rouges et de certaines bactéries

empëchent l'agglomération des cellules et la reconnaissance par le système

immunitaire (Lasic, 1992). L'incorporation de glycolipides comme le

phosphatidylinositol hydrogéné (HPI) dans la bicouche lipidique ou la greffe

de molécules ressembIant à l'acide sialique (GM- 1, monosialoganglioside) a la

surface des liposomes ont permis d'augmenter le temps de circulation des

liposomes (Allen, 1994). L'hydrophilicité de ces molécules sont en partie

responsable du détournement du système immunitaire. L'inconvénient de ces

deux méthodes est qu'elles sont limitêes aux liposomes à membrane rigide

ou aux liposomes administrés en grandes doses (Allen, 1992).

Il y a quelques années, Ia venue de la seconde génération de liposomes

stériquement stabilisés (steakho) a apporté la solution à ce problème. Cette

stratégie basée sur la prêcédente s'appIique toutefois à tous les liposomes

indépendamment de la composition lipidique et de la dose (Bergers et al.,

Chapitre 1: Introduction générale 30 --

1995). L'ajout d'un polymère comme le PEG a la surface des liposomes attire

les molécules d'eau, repousse les lipoprotéines et les fragments C3b et iC3b

du complément prévenant ainsi la fiation des opsonines (Gregoriadis, 1995).

Ils détournent ainsi les cellules du système réticulo-endothélial (Allen, 1994;

Baker-Woudenberg, 1995) pour voir leur demi-vie en circulation prolongée

de 50 à 100 fois (Lasic, 1992). Malgré le fait que leur durée de vie est

augmentée, ils finiront par être phagocytés par les cellules phagocytaires

mais moins rapidement que les liposomes conventionnels (Désormeaux et

Bergeron, 1998; Lasic, 1998). Des concentrations entre 5 et 10 mol% de

PEG-2000 ont été déterminées comme étant idéales pour prolonger la demi-

vie des liposomes (Allen, 1994). Ces liposomes stériquement stabilisés, lors

d'une administration sous-cutanée, ont moins tendance a s'agréger au site

d'injection que les liposomes conventionnels et ont l'habileté a traverser les

épithélium pour rejoindre la circulation plasmatique (Bestman-Smith et al.,

2000; Gregoriadis, 1995).

De plus, lors d'une administration intrapêritonéale, le passage de la cavité

péritonéale est aussi facilité, Les liposomes sténquement stabilisés

s'accumulent d'ailleurs en plus grande quantité au site d'infection que les

liposomes conventionnels.


Figure 5: Les différents types de liposomes

Les liposomes peuvent interagir avec les cellules de quatre façons possibles

(figure 6). Ils peuvent être ingérés par le processus d'endocytose et dégradés

à l'intérieur des lysosomes pour y libérer leur contenu (endocytose). Ils

peuvent fusionner leur membrane avec ceux de la membrane cellulaire pour

libérer directement le contenu à i'iitêrieur du cytoplasme (fusion). Ils

peuvent aussi échanger des lipides de leur membrane avec celle de la cellule

(échange de lipides). Les liposomes peuvent s'adsorber à la membrane

cytoplasmique et libérer son contenu dans le milieu extracelluiaire. Une

partie du médicament libérê peut alors diffuser à l'intérieur de la cellule

(adsorption).


Endocytose JI;/ Fusion

Figure 6: v p e s d'interaction des liposomes avec les cellules.

1.4.6 Liposomes e t Leishmaniu

Le parasite Leishmania infecte les cellules du système réticulo-endothélial.

Puisque les liposomes sont naturellement captés par ces cellules, l'utilisation

de nouveau médicaments anti-Leishmania encapsules dans des liposomes

constitue une approche intéressante pour cibler les cellules infectées. Avec

cette méthode, le médicament se concentre davantage dans les tissus

infectés permettant ainsi de réduire le niveau de toxicité sur les autres

organes (Croft, 1986; Lasic, 1992; New et al., 198 1).

La biodistribution des Liposomes dépend de pIusieurs paramètres. Dans le

traitement de la leishmaniose viscérale, les administrations intraveineuse et

intrapéritonéale de la majorité des types de liposomes s'avèrent les meilleurs

modes d'administration puisqu'ils permettent d'augmenter 1'accumuIation de

la drogue dans les tissus riches en macrophages tels le foie et la rate (Hamie

et al., 1995; Senior, 1987). Paul et al. ont démontré que l'amphotéricine B

Chapitre I: Introduction genérale 34

de réduire la toxicité du médicament (Castagnola et al., 1996) et de traiter la

leishmaniose viscérale résistante chez des patients atteints du VIH (Davidson

et al., 199 1).

1.4.7 Liposomes stériquement stabilisés et camptothécine

Les études portant sur la camptothécine liposomale ne sont qu'au stade

préclinique; aucune formulation lipidique de cette drogue n'est encore sur le

marché. Toutefois, quelques études in vitro et in vivo portent sur des

formulations liposomales de 20(S)-camptothécine et de ses dérivés (Daoud et

al., 1995; Sadzuka et al., 1998; Subramanian et Muller, 1995). Les résultats

tendent tous a démontrer la supériorité de la forme liposomale par rapport a

la drogue libre. Présentement, aucune étude portant sur I'inhi bi tion in vitro

ou in vivo de Leishmania a l'aide de la camptothécine liposomale n'a été

menée. Les études traitent surtout de l'efficacité anticancéreuse, de la

toxicité, de la distribution tissulaire et de la stabilisation moléculaire.

La camptothécine liposomale administrée par voie intramusculaire inhibe,

tout comme la forme libre, le grossissement de la tumeur humaine

(carcinome de la poitrine et mélanome malin) greffée chez la souris (Daoud et

al., 1995). L'incorporation de la CPT-1 1 (derivé hydrosoluble de la CFT) dans

les liposomes-PEG augmente la concentration de drogue dans la tumeur

intestinale de 4.5 fois et améliore l'activité antitumorale de 2.6 fois. Cette

formulation est legèrement supérieure a la forme libre quant a la

concentration en CPT dans le foie et la formulation IiposomaIe

conventionnelle est supérieure de 3.4 fois. Par ailleurs, les problèmes

intestinaux comme la diarrhée qui sont des signes de toxicité associés au

traitement, sont aussi diminués (Sadzuka et al., 1998). Yang et al. ont

démontré que l'incorporation de la CPT dans les nanoparticules lipidiques

améliore l'accumulation dans le plasma, le foie et la rate respectivement de


4.9, 8.2 et 6.7 fois par rapport a la drogue libre (Yang et al., 1999). De plus,

les travaux de l'équipe de CoIbern sur les tumeurs intestinales (tumeur du

colon HT29), démontrent une activité antitumorale supérieure de 20 fois à la

drogue libre lorsque l'inhibiteur de topoisomërase 1 GL17211C était

encapsulé dans les liposomes-PEG (Colbern et al., 1998). L'incorporation

dans les liposomes-PEG a toutebis augmenté de 4 fois la toxicité.

Des recherches menées par le département de génétique moléculaire à

l'Université de l'Ohio ont démontré que les liposomes sont un moyen efficace

pour délivrer le topotécan (dérivé hydrosoluble de la CPT) aux cellules

cancëreuses. Elles rapportent que le topotécan liposomal est 3 à 4 fois plus

efficace que la forme libre pour stabiliser le complexe ADN-topoisomérase 1 à

l'intérieur des cellules cancéreuses (Subramanian et Muller, 1995).

L'incorporation d'un dérivé de la CPT dans les liposomes-PEG permet de

protéger le cycle lactone (actif) contre la conversion en cycle carboxylate

(inactif) et d'empêcher la liaison avec les protéines plasmatiques (Burke et al.,

1993; Lundberg, 1998). La stabilisation du cycle lactone est d'autant

améliorée par une encapsulation dans des Liposomes dont la solution

aqueuse est acide (Burke et Gao, 1993). Toutefois, l'incorporation de la CPT

dans les Liposomes est dificile etant donné l'hydrophobicité de la molëcule

(Daoud et al., 1995), le maximum d'incorporation de la drogue étant de

l'ordre de 10% (Lundberg, 1998).

La camptothécine Iiposomale présente, en somme, plusieurs avantages par

rapport à la forme libre. Ces avantages peuvent non seulement être mis à

profit dans le traitement de tumeurs cancéreuses mais aussi dans le

traitement de la leishmaniose viscérale.


Dans beaucoup de pays en voie de développement, les traitements sont rares

et souvent trop dispendieux pour une grande partie de la population. De

plus, l'émergence de résistance des parasites aux médicaments

conventionnels rend le problème des plus complexe. Actuellement, la

technologie de pointe permet d'effectuer des recherches sur ces maladies qui

mèneront au développement de nouveaux médicaments visant à réduire la

mortalité associée à ces pathogènes.

La prévalence sans cesse grandissante de la leishmaniose ainsi que

l'émergence de résistance aux anti-leishmania conventionnels démontre le

besoin urgent de développer de nouvelles drogues efficaces contre cette

maladie. La camptothécine est un candidat potentiel dans le traitement de

cette dernière étant donné qu'elle interfère avec la réplication de Leishmania

donovani in vitro. Toutefois, comme la majorité des drogues efficaces contre

les maladies parasitaires, cette drogue présente une grande toxicité pour les

cellules humaines. De plus, le cycle lactone qui lui confère son pouvoir

pharmacologique est rapidement hydrolysé en cycle carboxylate (forme

inactive) dans les conditions physiologiques. Pour pallier à ses inconvénients,

une stratégie visant à augmenter la concentration d'anti-parasitaires dans le

foie et la rate, qui sont les organes principalement touchés dans la

leishmaniose viscérale, pourrait permettre de réduire les effets cytotoxiques

et prolonger la demi-vie de la drogue.


Le projet de recherche faisant l'objet de ce mémoire porte sur l'utilisation de

Ia carnptothécine encapsulée dans des liposomes dans le traitement de la

leishmaniose. L'objectif de mon projet de maitrise consiste a mettre a u point

une formulation stable de liposomes-PEG contenant de la camptothécine qui

permet d'inhiber in vitro et in vivo le parasite Leishmania donouani. Dans un

premier temps, nous avons évalué la rétention de la carnptothécine dans les

liposomes pour ensuite procéder aux mesures in vitro ayant pour but de

vérifier la toxicité de la camptothécine libre et encapsulée dans les liposornes-

PEG sur Ies promastigotes.

Dans un deuxième temps, nous avons évalué si I'encapsulation de la

camptothécine dans les liposomes-PEG augmentait l'accumulation dans les

organes riches en macrophages. Nous avons donc effectué la distribution

tissulaire de la drogue libre et encapsulée suite à l'injection intrapéritonéaie

et sous-cutanée chez la souris. Par la suite, nous avons évalué l'efficacité de

de la camptothécine libre (administrée par voies intraveineuse, sous-cutanée

et intrapéritonéale) et liposomale (administrée par voie intrapéritonéale) a

réduire l'infection à Leishmania donovani in vivo. Finalement, chez la souris,

la toxicité hématologique de la drogue libre et encapsulée administrée a été

évaluée chez la souris.

TRAITEMENT DE LA LEISHMMIOSE VISCERALE A L'AIDE DE LA cAMPTOTHÉCINE INCORPORÉE DANS LES LIPOSOMES

Ce chapitre reproduit le texte intégral d'un article intitulé heatmenf of visceraf leishmaniasis with sterically stabilized ltposomes containing

camptothecin par Marie-Eve Prouix, André Désormeaux, Jean-François Marquis, Martin Olivier et Michel G. Bergeron (soumis pour publication dans

Antimicro bial Agents & Chemotherapy).

Chapitre II: Traitement de la leishmaniose viscérale à l'aide de la campto- 39 thécine incorporée dans les liposomes stériquement stabilisés

L'efficacité de la 20(Sj-camptothécine (CPT) libre et encapsulée dans des

liposomes stériquement stabilisés, a été évaluée in vitro sur les promastigotes

de Leishrnania donovani et in uivo chez un modèle murin de la leishmaniose

viscérale. L'incubation des promastigotes avec la CPT libre ou liposomale a

inhibé la croissance des parasites selon un effet dose-dépendant. Les études

portant sur la distribution tissulaire révèlent que l'administration

intrapéritonéale est efficace pour concentrer le médicament au niveau du foie

et de la rate. Le traitement, des souris infectées, par injections

intrapéritonéales de CPT libre ou liposomaie a pennis de réduire la charge

parasitaire au niveau du foie de 43% et 55% respectivement, en comparaison

avec les contrôles non-traites. Toutefois, les deux traitements entraînent une

anémie normochrome et une neutropénie.

Chapitre II: Traitement de Ia leishmaniose viscérale à l'aide de ta campto- 40 thécine incorporée dans les iiposomes stériquement stabilisés

The efficacy of 2O(q-camptothecin, free and incorporated into stericaliy

stabilized liposomes, has been investigated in vitro on Leishmania donovani

promastigotes and in vivo in a murine model of visceral Leishmaniasis.

Incubation of L. donovani promastigotes with free or liposomal CPT inhibited,

in a dose-dependent manner, the growth of parasites. Tissue distribution

studies reveaied that the intraperitoneal administration of liposomal CPT was

efficient in deliveringhigh d m g levels to the liver and spleen. Treatment of

infected mice with intraperitoneal injections of free or Iiposomal CFT

significantiy reduced the parasite load in liver by 43% and 55%, respectively,

when compared wi th un treated controls. However, bo th treatrnents caused

normoc hrom anemia and neutropenia.

Chapitre II: Traitement de la leishmaniose viscérale a I'aide de la campto- 4 1 thécine incorporée dans les liposomes stériquement stabilises

Parasites of the genus Leishmania are intracellular protozoans that infect

more than 12 million individuals around the world with 400,000 new cases

every year (3). Various pathologies can develop following infection with

Leishmania, depending on the species involved, encompassing cutaneous,

mucocutaneous and visceral leishmaniasis (25). The first line therapy of

visceral leishmaniasis is antirnonial derivatives which have a variable efficacy

and produce serious side effects. Amphotericin B and pentarnidines, which

represent the second line of therapy, also have limited efficacy and high

toxicity. The high prevaIcnce of leishmaniasis and the emergence of resistance

to conventional drugs demonstrate the need to develop new less toxic and

efficient treatrnents (7, 19, 23).

A s liposomes are naturally taken up by macrophages of the liver and spleen,

the main reservoirs of parasites in visceral leishmaniasis, their use

represents a IogicaI strategy to concentrate drugs within these tissues to

more efficiently treat this parasitic infection. Mullen et al. have evaluated the

antileishmanial effïcacies of different amphotericin B formulations

(Fungizone, Arnbisome, Abelcet and Amphocil) in a murine model of viscera1

leishmaniasis (18). Results showed that the liposornal formulation of

amphotericin B (Arnbisome) and Arnphocil were the most active formulations

against L, donovani in this animal model of infection. A case of visceral

leishmaniasis unresponsive to several courses of treatment with standard

Chapitre 11: Traitement de la leishmaniose viscérale à l'aide de la campto- 42 thécine incorporée dans les liposomes stériquement stabilisés

- --

drugs was succesfully cured by a 2 1 day course (50 mg/day) of liposomal

amphotericin B (10).

2O(S)-carnptothecin [CPT), a chemotherapeutic agent used to treat solid

tumors and leukemias (13), has been shown to be effective in inhibiting the

growth of Leishmania donovani promastigotes in uitro (6, 17) by trapping type

1 DNA topoisornerase to form a complex which inhibits both cleavage and

religation reactions of DNA replication leading to ce11 death (14). However, the

rapid ring opening of CPT to its less effective hydrolysed carboxylate form in

human plasma and its high toxicity constitute the major drawbacks of this

drug. Previous studies showed that the lactone ring of CFT is protected upon

incorporation of the drug into a lipid bilayer structure like liposomes (8, 9,

16).

The coupling of polyethyleneglycol (PEG) of defined rnolecular weight on

liposomes (sterically stabilized liposomes) of specific lipid composition and

size is known to increase their ability to move through the lymph after

subcutaneous injection thereby reducing their accumulation a t the site of

injection (1, 2). Our previous studies have demonstrated that sterically

stabilized liposomes accumulated more eificiently than PEG-free liposomes in

lymph nodes, liver and spleen after a single subcutaneous administration to

mice (5). Such PEG liposomes reduced the toxicity associated with the

administration of a carnptothecin derivative (24). In this study, the efficacy of

CPT, free and incorporated into sterically stabilized liposomes, has been

evaluated in vitro on Leishmania donovani promastigotes and in vivo in a

Chapitre II: Traitement de la leishmaniose viscérale à l'aide de Ia campto- 43 thécine incorporée dans les liposomes stériquement stabilisés

-

murine mode1 of visceral leishmaniasis. The tissue distribution and

hematologic profde of both formulations have also been investigated in mice

since it is hypothetized that liposomal CPT might reduce the toxic effects

associated with the free dmg as reported for other liposomal h g

formulations (4, 11, 15).


CPT was a generous gift of Dr. M.C. Wani (Research Triangle Institute, NC) . Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dipalmitoylphosphatidylglycero1

(DPPG) and diste~ylphosphatidylethanolamine-N-[~ly-(ethyleneglycol)

20001 (DSPE-PEG) were purchascd from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).

The parasites (Leishmania donovani donouani Sudanese 1S2D) were grown at

room temperature and transfered twice a week in SDM-79 culture medium

supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) as previously described

(20, 27).

Liposomes composed of DPPC:DPPG:DSPE-PEG in a molar ratio of 10:3:0.83

(rno1:mol) were prepared according to the method of thin lipid film hydration

as previously described (12). For CPT-containhg liposomes, the lipid film was

hydrated with a solution of CFT pre-solubilized (9.5 rng/rnl) in dimethyl

suifoxide (DMSO) and diluted in phosphate buffer (pH 6.0) (23.75 pg

CET/prnol lipid). A srnall proportion of [WJ-DPPC or [WJ-CPT was added as

radioactive tracers. The lipid mixture was sonicated for 2 h using an

ultrasonic bath to generate liposomes having a diameter ranging between

160-200 nm. Vesicle size distribution of the small unilamellar vesicles (SUVs)

were evaluated with a submicron particle analyzer. Unencapsulated drug was

removed by centrifugation of the liposomal preparation through a Sephadex

G-50 column and efiiciency of drug entrapment in the liposomal effluent was

determined by radioactivity measurements. In vitro liposomal drug retention

was evaluated at 4 and 37'C in phosphate buffer and a t 37°C in 80% FBS as

Chapitre II: Traitement de la leishmaniose viscérale a l'aide de la campto- 45 thécine incorporée dans les liposomes stériquement stabilisés

described previously (12). Drug retention was evaluated by radioactivity

measurements of the eluate in cornparison with that value a t time zero.

To monitor the efficacy of free and liposomal CPT on the growth of

Leishmania donovani, parasites were transfered (6 x 106 log phase

promastigotes) into 3 ml of culture medium in the absence or presence of

increasing concentrations of free or liposome-encapsulated camptothecin (O

to 10 pM) or with the corresponding arnount of drug-free liposomes. The

parasite growth was followed over 6 days by measuring the absorbance at

600 nm. For the tissue distribution studies, a single bolus of free or

liposomal carnptothecin (5.5 mg CPT/kg; 12.9 0Ci [3H]-CPT/mg of cold CFT)

was administered subcutaneousIy in the upper right leg region or

intraperitoneally to uninfected BALB/c mice (18-20 g) in a volume of 500 01.

At specific time points postinjection, animals were sacrificed and selected

tissues were collected, washed and weighed. Al1 samples were treated with

tissue solubilizer and decolorized with H202. Drug and lipid levels were

monitored in al1 samples with radioactivity measurements using a liquid

scintillation counter.

For the in Guo efficacy studies, BALB/c rnice (18-20 g, n=6/group) were

infected 1~1th Leishmania donovani (2 x 107 stationary phase promas tigotes)

given intravenously in the tail vein. Two weeks postinfection, free and

liposomal CPT (2.5 mg CPT/kg of body weight) were administered

intraperitoneally to mice in a volume of 500 fi1 every 2 days over a period of 2

weeks. Infected mice were also treated with intravenous or subcutaneous

Chapitre 11: Traitement de la leishmaniose viscérale a i'aide de la campto- 46 thécine incorporée dans les liposomes stériquement stabilisés

administrations of free CPT. Five days after the end of the treatrnent, mice

were sacrificed and the eficacy was evaiuated using liver impression smears,

The parasite load was deterrnined by optic rnicroscopy and each group was

compared with the untreated control group. For hernatologic toxicity,

uninfected BALB/c rnice were injected intraperitoneally with 500 O1 of free or

liposomal CFT (2.5 mg CPT/kg body weight) every 2 days over a 2 week

period. Animais treated with phosphate buffer containing 1% DMSO were

used as controls. Blood samples were collected on days 0, 6 and 14 for

hernatologic analysis. UncoaguIated blmd sarnples were used for obtaining a

complete blood evaluation including total red blood cells, hemoglobin,

hematocrit, platelets, total white blood cells, neutrophil and lymphocyte

counts. Statisticaiy significant differences between groups were determined

with the analysis of variance (ANOVA) using the Fisher least significant

difference tests.

Chapitre II: Traitement de la leishmaniose viscérale à l'aide de la carnpto- 47 thécine incorporée dans les liposomes stériquement stabilisés

The encapsulation efficiency of CPT in sterically stabilized liposomes was

0.027 * 0.006 pmol CPT/pmol lipid. About 15% of the drug was released from

liposomes after a 48 h incubation in phosphate buffer at 4°C whereas this

value reached 30% following incubations of liposomes in phosphate buffer or

in 80% FBS a t 37°C (data not shown). However, after this initial drug release,

complete retention of drug in liposomes was observed for up to a t least 14

days. Figure 1 shows the proliferation of L. donouani promastigotes following

incubation with different concentrations of free and liposome-encapsulated

CPT or with the corresponding arnount of drug-free liposomes. Incubation of

L. donovani promastigotes with free or liposomal CFT inhibited, in a dose-

dependent manner, the growth of parasites. A complete inhibition of parasite

growth was observed following incubation with 10 pM of free or liposomal

CPT. Drug-free liposomes had no major effect on the proliferation of L.

donovani promas tigo tes.

Figure 2 shows the tissue distribution of CPT, free or incorporated into

stencally stabilized liposomes, a t 6 and 48 h after a single bolus

subcutaneous or intraperitoneal administration in uninfected mice. Overall,

except for the concentration observed in popliteal lymph nodes at 48 h after

the subcutaneous administration of free drug, the incorporation of CPT into

sterically stabilized liposomes resulted in similar or higher drug

accumulation in al1 tissues a t al1 time points. Results show that liposornal

drug administered subcutaneously mostly accumulated in inguinal Iymph

nodes. The intraperitoneal administration of liposomal CPT significantly


-

increased the concentration of drug in iiver, spleen and mesenteric lymph

nodes a t 48 h postinjection. Of particulai- interest, the incorporation of CPT

into liposomes increased by 1.8 and 2.7 times the concentration of drug in

the spleen and liver, respectively.

We have next evaluated the effect of the route of administration on the

efficacy of free CFT in reducing the parasite faad in the livers of mice infected

with L. donovani. As the intraperitoned injection of liposomal CPT represents

the best route of administration tested in this study to concentrate the drug

in the liver, we have also evaluated the efficacy of this treatment. Results

showed that treatment of mice with subcutaneous or intravenous injection of

free CPT did not significantly decrease the parasite load (Leishmania donovani

units - LDU) in the liver when compared with control mice (data not shown).

in contrast, infected animals treated with intraperitoneal injections of free or

liposomal CPT significantly reduced the parasite load in the liver by 43 * 12%

and 55 * 17%, respectively, when compared with untreated control mice.

Table 1 shows the effect of intraperitoneal administrations of free and

liposome-encapsulated CPT given every two days for 14 days to uninfected

BALB/c mice on the hematologic parameters on days 6 and 14 of treatment.

Both treatrnents a t this dosing regimen caused norrnochrom anemia as

evidenced by the significant decrease of the total red blood cells (14 to 24%),

hemoglobin (1 1 to 18%) and hematocrit (13 to 21%) when compared with the

untreated control values. Treatment of mice with free CPT resulted in a 35

and 39% increased number of platelets on days 6 and 14, respectively, when

compared with untreated controls. The incorporation of CPT into PEG

Chapitre II: Traitement de fa leishmaniose viscérale a l'aide de la campto- 49 thécine incorporée dans les liposomes stériquement stabilisés

Iiposomes had less of an effect on the platelets increasing their n u b e r s by

14 and 28% on days 6 and 14, respectively, when compared with untreated

controls. Mice treated with both free and liposomal CFT exhibited

neutropenia with decreases in the number of neutrophils by 50 to 67% when

compared with untreated controls.

Our in vitro studies showed that CPT incorporated into 160-200 nm sterically

stabilized liposomes composed of DPPC:DPPG:DSPE-PEG (10:3:0.83 rno1:mol)

was as effective as the free agent in inhibiting the proliferation of Leishmania

donovani promastigotes. These results indicate that the incorporation of CPT

into these phospholipid vesicles did not affect its ability to inhibit the

proliferation of the parasites. Bodley et al. have previously demonstrated that

the ICso of CPT against 1;. donovani promastigotes (MHOM/SD/62/ 1s-CL2D)

after a 48 h incubation at 26°C was 2.2 pM (6). The difference between the

ICso values could be due to the different strains and concentrations of L.

donovani promastigotes used in these studies.

Chapitre II: Traitement de la leishmaniose viscérale à l'aide de la campto- 50 thécine incorporée dans les liposomes steriquement stabilisés

Our previous studies showed that in fluorescence microscopy, sterically

stabilized liposomes like those used in this study were mainly localized in

macrophage-rich areas such as the subcapsular region of lymph nodes and

in the red pulp and marginal zone of the spleen (5). In the present study,

tissue distribution studies showed that the intraperitoneal administration of

Iiposome-encapsulated CPT efficiently delivered high drug levels into the liver

and spleen, the main reservoirs of parasites in visceral leishmaniasis. Such

drug targeting of infected tissues should theoretically improve the inhibition

of parasite replication. On the other hand, most of the liposome-encapsulated

CFT administered subcutaneously accumulated in inguinal lymph nodes.

This is in agreement with our previous observations which showed that

subcutaneously administered sterically stabilized liposomes tend to

concentrate in lymph nodes near the injection site when compared with other

lymph nodes or tissues (5).

The effect of the route of administration plays an important role on the

efficacy of free CPT to reduce parasites load in liver of mice infected with L.

donovani. Results showed that both subcutaneous and intravenous

injections of free CPT were not effective in reducing the parasite load in the

liver when compared with infected untreated controls. In contrast, the

intraperitoneal administration of free CPT significantly reduced by 43% the

parasite load in the liver. Incorporation of CFT into sterically stabilized

liposomes further reduced to 55% the parasite load in the liver when


compared with untreated controls. Although significant, the eficacy of b th

free and liposomal CPT was relatively poor under these experimentai

conditions. This low efficacy rnay be associated to the poor abiiity of

camptothecin to inhibit the intracellular parasite, although it has shown

good activity against the extracellular parasite in culture medium.

Numerous studies showed that the incorporation of drugs into liposomes

reduce the toxic effects associated with their administrations (for reviews see,

(4, 11, 15, 26). For instance, the encapsulation of CPT-1 1, a hydrophilic

derivative of 20(S)-CPT, into liposomes, suppressed dmg-induced diarrhea, a

potential lethal toxic effect (24). Phillips et al. have shown that the

incorporation of AZT in liposomes abrogated bone marrow toxicity associated

with drug administration (21, 22). The poor accumulation of liposomes in

bone marrow may provide a mechanism for reducing the toxicity of

therapeutic agents. In this study, the administration of CPT induced

normochrom anemia and neutropenia. iiowever, in contrast to the AZT

liposomes, incorporation of CPT into liposomes did not prevent drug

hematotoxicity. Poor accumulation of liposomes in the bone marrow may be

true for some formulations but not for others. For instance, Mullen et al.

showed that liposomai amphotericin B caused significant suppression of

parasite burdens in bone marrow in murine visceral leishmaniasis (18). This

suggest that differences in the lipid composition of liposomes is an important

contributing factor in the performance of a IiposomaI drug.


Because of its unique mode of action, CPT could expand the available

effective anti-leishmania dmgs. Although the results presented in this study

showed that the encapsulation of CPT in liposomes did not increase the

efficacy of this drug in vitro and in vivo or decrease its toxicity profile,

modifications of the liposomal formulation might be developed to reduce

toxicity and maintain or even improve the efficacy as already shown for

numerous other liposomal drugs in Iiterature.

Chapitre il: Traitement de la leishmaniose viscérale à l'aide de la carnpto- 53 thécllie incorporée dans les liposomes stériquement stabilisés

The authors would like to thank Pierrette Gourde, Julie Bestman-Smith,

Jean-François Gagné and Rabeea F. Omar for constructive comments and

helpful discussions, M.O. is a FRSQ Junior 2 Scholar and recipient of a

Burroughs Wellcome Fund Award in molecular parasitology.

Chapitre II: Traitement de la leishmaniose viscérale a l'aide de la carnpto- 54 thécine incorporée dans les liposomes stériquement stabilisés

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Table 1: Hematologic changes on days 6 and 14 after intrapentoneal administrations of free or liposomal CPT (2.5 mg/kg)

every two days during 14 days to uninfected BALB/c mice. Untreated mice were used as controls.

Red blood Treatment cells Hemoglobin Hcmatocrit Platelets WBC Neutrophils Lymphocytes

Diw 6

Untreated control 9.38 î 0.08 158 * 1 0.486 * 0.004 1256 2 28 3.3 * 0.3 0.6 I 0 . 0 2.6 * 0.3

Free CPT 8.05 I 0.078 140 * la 0.424 * 0.003a 1737 * 37a 3.8 * 0.4 0.3 * o.la 3.5 I 0.4

Liposomal-CPT 7.82 I 0.1 18 137 I 2a 0.413 I O,OOSa 1438 i 4gamb * ls5 0.3 * O.la 5.1 f 1.4a

Diw 14

Untreated control 9.62 * 0.10 162 * 2 0.517 I 0.008 1147 î 34 5.2 i 0.5 0.9 1 0.1 4.2 I 0.5

Free CFT 7.33 * 0,08a 136 * la 0.418 i O.OOSa 1595 I 50a 3 .8 i1 .1 0 ,3*0+la 3 .4I1.0

Liposomal-CPT 7.27 I0,04a 133 I. l a 0.409 i 0.003a 1463 * 42a.b * l1.O 0.4 * O.la 4.7 *

Values represent the means (I SEM) obtained from 6 mice per group. aSignificantly different (pcO.05) when compared with

untreated control on the same day; b~igniircantly different (pc0.05) when compared with free CPT-treated group on the same

day.

Chapitre II: Traitement de la leishmaniose viscérale a l'aide de la campto- 59 thécine incorporée dans les Liposomes stériquement stabilisés

O 2 4 6

Timc (di~ys) 0 2 4 u

Timc (days) Timc (dqsl

Figure 1: Prolife ration of L. donovani promastigo tes following incubation

with 0.1 pM (O), 0.5 fiM (a), 1 pM (Q), 2.5 PM (1), 5 JLM (A) and 10

pM (A) of free CPT (Panel A), liposome-encapsulated CPT (Panel B) or

corresponding drug-free liposomes (Panel C) a t 25T for a 6 day

period. Proliferation of L. donovani promastigotes in absence of any

treatment was used as controls (e). The growth of parasites was

evaluated from determination of the opticaI density at 600 nm on

days 0, 2 , 4 and 6. The parasite growth is expressed as % of optical

density when compared with control. Values represent the mean (*

SEM) of 3 independent experiments.

Chapitre II: Traitement de la leishmaniose viscérale a l'aide de la campto- 60 thécine incorporée dans les liposomes steriquement stabilisés

Livrr Splczin Mrscnicnc lymph ndcs

Figure 2: Tissue distribution of free (O)

#

k S.C. i.p.

Inguinal iymph nulCs

and liposome-encapsulated

camptothecin (I) at 6 h (Panel A) and 48 h (Panel B) after a single

subcutaneous (s.c.) or intraperitoneai i p . ) administration in

uninfected BALB/c mice. Values represent the mean (I SEM)

obtained from 6 animais per group per time point. *, p < 0.05 and ",

p < 0.01 when compared with free CPT in the same tissue. #, p c

0.05 and ##, p < 0.01 when compared with mode of administration

in the same tissue.

CONCLUSION G&N$RALE

Chapitre III: Conclusion générale 62

L'utilisation de l'antimoine pentavalent dans le traitement de la leishmaniose

est largement rkpandue. Cette thêrapie de courte durée parvient à guérir la

majorité des cas de leishmanioses viscérales. Par contre, comme la majorité

des pathogènes au cours des dernières années, le parasite Leishmania réussit

a survivre dans les conditions qui autrefois le détruisait. Actuellement, après

un traitement a l'antimoine, les cas de rechute sont fréquents (de Rossel1 et

al., 1992). Les traitements secondaires comme l'amphotéricine B et les

diamidines et pentamidines présentent également une efficacité variable et

une toxicité élevée. L'efficacité variable, la toxicité élevée et l'émergence de

parasites résistants associés à une telle thérapie montre la faiblesse du

traitement. Il est primordial de découvrir de nouvelles drogues pour traiter

plus efficacement cette infection mortelle.

Les liposomes sont utilisés dans le domaine pharmacologique comme

transporteurs de médicament. L'encapsulation de drogues dans les

liposomes a permis d'améliorer les propriétés pharmacologiques de plusieurs

d'entre elles tels les antifongiques et les anticancéreux. Étant donné que les

liposomes s'accumulent davantage dans les tissus affectés, l'efficacité s'y

trouve augmentée et la toxicité sur les autres tissus diminuée. Des études

effectuées dans notre laboratoire ont démontré que l'administration

d'antiviraux comme le foscarnet et le 2'3' didéoxyinosine (ddI) encapsulés

dans les liposomes, permet d'augmenter la concentration de ces

médicaments dans les tissus riches en macrophages et d'améliorer leur

demi-vie plasmatique (Dusserre et a t , 1995; Harvie et al., 1995). En effet, les

liposomes étant captés naturellement par les cellules du système ré ticulo-

endothéIial, soit les cellules principalement infectées lors de Ia leishmaniose,

les liposomes s'avèrent une approche intéressante pour augmenter


l'accumulation d'anti-parasitaires dans ces dernières. De plus, les molécules

de polyéthylène glycol greffées à la surface des liposomes permet de prolonger

la demi-vie et l'effet thérapeutique des médicaments. Les liposomes offrent

aussi la possibilité de réduire la dose ainsi que la fréquence d'administration

du médicament.

Pour inhiber la réplication du parasite Leishmania, la topoisomérase 1

semblait être une bonne cible puisqu'elle est essentielle a la réplication de

l'ADN au niveau du noyau. La camptothécine a été rapportée comme étant

un inhibiteur de topoisomérase 1 dont le mode d'action est de former un

complexe ADN-topoisornerase 1-camptothécine qui mène directement a l'arrêt

de la réplication et a la mort cellulaire. Son efficacité a d'ailleurs été

démontré in vitro sur les promastigotes de L. donovani. L'efficacité in vivo de

la campthotécine sur l'infection a L. donovani n'a jamais été tentée jusqu'à

maintenant. Une des difficultés majeures que présente les études de ce

médicament in vivo est qu'il est rapidement inactive dans les conditions

physiologiques. En effet, le cycle lactone qui permet une meilleure interaction

avec l'ADN des cellules cibles s'hydrolyse rapidement en cycle carboxylate

inactif lorsque le pH du milieu est neutre ou basique. Un des moyens de

protéger le cycle lactone de l'hydrolyse est d'encapsuler la camptothécine

dans un vecteur lipidique. Il a été démontré que le temps de demi-vie de la

drogue active est prolongé lorsqu'elle est encapsulée dans les liposomes. Afin

d'améliorer ses propriétés pharmacologiques, nous avons mis au point une

formulation liposomaie de carnptothécine stable aux conditions d'entreposage

et aux conditions physiologiques. Dans un premier temps, des expériences in

vitro nous ont permis de démontrer que la camptothécine liposomale inhibe

la réplication des promastigotes de L. donovani de façon dose-dépendante

aux mëmes concentrations que la camptothécine, indiquant que le


médicament demeure disponible pour inhiber la réplication du parasite. Les

liposomes vides n'influencent en rien la réplication parasitaire Vr vitro,

Les parasites L. donovani se retrouvent et se répliquent a l'intérieur du

phagolysosome des cellules du système réticulo-endothélial. Les

macrophages situés dans le foie et la rate sont particulièrement touchés. Le

macrophage perd tranquillement ses fonctions pour ensuite se lyser libérant

ainsi les parasites dans le milieu environnant. Ces parasites sont un danger

d'infection pour les autres cellules du système réticulo-endothélial. Les

cellules infectées constituent donc une source importante d'infection des

autres cellules. Comme les liposomes s'accumulent dans ces mëmes organes,

ce transporteur de médicament permettrait de cibler ces tissus et d'y

concentrer la camptothecine. Nos résultats ont clairement démontré que la

camptothécine liposomale s'accumulent davantage dans le foie et la rate en

comparaison avec la drogue libre. Le mode d'injection intrapéritonéale

permet de concentrer plus efficacement la drogue dans ces organes que le

mode d'injection sous-cutané. Ce dernier favorise plutôt une accumulation

de drogue au niveau des ganglions près du site d'injection. Ce type

d'administration s'avérerait plus intéressant dans le traitement de la

leishmaniose cutanée (infection à L. major) étant donné que l'infection se

propage à l'intérieur des ganglions près de la région cutanke affectée. De

plus, a présence des molécules de PEG à la surface des liposomes permet de

prolonger cette accumulation pour au moins 48 heures. Puisque les

liposomes stériquement stabilisés diffusent plus facilement a travers les

épithélium et la cavité péritonéale, circulent plus longtemps et sont captés à

retardement par le systême réticulo-endothélial, l'effet thérapeutique est

possiblement allongé.

Chapitre iII: Conclusion générale 65

Nous avons également voulu védier et comparer l'efficacité de la

camptothëcine libre et liposomale contre l'infection à L. donouani chez un

modèle murin. L'inoculation de promastigotes de L. donovani chez le modèle

murin BALB/c induit une infection viscérale engendrant une hépato-

splénomégalie comme dans le cas de la leishmaniose viscérale chez l'humain.

Nous avons utilisé un régime de traitement semblable a ceux des autres anti-

Leishmania tout en respectant les limites de la dose d'administration totale

de camptothécine permise. Les deux formulations de camptothecine ont

permis de réduire la charge parasitaire au niveau du foie. La supériorité de la

camptothécine liposomale, par rapport à la forme libre, à diminuer l'infection

n'est toutefois pas significative. Certaines explications supportent la

supériorité de l'administration intrapéritonéale de la CPT pour réduire la

charge parasitaire par rapport aux autres modes d'injection. L'administration

intrapéritonéale permet d'augmenter l'accumulation de la drogue dans Les

tissus riches en macrophages tels le foie et la rate (Harvie et al., 1995; Senior,

1987) alors que l'injection sous-cutanée est plus efficace pour cibler les

ganglions lymphatiques (Bestman-Smith et al., 2000; Gregoriadis, 1995).

Quant a elle, l'administration intraveineuse est parfois plus efficace pour

cibler le foie et la rate que l'administration intrapéritonéale (Ellens et al.,

1981; Goto et Ibuki, 1994). Or, l'injection intrapéritonéale combiné à

l'incorporation du PEG dans les liposomes permet de prolonger l'effet

thérapeutique. En effet, les liposomes PEG injectés dans la cavité

intrapéritonéale maintiendront pIus longtemps une concentration

intrapéritonéale élevée que s'ils avaient été injectés dans la circulation

sanguine (Mayhew et al., 1990). Ces liposomes diffuseront, par la suite, à

travers la cavité péritonéale afin de rejoindre la circulation puis le foie et la

rate pour exercer leur effet (Besûnan-Smith et al., 2000; Gregoriadis, 1995).

De plus, les médicaments encapsultis dans des liposomes et administrés par


la voie intrapéritonéaie bénéficie dime bonne absorption (Fielding et d,

1999).

Chez le modèle murin BALB/c, nous avons égaiement déterminé la toxicité

hématologique du régime de traitement utilisé. 11 est établi que la toxicité

hématologique induite par la camptothécine apparaît précocement alors que

la toxicité intestinale n'apparaît que tardivement. A ce régime de traitement,

l'encapsulation de la camptothécine dans les liposomes stériquernent

stabilisés n'a pas réduit efficacement la neutropénie et l'anémie. A une dose

totale équivalente administrée sur une semaine plutôt que deux, aucune

modification histologique n'a été observée au niveau de la rate, du foie et de

l'intestin après l'arrêt du traitement a la camptothécine libre ou liposomale.

Puisque les médicaments actuels présentent des problèmes d'efficacité

variable, de résistance, de toxicité et de biodistribution, il est important de

développer rapidement de nouveaux traitements pour traiter efficacement la

leishmaniose. En somme, nos résultats demontrent le potentiel des

liposomes comme système de transport de la camptothécine pour accroître

sa concentration dans les organes atteints par L. donovani, augmenter sa

spécificité pour les cellules infectées et prolonger la demi-vie de la forme

lactone qui lui confère son activité pharmacologique.

L a 20(S)-carnptothecine est l'ancêtre des dérivés topotecan et irinotécan

couramment utilisés dans le traitement du cancer. La 20(q -camptothécine

est encore beaucoup utilisée en laboratoire mais peu en pharmaceutique a

cause de sa toxicitti. L'encapsulation de ce médicament dans les liposomes

pourrait remédier à ce problème en ajustant les paramètres du régime de


traitement. En effet, la réduction de la toxicité est plus facilement observable

lorsque les premiers signes de toxicité (hématologiques) apparaissent. Le

régime de traitement devra être ajusté dans le but d'observer ces premiers

signes. C'est dans ces conditions que la réduction de la toxicité engendrée

par lJencapsulation de la drogue dans les liposomes pourra être démontrée.

De plus, a ce régime de traitement, la supériorité de l'efficacité in vivo de la

camptothécine liposomale par rapport au médicament libre pourrait être

davantage mise en évidence.

La camptothécine semble être un médicament potentiel dans le traitement de

la leishmaniose. Nos résultats ont démontré une réduction de 55% de la

charge parasitaire au niveau du foie, ce qui est considérable pour une

première tentative de traitement. Toutefois, pour mieux évaluer le potentiel

de la camptothécine, il serait intéressant de comparer l'efficacité in vivo de ce

médicament avec ceux couramment utilisés dans le traitement de cette

maladie comme l'antimoine et lJamphotëricine B. Par ailleurs, il serait

important de comparer l'efficacité de la camptothecine liposomale avec

d'autres agents encapsulés tel ~ ' A m ~ i s o m e ~ .

Les liposomes améliorent le ciblage des cellules du système réticulo-

endothélial mais il serait possible de rendre les liposomes contenant le

médicament encore plus spécifique en greffant des molécules a leur surface.

Des études ont démontré qu'il était possible de cibler efficacement les

macrophages infectés par L. donovani a l'aide de liposomes greffes de

mannose (Bane jee et al., 1994; Raay et al., 1999). Kole et al. ont utilise du

mannosyl lié a des proteines du sérum (Kole et al., 1994). Ces molécules

permettent de cibler davantage les macrophages infectés puisqu'elles se lient

aux récepteurs spécifiques au mannose sur ces cellules (Banejee et al.,

Chapitre III: Conclusion gknérale 68

1996). Il serait aussi possible de cibler spécifiquement ces cel1uies à l'aide

d'immunoglobulines greffées a la surface des liposomes (immunoliposomes).

Ces immunoglobulines doivent ëtre spécifiques à un récepteur ou à une

molécule membranaire comme ici, le récepteur au mannose.

Finalement, il serait intéressant d%valuer l'efficacité in vitro et in vivo de la

carnpbthécine encapsulée dans les liposomes stériquement stabilisés sur

l'infection a L. major soit l'agent responsable de la leishmaniose cutanée. Lors

de l'infection à L. major dans le coussinet plantaire de la souris (BALB/c ou

C57BL/6), l'infection débute par une inflammation cutanée pour ensuite se

propager aux ganglions prës du site d'infection. Les résultats de la

biodistribution ont démontré que l'injection sous-cutanée à l'intérieur de la

hanche favorisait l'accumulation de la camptothécine aux niveaux des

ganglions environnants. De plus, il est établit que les liposomes stériquemen t

stabilisés s'accumuIent moins au site d'injection que les liposomes

conventionnels et qu'ils se rendent en plus grande quantité aux ganglions. La

camptothecine encapsulée dans les liposomes stériquement stabilises s'avère

une stratégie intéressante pour concentrer la drogue dans les réservoirs

cibles de l'infection à L. majoret inhiber la réplication du parasite.

REFERENCES DE L'INTRODUCTION ET DE LA CONCLUSION

Références de l'introduction et de la conclusion 70

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