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HAL Id: tel-01940544https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01940544
Submitted on 30 Nov 2018
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Marqueurs d’athérothrombose carotidienne chez lediabétique de type 2 : rôle du stress oxydant dans la
vulnérabilité de la plaqueAurélie Catan
To cite this version:Aurélie Catan. Marqueurs d’athérothrombose carotidienne chez le diabétique de type 2 : rôle dustress oxydant dans la vulnérabilité de la plaque. Biochimie [q-bio.BM]. Université de la Réunion,2018. Français. �NNT : 2018LARE0022�. �tel-01940544�
Université de La Réunion Thèse
Pour l’obtention du titre de Docteur en Sciences de L’Université de La Réunion
Spécialité : Biologie Médicale, Santé
Présentée par :
Aurélie CATAN
Marqueurs d’athérothrombose carotidienne chez le diabétique de type 2 : rôle du stress oxydant dans la vulnérabilité de la plaque.
Soutenance publique le 27 septembre 2018
Université Pierre et Marie Curie, Paris Rapporteur
Composition du Jury :
Pr Isabelle LIMON
Dr François CANONNE-HERGAUX INSERM, Toulouse Rapporteur
Dr Adèle RICHART Université de Melbourne, Australie Examinatrice
Pr Gilles LAMBERT Université de La Réunion Examinateur
Dr Olivier MEILHAC INSERM, La Réunion Directeur
2
3
Remerciements Cette thèse a été accomplie au sein du Laboratoire UMR 1188 DéTROI, Diabète
athérothrombose Thérapie Réunion Océan Indien, dirigé par le Dr Olivier Meilhac. Ce travail a
été réalisé grâce au soutien financier de l’ANRT, de la Clinique Sainte Clotilde et du groupe de
santé Clinifutur.
Cette thèse a été dirigée par le Dr Olivier Meilhac, avec un co-encadrement assuré par le Dr
Philippe Rondeau et le Dr Reuben Veerapen.
Olivier et Reuben,
Je tiens à vous remercier de m’avoir accordé votre confiance et de m’avoir permis de travailler
en autonomie sur bien des aspects pour mener à bien ce projet de thèse avec les aléas que
nous avons dû affronter.
Philippe,
Simplement merci d’avoir été présent au cours de ces trois années mais aussi depuis mon
entrée au laboratoire il y a quelques années déjà.
A vous trois, je vous suis profondément reconnaissante.
Je remercie l’ensemble des personnalités scientifiques qui ont accepté d’évaluer mon travail de
thèse : le Pr Isabelle Limon (Université de Pierre et Marie Curie, Paris), le Dr Adèle Richart
(Université de Merlbourne), le Dr François Canonne-Hergaux (Université de Toulouse) et le Pr
Gilles Lambert (Université de La Réunion). Je vous remercie vivement de me faire l’honneur de
consacrer une partie de votre temps précieux pour juger ce travail. Soyez assurés ici de
l’expression de mon profond respect.
Je tiens à remercier les membres du laboratoire qui ont d’abord été mes enseignants puis sont
devenus des collègues et amis, qui ont su affûter chez moi ce goût pour la rechercher et qui ont
su répondre à mes questions même les plus futiles.
Manu et Philippe, merci de m’avoir permis de mettre le pied à l’étrier très tôt.
4
A tous les doctorants, les anciens comme les nouveaux, nous sommes tous dans la même
galère et nous en sortons tous grandi.
Aux techniciens, aux ingénieurs, aux gestionnaires merci pour votre aide, votre soutien et votre
écoute.
A vous tous, merci pour ces moments passés à échanger non seulement sur les sujets
scientifiques mais aussi sur des sujets plus désinvoltes. Merci aussi de m’avoir aidée à faire
cette fameuse liste que je ne voulais plus faire et qui a été réduite de moitié au moins ;)
Merci à ma famille qui a su se montrer compréhensive et patiente ces derniers temps. Merci
de nous avoir nourris durant cette période de dur labeur.
A mon compagnon de galère, merci pour ces moments à décompresser, pour ton soutien, pour
avoir pris le relais quand il le fallait. Il ne nous reste plus qu’à passer à l’étape supérieure
maintenant.
Merci à vous, ceux que j’ai cité et ceux que j’oublie pour avoir contribué de loin ou de près à
l’accomplissement de ces travaux.
5
Sommaire
Liste des figures .......................................................................................................................... 8
Liste des tableaux ..................................................................................................................... 10
Liste des abréviations ............................................................................................................... 11
Introduction générale............................................................................................................... 13
Contexte bibliographique ......................................................................................................... 19
1 Le diabète ......................................................................................................................... 21
1.1 Les différents types de diabète ................................................................................ 21
1.2 La prévalence du diabète de type 2 dans le monde, en France et à La Réunion. ... 22
1.3 Les conséquences moléculaires du diabète ............................................................. 22
1.3.1 Le déséquilibre de la balance redox – stress oxydatif ......................................... 22
1.3.2 La glycation des protéines .................................................................................... 24
1.3.3 L’inflammation de bas grade ................................................................................ 26
1.4 Les pathologies associées au diabète de type 2 ...................................................... 27
1.4.1 Les néphropathies – insuffisance rénale terminales ........................................... 29
1.4.2 Neuropathies des membres inférieurs – syndrome du pied diabétique et risque
d’amputation des membres inférieurs ............................................................................ 29
1.4.3 Les rétinopathies .................................................................................................. 30
1.4.4 Les maladies cardio-vasculaires ........................................................................... 30
2 L’athérosclérose ............................................................................................................... 33
2.1 La paroi vasculaire .................................................................................................... 33
2.2 L’endothélium .......................................................................................................... 35
2.3 Les zones de formation des plaques d’athérosclérose ............................................ 37
2.4 Formation de la plaque d’athérosclérose ................................................................ 38
2.4.1 Les stries lipidiques .............................................................................................. 39
2.4.2 L’athérome ........................................................................................................... 41
6
2.4.3 La plaque d’athérosclérose .................................................................................. 42
2.4.3.1 La formation des néo vaisseaux dans la plaque ......................................... 43
2.4.4 La complication de la plaque, la thrombose et la rupture de la plaque .............. 44
2.4.4.1 L’hémorragie intraplaque (HIP) dans les plaques compliquées ................. 46
3 L’impact du diabète de type 2 sur la plaque d’athérosclérose ........................................ 61
3.1 Diabète et l’endothélium vasculaire. ....................................................................... 61
3.1.1 La dysfonction endothéliale. ................................................................................ 62
3.1.1.1 Les effets de l’hyperglycémie sur la dysfonction endothéliale................... 62
3.1.1.2 L’insuline et les acides gras libres impactent l’endothélium du diabétique.
63
3.1.2 L’état prothrombotique de l’endothélium ........................................................... 65
3.2 Diabète, néo vascularisation, hémorragie intraplaque (HIP) ................................... 66
3.2.1 La néo vascularisation de la plaque d’athérosclérose ......................................... 66
3.2.2 L’hémorragie intraplaque (HIP). ........................................................................... 68
3.2.2.1 L’implication des érythrocytes de patients diabétiques dans l’HIP. ........... 68
3.2.2.2 La clairance des globules rouges : rôle de l’haptoglobine dans la plaque du
diabétique. ................................................................................................................... 69
3.2.2.3 La NETose chez le diabétique et l’HIP. ........................................................ 70
Objectifs de travail ................................................................................................................... 73
Démarche expérimentale, Résultats et Discussion .................................................................. 77
4 Etude clinique : Marqueurs d’Athérothrombose carotidienne Chez le Diabétique – MADi
79
4.1 Objectifs de l’étude .................................................................................................. 80
4.2 Inclusion des patients ............................................................................................... 82
4.3 Déroulé de la recherche ........................................................................................... 83
4.4 Réalisation des dosages des biomarqueurs cibles de l’étude .................................. 87
7
4.5 Résultats et discussion ............................................................................................ 93
5 Etude in vitro : Impact de la glycation des érythrocytes sur l’endothélium de la plaque 99
5.1 Caractérisation du modèle de glycation des globules rouges et de la phagocytose
des globules rouges par les cellules endothéliales humaines. .......................................... 100
5.1.1 Principaux résultats ............................................................................................ 100
5.2 Conséquences de la phagocytose des érythrocytes sur la fonctionnalité de
l’endothélium. .................................................................................................................... 104
5.2.1 Activation de l’endothélium ............................................................................... 104
5.2.2 Modulation de la perméabilité de l’endothélium .............................................. 108
5.3 Conséquence de la phagocytose des érythrocytes sur la production de stress
oxydant par l’endothélium ................................................................................................. 112
5.3.1 Production de ROS par l’endothélium ............................................................... 112
5.3.2 Les défenses antioxydantes de l’endothélium ................................................... 114
5.4 Discussion de l’étude in vitro : Impact de la glycation des érythrocytes sur
l’endothélium. .................................................................................................................... 120
Conclusion et perspectives ..................................................................................................... 127
Références .............................................................................................................................. 133
Annexes .................................................................................................................................. 149
8
Liste des figures
Figure 1 : La formation des AGE. .............................................................................................. 24
Figure 2: Stimulation du facteur de transcription NF-κB par la liaison entre les AGE et RAGE.
.................................................................................................................................................. 26
Figure 3 : Principales complications du diabète....................................................................... 28
Figure 4 : Organisation de la structure d’une artère. .............................................................. 34
Figure 5: Production d’oxyde nitrique par la cellule endothéliale. .......................................... 37
Figure 6: Illustration des différents types de flux sanguins (A) et des types de forces de
cisaillement (B) qui surviennent dans les vaisseaux sanguins. ................................................ 38
Figure 7: Illustration d’une strie lipidique. ............................................................................... 41
Figure 8 : Illustration de la plaque instable ou compliquée. .................................................... 43
Figure 9 : Illustration d’une plaque instable. ........................................................................... 46
Figure 10 : Mise en évidence de l’extravasation du contenu sanguin à partir des néo vaisseaux
dans des plaques d’athérome. ................................................................................................. 48
Figure 11 : Modèle proposé du devenir des érythrocytes en contact avec les lipides oxydés du
cœur nécrotico-lipidique de la plaque d’athérosclérose. ........................................................ 50
Figure 12 : Exemples de complexes Hp-Hb (complexe Hp1-1/Hb et Hp2-2/Hb). .................... 53
Figure 13 : Quelques exemples de structures des différents génotypes d’haptoglobine
possibles. .................................................................................................................................. 54
Figure 14 : Localisation de neutrophiles dans une plaque de carotide humaine. ................... 57
Figure 15 : Les voies de signalisation de l’insuline. .................................................................. 63
Figure 16 : Exemple des 3 types de morphologies spécifiques des néo vaisseaux des plaques
d’athérosclérose des patients diabétiques. ............................................................................. 67
Figure 17 : Schéma général de l’étude clinique. ...................................................................... 81
Figure 18 : Plan de distribution des échantillons de plasma de l’étude MADI. ....................... 87
Figure 19 : Plan de distribution des échantillons de milieux conditionnés des CP de l’étude
MADI. ........................................................................................................................................ 88
Figure 20 : Plan de distribution des échantillons de milieux conditionnés des NPs de l’étude
MADI. ........................................................................................................................................ 88
Figure 21 : ELISA MPO/ADN – mesure des complexes NETs. .................................................. 91
9
Figure 22 : Caractérisation des érythrocytes glyqués in vitro avec des concentrations
croissantes en glucose. ........................................................................................................... 101
Figure 23 : Liaison et phagocytose des érythrocytes par les cellules endothéliales. ............ 101
Figure 24 : La glycation des érythrocytes altère la capacité de réparation de l’endothélium
après une lésion. .................................................................................................................... 102
Figure 25 : Le stress induit par les érythrocytes glyqués n’active pas l’endothélium. .......... 107
Figure 26 : Schéma du déroulement du test de perméabilité. .............................................. 109
Figure 27 : Le stress induit par les érythrocytes glyqués ne modifie pas la perméabilité de
l’endothélium. ........................................................................................................................ 110
Figure 28 : Le stress induit par les érythrocytes glyqués engendre la production de ROS par les
cellules endothéliales. ............................................................................................................ 113
Figure 29 : Schéma du principe du la mesure de l’activité de la SOD totale. ........................ 115
Figure 30 : Influence des érythrocytes glyqués sur le système de défenses antioxydantes des
cellules endothéliales. ............................................................................................................ 118
10
Liste des tableaux
Tableau 1 : Descriptif de la population avec les comparaisons statistiques entre les groupes
des patients diabétiques (DT2) et des patients non diabétiques (NDT2). ............................... 93
Tableau 2: Effets du traitement des cellules et du DFO sur la production de ROS. .............. 113
11
Liste des abréviations
AGE : produits avancés de glycation
ARC : attaché de recherche clinique
AVC: Accident Vasculaire Cérébrale
CP : partie coupable (partie responsable de la sténose)
CRB : Centre de Resources Biologiques
CRF : case report form
DFO : deferoxamine
eNOS : NO synthase endothéliale
Fe 2+ : fer férreux
Fe 3+ : fer ferrique
Hb : hémoglobine
HbA1c : hémoglobine glyquée
HDL : Lipoprotéine de haute densité
Hp : Haptoglobine
Hx : Hémopexine
ICAM-1 : Intercellular Adhesion Molecu1e 1
IL : Interleukine
IM : Infarctus du myocarde
LDL : Lipoprotéine de basse densité
MADI : marqueur d'athérothrombose carotidienne chez le diabétique
MEC : matrice extracellulaire
MLC : milieu liquide conditionné
MMP : métalloprotéinase matricielle
MPO : myéloperoxydase
NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
NCP ou NP : partie non coupable (non responsable de la sténose)
NET : neutrophil extracellular traps
NFkB : nuclear factor k B
NGAL : neutrophil gelatinase-associated lipocalin
12
OMS: Organisation Mondiale de la Santé
P. gingivalis : Porphiromonas gingivalis
PECAM -1 : Platelet Endothelial Adhesion Molecule 1
PS: phosphatidylsérine
PSR : récepteur des phosphatidylsérines
RAGE : récepteur aux AGE
RBC : red blood cell
ROS : espèce réactive de l'oxygène
TCFA : Thin Cap Fibro Atheroma
TNF a : Tumor Necrosis Factor alpha
VCAM-1 : Vascular Cell Adhesion Molecule 1
Ve Cadhérine : Vascular Endothelial Cadherine
13
Introduction générale
14
15
Le diabète touche 422 millions de personnes à travers le monde. Il s’agit d’une maladie
chronique évolutive devenue pandémique (OMS) [1]. Le diabète est caractérisé soit par un
défaut d’action, soit par un défaut de production de l’insuline qui entraîne une hyperglycémie
chronique chez les patients. Il existe différents types de diabètes, mais le diabète de type 2
est la forme la plus répandue car elle concerne 90% des sujets diabétiques. Sur l’île de La
Réunion le diabète de type 2 souvent diagnostiqué aux alentours de 45 ans a une prévalence
3 à 4 fois supérieure à celle de la France hexagonale [2]. D’ailleurs la surmortalité des patients
diabétiques à La Réunion est 3,5 fois supérieure à celle de la métropole avec une incidence
plus prononcée chez les femmes [3]. Parmi les complications possibles chez le diabétique, 60%
des patients ont un risque élevé de maladies cardiovasculaires se manifestant par des
atteintes coronaires ou cérébrales. Il a été montré que 80% des patients diabétiques de type
2 développent des lésions athérosclérotiques dans les zones privilégiées que sont les artères
coronaires, fémorales et carotides. Par ailleurs, plusieurs études de populations ont mis en
évidence l’augmentation de la prévalence des accidents vasculaires cérébraux (AVC) chez les
diabétiques de type 2 [4]. Sur l’île de La Réunion, les maladies cardiovasculaires représentent
le premier motif d’affections longues durées. De surcroît, ces maladies y constituent aussi la
première cause de mortalité contrairement à la France hexagonale où la première cause de
mortalité est représentée par le cancer. D’ailleurs, la survenue plus fréquente des AVC ainsi
que l’augmentation de leur prévalence à La Réunion en font un problème de santé publique
majeur [5].
Quel que soit le type de diabète, cette maladie entraîne de lourdes complications chez les
patients. Ces dernières affectent notamment le système circulatoire soit à un niveau micro-
vasculaire soit à un niveau macro-vasculaire [1]. Ainsi, l’expression clinique de ces atteintes a
des retentissements sur divers organes. Les atteintes micro-vasculaires des petits vaisseaux
sanguins de la rétine peuvent entraîner la cécité des patients. Les atteintes des glomérules
des reins peuvent aboutir à une insuffisance rénale terminale. L’association des atteintes
micro- et macro-vasculaires engendre également la maladie du « pied diabétique » et peut
amener à l’amputation des membres inférieurs. Enfin, les atteintes macro-vasculaires de 60
% des patients diabétiques se manifestent par des maladies cardio-vasculaires susceptibles de
provoquer des accidents cardiaques ou cérébraux. Ces conséquences sont gravissimes car
elles sont responsables d’une forte mortalité [1]. En effets, ces accidents peuvent tuer la
moitié des patients atteints suite à un infarctus du myocarde (IM) ou suite à AVC. D’ailleurs,
16
la prévalence des AVC chez les patients diabétiques de type 2 est deux fois supérieure à celle
des patients non diabétiques [5-7]. Les AVC ischémiques résultent de l’occlusion d’une artère
cérébrale par un thrombus généré localement ou bien qui s’est détaché d’une plaque
d’athérothrombose généralement localisée au niveau des bifurcations des artères
carotidiennes. Les plaques d’athérosclérose se forment préférentiellement à certains endroits
particuliers du système artériel. En effet, les sites qui subissent de fortes contraintes de
cisaillement au niveau de l’intima des artères à cause du flux sanguin sont des zones
privilégiées de formation de plaque d’athérosclérose. Ces zones se situent en général au
niveau des branches et des bifurcations du système circulatoire telles que les bifurcations de
l’aorte abdominale, les artères coronaires ou ilio-fémorales, ou encore les bifurcations
carotidiennes. L’intima de ces zones étant fragilisée, les lipoprotéines comme des LDL
(lipoprotéine de basse densité), pourvoyeurs de lipides et en particuliers de cholestérol
peuvent s’y déposer et initier la formation de la plaque d’athérome. La plaque
d’athérosclérose se forme en différentes étapes caractérisées par la présence d’acteurs
spécifiques tels que les lipides (estérifiés ou non), les cellules immunitaires (intactes actives
ou transformées en cellules spumeuses), d’une matrice extracellulaire remodelée notamment
riche en collagène qui constitue la chape fibreuse et qui recouvre le cœur nécrotico-lipidique,
ou encore de néo vaisseaux émanant de l’adventice des artères (tunique externe) à l’origine
d’hémorragies intraplaques. Dans un premier temps, les plaques stables se compliquent à
cause de l’afflux des néo vaisseaux au sein de cette dernière. Les néo vaisseaux qui sont
immatures, fragiles et perméables permettent la survenue des hémorragies intraplaques à
l’origine de l’invasion de la plaque par les cellules sanguines (érythrocytes, cellules
immunitaires, plaquettes…).
Les plaques d’athérothrombose peuvent devenir instables et engendrer un AVC ischémique
ou un infarctus du myocarde à cause du détachement d’un morceau de plaque ou bien de la
formation d’un thrombus in situ. Différents marqueurs moléculaires, protéiques et physiques
peuvent refléter ces processus et renseigner le médecin sur l’instabilité de la plaque présentée
par le patient. Il est donc important d’étudier les marqueurs de rupture de plaque
d’athérothrombose carotidienne des patients diabétiques, en particulier à La Réunion, afin
d’en prévenir les complications et la mortalité associée.
Dans une première partie bibliographique divisée en trois grands chapitres, nous définirons
brièvement le diabète et l’athérosclérose. Nous nous attacherons ensuite à montrer l’impact
17
du diabète sur l’athérosclérose et l’athérothrombose au niveau cellulaire et moléculaire.
Enfin, nous exposerons les différents objectifs et travaux accomplis au cours de cette thèse à
travers une partie expérimentale scindée en deux. La première partie décrira une étude
clinique portant sur des patients opérés pour une chirurgie carotidienne, diabétiques ou non
et une seconde partie portera sur une étude in vitro sur des cellules endothéliales exposées à
des globules rouges glyqués. Enfin, pour ces deux parties, les résultats obtenus seront
également discutés en proposant différentes perspectives intéressantes que ces travaux
permettent d’envisager
18
19
Contexte bibliographique
20
21
1 Le diabète Le diabète est une maladie métabolique chronique évolutive qui se caractérise par un relevé
de glycémie anormalement élevé chez un individu. Cette hyperglycémie induite par la
défaillance de la captation du glucose sanguin par les cellules cibles résulte d’un défaut de
production et/ou d’action de l’insuline, hormone responsable de l’absorption du glucose
sanguin par les organes cibles (muscles, foie et tissus adipeux)[8]. Le diagnostic du diabète est
établi lorsque, de façon répétée, l’hyperglycémie mesurée à jeun est supérieure ou égale à
1,26 g/L de glucose dans le sang ou supérieur à 2 g/L de glucose dans le sang au cours de la
journée [8].
1.1 Les différents types de diabète
Avant 1997, les différents types de diabètes étaient classés en fonction du type de traitement
médicamenteux prescrit aux patients [9, 10]. Puis, les diabètes ont été classé en diabètes
insulino-dépendants et non insulino-dépendants, jusqu’à aujourd’hui, où il est question de
diabète de types 1 et de diabète de type 2. Il existe également d’autres types de diabètes qui
sont plus rares et spécifiques comme le diabète gestationnel ou encore le diabète de type
MODY (Maturity Onset Diabetes in the Young). Il existe aussi un état transitoire qui n’est pas
un diabète mais qui peut évoluer vers un diabète de type 2 chez des patients intolérants au
glucose ou ayant une hyperglycémie à jeun modérée.
Les diabètes de type 1 et de type 2 représentent plus de 95% de l’ensemble des types de
diabètes et la majorité des cas de diabètes déclarés sont de type 2.
Le diabète de type 1 ou anciennement le diabète insulino-dépendant est caractérisé par une
production insuffisante voire inexistante d’insuline par les cellules β des ilots de Langerhans.
Les enfants et les adolescents sont les patients les plus touchés et doivent impérativement
recevoir des injections d’insuline au quotidien pour réguler leur glycémie. Ces patients ont le
plus souvent un poids normal. Bien que les causes du diabète de type I ne soient pas
clairement identifiées, une origine auto-immune conduisant à la destruction des cellules β des
îlots de Langerhans du pancréas est clairement admise.
Le diabète de type 2 ou anciennement diabète non insulino-dépendant est caractérisé par un
défaut partiel de l’action de l’insuline qui entraîne une insulinorésistance des cellules cibles
pour cette hormone. L’insuline ne parvient pas à stimuler la captation du glucose par les
organes cibles. Le foie va donc produire du glucose de façon continue. Ce phénomène est à
22
l’origine de l’hyperglycémie à jeun. De plus, l’organisme pour tenter de compenser ce défaut
d’insuline va stimuler sa production par les cellules β des îlots de Langerhans du pancréas qui
vont à terme s’épuiser. Toutes les causes du diabète de type 2 ne sont pas connues mais sont
néanmoins liées à l’obésité, à des facteurs environnementaux et au mode de vie. Cette forme
de diabète touche principalement les adultes à partir de 40 ans et les personnes âgées en
surpoids ou atteints d’obésité.
L’hyperglycémie modérée à jeun ou l’intolérance au glucose se caractérise par une glycémie
supérieure à la normale pour le patient mais en dessous des valeurs seuils pour être déclaré
diabétique (entre 1,05 et 1,26 g/L à jeun). Cet état appelé prédiabète, correspond à la
transition d’un état intermédiaire entre la normoglycémie et l’hyperglycémie vers un diabète
de type 2.
1.2 La prévalence du diabète de type 2 dans le monde, en France et à La Réunion.
En 2014, le diabète qui est une épidémie mondiale, a touché environ 422 millions de
personnes dans le monde selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) [11]. Actuellement,
la prévalence du diabète est en augmentation constante, ce qui en fait un problème de santé
publique majeur au niveau mondial. Sur l’île de La Réunion, environ 10% de la population est
atteinte de diabète de type 2 [2]. D’ailleurs, 7,1% de ces patients utilisent des traitements
médicamenteux, avec une proportion de 7 patients sur 10 sous antidiabétiques oraux et 3
patients sur 10 sous insuline avec ou sans antidiabétiques oraux [12]. Enfin, selon l’OMS la
prévalence du diabète de type 2 devrait doubler d’ici à 2030 et deviendrait la 7èmecause de
décès des patients à travers le monde. D’ailleurs, les maladies qui découlent du diabète
participent aux nombreux décès que cette maladie provoque [1].
1.3 Les conséquences moléculaires du diabète
L’hyperglycémie chronique chez les patients diabétiques entraîne une multitude de
modifications moléculaires. Ces dernières engendrent et participent à la déstabilisation de
l’équilibre oxydatif, la formation d’AGE (produits avancé de glycation) et à l’installation d’une
inflammation de bas grade.
1.3.1 Le déséquilibre de la balance redox – stress oxydatif
Le stress oxydatif résulte du déséquilibre entre la production d’espèces pro-oxydantes parmi
lesquelles on compte les espèces radicalaires et les espèces non radicalaires, et leur
neutralisation par le système de défenses antioxydantes de l’organisme. Les espèces
23
radicalaires sont des molécules contenants un ou plusieurs électrons non appariés, cette
spécificité les rend hyperréaactives. Ces molécules fortement pro-oxydantes peuvent
appartenir soit aux espèces réactives de l’oxygène (ROS-reactive oxygen species) parmi
lesquelles on retrouve l’anion superoxyde (O2°-) et le radical hydroxyle (OH°), soit aux espèces
réactives de l’azote (RNS-reactive nitrogen species) comme l’oxyde nitreux (NO°). Les
mitochondries et la NADPH oxydase sont les producteurs majeurs de ROS intracellulaires [13].
Les espèces radicalaires peuvent être neutralisées soit par des enzymes endogènes comme la
catalase, la superoxyde dismutase (SOD), la glutathion peroxydase (GPx) ou par le glutathion,
les vitamines C et E ou encore par les polyphénols. Dans les conditions physiologiques, les
cellules synthétisent les ROS ou RNS en réponses aux stimuli qu’elles perçoivent. Cependant,
lorsqu’elles synthétisent plus de molécules pro-oxydantes qu’elles ne peuvent en détoxifier
des dommages au niveau lipidique, protéique ou encore au niveau de l’ADN cellulaires sont
observés [13].
L’hyperglycémie chronique est connue pour être à l’origine de l’augmentation du stress
oxydatif chez les patients diabétiques. Ainsi, on note une corrélation entre le taux élevé de
glucose circulant et le taux élevé de marqueurs de peroxydation des lipides membranaires
(comme la phosphatidylsérine, la sphingomyéline, la phosphatidyléthanolamine ou encore la
phosphatidylcholine) et de l’oxydation de l’hémoglobine (hémoglobine glyquée ou HbA1c) des
globules rouges [14, 15]. Le stress oxydant induit par l’hyperglycémie est augmenté via
différents mécanismes parmi lesquels on retrouve la voie des polyols davantage sollicitée ou
encore la surproduction de l’anion superoxyde par la mitochondrie. La voie des polyols permet
la réduction de sucres dont le glucose en sorbitol via l’action de l’aldose réductase grâce au
cofacteur NADPH (nicotinamide adénine dinucléotide). Dans les conditions physiologiques,
l’affinité de l’aldose réductase pour le glucose est faible mais dans une situation
d’hyperglycémie, cette affinité devient forte et entraîne l’augmentation de la conversion du
glucose en sorbitol. Il en résulte une diminution du cofacteur NADPH qui est nécessaire à la
régénération du glutathion réduit, un puissant antioxydant [16]. La balance entre espèces pro-
oxydantes et défenses antioxydantes est alors déséquilibrée en faveur des espèces pro-
oxydantes. De plus, l’auto-oxydation du glucose induit une surproduction de NADPH et de
flavine qui participent à la production de l’ATP (adénosine triphosphate) par la chaîne de
transport des électrons de la mitochondrie [17]. Cette augmentation des cofacteurs NADPH
24
et flavine entraîne une surproduction du radical O2°- qui entre en jeu dans diverses situations
pour favoriser le stress oxydatif.
1.3.2 La glycation des protéines
L’hyperglycémie chronique entraîne aussi la modification des protéines par le biais de la
réaction de Maillard qui correspond à une réaction non enzymatique entre un sucre, dans ce
cas le glucose, et les groupements aminés des protéines [18]. La glycation des protéines se
déroule en trois étapes (Figure 1). La première étape consiste en la formation rapide d’une
base de Schiff suite à la réaction entre les amines libres des protéines et le glucose [18]. Dans
une deuxième étape, les réarrangements moléculaires de cette base de Schiff donnent
naissance à des produits d’Amadori ou fructosamines (des produits de glycation
intermédiaires). Enfin, l’accumulation lente de ces derniers combinée à des réarrangements,
à des réactions oxydatives et transfert d’oxygène, aboutissent à la formation irréversible des
produits terminaux de glycation (AGE-advanced glycated end-products) par des réactions de
glycoxydation. Les protéines devenues AGE voient alors leur propriétés fonctionnelles et leurs
structures modifiées mais aussi leur durée de vie prolongée.
Figure 1 : La formation des AGE. La formation des AGE par la réaction de Maillard se déroule en 3 phases : la première réaction est rapide, elle dure quelques heures et aboutit à la formation de base de Schiff, la deuxième réaction est une successions de réarrangements réversibles qui dure plusieurs jours et forme les produits d’Amadori et la troisième réaction est irréversible et conduit à la formation des AGE après glycoxydation [19].
25
La formation des AGE affecte le fonctionnement des protéines et cellulaire selon trois
mécanismes. Premièrement, les protéines glyquées voient leurs fonctions altérées comme
dans le cas de l’albumine où son activité antioxydante est diminuée [20]. Deuxièmement, les
protéines de la matrice extracellulaire (MEC) transformées en AGE vont interagir de manière
anormale avec les autres protéines de la MEC ou les protéines de surface d’autres types
cellulaires comme dans le cas où la glycation des protéines de surface des globules rouges
induit une adhérence accrue de ces derniers aux cellules endothéliales chez les diabétiques
[21, 22]. Troisièmement, les protéines glyquées circulantes vont se lier à leur récepteur RAGE
(Receptor for AGE) qui sont exprimés à la surface de divers type cellulaires tels que les cellules
endothéliales, les cellules musculaires lisses ou encore les macrophages [23, 24]. De cette
manière ils agissent soit en activant la NADPH oxydase amplifiant ainsi le stress oxydatif déjà
présent, soit en activant le facteur de transcription NF-κB (nuclear factor κB) qui induit la
transcription de cytokines inflammatoires (Figure 2) ou d’autres molécules particulièrement
impliquées dans la fonction endothéliale comme par exemple l’endothéline 1 [25]. Cette
action a une incidence sur diverses pathologies, en augmentant entre autre le risque de
développer des maladies cardiovasculaires comme l’athérosclérose [17, 26].
26
Figure 2: Stimulation du facteur de transcription NF-κB par la liaison entre les AGE et RAGE. L’interaction des AGE avec leurs récepteurs RAGE à la surface les cellules endothéliales induit l’activation du facteur de transcription NF-κB. Ainsi, l’augmentation de l’expression des gènes sous son contrôle rend l’endothélium prothrombotique et conduit à la production de cytokines pro-inflammatoires, à la vasoconstriction de l’endothélium et à l’augmentation de l’expression de molécules d’adhésions à leur surface [27].
1.3.3 L’inflammation de bas grade
On retrouve chez les patients diabétiques de type 2 une inflammation chronique, appelée
inflammation de bas grade, caractérisée par une sécrétion faible mais prolongée de facteurs
pro-inflammatoires comme les interleukines IL1, IL6 ou IL10, le TNF-α (tumor necrosis factor),
mais aussi la leptine, ou encore la CRP (protéine C réactive) un marqueur d’inflammation
circulant dépendant de l’activation du facteur de transcription NF-κB . La majeure partie de
ces marqueurs de l’inflammation de bas grade provient du tissu adipeux des patients mais
aussi des cellules immunitaires qui s’y infiltrent comme les macrophages ou les lymphocytes
27
B ou T. Parmi les facteurs qui entraînent l’inflammation de bas grade chez les diabétiques, on
retrouve les éléments bactériens comme le LPS (lipopolysaccharide) provenant de différentes
sources, notamment des parodontites causées par des bactéries anaérobie gram négatives
[28, 29]. Cette inflammation a des conséquences sur divers organes, participe à la résistance
à l’insuline et in fine a un rôle dans le développement des pathologies qui surviennent le plus
chez ces patients [30, 31]. Ainsi, le TNF-α participe à l’expression des molécules d’adhésion
notamment au niveau de l’endothélium, induit l’apoptose des cellules endothéliales et
participe à la dysfonction endothéliale [32]. De plus, des travaux ont mis en évidence des liens
entre l’inflammation causée par les bactéries parodontales et le développement de maladies
cardiovasculaire [33, 34].
Toutes ces modifications au niveau moléculaire et cellulaire participent à l’installation des
pathologies associées au diabète de type 2.
1.4 Les pathologies associées au diabète de type 2
Un diabète mal équilibré, c’est-à-dire une glycémie non contrôlée, peut entraîner des
complications aiguës et des complications à long terme. En effet, le mauvais contrôle de la
glycémie associé à la durée du diabète et à d’autres facteurs de risques tels que l’hypertension
artérielle, les dyslipidémies (marquées soit par une hypertriglycéridémie soit par la diminution
du HDL cholestérol), l’hyper agrégation des plaquettes, la surcharge pondérale ou encore le
tabagisme favorisent l’apparition de ces complications et en modulent la sévérité. Ces
complications affectent différents territoires du corps humain, quel que soit le type de
diabète et se répartissent en micro- et en macro-angiopathies. Ainsi le cœur, les vaisseaux
sanguins, les nerfs, les yeux et les reins sont les tissus les plus touchés (Figure 3).
28
Figure 3 : Principales complications du diabète. Ces atteintes touchent différents tissus et organes comme les yeux, le cœur, les reins ou encore les membres inférieurs. Image Rapport mondial sur le diabète de l’OMS de 2016 [1]. L’apparition et/ou le cumul de ces pathologies chez le diabétique augmente le risque de décès
prématurés des patients avant 70 ans. En effet, en 2012, l’hyperglycémie a été responsable
de 3,7 millions de décès, parmi lesquels on distingue 1,5 millions de décès suite au diabète
exclusivement et 2,2 millions de décès suite aux complications notamment vasculaires [35,
36].
L’hyperglycémie chronique entraîne donc des modifications structurales et fonctionnelles des
protéines et organelles cellulaires notamment via la combinaison de la glycation et du stress
oxydatif induit. Ainsi, les grandes fonctions métaboliques sont perturbées et on observe aussi
un épaississement des membranes basales des cellules. De plus, on remarque une
hyperviscosité du sang et la dysfonction des cellules endothéliales qui aboutit aux micro- et
macro-angiopathies. Les micro-angiopathies concernent en particulier les petites artères des
yeux, des reins ou encore des nerfs alors que les macro-angiopathies concernent les grosses
artères du système circulatoire où des plaques d’athéroscléroses peuvent se former.
29
1.4.1 Les néphropathies – insuffisance rénale terminales
L’association de l’hyperglycémie qui affecte la morphologie et la fonction des glomérules des
reins aux autres facteurs de risques comme l’hypertension artérielle altère leur capacité de
filtration. Ainsi la glomérulopathie se traduit d’abord par une albuminurie faible voire infime
(présence d’albumine dans les urines), puis par une protéinurie élevée (présence de protéines
dans les urines) et enfin par la diminution de la capacité de filtration des reins amenant les
patients vers une insuffisance rénale terminale qui nécessite une dialyse et in fine une greffe
de reins.
1.4.2 Neuropathies des membres inférieurs – syndrome du pied diabétique et
risque d’amputation des membres inférieurs
L’expression clinique des neuropathies est multiple et touche les systèmes nerveux
périphérique et autonome. Ces maladies résultent de l’atteinte ischémique du vasa nervorum.
Il s’agit de petits vaisseaux provenant des vaisseaux sanguins adjacents qui, en situation
physiologique, assurent l’apport nutritionnel des nerfs périphériques. Leur fonction est
altérée en situation d’hyperglycémie par les AGE et le stress oxydatif notamment.
Parmi les différentes neuropathies des membres inférieurs, les artérites des membres
inférieurs (AMI) ou artériopathies oblitérantes des membres inférieurs (AOMI) sont celles les
plus souvent développées par les malades.
Chez les patients diabétiques, cette maladie est caractérisée par la combinaison de l’atteinte
des nerfs et celle des artères des membres inférieurs, à l’intérieur desquels se développent
des plaques d’athérosclérose. Concrètement, le diamètre de la lumière des vaisseaux sanguins
diminue suite à leur sténose progressive jusqu’à être totalement obstruée, plus souvent par
la formation d’un caillot luminal, il s’agit de la thrombose du vaisseau sanguin. Il est alors
observé une diminution du flux sanguin artériel qui irrigue les membres inférieurs entraînant
une ischémie au niveau de ces derniers. Le développement de cette maladie se fait en
différentes phases suivant l’échelle de Leriche et Fontaine, classées en 4 stades :
30
Stade 1 : asymptomatique.
Stade 2 : suite à la sténose et ou la thrombose des artères, lors de l’effort le patient
aura des douleurs caractéristiques des crampes au niveau des mollets (ischémie
d’effort). Ces douleurs vont affecter le périmètre de marche du patient.
Stade 3 : survenue de douleurs dans les membres inférieurs et des orteils du patient
au repos notamment en seconde partie de nuit.
Stade 4 : présence de zones plus ou moins importantes de mortifications
(noircissement des tissus) notamment au niveau du pied ou des orteils du patient
(zone les plus éloignées du cœur). Ces zones correspondent aux zones de nécrose ou
gangrène des tissus, sont douloureuses et ne guérissent pas. Les tissus ulcérés à ce
stade voient leur risque d’amputation critique.
Chez les diabétiques, cette classification se fait avec plus de difficultés que chez les patients
non diabétiques puisque l’atteinte des nerfs rend ces derniers moins sensibles à la douleur.
De ce fait, les patients perdent la sensation d’alerte à la douleur qui fragilise les téguments.
Le diabète augmente ainsi de 2 à 5 fois le risque d’ulcération des membres inférieurs (entre
les genoux et les orteils) et dans 7% des cas l’amputation survient [37].
1.4.3 Les rétinopathies
Les rétinopathies dues au diabète sont des maladies qui se développent en plusieurs années
et sont responsables de la cécité chez ces patients. Il est estimé que ces maladies prolifératives
concernent environ 35% des diabétiques de type 2 [38]. L’accumulation des lésions sur les
vaisseaux sanguins de la rétine induit des zones d’ischémies sur les vaisseaux pouvant mener
à une cécité chez les patients.
1.4.4 Les maladies cardio-vasculaires
Contrairement aux sujets sains, les diabétiques ont 2 à 3 fois plus de risque de développer des
maladies cardiovasculaires [39]. En 2012, ces maladies représentaient 17,5 millions de décès
dans le monde selon l’OMS [1]. Ces décès survenant en majorité avant les 70 ans des patients
se répartissent entre les cardiopathies coronariennes à raison de 7,4 millions de décès et les
31
AVC à raison de 6,7 millions de décès. Sur l’île de La Réunion la prévalence des maladies
cardiovasculaires est deux fois plus élevée qu’en France hexagonale. Selon l’Agence Régionale
de la Santé de l’Océan Indien (ARS OI), la prévalence des AVC à La Réunion rapportée à l’âge
touche 1007 personnes sur 100 000 et place ce département en tête des départements
français. Elles se caractérisent par la formation de plaques d’athéromes à l’intérieur des
grosses artères menant à une réduction de leur lumière. Les artères les plus touchées se
situent au niveau du cœur, du cou ou encore des jambes. L’occlusion partielle des artères
coronaires dans le cœur induit un angor (angine de poitrine) et un risque accru de faire un
infarctus du myocarde. Au niveau des jambes, la diminution de la lumière des artères iliaques
induit l’AOMI qui s’ensuit possiblement d’une amputation des membres inférieurs. Au niveau
du cou, la sténose des artères carotides peut provoquer un AVC ischémique. En fonction de
l’atteinte cérébrale, les patients peuvent garder des séquelles importantes (hémiplégie,
aphasie, etc…) ou décéder.
32
33
2 L’athérosclérose
Les maladies cardiovasculaires sont généralement provoquées par l’obstruction et le
durcissement progressif des artères par les dépôts lipidiques sous la forme de plaques
d’athéromes. Dans l’athérosclérose (du grec athêré : bouillie et sklêrosé : dur), ce dépôt de
lipides dans les artères est un processus long et pernicieux. Ces plaques formées peuvent se
déposer à différents niveaux du système artériel, bien que les grosses et moyennes artères
soient des sites préférentiels. Par conséquent, les maladies engendrées comprennent entre
autre des cardiopathies coronariennes (atteintes du cœur), des maladies cérébrovasculaires
(atteintes du cerveau qui se manifestent par des AVC) ou encore des artériopathies
périphériques (AOMI).
Le diagnostic et le suivi des patients cumulant un ou plusieurs facteurs de risques se fait grâce
à différents examens qui peuvent être non invasifs (mesure de la pression artérielle,
électrocardiogramme -ECG-, épreuves d’efforts, échographies ou écho-doppler, scanner,
imagerie par résonnance magnétique –IRM– ou encore scintigraphie) ou invasifs
(coronarographie, examens biologiques) [40]. Les praticiens évaluent ainsi le fonctionnement
et l’état des vaisseaux sanguins et du muscle cardiaque des patients selon leur la technique
utilisée. En effet, chaque patient développe des plaques qui présentent des caractéristiques
individuelles propres (composition, taille). Ces plaques sont présentes chez l’individu depuis
la naissance et ne donnent pas lieu à des manifestations cliniques jusqu’à leur transformation
en plaques d’athérosclérose et leur rupture sous l’influence des différents facteurs de risques.
2.1 La paroi vasculaire
Le système vasculaire humain se constitue de la façon suivante : des artères qui proviennent
du cœur et vont vers les organes pour les approvisionner en oxygène et en nutriments, des
veines qui assurent le retour d’un sang riche en dioxyde de carbone et pauvre en nutriments
vers le cœur et également de petits capillaires qui assurent la circulation du sang dans les
organes.
La paroi vasculaire est organisée en trois feuillets allant de la lumière du vaisseau vers
l’extérieur (Figure 4) : l’intima (feuillet interne) qui est en contact avec la lumière du vaisseau
34
sanguin, la media (feuillet musculaire) composée en grande partie de cellules musculaires
lisses responsables de la contractilité du vaisseau et l’adventice (feuillet externe) constituée
de tissus conjonctif lâche et de différents types cellulaires (fibroblastes, cellules immunitaires,
adipocytes, terminaisons nerveuses, cellules vasculaires des vasa vasorum). L’épaisseur et la
proportion de ces trois feuillets dépendent du type de vaisseau et de leur distance par rapport
au cœur [41, 42].
Figure 4 : Organisation de la structure d’une artère. Elle est composé de trois feuillets, de la lumière vers l’extérieur du vaisseau : l’intima qui sert de barrière entre le tissu et la circulation sanguin, la média qui a un rôle contractile et participe à la contention, et l’adventice qui a un rôle de soutien. La composition de ces trois feuillets dépend de la fonction de l’artère (artères élastiques avec beaucoup de lames élastiques dans la média, artères musculaires avec beaucoup de cellules musculaires lisses et peu de lames élastiques par exemple). (Image provenant de medical servier modifiée) La tunique interne, l’intima, est composée d’une couche de cellules endothéliales reposant
sur une lame basale (matrice extra-cellulaire) ; elle est séparée de la média par la limitante
élastique interne. L’endothélium qui borde la lumière du vaisseau est en contact direct avec
la circulation. Les cellules endothéliales qui le composent sont en forme de losanges ; elles
sont juxtaposées en mosaïque et allongées selon l’axe de l’écoulement du flux sanguin.
L’organisation de l’intima est la même quelque soit le type d’artère bien qu’il puisse contenir
quelques cellules musculaires lisses également [41-43].
La tunique musculaire, la media, est la couche située entre l’intima et l’adventice. Elle est plus
épaisse que l’intima et est composée de cellules musculaires lisses ainsi que de fibres
élastiques. Elle est délimitée par les limitantes élastiques interne et externe. Elle est
35
responsable de l’adaptation du vaisseau aux contraintes de flux et de pression car les fibres
de collagène assurent la solidité de la paroi et les fibres élastiques assurent son élasticité, alors
que les cellules musculaires lisses assurent sa contractilité (via la vasodilatation ou la
vasoconstriction). Cette couche joue donc un rôle essentiel dans la pression artérielle. La
composition de la média varie selon la fonction de l’artère. Ainsi, l’artère élastique sera
composée de plusieurs feuillets musculo-élastiques eux-mêmes constitués de groupements
de cellules musculaires lisses enveloppées de lame basale et de fibres de collagènes entourées
de fibres élastiques. L’artère musculaire est beaucoup plus riche en cellules musculaires lisses
organisées de manière concentrique entre lesquelles s’intercalent quelques fibres élastiques
[41, 42].
L’adventice, la tunique externe, est séparée de la média par la limitante élastique externe. Elle
est constituée de tissu conjonctif (fibres élastiques et collagène peu organisées), de
terminaisons nerveuses, de fibroblastes, d’adipocytes et cellules immunitaires (présence
occasionnelle d’organe lymphoïdes tertiaires). Elle est aussi irriguée par des vasa vasora, des
ensembles de petits vaisseaux, qui assurent l’acheminement de cellules immunitaires et de
l’apport nutritionnel nécessaire aux cellules de la média (avasculaire), qui sont éloignées de la
lumière de l’artère [41, 42].
2.2 L’endothélium
L’endothélium, monocouche de cellules endothéliales qui tapissent l’intérieur de l’intima,
sépare la partie tissulaire des vaisseaux sanguins de la circulation sanguine [44]. Les cellules
endothéliales qui le composent sont orientées dans le sens du flux sanguin et présentent à
leur surface un glycocalyx qu’elles synthétisent. Il est constitué de polysaccharides, de
glycosaminoglycanes, de glycolipides et de glycoprotéines. Au pôle basal, d’autres composés
de la matrice extracellulaire son responsables de l’ancrage comme la fibronectine, le collagène
de type IV ou V, la laminine, etc. Ces cellules possèdent des vésicules appelées cavéoles qui
sont impliquées dans le transport des lipoprotéines et d’autres constituants spécifiques tels
que le facteur de Von Willebrand impliqué dans l’adhésion des plaquettes aux vaisseaux
sanguins [41, 42]. Ces facteurs sont contenus dans les corps de Weibel Palade. Les cellules
endothéliales expriment à leur surface de multiples récepteurs tels que les récepteurs de
36
lipoprotéines natives ou modifiées par oxydation, les récepteurs de l’insuline, mais aussi des
récepteurs « scavenger » de type CD36 [45]. Les cellules endothéliales possèdent un ensemble
de protéines ayant un rôle dans leur fonction de barrière entre la circulation sanguine et les
tissus. Ainsi des jonctions d’adhérences de type VE-Cadhérine (Vascular Endothelium
Cadherin) ou des jonctions serrées composées d’occludine, de claudines et de JAM (Junction
Adhesion Molecules) sont positionnées entre les cellules pour assurer la cohésion et contrôler
la perméabilité endothéliale[46]. Ces dernières jouent un rôle dans le passage des protéines
plasmatiques à travers l’endothélium. Ce transport est variable en fonction de leur
concentration, de leur taille, de leur charge mais aussi en fonction de la localisation de
l’endothélium (cérébrale, périphérique, pulmonaire, rénal…) et des caractéristiques
individuelles du patient (c’est-à-dire l’âge, la pression sanguine et le tonus vasculaire).
L’endothélium est un acteur important de l’homéostasie vasculaire [47]. En conditions
physiologiques, il synthétise et sécrète les facteurs nécessaires à la vasomotricité du vaisseau,
à sa perméabilité, il stimule la croissance des cellules musculaires lisses et le renouvellement
des cellules endothéliales. L’intégralité des activités de l’endothélium sont réalisées en
fonction des stimuli physiques ou chimiques qu’il reçoit de l’environnement. De surcroît, il
assure un rôle anti-inflammatoire, anticoagulant et anti-thrombotique en ne permettant pas
l’adhésion de plaquettes ou la formation de thrombus à sa surface sans lésion préalable. La
fonction vasomotrice de l’endothélium permet aux vaisseaux de moduler leur diamètre en
fonction des besoins physiologiques. Ainsi, l’endothélium sécrète des facteurs vasodilatateurs
tels que le monoxyde d’azote (NO) ou la prostacycline et des facteurs vasoconstricteurs
comme l’endothéline-1 ou le thromboxane. Ces derniers vont ensuite activer la vasomotricité
des vaisseaux sanguins auprès des cellules effectrices, les cellules musculaires lisses, en
adaptant le diamètre des vaisseaux en fonction de la demande physiologique.
Le monoxyde d’azote joue un rôle essentiel dans l’homéostasie de l’endothélium. En effet, il
régule la dilatation des vaisseaux sanguins, inhibe l’adhésion et l’agrégation des plaquettes,
l’adhésion et l’infiltration des leucocytes et aussi la prolifération des cellules musculaires lisses
[48]. Sa synthèse se déroule dans les cavéoles des cellules endothéliales sous l’action d’eNOS
(NO synthase endothéliale). Cette enzyme synthétise le NO à partir de la L-arginine grâce aux
cofacteurs BH4 (tetrahydrobiopterine) et NADPH (Figure 5) [48, 49].
37
Figure 5: Production d’oxyde nitrique par la cellule endothéliale. La production de NO se déroule dans les cavéoles des cellules endothéliales à partir de la L-arginine, du BH4 et du NADPH par l’enzyme NO synthase endothéliale (eNOS). Du fait du rôle central du monoxyde d’azote, la diminution de sa biodisponibilité, qu’elle soit
due à un défaut dans son action ou à la diminution de sa production, entraîne la dysfonction
de l’endothélium [48]. En effet, les ROS et en particulier l’anion O2°- peuvent interagir avec
NO le rendant indisponible pour assurer les divers rôles qu’il endosse. De plus, l’association
entre les concentrations élevées de triglycérides circulants et du flux sanguin perturbé
participe aussi à l’activation et la dysfonction de l’endothélium. De cette façon, la perturbation
de la fonction endothéliale rend ce dernier sensible à la survenue de lésions qui initient la
formation des plaques d’athérosclérose.
2.3 Les zones de formation des plaques d’athérosclérose
Dans les conditions de repos, le flux sanguin est un flux laminaire dont la vitesse est maximale
au centre du vaisseau et minimale au niveau de sa paroi. Lorsque cette vitesse augmente, le
flux sanguin est alors perturbé et adopte des mouvements de vortex (tourbillons) ou
oscillatoires. Les paramètres qui décrivent le flux sanguin sont les suivants (Figure 6) [50] :
Le taux de cisaillement ou « shear rate » représente la différence de vitesse du flux
sanguin entre le centre et la paroi du vaisseau.
La force de cisaillement ou « shear stress » (ESS) représente la force exercée par le
sang sur la paroi vasculaire par unité de surface. Elle est le produit du taux de
cisaillement par la viscosité du sang.
38
Figure 6: Illustration des différents types de flux sanguins (A) et des types de forces de cisaillement (B) qui surviennent dans les vaisseaux sanguins. (d’après Wentzel et al. adapté de Chatzizisis et al. )[51]. Les conditions de flux déterminent ainsi la force de cisaillement appliquée aux parois
vasculaires et donc à l’endothélium. Ces conditions peuvent influencer la sécrétion de NO ou
d’autres facteurs vasomoteurs mais aussi l’agrégation plaquettaire au niveau des cellules
endothéliales. Par conséquent, les zones où l’endothélium subit des forces de cisaillement
trop faibles avec un flux sanguin perturbé par des mouvements oscillatoires et/ou
tourbillonnaires sont des zones de prédilections pour l’initiation de la formation de plaques
d’athérosclérose. Ces zones correspondent aux courbures ou aux bifurcations présentes dans
l’arbre artériel. C’est pourquoi les plaques d’athérosclérose se forment préférentiellement au
niveau de l’aorte abdominale, des artères coronaires, des artères ilio fémorales ou encore au
niveau des bifurcations carotidiennes [51, 52].
2.4 Formation de la plaque d’athérosclérose
Avant les premiers dépôts de lipides dans les zones préférentielles de formation de plaques,
la physiologie des cellules endothéliales est perturbée, suite aux mouvements du flux sanguin.
Des changements de l’épaisseur de l’intima qui s’adapte aux différentes conditions de flux
sanguins sont observés. Il est ainsi question d’ « adaptative intimal thickening ». Le
fonctionnement perturbé de l’endothélium ainsi que la variation de l’épaisseur de l’intima
sont propices à l’initiation de la formation de la plaque d’athérosclérose qui se déroule en
plusieurs étapes [53]. Dans un premier temps, les lipides provenant des lipoprotéines
s’accumulent dans l’intima jusqu’à la formation de cellules spumeuses (phagocytes gorgées
39
de LDL –low density lipoprotein). Ces dernières évoluent en en stries lipidiques puis en plaque
d’athérome composée de cellules spumeuses et de lipides extracellulaires provenant de
cellules nécrosées. Ensuite, la paroi des artères se sclérose laissant la place à la plaque
d’athérosclérose suite à la formation d’une chape fibreuse qui recouvre un cœur lipidique,
pouvant présenter des calcifications. Enfin, la plaque d’athérosclérose peut se compliquer
avec la survenue d’hémorragies intraplaque qui la déstabilisent. La présence d’un thrombus
obstrue alors la lumière artérielle engendrant ainsi des accidents vasculaires ischémiques.
2.4.1 Les stries lipidiques
Le passage accru de lipoprotéines à travers l’endothélium est à l’origine de la formation des
stries lipidiques (Figure 7). Les lipoprotéines les plus athérogènes sont les lipoprotéines de
basse densité (LDL) riches en cholestérol. Les LDL vont pénétrer l’intima soit via les récepteurs
membranaires des cellules endothéliales par transcytose, soit par un passage para-cellulaire.
L’entrée des LDL dans l’intima est proportionnelle à leur concentration plasmatique. Ainsi,
plus leur concentration plasmatique élevée sera, plus importante sera leur endocytose par les
cellules endothéliales. A partir de leur captation, les LDL vont rester piégées et s’agréger dans
l’espace sous endothélial de l’intima notamment car elles ont une grande affinité pour les
protéoglycanes de la matrice extracellulaire. De plus cette interaction entre les LDL et les
protéoglycanes entraîne leur accumulation dans l’intima engendrant ainsi des modifications
dans le milieu extracellulaire soit par oxydation, glycosylation ou encore par protéolyse
enzymatique. L’oxydation est favorisée par certains facteurs de risques comme le tabagisme
ou encore l’hypercholestérolémie (qui augmente leur temps de résidence dans l’intima).
L’oxydation des LDL va participer à la déstabilisation de l’équilibre redox de l’endothélium. Ce
dernier déjà activé par des conditions de flux particulières, sera alors suractivé suite à la
déstabilisation de cet équilibre redox. Cette situation entraîne au niveau de l’endothélium la
sécrétion d’une cascade de molécules impliquées dans le recrutement de différents acteurs
comme les cellules immunitaires de type monocytes ou cellules dendritiques qui participent à
l’élimination de cet excès de LDL présentes dans l’intima. Les monocytes attirés sur le site des
lésions via les molécules d’adhésion comme ICAM-1 (intercellular adhesion molecule 1),
VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) ou encore les sélectines [54], vont se différencier
40
en macrophages. Les différents facteurs sécrétés par l’endothélium vont aussi entraîner la
migration de cellules musculaires lisses provenant de la média vers le site des lésions.
Ensembles, les macrophages et les cellules musculaires lisses vont phagocyter les LDL natives
et oxydées présentes en excès. Cette endocytose est médiée par différents mécanismes : la
macropinocytose des LDL natives par les macrophages [55, 56] qui est l’endocytose de fluides
extracellulaires par invagination de la membrane plasmique, ou grâce aux récepteurs présents
à la fois à la surface des macrophages et des cellules musculaires lisses comme le LDL-R
(récepteurs des LDL natives), le LOX 1 (récepteurs de LDL oxydés) ou encore de récepteurs
scavengers comme CD36 [45, 57]. Suite à cela, les macrophages activés vont participer et
amplifier l’état inflammatoire et oxydatif de la lésion via la production de cytokines pro-
inflammatoires comme IL1-β (InterLeukin-1-β) ou TNFα (Tumor Necrosis Factor-α) et la
production de ROS sous l’action de la myéloperoxydase (MPO), par exemple. Ces molécules
pro-oxydantes vont à leur tour participer aux modifications des LDL présentes dans l’intima.
Après leur phagocytose par les macrophages ou les cellules musculaires lisses, les LDL libèrent
leur contenu en cholestérol. Ce dernier s’accumule alors dans les cellules sous formes de
gouttelettes d’esters de cholestérols. L’accumulation de lipides les transforme en cellules
spumeuses lorsqu’elles ne sont plus capables d’éliminer l’excès de lipides. Les cellules
spumeuses vont ensuite s’accumuler dans la couche de protéoglycanes de l’intima pour
former des stries lipidiques aussi appelées xanthomes [7, 58, 59].
41
Figure 7: Illustration d’une strie lipidique. La lésion de l’endothélium permet l’infiltration de lipides dont les LDL dans l’intima, en parallèle, les leucocytes sont recrutés dans l’intima où les LDL s’accumulent. L’environnement autour des LDL induit leur modification (oxydation, agrégation) et leur endocytose non régulée par les leucocytes et les cellules musculaires lisses. Lorsque ces cellules sont gorgées de lipides, elles deviennent des cellules spumeuses et finissent par libérer leur contenu lipidique dans la plaque formant ainsi les stries lipidiques[60].
2.4.2 L’athérome
Suite à la formation des stries lipidiques, les cytokines et chimiokines libérées par
l’endothélium et les phagocytes vont favoriser la prolifération des cellules musculaires lisses.
Ces cellules migrent alors de la média vers l’intima et se mettent à sécréter des composants
de la matrice extracellulaire tels que les fibres de collagènes qui vont former une chape
fibreuse autour des stries lipidiques. Les cellules musculaires lisses passent d’un phénotype
contractile à un phénotype sécrétoire. Protégé de la circulation sanguine, un cœur riche en
lipides et en cellules spumeuses est formé. L’environnement pro-inflammatoire et pro-
oxydant au sein de ce cœur lipidique entraîne la destruction des cellules spumeuses par
nécrose ou nécrose post-apoptotique (étant donné qu’il n’y a plus de cellules capables de
phagocyter les corps apoptotiques). Ces dernières y libèrent alors leur contenu cellulaire et
42
lipidique. Le cœur lipidique devient ainsi cœur nécrotico-lipidique. A ce stade la plaque
d’athérome est formée [7, 58, 59].
2.4.3 La plaque d’athérosclérose
Les cellules immunitaires et musculaires lisses continuent d’affluer au sein du cœur nécrotico-
lipidique où survient l’apoptose de ces dernières ainsi que celle des cellules endothéliales.
Cette zone est le siège de réactions inflammatoires et pro-oxydantes [61]. La chape fibreuse
qui la recouvre s’épaissit et la plaque peut se compliquer avec des calcifications. La plaque
d’athérosclérose fait alors saillie dans la lumière du vaisseau sanguin provoquant une sténose
en réduisant le diamètre vasculaire et l’espace dédié au flux sanguin. Sans la survenue d’autres
évènements, la plaque est alors dite stable. Cependant, une zone d’hypoxie est présente au
niveau du cœur nécrotico-lipidique. Le manque d’oxygène va alors stimuler la croissance de
néo vaisseaux provenant des vasa vasora de l’adventice à l’intérieur de la plaque [62]. Ces néo
vaisseaux peuvent être responsable d’hémorragies intraplaque au sein d’une plaque devenue
compliquée (Figure 8).
43
Figure 8 : Illustration de la plaque instable ou compliquée. Le noyau lipidique se transforme en cœur nécrotico-lipidique suite à la nécrose et l’apoptose des cellules à l’intérieure de la plaque [60].
2.4.3.1 La formation des néo vaisseaux dans la plaque
L’angiogenèse est stimulée par l’hypoxie engendrée par l’épaississement de l’intima associée
à une consommation accrue d’oxygène par les macrophages ayant phagocyté les LDL oxydés
et une circulation sanguine réduite au sein la plaque [62]. Les néo vaisseaux poussent alors à
partir des vasa vasora de l’adventice vers la lumière de l’artère à travers la plaque
d’athérosclérose et plus précisément en dessous du cœur nécrotico-lipidique [63]. L’hypoxie
engendrée par la combinaison d’une faible densité de néo vaisseaux et d’une consommation
accrue d’oxygène par les macrophages actifs induit l’augmentation de la synthèse de HIF-1α
(hypoxia inducible-factor 1α). D’ailleurs les travaux de l’équipe de Gossl ont mis en évidence
une corrélation inverse entre la densité de néo vaisseaux et le nombre de cellules positives
pour HIF-1α [64]. La protéine HIF-1 est une protéine hétérodimérique constituée de deux sous
unités α et β qui lorsqu’elles s’associent forment un facteur de transcription capable d’induire
la transcription des gènes impliqués dans l’angiogenèse suite à une hypoxie [65]. La
44
transcription des gènes suivant est alors activée : iNOS (inducible NO synthase), VEGF
(vascular endothelial growth factor), VEGFR-1 et VEGFR-2 (VEGF receptor 1 et 2), PA
(plasminogen activator), PAI-1 (plasminogen activator ihnibitor 1), HO-1 (heme oxygenase 1)
ou encore ETS-1 (E26 transformation specific 1) [65-68]. Le facteur de croissance VEGF et en
particulier le VEGF-A associé à son récepteur VEGFR-2 conduit les cellules endothéliales vers
un phénotype angiogénique favorisant la croissance de néo vaisseaux dans la plaque [63]. En
plus de l’action du couple VEGF-A/VEGFR, l’ETS-1 participe aussi à la formation de néo
vaisseaux de diverses manières. D’une part, ETS-1 agit comme facteur de transcription [69], il
induit l’expression de VEGF et forme ainsi une boucle d’autorégulation favorisant la formation
des néo vaisseaux. ETS-1 induit aussi l’expression d’enzymes de dégradation de la matrice
extracellulaire telles que la métalloprotéinase matricielle 1 (MMP-1) nécessaires à la digestion
des jonctions cellulaires impliquées dans la cohésion des cellules endothéliales [70]. D’autre
part, il induit la migration des cellules endothéliales, aussi impliquées dans la formation des
néo vaisseaux après que ces dernières aient été désolidarisées suite à l’action des enzymes de
dégradation de la matrice extracellulaire [70]. Bien que ces néo vaisseaux aient pour fonction
de pallier le manque d’oxygène et de nutriments au sein de la plaque, ils sont souvent
immatures, fragiles et perméables [62]. Une hémorragie intraplaque survient alors au sein de
la plaque compliquée.
2.4.4 La complication de la plaque, la thrombose et la rupture de la plaque
La plaque devenue compliquée par la présence des néo vaisseaux non stables et perméables
est alors sujette à des hémorragies. Ces évènements impliquent différents acteurs qui vont
avoir un rôle dans la déstabilisation et la rupture de la plaque d’athérosclérose engendrant in
fine un accident vasculaire. Ainsi, les hémorragies apportent des érythrocytes (globules
rouges) dans la plaque. Dans l’environnement pro-inflammatoire et pro-oxydant du cœur
nécrotique, les érythrocytes subissant l’éryptose (l’apoptose des érythrocytes) libèrent leur
contenu s’ils ne sont pas phagocytés. Au sein de la plaque, les macrophages et les cellules
musculaires lisses peuvent phagocyter ces érythrocytes afin de les éliminer de manière
physiologique. Ces cellules se transforment également en cellules spumeuses par la suite.
Ainsi, le cholestérol, le composant majeur de la membrane de ces cellules sanguines sous
forme libre ou piégé dans les cellules spumeuses, participe à l’apport de lipides à l’intérieur
45
de la plaque [71]. D’ailleurs, il a été montré que 50 µL de globules rouges contribuent à
étendre le volume du cœur nécrotique de plus de 0,2 mm3 [71]. De plus, le fer, l’hémoglobine
ou encore l’hème se retrouvent dans le cœur nécrotico-lipidique en contact avec les autres
éléments présents participant ainsi à accroître le stress oxydant de la plaque en oxydant
d’avantage les lipides présents ou encore en participant à la production d’espèces réactives
de l’oxygène. De plus, les hémorragies intraplaque récurrentes apportent un lot de leucocytes
supplémentaires comme les neutrophiles en plus des macrophages déjà présents. Les
neutrophiles contiennent des granules qui renferment des enzymes et en particuliers des
protéases qui digèrent la matrice extracellulaire. Suite aux hémorragies intraplaque, les
neutrophiles activés vont libérer leur contenu granulaire comme l’élastase, les
métalloprotéinases matricielles (MMP) ou encore la myéloperoxydase (MPO) [72]. La MPO
expulsée des granules a un rôle dans la déstabilisation de la balance redox puisqu’elle catalyse
la formation d’acide hypochloridrique (HOCl) et participe à la formation de ROS. L’élastase et
les MMP ont pour action de digérer la matrice extracellulaire qui compose la chape fibreuse.
Celle-ci devenant de plus en plus fine, finit par se rompre permettant ainsi le déversement du
contenu du cœur nécrotico-lipidique dans la circulation sanguine (Figure 9). A ce point de
rupture, se déroule l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation d’un thrombus qui
colmate l’épanchement du cœur nécrotico-lipidique. L’évolution de la plaque peut alors suivre
deux voies : la première consiste en la cicatrisation de la lésion qui entraîne une sténose au
niveau du thrombus et la stabilisation de la plaque, et la seconde consiste en la surenchère
des cycles d’érosion de la plaque avec des hémorragies successives aboutissant à un thrombus
qui se décroche ou obstrue complètement la lumière in situ, pour entraîner l’accident
vasculaire [58].
46
Figure 9 : Illustration d’une plaque instable. Les hémorragies intraplaque successives entraînent la diminution de l’épaisseur de la chape fibreuse qui recouvre et protège la plaque de la circulation sanguine. Ainsi, cette chape fibreuse se rompt, le sang coagule au contact des composant de la plaque (collagène, facteur tissulaire, …) puis un thrombus luminal peut se former et obstruer le vaisseau [60].
2.4.4.1 L’hémorragie intraplaque (HIP) dans les plaques compliquées
La densité élevée des néo vaisseaux dans les plaques d’athérosclérose humaines ainsi que
l’inflammation qui y règne sont associées à l’amincissement de la chape fibreuse (Thin Cap
FibroAtheroma – TCFA) qui recouvre e cœur nécrotico-lipidique et à l’hémorragie intraplaque
[73]. L’hémorragie intraplaque correspond aux fuites des néo vaisseaux à cause de leur
fragilité particulière. En effet, Xu et al. qualifient les néo vaisseaux de fragiles, immatures,
irréguliers et perméables [62]. On note une membrane basale discontinue ainsi qu’une faible
densité en jonctions serrées entre les cellules endothéliales du néo vaisseau [74]. De plus, le
nombre de péricytes nécessaires au maintien des cellules endothéliales du vaisseau est
insuffisant et est associé à l’hémorragie intraplaque conduisant à l’extravasation des globules
rouges et des leucocytes [75]. De surcroît, on remarque une répartition des médiateurs
importants pour la maturation des néo vaisseaux en faveur de leur fragilité. Ainsi, les couples
47
VEGF/ VEGFR-1 et VGF/VEGFR-2 sont impliqués dans la prolifération des cellules
endothéliales, la formation du tube vasculaire et les évènements
d’attachement/détachement des péricytes [76]. L’angiopoiétine 1 (Ang-1) et l’angiopoiétine 2
(Ang-2) ont eux aussi un rôle dans la maturation des néo vaisseaux mais avec des effets
opposés. La surexpression de l’Ang-2 déstabilise les interactions entre péricytes et cellules
endothéliales et aussi les interactions entre les cellules endothéliales alors que l’Ang-1
associée au PDGF consolide les jonctions des cellules endothéliales favorisant la stabilité, la
maturation du néo vaisseau et diminue les fuites. Dans les plaques d’athérosclérose,
l’angiogenèse stimulée par HIF-1α et VEGF-A favorise l’expression de l’Ang-2 [77] et donc la
déstabilisation du néo vaisseau. D’ailleurs Post et al. ont mis en évidence une corrélation
positive entre le taux d’Ang-2 et la densité des néo vaisseaux intraplaque associée à
l’augmentation de l’activité de la MMP-2 impliquée dans la dégradation de la matrice
extracellulaire nécessaire à la migration des cellules endothéliales [78]. Ainsi, ces néo
vaisseaux fragiles, immatures et perméables, peuvent conduire au déversement des
érythrocytes, des neutrophiles et autres lipides plasmatiques dans la plaque d’athérosclérose
(Figure 10) et concourent à la survenue de l’hémorragie intraplaque.
2.4.4.1.1 HIP : le rôle des érythrocytes dans la déstabilisation de la plaque.
Le sang est constitué de divers types cellulaires qui évoluent dans une matrice extracellulaire
liquide inerte qu’est le plasma. Les éléments qui le composent sont répartis de la manière
suivante : 55% de plasma, 45% d’érythrocytes et moins de 1% de leucocytes [79]. Il est donc
naturel que l’hémorragie intraplaque soit essentiellement composée de globules rouges [80].
Le globule rouge est une cellule anucléée, dépourvue d’organelles, biconcave et d’environ 7,5
nm de diamètre. L’érythrocyte est riche en hémoglobine (environ 250 millions molécules
d’hémoglobine par globule rouge) afin d’assurer le transport des gaz au sein de l’organisme
[79]. L’extravasation des érythrocytes dans la plaque participe à sa déstabilisation de diverses
manières, notamment grâce à son contenu en cholestérol et en éléments pro-oxydants.
48
Figure 10 : Mise en évidence de l’extravasation du contenu sanguin à partir des néo vaisseaux dans des plaques d’athérome. Présence de macrophages, érythrocytes, fer et néo vaisseaux dans les plaques de fibro athérome avec un cœur nécrotico-lipidique (NC) entouré d’une chape fibreuse épaisse (A à E) et exemple de plaque avec un amincissement de la chape fibreuse (Thin-Cap fibroatheroma) (F à J). A) Photo d’un fibro athérome avec un important cœur nécrotique (coloration au Pentachrome de Movat, X20). B) Marquage intense du CD68 des macrophages, C) de la glycophorine A des globules rouges, D) dépôts de fer (pigment bleu) dans les cellules spumeuses (coloration de Mallory) et E) présence de micro vaisseaux par marquage des facteurs de von Willebrand en bordure du cœur nécrotique (X200). F) Photo d’une fibro athérome avec une chape fibreuse fine qui recouvre un cœur nécrotique important (coloration au Pentachrome de Movat, X20). G) Infiltration de macrophages par marquage du CD68, H) marquage de la glycophorin A des érythrocytes, I) déports de fer dans les régions riches en macrophages (coloration de Mallory) et J) marquages diffus des facteurs de von Willebrand dans les micro vaisseaux mettant en évidence des fuites dans le cœur nécrotique (X200). [81]
2.4.4.1.1.1 L’expansion du cœur nécrotico-lipidique.
Les érythrocytes contribuent à l’expansion du cœur nécrotico-lipidique de la plaque à cause
de la richesse de leur membrane plasmique en cholestérol, ce qui constitue, en plus des LDL,
une source importante de cholestérol alimentant la plaque après une HIP [82]. En effet, les
érythrocytes ne pouvant produire eux-mêmes leurs lipides, leur composition membranaire
dépend des échanges avec les lipides plasmatiques. De cette manière, la composition des
lipides membranaires des globules rouges reflète les taux circulants de lipoprotéines [83]. De
plus, afin de vérifier l’hypothèse selon laquelle les globules rouges participent activement au
développement de la plaque, Kolodgie et al. ont injecté des érythrocytes autologues chez des
lapins ayant suivi un régime pro-athérogène ou non et chez lesquels des lésions aortiques ont
été induite par angioplastie au ballonnet [81]. Ils montrent que l’injection de 25 à 50 µL de
globules rouges chez les lapins ayant déjà développés des plaques induit la formation
importante de cristaux de cholestérol associés à la présence de lipides, de fer et de cellules
49
spumeuses en comparaison avec les lapins contrôles chez qui les lésions sont composées
d’une faible quantité de cholestérol libre et de quelques macrophages. Aussi, l’analyse de
plaques coronariennes humaines, dans cette même étude, montre une importante
accumulation de glycophorine A (protéine de surface des globules rouges) et de fer associé à
l’infiltration macrophagique et a un cœur nécrotico-lipidique. Ainsi, l’hémorragie intraplaque
est associée à l’augmentation du cœur nécrotico-lipidique et à l’instabilité des lésions.
D’ailleurs, Virmani et al. indiquent que 100 µL de globules rouges avec un hématocrite de 50%
contenant 10% de cholestérol contribue à plus de 0,2 mm3 du volume du cœur nécrotico-
lipidique, ce qui correspond à un volume de 0,137 µL de sang total par jour déversé dans la
plaque suite à une HIP qui dure pendant 2 ans [71].
2.4.4.1.1.2 Les érythrocytes : une source d’éléments pro-oxydants qui altèrent le
fonctionnement de l’endothélium.
En plus d’être une source majeure de cholestérol, les globules rouges sont aussi une source
importante d’éléments pro-oxydants au sein de la plaque. Dès leur entrée dans la plaque, la
lyse rapide des globules rouges est provoquée par les produits de peroxydation lipidique tels
que les hydroperoxydes, les aldéhydes et les carbonyles [84] qui sont contenus dans le cœur
nécrotico-lipidique. En effet, les travaux de Van der Berg et al. [85] et de Carpenter et al. [86]
montrent que les hydroxydes lipidiques sont non seulement capables d’induire l’oxydation de
l’hémoglobine mais aussi la lyse des érythrocytes en réagissant majoritairement avec leurs
lipides membranaires. De plus, Nagy et al. montrent que l’incubation de globules rouges avec
des lipides issus de plaques d’athérosclérose humaines induit une lyse massive des
érythrocytes après 24h d’incubation. Leur contenu en hémoglobine est alors libéré dans la
plaque et une de boucle de réactions d’oxydation en découle agissant tour à tour sur
l’hémoglobine aboutissant à la libération du fer héminique et sur les lipides de la plaque déjà
en partie oxydés [87]. Ainsi, la lyse des érythrocytes après leur entrée dans la plaque est suivie
par la libération de l’hémoglobine sous sa forme réduite stable la ferro-hémoglobine. Ensuite
la ferryl-hémoglobine puis la ferri-hémoglobine qui sont très instables sont produits par
l’oxydation de la ferro-hémoglobine via l’action des lipides oxydés de la plaque. Le
groupement prosthétique de l’hémoglobine non stable dans la ferri-hémoglobine se sépare
alors de la globine. L’hème, étant hydrophobe, va entrer dans la partie lipidique de la plaque
50
et participer davantage au stress oxydatif qui y règne, ce qui a pour effet d’entraîner la
libération du fer qu’il contient, d’augmenter la peroxydation des lipides de la plaque et
d’altérer davantage l’endothélium (Figure 11).
Figure 11 : Modèle proposé du devenir des érythrocytes en contact avec les lipides oxydés du cœur nécrotico-lipidique de la plaque d’athérosclérose. 1) Entrée des globules rouges dans la plaque d’athérosclérose, 2) lyse des érythrocytes et libération de l’hémoglobine sous la forme ferro-hémoglobine, 3) a-transformation de la ferro-hémoglobine en ferryl-hémoglobine, et en b-ferri-hémoglobine, 4) libération de l’hème, 5) absorption de l’hème par le cœur nécrotico-lipidique, 6) augmentation du stress oxydant de la plaque, 7) activation de l’endothélium et 8) stimulation de l’expression de l’hème oxygénase 1 (HO-1). [87] L’oxydation des LDL par l’hème forme un produit unique d’oxydation, le HAVA (acide 5-
hydroxy-2-amino valérique), ce qui en fait un marqueur de l’oxydation des LDL par l’hème. En
effet, l’oxydation des LDL survient aussi en réponse à différents agents comme l’acide
hypochloridrique, le peroxyde d’hydrogène (H2O2) associés ou non au fer ferrique (Fe3+) ou
ferreux (Fe2+), mais qui n’induit pas ou peu la formation de HAVA. Dans leurs travaux, Julius et
Pietzsch montrent que l’oxydation des LDL chez des patients diabétiques de type 2 est due à
la présence de l’hème à cause de taux élevés de HAVA chez ces derniers [88]. Ils mettent
d’ailleurs en évidence l’existence d’une corrélation entre la glycémie et la formation de HAVA
chez les diabétiques. La présence de globules rouges dans la plaque et plus particulièrement
51
les produits de dégradation de l’hémoglobine peut endommager l’endothélium et entraîner
l’activation de ses systèmes de réponse au stress. D’ailleurs, Balla et al. ont montré que les
cellules endothéliales absorbent de manière dose-dépendante et rapide l’hème. Les cellules
endothéliales ne subissent pas d’effets cytotoxiques de l’hème directement mais sont
sensibilisées aux effets cytotoxiques des leucocytes ou de ROS [89, 90] après avoir absorbées
l’hème. Ils supposent alors que l’absorption de l’hème par les cellules endothéliales participe
aux dommages vasculaires en montrant que l’hème est une source d’oxydation pour les lipides
et le lipoprotéines qui deviennent cytotoxiques pour les cellules endothéliales aortiques [91],
comme les LDL oxydées de la plaque suite aux hémorragies intraplaque. Puis, Ils mettent en
évidence que la ferri-hémoglobine, autrement appelée methémoglobine, en contact avec les
augmente les effets induits par les ROS sur la cellule endothéliale. Ils montrent aussi que suite
à ces évènements, la cellule endothéliale synthétise l’hème oxygénase 1 (HO-1) et la ferritine
impliquées respectivement dans la dégradation de l’hème et le stockage du fer [92]. D’autres
équipes ont aussi travaillé sur la formation de la ferryl-hémoglobine et ses effets biologiques
sur les cellules endothéliales. Ainsi, Potor et al. ont mis en évidence que les lipides oxydés
issus de plaque d’athérome oxydent l’hémoglobine et provoquent la formation de la ferryl-
hémoglobine. Ils montrent aussi que la ferryl-hémoglobine est capable de sensibiliser
l’endothélium aux effets cytotoxiques de l’H2O2 et des lipides oxydés et ils démontrent que la
ferryl-hémoglobine augmente la perméabilité de l’endothélium et l’adhésion des monocytes
[93]. Enfin de manière similaire à Balla et al. ils mettent en évidence l’augmentation de
l’expression de HO-1 et de la ferritine dans ces conditions. Ces évènements contribuent donc
à la stimulation de l’expression génique et protéique de l’HO-1 par les cellules endothéliales
et augmentent aussi son activité enzymatique. En outre, des études montrent de manière
surprenante qu’une première incubation des cellules endothéliales avec l’hème brève suivi
d’une incubation plus longue stimule la synthèse de l’HO-1 et de la ferritine par les cellules
endothéliales qui deviennent résistantes au stress oxydatif [92, 94].
2.4.4.1.1.3 La détoxification de l’hème et du fer
Beaucoup d’études ont montré que la présence d’hémoglobine et plus précisément celle du
ferryl-hémoglobine entraîne l’expression protéique et génique de l’HO-1 et de la ferritine qui
participent à la détoxification de l’hème et au stockage du fer. Le système hème oxygénase
52
est le seul dispositif qui dégrade l’hème de manière physiologique dans l’organisme [95]. Il est
composé de trois enzymes HO-1, HO-2 et HO-3 qui sont exprimées par divers les types
cellulaires comme les cellules du système réticulo-endothélial, les cellules vasculaires, les
cellules hépatiques ou encore par les macrophages. Contrairement à HO-2 qui est exprimée
de manière constitutive, HO-1 est inductible et HO-3 qui ne semble pas être exprimée chez
l’homme [96]. En effet, les dommages oxydatifs cellulaires et notamment ceux de
l’endothélium dans l’athérosclérose induit par les produits de dégradation de l’hémoglobine,
les produits de peroxydation lipidiques, les ROS ou encore par les leucocytes entraînent la
synthèse de HO-1 ; son activité est donc induite par une perturbation de la balance redox
cellulaire [95]. Le système HO qui dégrade l’hème en biliverdine, en monoxyde de carbone et
en fer ferreux (Fe2+) permet aux cellules de résister aux dommages oxydatifs, notamment
grâce à la réduction de la biliverdine en bilirubine par la biliverdine réductase [97, 98] un
élément antioxydant important. Cependant, les cellules endothéliales ne possèdent pas de
biliverdine réductase [99]. Suite à la synthèse de HO-1, les cellules endothéliales synthétisent
aussi la ferritine qui est une protéine impliquée dans le stockage du fer [100]. Cette protéine
multimériques est constituée de deux sous unités (une chaine légère et une chaine lourde)
dont la proportion dépend de l’état du fer. Ainsi, plus la concentration en fer ferrique (Fe3+)
est élevée, plus grande sera la proportion de la chaine lourde de la ferritine car cette dernière
possède une ferroxydase qui réduit Fe3+ en Fe2+. De plus la ferritine a une forte capacité de
stockage du fer puisqu’une mole de ferritine est capable stocker jusqu’à 4500 moles de fer
[101].
Toutes ces études mettent aussi en lumière le fait que les dommages cellulaires provoqués
chez les cellules endothéliales par les ROS et les produits de peroxydation lipidiques après
incubation avec l’hémoglobine et la ferri-hémoglobine sont annulés par l’haptoglobine (Hp)
ou l’hémopexine (Hx). Ces protéines plasmatiques se lient respectivement à l’hémoglobine et
l’hème ; elles participent à la clairance de l’hémoglobine et à la stabilisation de la ferri-
hémoglobine [92].
L’hémopexine est une protéine plasmatique de 60 kDa synthétisée majoritairement par le foie
qui appartient à la famille des protéines de phase aiguë sécrétées en réponse à une situation
inflammatoire [102]. Elle possède une forte affinité (Kd < 1 pM) pour l’hème à laquelle elle se
lie en ratio équimolaire [103], elle permet d’éviter la dissociation de l’hème et du fer. La
complexation de l’hème par l’Hx atténue ainsi les effets pro-oxydants du fer libéré. Lorsque le
53
complexe hème-Hx est formé, l’Hx subit des modifications conformationnelles pour permettre
la liaison de l’Hx à son récepteur CD91 [104]sur les macrophages ou les hépatocytes [105] où
le complexe hème-Hx est internalisé. L’hème est alors libéré du complexe puis dégradé par
l’HO-1 [106] et le complexe Hx-Hx récepteur est recyclé [107, 108]. Bien que le rôle de l’Hx
dans l’athérosclérose ne soit pas clairement établit, il prévient les effets pro-oxydants de
l’hème et pourrait être une cible thérapeutique dans cette pathologie.
L’haptoglobine est une protéine plasmatique appartenant comme l’Hx à la famille des
protéines de phase aiguë sécrétées en réponse à une situation inflammatoire [109], elle est
synthétisée par le foie mais aussi par d’autres organes comme les poumons [110], le thymus
[111] ou encore les adipocytes [112, 113]. Le rôle de l’Hp est de se lier à l’hémoglobine libérée
(Figure 12) suite à une hémolyse intravasculaire, elle possède une forte affinité pour
l’hémoglobine libre (Kd ≈ 10-15 M) [114]. D’ailleurs elle se lie à l’hémoglobine avec un ratio
stœchiométrique de 1 : 1 [114] pour former un complexe très stable qui protège
l’hémoglobine de l’oxydation notamment induite par H2O2 [115-117]. En temps normal,
l’élimination du complexe Hp-hémoglobine (Hp-Hb) de la circulation sanguine se déroule
majoritairement dans le foie (90%) mais aussi en partie dans les macrophages (10%) [118, 119]
grâce à l’interaction entre le complexe Hp-Hb et le récepteur CD163 [119].
Figure 12 : Exemples de complexes Hp-Hb (complexe Hp1-1/Hb et Hp2-2/Hb). On remarque ici que l’Hp1-1 est de plus petite taille que l’Hp2-2. Aussi, l’Hp1-1 constituée uniquement de 2 sous-unités β ne peut se lier qu’à 2 hémoglobines alors que l’Hp2-2 composée de 4 sous-unités β peut se lier à 4 molécules hémoglobines [119]. Le complexe Hp-Hb est internalisé par endocytose et l’hémoglobine est alors déradée dans le
foie ou par les macrophages par la voie HO-1. En revanche, dans les sites extra vasculaires
comme les plaques d’athérosclérose, l’élimination du complexe Hp-Hb est majoritairement
assurée par les macrophages qui expriment à leur surface CD163 [120]. La demi-vie de l’Hp
est de 3 à 5 jours mais une fois complexée à l’hémoglobine, le complexe Hp-Hb est éliminé de
la circulation en 20 minutes [121].
54
Figure 13 : Quelques exemples de structures des différents génotypes d’haptoglobine possibles. L’Hp1-1 est constituée d’un dimère de sous-unités α1/β, l’Hp2-2 est formée de polymères de sous-unités α2/β et l’Hp2-1 est composée de polymères hétérogène des sous-unités α1/α2/β [122]. Il existe 2 allèles du gène codant pour l’Hp situés sur le chromosome 16 (16q22.1) [123], l’Hp1
et l’Hp2, aboutissant à trois génotypes d’Hp possibles : les génotypes homozygotes Hp1-1 ou
Hp2-2 et hétérozygote Hp2-1 [114] (Figure 13). Les séquences codantes pour ces deux allèles
de l’Hp sont de tailles différentes ce qui permet la formation des sous-unités α de tailles
différentes. Ainsi, la sous-unité α1 issue de l’Hp1 possède 42 acides aminés et la sous-unité α2
provenant de l’Hp2 possède 83 acides aminés [124]. De plus, l’Hp1-1 est une protéine
tétramérique composée de deux dimères α/β alors que l’Hp2-2 est une protéine constituée
de polymères de sous-unités α/β de forme cyclique [125] pouvant compter jusqu’à 10
polymères. Par conséquent, l’Hp1-1 et l’Hp2-2 sont de tailles différentes mais d’autres
paramètres distinguent ces deux Hp. Ainsi, bien que l’affinité de ces deux Hp pour
l’hémoglobine ne soit pas modifiée [126], comme la sous unité α1 est plus petite que la sous
unité α2, 1g d’Hp1-1 est composé de plus de sous unités α/β par rapport à 1g d’Hp2-2 ou
d’Hp2-1. De cette manière l’Hp1-1 peut se lier à plus d’hémoglobine que l’Hp2-1 ou l’Hp2-2
[122]. De plus, l’Hp1-1 étant plus petite que l’Hp2-2, l’Hp1-1 peut atteindre des régions
inaccessibles à l’Hp2-2 à cause de sa taille et peut donc couvrir une zone plus étendue que
l’Hp2-2 [122]. Aussi, l’Hp1-1 prévient de manière plus efficace l’effet pro-oxydatif de
l’hémoglobine libre que l’Hp2-2 en empêchant la libération de l’hème du complexe Hp-Hb
55
[126, 127]. En outre, l’Hp1-1 favorise l’absorption du complexe Hp-Hb par les macrophages
via CD163 [126, 128, 129]. De ce fait, la captation du complexe Hp1-1/Hb dans la circulation
sanguine est 2 fois plus rapide que celle du complexe Hp2-2/Hb [130]. Ces divers éléments
montrent la différence d’efficacité entre ces deux génotypes d’Hp. De plus, différentes études
de carotides humaines montrent un lien entre le génotype de l’Hp des patients et la stabilité
de la plaque. Ainsi, l’étude d’Ijas et al. sur deux cohortes de patients (la cohorte Helsinkin
Carotid Endarterectomy Study –HeCES– de 91 patients et la cohorte Health 2000 de 1460
patients) met en évidence d’une part l’association entre le génotype Hp2-2 et l’instabilité de
la plaque carotidienne et d’autre part la corrélation entre la présence de l’allèle 2 de
l’haptoglobine et l’augmentation de HO-1 dans ces mêmes plaques [131].
2.4.4.1.2 HIP : le rôle des cellules immunitaires
Les HIP apportent de nombreux éléments qui agissent sur l’expansion de la taille du cœur
nécrotico-lipidique, source de stress oxydatif mais aussi d’inflammation au sein de la plaque.
De ce fait, lors d’HIP successives, l’extravasation d’érythrocytes dans la plaque stimule le
recrutement de cellules immunitaires. Ainsi Melder et al. [132] et Munn et al. [133] ont étudié
l’adhésion et le « rolling » des lymphocytes à l’endothélium dans différentes conditions : in
vivo sur des veines de souris SCID (modèle murin immuno-déficient où les souris développent
une lymphopénie) et in vitro sur des cellules endothéliales HUVEC. Après avoir activé
l’endothélium avec du TNF-α, ils ont mesuré différents paramètres d’adhésion des
lymphocytes à l’endothélium en présence ou non de globules rouges en conditions
dynamiques. Ils ont mis en évidence que l’adhésion et le « rolling » des lymphocytes est
augmentée en présence de globules rouges en conditions de flux faibles. Ces travaux
indiquent aussi que la liaison des lymphocytes à l’endothélium se fait grâce aux intégrines et
aux sélectines exprimées à leur surface, et grâce aux molécules d’adhésion ICAM-1 ou VCAM-
1 à la surface des cellules endothéliales. De plus, Melder et al. ont confirmé ces résultats in
vivo en utilisant les cellules sanguines périphériques mononucléées (PBMC) regroupant les
lymphocytes et les monocytes [134]. Dans l’athérosclérose, on peut donc supposer que la
présence de globules rouges dans la plaque a pour conséquence de stimuler l’adhésion des
monocytes et lymphocytes aux néo vaisseaux et de favoriser leur diapédèse.
56
L’extravasation continue à partir des néo vaisseaux ainsi que l’HIP représentent une porte
d’entrée pour d’autres types de cellules immunitaires dans la plaque. Ainsi, parmi les
leucocytes qui transitent dans la plaque, les neutrophiles qui représentent 70% d’entre eux
participent à l’inflammation et la déstabilisation de la plaque [135]. En effet, une étude de 355
plaques de carotides humaines a mis en évidence la présence de neutrophiles répartis de
manière hétérogène dans la plaque. Les neutrophiles se retrouvent au niveau de la chape
fibreuse, de l’épaulement de la plaque, à la base de la plaque dans la média proche des HIP
ou encore dans l’espace sous-endothélial à proximité de la lumière du vaisseau sanguin. Cette
étude montre aussi qu’il existe une corrélation entre la présence des neutrophiles dans la
plaque avec l’expansion du cœur nécrotico-lipidique, la présence croissante de macrophages
et de néo vaisseaux. Il existe une corrélation inverse entre la présence de neutrophiles dans
la plaque et la présence de cellules musculaires lisses et du contenu en collagène de la plaque.
Dans cette étude, les auteurs ont aussi remarqué une corrélation positive entre la présence
des neutrophiles et la concentration de l’interleukine 8 (IL8), une chimiokine qui permet leur
recrutement, associée à l’expression croissante des MMP8 et MMP9, d’origine neutrophilaire
[136]. Ainsi, cette étude met en évidence que la présence de neutrophiles dans la plaque
d’athérosclérose est associée aux éléments caractéristiques de la rupture. De plus, les
mastocytes qui atteignent la plaque [137, 138] aussi via l’HIP et les fuites des néo vaisseaux
participent au recrutement des neutrophiles. D’ailleurs, les travaux de Wezel et al. montrent
que l’activation des mastocytes dans la plaque entraîne la dégradation du collagène
notamment par l’action de la chymase (une enzyme libérée par les mastocytes). Ces travaux
indiquent que l’activation des mastocytes entraîne le recrutement des neutrophiles dans la
plaque mais pas celui des monocytes ou des lymphocytes (Figure 14). Ce recrutement survient
notamment suite aux interactions entre CXCR2 ou CXCR4 exprimés à la surface des
neutrophiles et leurs ligands CXCL1 ou CXCL12 exprimés à la surface des mastocytes [139].
D’autres travaux montrent d’autres mécanismes de recrutement des neutrophiles dans la
plaque. Ainsi, Eriksson et al. ont mis en évidence que l’interaction dynamique entre
l’endothélium et les neutrophiles permettant leur attachement et « rolling » se déroule via les
sélectines exprimées à la surface des cellules endothéliales [140].
57
Figure 14 : Localisation de neutrophiles dans une plaque de carotide humaine. A) Neutrophiles CD66b positives au niveau de l’épaulement de la plaque, B) dans l’espace sous-endothéliale de la lumière de la carotide et C) autour d’un micro vaisseau [136].
2.4.4.1.2.1 L’activation des neutrophiles : libération des enzymes granulaires
Une fois dans la plaque d’athérosclérose, les neutrophiles, en contact avec les éléments pro-
oxydants produits par la NADPH oxydase, l’hémoglobine libre ou encore les lipides oxydés,
vont être activés et vont libérer le contenu de leurs granules et aussi leur ADN sous forme de
filets. Ainsi, l’étude de Doweiler et al. met en évidence que le recrutement des neutrophiles
via IL8 dans les plaques compliquées induit la libération de la MMP8 granulaire et l’apoptose
des cellules endothéliales dans un modèle in vitro humain de néo-intima. De ce fait, cette
étude propose que la dégranulation des neutrophiles soit impliquée dans la déstabilisation de
la plaque et dans la survenue des évènements cardiovasculaires qui en découlent [141].
Plusieurs études montrent la présence et le rôle des protéines granulaires libérées comme les
différents types de MMP [142-146], l’élastase [147] ou encore la myéloperoxydase [148], suite
à l’activation des neutrophiles dans et sur la plaque d’athérosclérose. Parmi ces études, celle
de Leclercq et al. sur des plaques d’athérosclérose carotidiennes humaines montrent d’une
part des concentrations plus importantes des marqueurs de l’activation des neutrophiles (les
MMP2 et 9, le complexe MMP9-NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipicalin), l’élastase et
la MPO) sont retrouvées dans les plaques carotidiennes hémorragiques par rapport aux
plaques non hémorragiques. D’autre part, cette étude montre que la libération de ces
protéases est impliquée dans la déstabilisation de la plaque. Ainsi, la dégradation de la matrice
extracellulaire et notamment de la chape fibreuse assurée directement par les MMP2 et 9, le
complexe MMP9-NGAL et par l’élastase des neutrophiles est plus importante dans les plaques
hémorragiques par rapport aux plaques non hémorragiques [72]. De ce fait, les neutrophiles
participent activement à l’augmentation du stress oxydant et à la déstabilisation de la plaque
58
grâce à l’activité de la MPO et à la protéolyse de la chape fibreuse par les MMP ou encore
l’élastase.
2.4.4.1.2.2 Activité des enzymes des neutrophiles
Les différentes protéinases et enzymes libérées ont des actions complémentaires et diverses
dans la dégradation de la chape fibreuse. Ainsi, les métalloprotéinases 1, 2, 8, 13 et 14 clivent
les fibres de collagènes de type I et III [149]. D’ailleurs, les travaux de Sukhova et al. montrent
que la présence des MMP1 et MMP3 sont co-localisés avec les fibres de collagènes clivés dans
la plaque [144]. Ensuite, les MMP8 et MMP12 fragmentent les fibres d’élastines [149]et les
MMP3, MMP7 et MMP9 clivent les fibres de collagènes et aussi les protéoglycanes du cœur
nécrotico-lipidique [149]. Enfin, la chaperonne NGAL, un marqueur prédictif des risques
cardio vasculaire [150, 151], prolonge l’activité protéolytique de la MMP9 lorsqu’elles sont
complexées en inhibant l’inactivation de la MMP9 [152].
L’élastase des neutrophiles est une enzyme de type sérine protéase qui dégrade les ancrages
homophiliques de l’endothélium de type cadhérine-cadhérine entre les cellules endothéliales
ou entre les cellules endothéliales et les protéines de la matrice extracellulaire [153]. Cette
activité peut être inhibée grâce à l’action de l’α-1-antitrypsine un inhibiteur circulant de
l’élastase. Cependant, dans la plaque d’athérosclérose, l’environnement riche en éléments
pro-oxydants associés aux complexes MPO/NET (Neutrophil Extracellular Trap) altère l’action
inhibitrice de l’α-1-antitrypsine [154].
La myéloperoxydase des neutrophiles possède une activité de peroxydase et de chloration.
Ainsi, elle converti le peroxyde d’hydrogène produit par la NADPH oxydase en acide
hypochloridrique [155]. Dans la plaque, elle contribue donc au stress oxydatif notamment en
oxydant les lipoprotéines [156] ou en participant à la formation des résidus Nε-
(carboxyméthyl)lysine lors de la formation des AGE [157]. De plus, des études cliniques ont
mis en évidence des corrélations entre les taux circulants de MPO et l’incidence de
l’athérosclérose, c’est pourquoi, la MPO est facteur de risque des maladies coronariennes
[158]. L’action synergique de ces différentes MMP associées à l’élastase et à la MPO permet
donc de dégrader le collagène, de diminuer l’épaisseur de la chape fibreuse et d’augmenter le
stress oxydatif de la plaque. De cette manière, tous ces acteurs participent à la déstabilisation
de la plaque.
59
2.4.4.1.2.3 Contribution des complexes NETs
L’activation des neutrophiles conduit aussi à la libération de leur ADN double brins sous la
forme de filets complexés à des histones et à des protéines de leurs granules appelés NETs
[159]. Ce processus appelé NETose entraîne la mort des neutrophiles par des mécanismes qui
diffèrent de l’apoptose et de la nécrose et qui dépend des ROS produits par la NADPH oxydase
des neutrophiles [160]. Après la production de ROS par les neutrophiles, leur NETose se
déroule en plusieurs étapes. Ainsi, les enzymes et protéines des granules migrent dans le
noyau comme l’élastase et la MPO qui provoquent la décondensation de la chromatine en
digérant les histones du nucléosome [161]. Ensuite, les membranes des granules et du noyau
sont détruites ce qui entraîne le mélange du matériel cytoplasmique et nucléaire [160].
Cependant, la membrane plasmique du neutrophile reste encore intacte. Ensuite, l’élastase
et la MPO s’associent à l’ADN décondensé mais toujours lié aux histones formant des
complexes NETs. Enfin sous l’action conjointe des NETS, des ROS et des protéines granulaires,
la membrane plasmique des neutrophiles se rompt et permet la libération des complexes
NETs et des protéines granulaires [160, 161]. De manière intéressante, des travaux sur un
modèle murin qui développe la drépanocytose ont mis en évidence la participation de l’hème,
libéré après l’hémolyse des érythrocytes, à la formation des NETs [162]. Les NETs sont
impliqués dans la formation et le développement de la plaque d’athérosclérose comme le
montre les travaux de Knight et al. dans le modèle murin déficient pour l’ApoE où l’inhibition
de la formation des NETs réduit la thrombose artérielle et le développement de la plaque
l’athérosclérose [163]. De plus, l’étude de Borrissof et al. met en évidence l’existence d’une
corrélation entre la sévérité de l’athérome coronarien, l’état prothrombotique de la plaque et
la présence des NETs ou de l’ADN libre double brins [164]. Aussi les travaux de Megens et al.
mettent en évidence la présence de NETs dans les plaques d’athérosclérose [165].
60
61
3 L’impact du diabète de type 2 sur la plaque d’athérosclérose
Les complications cardiovasculaires représentent les principales causes de décès des patients
diabétiques [166, 167]. D’ailleurs les équipes de Jamrozik et de Folsom [168, 169] ont montré
que les sujets diabétiques faisaient 4 fois plus d’AVC que des sujets non diabétiques. A travers
le stress oxydant, la glycation des protéines et l’inflammation de bas grade, l’hyperglycémie
chronique des diabétiques accentue le devenir de la plaque d’athérosclérose de sa formation
à sa rupture. En effet, il a été montré que le développement des plaques des patients
diabétiques est plus rapide et agressif que celui des patients non diabétiques [170, 171]. En
outre, l’équipe de Khan a mis en évidence que l’hyperglycémie entraîne un processus
athérogène accéléré sur des souris ApoE-/- (modèle murin déficient pour l’apolipoprotéine E
développant des plaques d’athérosclérose suite à une dyslipidémie). En effet, avant même
que des taux anormaux de lipides ne soient détectables, des plaques d’athérosclérose
avancées s’étaient développées [172]. D’ailleurs, Les travaux de Moreno et al. ont montré que
la composition des plaques d’athérosclérose des patients diabétiques de type 2 était
différente de celles des patients non diabétiques. Ainsi, les plaques des patients diabétiques
ont une superficie du cœur nécrotico-lipidique et un thrombus plus important que ceux des
patients non diabétiques. De plus, l’infiltration macrophagique ainsi que la surface qu’ils
occupent sont supérieures chez les patients diabétiques par rapport aux patients non
diabétiques, ce qui suggère une fragilité et une vulnérabilité à la rupture de la plaque accrue
chez les patients diabétiques par rapport aux patients non diabétiques [173].
3.1 Diabète et l’endothélium vasculaire.
L’endothélium a un rôle important dans l’homéostasie vasculaire. Cependant, celui-ci voit son
fonctionnement perturbé dans l’athérosclérose notamment à cause de la diminution de la
biodisponibilité du NO. De plus, chez les diabétiques, l’hyperglycémie provoque
l’augmentation du stress oxydatif, l’augmentation de la production d’AGE et l’installation de
l’inflammation de bas grade. Ces éléments influencent aussi l’endothélium du diabétique en
participant à sa dysfonction et en le rendant prothrombotique.
62
3.1.1 La dysfonction endothéliale.
L’endothélium participe activement à l’homéostasie vasculaire en maintenant l’équilibre
entre la vasoconstriction (via l’endothéline) et la vasodilatation (via le NO), ou encore entre
les phénomènes thrombotiques et fibrinolytiques. Chez les sujets diabétiques,
l’hyperglycémie, la résistance à l’insuline et les fortes concentrations en acides gras libres
participent à la dysfonction de l’endothélium caractérisée par une diminution de la
biodisponibilité du NO soit via la diminution de sa production, soit via la diminution de son
activité [174, 175], et le rendent prothrombotique.
3.1.1.1 Les effets de l’hyperglycémie sur la dysfonction endothéliale.
L’hyperglycémie induit la formation de ROS et plus particulièrement l’anion superoxyde O2°-
via la chaîne de transport des électrons de la mitochondrie des cellules endothéliales [176].
D’une part, la surproduction de l’anion O2°- favorise son interaction avec le NO pour former le
peroxynitrite (ONOO-) [177] qui oxyde le cofacteur d’eNOS (endothelial NO synthase) le BH4
(tétrahydrobioptérine) [178]. L’enzyme NOS est alors découplée et cette action entraîne
l’augmentation de la production d’O2°- au détriment de celle du NO [179]. D’autre part, les
ROS dont l’anion superoxyde participent à l’augmentation de la formation d’AGE [176]. Ces
protéines glyquées au fonctionnement perturbé vont aller se lier à leurs récepteurs RAGE et
à leur tour participer à l’augmentation du stress oxydant intracellulaire via la production de
l’anion O2°- et in fine participent à la diminution de la production de NO. De cette manière, la
formation de ROS s’auto alimente en formant un cercle vicieux.
L’hyperglycémie active l’endothélium et induit l’expression de molécules d’adhésion de types
ICAM-1 ou VCAM-1 à la surface des cellules endothéliales [60, 180]. Ces molécules permettent
l’adhésion des leucocytes comme les monocytes, les macrophages ou encore les neutrophiles
à l’endothélium. Dans l’environnement hyperglycémique et riche en radicaux libres des
diabétiques, suite à l’activation de NF-κB les leucocytes vont produire des cytokines pro-
inflammatoires mais aussi participer au stress oxydatif en augmentant la production d’O2°- via
la NADPH oxydase. Ainsi l’équipe de Venugopal [181] a montré une augmentation de la
production d’O2°- dans des monocytes/macrophages isolés de patients diabétiques. De plus,
63
l’hyperglycémie augmente l’activation de la PK-C (protéine kinase C) et la production de ROS
via la NADPH oxydase dans les cellules musculaires lisses [182].
3.1.1.2 L’insuline et les acides gras libres impactent l’endothélium du diabétique.
La liaison de l’insuline à son récepteur (IR) entraîne l’activation de deux voies de signalisations
qui d’une part activent les voies métaboliques en jeux dans le stockage et l’utilisation du
glucose et d’autre part entrent en jeux dans l’activation de la prolifération et la différenciation
cellulaire ainsi que dans la synthèse de gènes (Figure 15).
Figure 15 : Les voies de signalisation de l’insuline. Dans des conditions physiologiques, la stimulation de la voie PI3-K est antiathérogène. Cependant, chez les patients diabétiques, l’insulinorésistance diminue l’interaction entre le complexe [insuline-IR] et la protéine IRS1 diminuant ainsi l’activation de la voie PI3-K au profit de la voie MAPK pro-athérogène. (IRS1 : insulin receptor substrate 1, PI3-K : phosphatidylinositol 3-kinase, Akt : protein kinase, MEK ½: mitogen-activated protein kinase, Erk ½ : extracellular receptor kinase, eNOS : endothelial nitric oxide synthase) [175]. En effet, l’insuline active la voie de signalisation PI3-K/Akt (phosphatodylinosytol 3 kinase/Akt)
pour induire l’entrée du glucose dans la cellule, la synthèse de protéines, de glycogène ou de
lipides mais aussi l’expression et l’activité de la eNOS (endothelial NO synthase). De cette
manière, la production de NO est augmentée [183-185]. De plus, l’insuline peut aussi activer
la voie des MAP Kinase/ERK (Mitogen-Activated Protein kinase / Extracellular-signal
Regulated Kinase) qui de son côté engendre la synthèse de l’endothéline-1 en plus de stimuler
entre autre la synthèse de facteurs de croissance [175]. Cependant, dans les conditions
physiologiques l’insuline exerce un rôle vasodilatateur favorisant la voie PI3-K. Chez les sujets
diabétiques, la résistance à l’insuline diminue l’interaction entre insuline et l’IRS-1 (insulin
receptor substrate 1) de qui limite l’activation de la voie PI3-K/Akt qui diminue l’activité de
64
l’eNOS et par conséquent la production de NO [186]. En revanche, l’activité de la voie des
MAPK/ERK n’est pas affectée. En effet l’hyper insulinémie résultant de la résistance à l’insuline
stimule d’avantage cette voie de signalisation et induit une surproduction d’endothéline-1
mais aussi de molécules d’adhésion de type ICAM-1 ou VCAM-1 [187].
Chez les sujets diabétiques, il y a une forte concentration en acides gras libres circulants issus
du tissu adipeux. Ces derniers participent à l’installation de la résistance à l’insuline [188] en
diminuant l’interaction entre la sous unité IRS-1 (Insulin Receptor Substrate 1) du récepteur à
l’insuline et l’insuline elle-même diminuant l’activation de la voie de signalisation PI3-K. De
cette manière, les acides gras libres participent à la dysfonction endothéliale en diminuant la
production de NO [189]. De plus, la forte concentration en acides gras libres circulants induit
l’augmentation de DAG (diacylglycérol) qui augmente à son tour l’activité de la PK-C (protéine
kinase C) impliquée dans la production de ROS intracellulaires. Les ROS produits
majoritairement par la NADPH oxydase [190, 191] dans les cellules endothéliales vont
interagir avec le NO, diminuer son action vasodilatatrice et augmenter la dysfonction de
l’endothélium [192].
En raison de l’hyperglycémie, du stress oxydatif, de la résistance à l’insuline ou encore à cause
de la forte concentration en acides gras libres circulants, l’endothélium des diabétiques est
rendu dysfonctionnel et par conséquent plus sensible aux lésions que celui des sujets non
diabétiques. De ce fait, l’initiation de la formation de plaque d’athérosclérose dans les artères
de gros et moyens calibres chez les diabétiques est plus rapide. De plus, comme le monoxyde
d’azote a non seulement un rôle dans la vasodilatation des vaisseaux sanguins mais aussi dans
l’adhésion et l’agrégation des plaquettes [48], la diminution de sa biodisponibilité dans le
contexte du diabète rend les vaisseaux sanguins d’avantage susceptibles à la formation de
thrombus. De surcroît, le NO semble aussi participer à l’angiogenèse. L’équipe de Murohara a
montré dans un modèle murin knock-out pour la NOS endothéliale que la synthèse endogène
de NO était nécessaire pour l’angiogenèse suite à une ischémie [193] de manière similaire à
l’angiogenèse induite suite à une hypoxie [194].
65
3.1.2 L’état prothrombotique de l’endothélium
Le diabète est une pathologie prothrombotique causée à la fois par l’hyperglycémie et
l’hyperinsulinisme chronique. Cet état est caractérisé entre autre par l’hyperréactivité
plaquettaire, l’altération de la fibrinolyse et de la coagulation ou encore la dysfonction
endothéliale. L’étude d’Angiolillo et al. montre que les plaquettes des patients diabétiques
sont hyperréaactives par rapport à des patients non diabétiques [195]. Cette hyperréactivité
est due à divers mécanismes : l’insulinorésistance a pour effet d’augmenter la concentration
intracellulaire de calcium et conduit à la dégranulation des plaquettes, l’hyperglycémie cause
l’amplification de l’expression de la P-sélectine grâce à l’activation de la PKC ou encore la
formation d’AGE à la surface des plaquettes diminuant ainsi la fluidité membranaire et
augmentant alors l’adhésion des plaquettes [196-198]. De plus la dysfonction de
l’endothélium caractérisé par l’altération de la biodisponibilité de NO rend les zones de
l’endothélium alors déficitaires en NO prothrombotiques. Ainsi, la diminution de la
concentration de NO lève l’action inhibitrice de NO sur l’adhésion, l’action, la sécrétion,
l’agrégation des plaquettes et sur l’expression de P-sélectine à la surface des plaquettes [199].
Enfin, le diabète modifie la coagulation et la fibrinolyse en faveur de la formation d’un
thrombus difficile à résorber. Ainsi, on constate l’augmentation de l’expression des facteurs
de coagulations et facteurs tissulaires chez les diabétiques [200-202]. De plus, les
concentrations élevées de thrombine et de fibrinogène modifient la structure du thrombus.
Ce dernier devient plus résistant à la fibrinolyse à notamment à cause d’une densité plus
importante en fibrine et de la glycation du fibrinogène [203-206]. Enfin, le diabétique est dans
un état d’hypofibrinolyse. En effet, la concentration élevée de PAI-1 (inhibiteur 1 de
l’activateur du plasminogène) empêche l’action du plasminogène ce qui allonge la durée de la
lyse du thrombus [207, 208]. De plus, la glycation du plasminogène altère ses propriétés
fibrinolytiques et donc son activité [209].
66
3.2 Diabète, néo vascularisation, hémorragie intraplaque (HIP)
Chez les patients non diabétiques, la déstabilisation de la plaque provient des néo vaisseaux
qui favorisent l’HIP. Chez les patients diabétiques, l’endothélium déjà fragilisé peut-être plus
affecté au niveau des néo vaisseaux et ainsi être plus susceptible aux HIP. De cette manière,
la néo vascularisation et les cellules acheminées par l’HIP peuvent aggraver la déstabilisation
de la plaque des patients diabétiques.
3.2.1 La néo vascularisation de la plaque d’athérosclérose
Chez les sujets non diabétiques, la formation de néo vaisseaux provenant des vasa vasora de
l’adventice dans la plaque d’athérosclérose participe aux évènements qui mènent à sa
rupture. Des travaux sur des modèles animaux diabétiques ou hyperglycémiques montrent les
liens entre le diabète et le développement des néo vaisseaux dans les plaques
d’athéroscléroses. Ainsi, l’hyperglycémie induite dans un modèle murin déficient pour
l’Apolipoprotéine E par Veerman et al. engendre l’augmentation du nombre de néo vaisseaux
de la plaque [210]. Dans cette étude, en plus de l’augmentation de la taille des lésions (plus
de deux fois), un défaut d’expression de VEGF altère ces néo vaisseaux par rapport aux souris
normo-glycémiques. Aussi, le diabète induit chez les porcs Swine après injections de
streptozotocine par Zang et al. induit une augmentation du stress oxydant et de
l’inflammation notamment par la suractivation de la NADPH oxydase dans les fibroblastes de
l’adventice de la plaque. Ces effets obtenus suite à l’interaction entre les AGE et leurs
récepteurs RAGE activent les voies de signalisations ERK 1/2 et JNK, aboutissent à
l’augmentation de l’expression des gènes pro inflammatoires via à NF-κB [211]. De cette
manière, le rôle des AGE dans le développement de la plaque d’athérosclérose est mis en
avant.
Chez les patients diabétiques, on remarque aussi une augmentation de la néo vascularisation
de la plaque, associée à l’augmentation de l’inflammation de la chape fibreuse localisée au
niveau l’épaulement de la plaque ainsi qu’une augmentation des HIP [212] par rapport aux
patients non diabétiques. On note une corrélation entre le nombre de néo vaisseaux, le
remodelage de la paroi artérielle et la croissance du cœur nécrotico-lipidique. D’ailleurs, cette
67
forte densité de néo vaisseaux au niveau de l’épaulement de la plaque est associée aux fort
risques de ruptures de cette dernière [213]. De même, les plaques des patients diabétiques
sont plus riches en lipides au niveau de l’athérome, contiennent une infiltration
macrophagique accrue ainsi qu’une incidence plus élevée de la thrombose par rapport aux
patients non diabétiques [173]. Bien que le processus de néo vascularisation soit similaire aux
processus de résolution de l’inflammation qui surviennent naturellement lors de
l’angiogenèse [214], chez le diabétique l’insulinorésistance entraîne l’augmentation de la
concentration en AGE, qui associée à la dysfonction endothéliale abouti à une augmentation
de l’infiltration des leucocytes [215]. De plus, la forte concentration en AGE induit
l’augmentation de l’expression de VEGF [216-218], de PDGF (platelet derived growth factor),
et d’IGF-1 (insulin like growth factor 1) [219] par les macrophages et monocytes de la plaque.
Ces acteurs stimulent l’angiogenèse et stimulent la migration et le bourgeonnement des
cellules endothéliales pour former les néo vaisseaux.
Les néo vaisseaux des plaques de patients diabétiques ont une morphologie différente de celle
des patients non diabétiques. Ainsi, après analyse de 530 plaques d’athérosclérose de patients
diabétiques, Purushothaman et al. on mis en évidence 3 types de motifs morphologiques
spécifiques des plaques diabétiques : le motif tubulo-luminal avec une configuration ovale ou
circulaire, le motif de pontage ou en septa (attachement de petits vaisseaux) et le motif
ramifié associé au bourgeonnement des cellules endothéliales entouré par une inflammation
périvasculaire (Figure 16) [220].
Figure 16 : Exemple des 3 types de morphologies spécifiques des néo vaisseaux des plaques d’athérosclérose des patients diabétiques. En 1, on observe le motif tubulo-luminal avec une configuration ovale, en 2, un exemple de motif en septa et en 3, le motif ramifié associé au bourgeonnement des cellules endothéliales [220].
68
3.2.2 L’hémorragie intraplaque (HIP).
L’extravasation des composés sanguins dans la plaque d’athérosclérose compliquée se
déroule lors de l’HIP. De cette manière, l’apport d’érythrocytes et de neutrophiles dans la
plaque des diabétiques participent aussi à sa déstabilisation.
3.2.2.1 L’implication des érythrocytes de patients diabétiques dans l’HIP.
Dans la pathologie diabétique, le globule rouge subit des modifications notamment à cause
de sa longue durée de vie et de l’hyperglycémie du patient. Ainsi, il subit la glycation de ses
protéines qu’elles soient de surfaces ou cytosoliques. La glycation la plus connue du globule
rouge est celle de la chaine A de l’hémoglobine, l’hémoglobine A1c [221], qui sert d’ailleurs
de marqueur pour le suivi de la glycémie des patients sur plusieurs mois. De plus, Nagai et al.
a montré que la glycation in vitro des globules rouges entraîne la formation d’AGE à leur
surface et plus particulièrement de carboxyméthylysines et carboxyéthylysines [222].
Cependant, les érythrocytes subissent d’autres modifications chez le diabétique. Ils
deviennent plus rigides, externalisent leur phosphatidylsérines (PS), voient leur forme changer
avec une surface irrégulière [223] et ont aussi une durée de vie réduite (80 jours ± 10 jours)
par rapport aux érythrocytes des patients non diabétiques (120 jours). Enfin, il faut noter que
l’adhérence des globules rouges diabétiques à l’endothélium est accrue [223]. De plus, des
travaux ont montré que l’interaction entre les cellules endothéliales et des érythrocytes
diabétiques passe notamment par la liaison des AGE à leurs récepteurs RAGE (AGE receptor)
à la surface des cellules endothéliales [22, 224, 225]. De ce fait, on peut supposer que cette
interaction prolongée érythrocytes/cellules endothéliales chez les patients diabétiques
participe à l’athérogènese. D’ailleurs, lors d’hémorragies intraplaque, l’extravasation des
érythrocytes dans la plaque participe à sa déstabilisation en étant un pourvoyeur de lipides
(cholestérol) et d’éléments pro-oxydants (hémoglobine, hème et fer), phénomène qui
pourrait être amplifié chez les diabétiques.
69
3.2.2.2 La clairance des globules rouges : rôle de l’haptoglobine dans la plaque du diabétique.
Chez les sujets non diabétiques, la clairance de l’hémoglobine libre dans la plaque est assurée
par l’haptoglobine (Hp). Cette protéine va former un complexe avec l’hémoglobine, le
complexe Hp-Hb, qui sera reconnu par le récepteur CD163 à la surface des macrophages. Ainsi,
les complexes Hp-Hb sont internalisés par les macrophages, l’hémoglobine est ensuite libérée
et dégradée par HO-1 [226]. Plusieurs études ont exploré l’impact du diabète de type 2 et des
différents génotypes de l’Hp sur les dommages engendrés par la libération de l’hémoglobine
dans l’athérosclérose. Chez le patient diabétique, l’affinité du complexe Hp2-2/Hb pour le
récepteur CD163 à la surface des macrophages est plus forte que celle du complexe Hp1-1/Hb.
Le complexe Hp1-1/Hb est internalisé par les macrophages plus rapidement que le complexe
Hp2-2/Hb. De cette manière, le temps de demi-vie du complexe Hp2-2/Hb est plus long (50
min) que celui du complexe Hp1-1/Hb. De plus, la capacité antioxydante de l’Hp en ce qui
concerne la séquestration de l’Hb et la stabilisation de l’hème et du fer est diminuée lorsque
l’Hp2-2 est liée à l’hémoglobine glyquée (HbA1c), ce qui pourrait favoriser la peroxydation des
lipides environnants [126]. De plus, les travaux d’Asleh et al. mettent en évidence que le
complexe Hp2-2/Hb se lie de manière plus importante aux HDL (lipoprotéines de haute
densité) que le complexe Hp1-1/Hb. De cette façon, l’Hb liée à l’Hp2-2 pourrait oxyder de
manière plus importante les lipides des HDL par rapport au complexe Hp1-1/Hb, ce qui altère
alors la fonction de transport inverse du cholestérol des HDL [130]. De plus, dans ces études,
chez les patients diabétiques ayant le génotype Hp2-2 on constate une diminution du taux de
macrophages qui expriment CD163 à leur surface. Ce résultat a d’ailleurs été montré aussi sur
un modèle de macrophages humains (THP1) stimulés en conditions hyperglycémiques où on
remarque que l’hyperglycémie diminue l’expression de CD163 à la surface des macrophages
[129]. Le taux de macrophages présentant à leur surface le récepteur CD163 diminue
également dans les plaques d’athérosclérose des patients diabétiques et cette diminution est
plus marquée chez les patients diabétiques Hp2-2 par rapport aux patients diabétiques Hp1-
1 ou Hp2-1. Cependant, la forme soluble du CD163 (sCD163) est plus élevée chez les patients
diabétiques Hp2-2 par rapports aux patients Hp1-1 et Hp2-1 [129]. De surcroît, la densité de
néo vaisseaux et de cellules musculaires lisses au niveau de la plaque des patients diabétiques
Hp2-2 est supérieure à celle des plaques des patients diabétiques Hp1-1 ou Hp2-1. Cela
pourrait amplifier l’hémorragie [227] et ainsi augmenter la proportion de fer libre dans les
70
plaques de ces patients [228]. Par ailleurs, la proportion de fer retrouvée dans les plaques des
patients diabétiques Hp2-2 est 4 fois supérieure à celle des patients diabétiques Hp1-1 ou
Hp2-1. Suite à l’augmentation de l’hémorragie intraplaque des patients diabétiques Hp2-2,
l’expression génique et protéique de HO-1 et de la myéloperoxydase (MPO) sont augmentée
par rapport aux plaques des patients diabétiques Hp1-1 et Hp2-1. De même, l’inflammation
est plus élevée dans les plaques des patients diabétiques Hp2-2 par rapport aux plaques des
patients diabétiques Hp1-1 ou Hp2-1 [227]. Dans cette étude, Purushothaman et al. montrent
alors que le génotype Hp2-2 des patients diabétiques altère la clairance de l’hémoglobine et
augmente le stress oxydatif ainsi que l’inflammation au niveau de la plaque d’athérosclérose
de ces patients. En outre, des études cliniques ont montré que le génotype d’Hp des patients
diabétiques est un facteur de risques cardiovasculaire. En effet, le génotype Hp2-2 des
patients diabétiques augmente les risques de complications cardiovasculaires comme montré
dans les quelques exemples d’études suivantes : l’étude sur la population indienne américaine
« Strong Heart » [229], l’étude « Munich Stent » [230], l’étude « ICARE » [231] ou encore
l’étude « Epidemiology of Diabetes Complication (EDC) Study of Childhood onset type 1
diabetes » [232, 233].
3.2.2.3 La NETose chez le diabétique et l’HIP.
La formation des NETs est dépendante du glucose, les besoins métaboliques de la NETose
requièrent d’abord du glucose exogène pour la décondensation de la chromatine puis
dépendent du glucose exogène associé à la glycolyse pour la libération des complexes NETs
[234]. Ainsi, chez les patients diabétiques l’hyperglycémie participe à la formation des NETs.
Les travaux de Menegazzo et al. montrent que l’hyperglycémie entraîne la formation des NETs
in vitro et in vivo chez les patients diabétiques. Ils montrent aussi que le taux NETs et d’élastase
circulants libérés par les neutrophiles est corrélé aux taux de glycation de l’hémoglobine des
patients diabétiques de type 2 [235]. De plus, la NETose est associée à l’hyperglycémie,
participe aussi à altérer la réparation de la peau chez les souris diabétiques comme exposé
dans les travaux de Wong et al. [236]. Il y a très peu de données sur la participation des
marqueurs de la NETose (complexes NETs, MMP, MPO ou élastase) à la déstabilisation de la
plaque d’athérosclérose des patients diabétiques. Cependant, comme ces acteurs participent
71
déjà à la déstabilisation de la plaque des patients non diabétiques, on peut supposer qu’ils
interviennent aussi dans les plaques des patients diabétiques de manière plus marquée.
72
73
Objectifs de travail
74
75
Dans la pathologie de l’athérosclérose, l’hémorragie intraplaque représente un facteur
important de complication et de déstabilisation de la plaque d’athérothrombose. Chez le
diabétique de type 2, l’angiogenèse intraplaque est augmentée à l’intérieur des plaques, ce
qui provoque des hémorragies ce qui favorise la rupture de la plaque [214, 237]. En effet, ces
néo vaisseaux immatures, fragiles et perméables apportent des composants sanguins au sein
de la plaque. Ainsi, l’extravasation des globules rouges et des leucocytes, dont les
neutrophiles, représente un des facteurs ayant un rôle déterminant dans la rupture de la
plaque. D’ailleurs, l’activation des neutrophiles représente un facteur important de
vulnérabilité [72]. La libération de protéases, comme l’élastase ou les MMP, va entraîner la
diminution de l’épaisseur de la chape fibreuse qui protège le cœur nécrotico-lipidique. D’autre
part, la libération d’enzymes pro-oxydantes telles que la MPO va perturber d’avantage la
balance redox de la plaque et d’autant plus fragiliser la plaque. Enfin, l’expulsion de l’ADN des
neutrophiles, sous forme de filaments appelés NETs complexés avec ses protéases granulaires
et les histones, va avoir une action bactéricide et surtout une activité pro-coagulante [238].
L’activation des neutrophiles participe donc activement à la déstabilisation de la plaque. De
plus, l’environnement hyper glycémique chez le diabétique de type 2 entraîne la glycation des
protéines aboutissant à la formation d’AGE, qui à leur tour favorisent l’activation des
neutrophiles par un phénomène de pré-activation (priming) [239].
Lors de l’hémorragie intraplaque, l’apport chronique et la stagnation des globules rouges
contribuent à l’expansion de la plaque de diverses façons, grâce notamment à leur membrane
plasmique riche en cholestérol ou encore grâce à la libération de leur contenu (hémoglobine
contenant notamment du fer) qui contribuent au stress oxydant au sein de la plaque [71, 240].
La clairance de ces divers éléments se fait via différents acteurs. En premier lieu, les
macrophages phagocytent les globules rouges lysés ou sénescents via les signaux « eat-me »
présents à leur surface, mais sont aussi capables d’éliminer les complexes hémoglobine-
haptoglobine (Hb-Hp) qu’ils captent via les récepteurs CD163 à leur surface [241]. En second
lieu, d’autres types cellulaires participent aussi à la clairance des globules rouges résident dans
la plaque comme les cellules musculaires lisses [242]. Cependant, le premier type cellulaire
en contact avec les globules rouges au niveau des néo vaisseaux immatures, fragiles et
perméables sont les cellules endothéliales. Ces dernières pourraient aussi
internaliser/phagocyter les globules rouges résident au sein de la plaque participant ainsi à
l’expansion et à la déstabilisation de cette dernière. Il a d’ailleurs été montré que chez les
76
patients diabétiques de type 2, les modifications dues à la glycation et au stress oxydant
rendent l’endothélium prothrombotique et induisent une augmentation de l’adhésion des
plaquettes mais surtout des globules rouges [225].
Le premier objectif de mon travail de thèse était d’identifier les biomarqueurs pouvant être
associés à des plaques d’athérothrombose vulnérables chez les diabétiques. Ainsi, l’évaluation
des concentrations des marqueurs biochimiques acteurs de la déstabilisation de la plaque
d’athérothrombose tels que les marqueurs de l’activation des neutrophiles (via la libération
des protéases granulaires, de l’ADN libre ou sous forme de complexes NETs et d’enzymes pro
oxydantes) et les marqueurs de l’hémorragie intraplaque (via la présence de globules rouges,
d’hémoglobine, des récepteurs solubles des complexes Hb-Hp sCD163) a été réalisée dans le
cadre d’une étude clinique sur l’île de La Réunion en partenariat avec le Centre Hospitalo-
Universitaire (CHU) et la Clinique Sainte Clotilde (groupe Clinifutur).
Le deuxième objectif de cette thèse était d’évaluer dans un contexte mimant un diabète de
type 2, les réactions engendrées par des globules rouges glyqués sur l’endothélium avec lequel
ces cellules sont en contact dans la plaque d’athérosclérose. Pour cela, l’étude de l’impact des
globules rouges diabétiques sur l’endothélium a été réalisée in vitro sur une lignée de cellules
endothéliales humaines, les EA.hy926. En premier lieu, un modèle de glycation des
érythrocytes in vitro a été mis au point puis caractérisé. En second lieu, ces érythrocytes
glyqués ont été mis en contact avec les EA.hy926 afin d’explorer la capacité des cellules
endothéliales à interagir avec les érythrocytes, leurs réactions en termes de réponse
antioxydante et de fonctionnalité.
77
Démarche expérimentale, Résultats et Discussion
78
79
Afin de répondre aux objectifs décrits, nous avons adopté la méthodologie suivante : nous
avons d’abord participé activement au déroulement d’une étude clinique visant à évaluer les
marqueurs de la vulnérabilité de la plaque d’athérothrombose carotidienne chez le diabétique
et nous avons ensuite réalisé une étude in vitro sur l’impact des globules rouges diabétiques
sur l’endothélium.
4 Etude clinique : Marqueurs d’Athérothrombose carotidienne
Chez le Diabétique – MADi
Comme décrit précédemment, la prévalence du diabète de type 2 sur l’île de La Réunion est
supérieure à celle de la France hexagonale et la mortalité engendrée par cette pathologie est
aussi 3,5 fois supérieure [2]. Parmi les complications qui en résultent, les maladies
cardiovasculaires touchent 60% des patients diabétiques de type 2 [3]. Ces maladies se
traduisent par des accidents coronaires ou cérébraux suite au développement de lésions
athérosclérotiques dans les zones privilégiées que sont les artères coronaires, carotides ou
cérébrales. Suite à des études de populations, une augmentation de la prévalence des AVC
chez les diabétiques de type 2 a été montrée. D’ailleurs, sur l’île de La Réunion, les maladies
cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité contrairement à la France
hexagonale où le cancer remporte la première place [5]. Cela peut s’expliquer ici par
l’augmentation des facteurs de risques que sont entre autre l’hypertension artérielle, le
diabète de type 2 ou encore les dyslipidémies, 1 cas sur 4 à La Réunion contre 1 cas sur 10 en
France hexagonale [5].
Les plaques des patients diabétiques se développent plus rapidement que celles des patients
non diabétiques. De plus, le niveau de complications, le taux d’hémorragies intraplaque et de
néo vaisseaux sont accrus chez les diabétiques [214]. L’hémorragie intraplaque conduit à
l’extravasation des composés sanguins dans la plaque et rend cette dernière vulnérable [237].
De surcroît, la présence d’AGE au sein de la plaque participe au stress oxydant qui y règne via
la stimulation d’enzymes capables de produire des espèces réactives de l’oxygène comme la
NADPH oxydase. De plus, l’étude de Rangé et al. a mis en évidence l’existence d’une
corrélation entre l’hémorragie intraplaque, l’activation des neutrophiles et la concentration
80
du LPS bactérien dans les plaques d’endartériectomies carotidienne humaines [243].
D’ailleurs, dans cette étude la bactérie Tannerella forsythia a été identifiée dans les plaques
carotidiennes. Par ailleurs, il a été montré que les parodontites sont associées au risque de
développer des maladies cardiovasculaires chez le diabétique [34]. De ce fait, la présence de
la bactérie Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), l’un des agents infectieux responsable de
parodontites, pourrait participer via le stress qu’elle engendre à entretenir l’activation des
neutrophiles et la libération des enzymes granulaires [72].
En plus de l’activation des neutrophiles provenant de l’hémorragie intraplaque, les
saignements apportent également de nombreux érythrocytes. Ces derniers stagnent dans la
plaque et subissent une lyse ou éryptose (mort cellulaire par apoptose des érythrocytes)
entraînant la libération de leur contenu (cholestérol membranaire, fer, hémoglobine, hème,
…) au cœur de la plaque participant ainsi à sa déstabilisation. Il existe des moyens de clairance
de ces éléments, notamment par les macrophages qui expriment à leur surface des récepteurs
CD163 capables de se lier aux complexes Hb-Hp afin de les éliminer. Ces récepteurs peuvent
d’ailleurs être présents dans la plaque sous forme soluble (sCD163), suite à un clivage
protéolytique notamment par l’élastase [244].
4.1 Objectifs de l’étude
Les divers acteurs cités ci-dessus participent activement à la déstabilisation de la plaque
d’athérosclérose. Ici, nous faisons l’hypothèse qu’il existe des différences entre les plaques
d’athérosclérose des patients diabétiques de type 2 par rapport aux patients non diabétiques.
Le but de l’étude clinique est donc de doser les marqueurs cités précédemment qu’ils soient
circulants ou libérés par les plaques d’athérothrombose des patients issues
d’endartériectomies carotidiennes, puis de comparer les profils de sécrétion entre les plaques
provenant de patients diabétiques versus non diabétiques.
Nous avons recueilli le plasma, le sérum et les pièces d’endartériectomie carotidienne des
patients inclus dans l’étude par les trois centres participants à la recherche, les CHU nord et
sud (centres d’inclusions 01 et 02) de La Réunion et la clinique Sainte Clotilde (centre
d’inclusion 03). Les pièces d’endartériectomies carotidiennes ont été incubées durant 24h
dans du milieu de culture sans sérum, mais contenant des antibiotiques et antifongiques afin
qu’elles puissent libérer les différents marqueurs qu’elles contiennent (Figure 17).
81
Dans un premier temps, nous avons réalisé le dosage de l’ADN libre dans le plasma et de celui
libéré par les plaques des patients incubées. Dans un second temps, nous avons dosé sur ces
mêmes échantillons les éléments suivants :
Les marqueurs de l’activation des neutrophiles : les complexes ADN/MPO (NETs),
les complexes élastase/anti-élastase, la NGAL (protéine chaperonne associée à la
MMP9) et la MPO.
Les marqueurs de l’hémorragie intraplaque : l’hémoglobine libérée par les plaques
et le récepteur soluble sCD163.
Les marqueurs de stress oxydant et de glycation : l’albumine glyquée, les
fructosamines, les protéines carbonylées, les AGE totaux.
la présence de bactéries parodontales comme P. gingivalis en dosant la présence
d’anticorps anti-P. gingivalis
Figure 17 : Schéma général de l’étude clinique. Des échantillons sanguins ainsi que les pièces d’endartériectomies carotidiennes sont prélevés sur les patients participants à l’étude. Les échantillons sanguins permettent l’isolement du plasma et du sérum des patients dans le but d’évaluer les concentrations circulantes des marqueurs cités précédemment. Les pièces d’endartériectomies carotidiennes sont disséquées et la partie responsable de la sténose (CP) est séparée de la partie non responsable de la sténose (NCP). Ces tissus sont ensuite incubés pendant 24h dans du milieu de culture puis les marqueurs cités précédemment sont quantifiés dans ces milieux conditionnés.
82
4.2 Inclusion des patients
Par rapport aux activités des centres d’inclusion, les CHU nord – sud et la clinique Sainte
Clotilde, il était prévu d’inclure un minimum de 100 patients avec une équivalence entre le
nombre de patients diabétiques de type 2 et le nombre de patients non diabétiques sur une
durée de 2 ans.
a) Critères d’inclusion des patients
Les patients qui ont été inclus dans l’étude devaient subir une intervention d’endartériectomie
carotidienne et répondre aux critères suivants :
- être âgés de plus de 18 ans au moment de l’intervention,
- être affilié à un régime de sécurité sociale,
- avoir signé un consentement éclairé,
Le groupe des patients diabétiques a été défini comme suit : soit par la prise de traitements
antidiabétiques oraux ou injectables, soit par le relevé d’une glycémie à jeun > 7 mmol/L ou
d’un taux d’hémoglobine glyquée (HbA1c) ≥ 6,5%. Seuls les patients diabétiques de type 2
définis selon les critères de l’étude ENTRED ont été retenus : soit un diabète non traité par
insuline, soit traité mais diagnostiqué après 45 ans ou diagnostiqué avant 45 ans avec un délai
de mise sous insuline > 2 ans après le début de la maladie.
(http://www.invs.sante.fr/surveillance/diabete/entred_2007_2010/methodologie.htm)
Le groupe des non diabétiques (sujets contrôles) a été défini comme tel : diabète non connu
ou non traité par antidiabétiques et une glycémie à jeun < 7 mmol/L.
b) Critères de non inclusion des patients
Tous les patients présentant les critères suivant ont été exclus de l’étude :
- Grossesse en cours,
- Antécédents de maladie auto-immune,
- Antécédents de maladie inflammatoire chronique,
83
- Antécédents de néoplasie,
- Sujet diabétique de type 1 défini de la manière suivante : sujet de moins de 45 ans
traité d’emblée par insuline ou si sujet de plus de 45 ans avec un délai de mise sous
insuline < 2 ans.
4.3 Déroulé de la recherche
La recherche s’est déroulée en plusieurs temps. La première étape concerne et implique le
patient directement. Je suis intervenue lors des étapes de recueil des échantillons biologiques
(sang, plasma, sérum et pièce chirurgicale), de recueil des données biologiques afin de remplir
les cahiers de données des patients de l’étude et j’ai réalisé les dosages des marqueurs
énumérés précédemment.
• Le parcours des patients inclus dans l’étude.
Tous les patients ayant une indication pour une endartériectomie carotidienne par voie
chirurgicale ont suivi le parcours suivant :
- Une visite de pré-inclusion au cours de laquelle les médecins investigateurs les ont
informés de l’étude clinique. Les risques potentiels ainsi que les attentes suite à leur
participation leur ont été expliqués. Les médecins étaient à disposition des patients
pour répondre à leurs interrogations au cours de cette visite. Un consentement éclairé
a été remis aux patients lors de cette visite. Les patients ayant consentis à faire partie
de l’étude ont remis leur consentement éclairé signé aux médecins. L’intervention a
ensuite été planifiée.
- La visite d’inclusion précède le jour de l’intervention, le patient a été admis au centre
hospitalier. Des prélèvements sanguins ont été effectués par les infirmiers, une partie
de ces prélèvements ont servi pour les dosages biologiques de routine (numération
formule sanguine, dosage de la CRP ultra-sensible, de l’hémoglobine glyquée, de la
glycémie et un bilan lipidique) et l’autre partie de ces prélèvements a été acheminée
au laboratoire DéTROI.
84
- Le jour de l’intervention chirurgicale, la plaque d’athérothrombose du patient a été
prélevée par les chirurgiens et a été placée dans du milieu de culture RPMI sans rouge
de phénol contenant des antibiotiques et un antimycotique (pénicilline, streptomycine
et amphotéricine B). Cet échantillon a alors été envoyé au laboratoire DéTROI.
• Le recueil des échantillons biologiques.
Après que les infirmiers et les chirurgiens du centre d’investigation n°03 aient recueillis les
échantillons biologiques auprès des patients, ces derniers ont été envoyés au laboratoire
DéTROI où j’ai procédé à leurs traitements avec le Dr Olivier Meilhac, responsable scientifique
de l’étude. Les échantillons biologiques recueillis par les infirmiers et médecins du centre
d’investigation n°02 ont quant à eux été traités par Nathalie Ah-You du CRB (Centre de
Ressources Biologiques), partenaire de l’étude MADI. Ces échantillons ont permis la mise en
place d’une collection de plasma, sérum et d’échantillons d’endartériectomies carotidiennes.
Les échantillons de sang des patients ont été recueillis soit dans des tubes avec anticoagulant
(tubes EDTA et tubes citrate pour obtenir le plasma), soit dans des tubes avec activateur de
coagulation (afin d’obtenir le sérum). Au total 26,7 mL de sang est prélevé à chaque patient
de l’étude en plus des dosages de routines des centres hospitaliers.
Dans un premier temps, les échantillons sanguins ont été centrifugés à 2000 g à température
ambiante pendant 10 min. Ensuite le plasma et le sérum ont été prélevés sans perturber le
buffy coat (couche de cellules nucléées présentes dans l’interphase entre le plasma et les
globules rouges) des tubes EDTA puis ces échantillons ont été centrifugés une seconde fois, à
2500 g à température ambiante pendant 15 min. A l’issue de cette seconde centrifugation, les
échantillons de plasma et de sérum ont été distribués dans 5 tubes. Les échantillons de buffy
coat permettant des analyses génétiques a posteriori ont été répartis dans 2 tubes. Les
échantillons ainsi traités ont été stockés à - 80°C.
Les pièces de chirurgie prélevées, conservées à 4°C dans du milieu de culture ont été
disséquées sous hotte en conditions stériles. Ainsi la partie coupable (CP - partie sténosante)
a été séparée de la partie adjacente non coupable (NP - partie non sténosante) de
l’échantillon. La description macroscopique de ces éléments a permis de « scorer » les
éléments suivants : le niveau de calcification, de lipides, de chape fibreuse et d’hémorragie.
Une partie de la CP et de la NP a été fixée dans du paraformaldéhyde à 4% pour des études
85
histologiques. Ensuite, la CP et la NP ont été incubées pendant 24h à 37°C dans du milieu de
culture RPMI sans rouge de phénol contenant des antibiotiques et un antifongique selon un
rapport poids humide/volume de 6 (soit 1 g de tissus pour 6 mL de milieu). Après 24h
d’incubation, les échantillons ont été centrifugés à 3000 g à température ambiante pendant
10 min afin de récupérer les milieux conditionnés exempts de débris tissulaires. Les
échantillons de milieux conditionnés distribués en 5 tubes ainsi que les tissus sont ensuite
stockés à - 80°C.
Tous les échantillons ont été stockés en attendant que le nombre convenu de patients inclus
soit atteint, c’est-à-dire le recueil d’échantillons de 50 patients diabétiques et de 50 patients
non diabétiques. Le centre d’inclusion du CHU Sud (02) a inclus 20 patients et celui de la
clinique Sainte Clotilde (03) a inclus 89 patients. En revanche le centre du CHU Nord (01) n’a
inclus aucun patient. Un total de 109 patients a été inclus dans l’étude MADI avec 58 patients
diabétiques contre 51 patients non diabétiques.
• Le recueil des données biologiques et le remplissage des cahiers de données des
patients.
Au fur et à mesure de l’inclusion des patients dans l’étude MADI, un cahier d’observations
cliniques papier (CRF – case report form) est rempli pour chacun d’entre eux. Ce cahier
recense les données cliniques et biologiques nécessaires aux analyses statistiques pertinentes.
Je me suis occupée du remplissage des CRF des patients inclus par le centre n°03 (clinique
Sainte Clotilde) et Julie Ruiz, Attachée de Recherches Cliniques (ARC) a rempli les cahiers des
patients du centre n°02 (CHU Sud). Avec l’accord des médecins investigateurs du centre 03,
les secrétaires ont mis à ma disposition les dossiers médicaux des patients de l’étude. Ainsi
après avoir vérifié qu’un consentement éclairé avait été signé par les patients inclus, j’ai
rempli le CRF de ces derniers en plusieurs vagues au fil de leur entrée dans l’étude. Au cours
de l’étude, l’ARC moniteur (responsable du bon déroulement de l’étude, d’une bonne
communication entre le centre promoteur et les centres investigateur) a effectué plusieurs
visite « Contrôle Qualité ». Lors de ces visites, je me suis tenue à sa disposition afin qu’il puisse
vérifier le remplissage des CRF des patients ainsi que celui du classeur de l’étude des médecins
investigateurs du centre n°03. Ce classeur contient entre autre une version papier de l’étude
clinique, les documents justifiants de l’exercice de chaque acteur du centre n°03, la liste des
86
patients inclus ainsi que leurs numéros d’inclusion, une copie des consentements éclairés des
patients inclus signés et aussi les documents nécessaires pour la déclaration d’évènements
indésirables survenus pendant la prise en charge des patients. Une fois que tous les CRF ont
été remplis correctement, ils ont été confiés au Centre de Méthodologie et de Gestion des
Données. Les données des CRF ont alors été saisies sur un support informatique dans le logiciel
Clinsight®. Les data managers sont les acteurs responsables de la saisie des données, de la
mise en forme de tableau de données cliniques et biologiques obtenues, ils s’assurent aussi
de la cohérence des données, de leur fiabilité et de l’obtention d’une base de données
exempte de toute incohérence avant transmission aux statisticiens. Ils ont dans notre cas
établi sur le logiciel une trame de saisie des données qui consigne toutes les incohérences
retrouvées. Par exemple nous notons la présence de dyslipidémies déclarée par le médecin,
les valeurs des taux de triglycérides, HDL cholestérol, LDL cholestérol et LDL totaux ainsi que
la prise ou non de statines par les patients dans les CRF. Les patients qui sont sous statines à
cause d’une dyslipidémie peuvent avoir des taux de triglycérides, HDL cholestérol, LDL
cholestérol et LDL totaux compris dans la norme. Cependant à cause de l’incohérence
observée entre le taux de lipides et la déclaration de dyslipidémies, le logiciel enverra une
notification d’erreur au data manager sous forme de « queries ». Pour chaque patient pour
lequel des erreurs surviennent, le logiciel a émis une fiche contenant toutes les « queries »
retrouvées. Ensuite les fiches « queries » du centre n°03 m’ont été remises afin de vérifier les
données renseignées dans les CRF des patients pour lesquels c’était nécessaire. Après la
correction des « queries » du centre n°03, les documents ont été transmis de nouveau au
Centre de Méthodologie et de Gestion des Données. Lorsqu’aucune nouvelle incohérence n’a
été relevée, la base de données est prête.
• Le dosage des marqueurs d’intérêts.
Une fois tous les patients de l’étude inclus, c’est à dire 109 patients tous centres confondus
(58 diabétiques et 51 non diabétiques), les dosages des marqueurs cibles ont été effectués.
Afin d’éviter les cycles successifs de congélation – décongélation, qui peuvent altérer
l’intégrité des échantillons, un plan de distribution des échantillons de plasma et des milieux
conditionnés dans des plaques de 96 puits a été mis en place (Figures 18 à 20). Ce plan a
permis de répartir les échantillons directement dans les tampons adéquats dans les plaques
87
définitives pour le dosage des marqueurs cibles. Le plan de répartition pour les plasmas et
pour les milieux conditionnés est détaillé sur les figures suivantes.
4.4 Réalisation des dosages des biomarqueurs cibles de l’étude
Figure 18 : Plan de distribution des échantillons de plasma de l’étude MADI.
88
Figure 19 : Plan de distribution des échantillons de milieux conditionnés des CP de l’étude MADI.
Figure 20 : Plan de distribution des échantillons de milieux conditionnés des NPs de l’étude MADI.
89
Mesures des marqueurs par les kits ELISA commerciaux.
Les dosages ELISA sur les échantillons de plasma et de milieux conditionnés ont été réalisés
suivant les recommandations des fabricants :
- ELISA sCD163 (Thermoscientific/eBioscience)-courbe étalon allant de 20 à 0,3125
ng/mL
- ELISA Albumine glyquée (Sunred Biological Technology)-courbe étalon allant de 40 à
0,625 mg/mL
- ELISA AGE (Sunred Biological Technology)-courbe étalon allant de 9600 à 150 ng/mL
- ELISA MPO (Hycult)-courbe étalon allant de 100 à 1,5625 ng/mL
- ELISA NGAL (Hycult)-courbe étalon allant de 100 à 1,5625 ng/mL
- ELISA Elastase/anti-élastase (Abcam)-courbe étalon allant de 10 à 0,15625 ng/mL
Les échantillons dilués ont été incubés, directement ou après une étape de blocage des sites
non spécifiques, pendant 1h à 2h30 à température ambiante en fonction des dosages dans les
puits contenant les anticorps de capture. Après 4 lavages des puits avec la solution de lavage
des kits, les échantillons sont incubés avec l’anticorps de détection couplé à la biotine pendant
1h à température ambiante. Après une deuxième étape de lavage, les échantillons sont
incubés pendant 45min à 1h à température ambiante avec le complexe avidine-peroxydase.
Une dernière étape de lavage est suivie de l’étape de révélation par une incubation avec du
substrat TMB (3,3’,5 ,5’-tétraméthylbenzidine) à température ambiante puis la coloration des
échantillons est stoppée par ajout d’une solution stop (HCl 2N). L’absorbance obtenue est lue
à 450 nm et la concentration est calculée à partir d’une courbe étalon dont l’amplitude varie
en fonction du dosage effectué.
Mesure des protéines carbonylées.
L’ELISA carbonyles (OxiSelect ™ Protein Carbonyl ELISA Kit – Cell Bioloabs, INC) sur les plasmass
et milieux conditionnés permet de déterminer le degré de carbonylation des protéines après
leur réaction avec les ROS. Le dosage repose sur la reconnaissance de la 2,4-
dinitrophenylhydrazine (DNPH) fixée sur les sites carbonylés des protéines par un anticorps
anti-DNPH. Les échantillons et la protéine étalon (albumine sérique bovine carbonylée) sont
incubés sur la nuit à 4°C dans les puits des plaques de dosage. Ensuite, les échantillons et
l’étalon sont incubés avec de la DNPH à 1 mg/mL dans un tampon carbonate à 0,1M pH 10,35
pendant 45 min à température ambiante et à l’obscurité. Les plaques d’échantillons sont
90
ensuite lavées 5 fois avec du PBS/Ethanol (1 :1, v/v) et 2 fois avec du tampon PBS. Les
échantillons sont ensuite mis en contact avec l’anticorps primaire anti-DNPH (dilution 1 :1000)
pendant 1h à température ambiante puis les plaques sont de nouveau lavées 3 fois au
PBS/Tween 0,05%. Les échantillons sont ensuite mis en contact avec un anticorps secondaire
couplé à la peroxydase (dilution 1 :1000) pendant 1h à température ambiante. Après une
dernière étape de lavage, la révélation au TMB est effectuée suivie de l’ajout d’HCL 2N pour
stopper la réaction. L’absorbance obtenue à 450 nm permet le calcul des concentrations à
partir de la courbe étalon dont la concentration en protéines carbonylées est comprise entre
7,5 et 0,375 nmol/mg.
Mesure de l’ADN libre.
Lors de l’activation des neutrophiles, ces derniers libèrent leur ADN doubles brins sous forme
de filet complexés ou non aux protéines granulaires. L’ADN libre dans les plasmas et les milieux
conditionnés a été dosé en utilisant le kit Quant-it™ Picogreen dsDNA Assay
(Thermoscientific/Invitrogen). Ce kit permet de quantifier de faibles concentrations d’ADN
double brin (25 pg/mL) présents en solution par mesure de fluorescence. Les échantillons et
l’étalon, de l’ADN double brins à une concentration connue, sont préparés dans un tampon
Tris-HCL 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5 puis incubés dans une plaque noire à température
ambiante à l’obscurité pendant 5 min sous agitation douce (250 rpm). Après que la sonde se
soit intercalée dans le double brin d’ADN, la fluorescence générée est mesurée à 520 nm après
excitation à 485 nm. La concentration en ADN double brin est calculée à partir de la courbe
étalon allant de 2 à 0,03125 µg/mL.
Mesure des complexes NETs.
Lors de l’activation des neutrophiles, ces derniers forment des complexes NETs composés
d’ADN doubles brins associés aux protéines granulaires comme l’élastase ou la MPO et aux
histones. N’ayant pas de kit permettant de détecter ces complexes directement, nous avons
effectué leur quantification dans nos échantillons en utilisant deux kits ELISA. En premier lieu
nous avons utilisé les kits ELISA MPO (Hycult – kit 1) dans le but de retenir uniquement la MPO
des échantillons et en second lieu nous avons dosé l’ADN associée à la MPO retenue dans la
plaque de dosage avec le kit Cell death detection ELISA (Roche – kit 2, Figure 21). Les
échantillons ont donc été incubés d’abord dans la plaque ELISA du kit 1 pendant 1h à
91
température ambiante. Après une première étape de lavage, les échantillons ont été incubés
avec l’anticorps anti-ADN couplé à la peroxydase du kit 2 pendant 2h à température ambiante.
Une dernière étape de lavage est suivie d’une révélation après incubation avec la solution
substrat pendant 20 min à température ambiante sous agitation douce (250 rpm).
L’absorbance obtenue est lue à 405 nm et les valeurs obtenues sont normalisée par
soustraction des valeurs du blanc.
Figure 21 : ELISA MPO/ADN – mesure des complexes NETs. Mesure de l’immunisation contre la bactérie P. gingivalis.
La présence de bactéries parodontales P. gingivalis dans les plasmas et milieux conditionnés
a été évaluée par dosage ELISA mis au point au laboratoire. Pour ce faire nous avons recherché
la présence éventuelle d’anticorps anti-P. gingivalis dans les échantillons des patients. Dans
un premier temps, les bactéries P. gingivalis ont été mises en culture dans un milieu de culture
M20 en anaérobie (GENbag anaer, Biomerieux) contenant les éléments suivants : 3% w/v
tryptone, 2% yeast extract, 0,05% w/v cysteine hydrochloride, 0,5% w/v glucose, 2,5% v/v
hemin solution (0,1% w/v hemine chloride, 4% v/v triethanolamine), à 37°C. Après
récupération des bactéries par centrifugation (3 fois à 5500 g pendant 15 min), le culot
bactérien a été fixé dans une solution de formaldéhyde à 0,5% sur la nuit à 4°C. Après un
lavage permettant d’éliminer le formaldéhyde, la solution bactérienne reprise dans du PBS à
une densité optique de 0,15 à 580 nm est déposée dans les puits des plaques Maxisorp (100
µL/puits) sous agitation sur la nuit à 4°C. Après élimination de la suspension bactérienne suivie
d’un lavage avec du PBS et d’une étape de saturation des sites non spécifiques avec une
solution de blocage (PBS/ Tween 20 0,1%/BSA 5%) pendant 2h à température ambiante, les
échantillons de plasma et milieux conditionnés sont ajoutés dans les plaques pré-coatées pour
une incubation pendant 1h à température ambiante. Après une étape de 3 lavages au PBS 1X/
92
Tween 20 0,1%, une incubation avec un anticorps de chèvre anti-humain couplé à la
peroxydase (dilution 1 :20 000) est réalisée pendant 1h à température ambiante. Après une
dernière étape de lavages, la révélation a été effectuée par ajout de TMB (100 µL/puits) dont
la coloration a été stoppée par ajout de HCl 1 M (100 µL/puits). L’absorbance obtenue a été
mesurée à 450 nm et les résultats ont été exprimés en unités arbitraires.
Mesure des AOPP.
Le dosage AOPP permet de quantifier les produits avancé d’oxydation des protéines. Une
gamme de chloramine T et les échantillons (100 µL) sont déposés dans les puits d’une plaque
de microtitration puis 10 µL d’acide acétique (≥99%, Sigma) sont ajoutés à chaque puits.
L’absorbance obtenue est mesurée à 340 nm et la concentration en AOPP des échantillons de
plasma et milieux conditionnés est évaluée en équivalent chloramine T par rapport à la courbe
étalon allant de 200 à 3,125 µM.
Mesure de la fluorescence des AGE.
Les produits avancés de glycation sont caractérisés par une coloration brune et un spectre de
fluorescence qui leur est spécifique. Leur quantification dans les plasmas et les milieux
conditionnés s’est faite par mesure d’émission de fluorescence à 460 nm après excitation à
355 nm. Leur estimation est rapportée en unité arbitraire par rapport à un étalon d’AGE
connu.
Mesure des fructosamines.
Les fructosamines sont des produits précoces de glycation mesurés dans les échantillons de
plasma et de milieux conditionnés grâce à la méthode établie par Johnson [245]. Les
échantillons ainsi que du DMF (1-deoxy-1-morpholinofrucutose) qui sert d’étalon sont incubés
dans un tampon carbonate 0,1M pH 10,35 en présence de NBT (Nitroblue Tetrazolium) à 37°C
pendant 30 min. Ensuite l’absorbance obtenue est mesurée à 540 nm et la concentration en
fructosamines des échantillons est estimée par rapport à la gamme de DMF allant de 0 à 70
nmol.
93
Mesure de l’hémoglobine.
Afin d’avoir une indication sur l’hémorragie intraplaque, l’hémoglobine libérée par les CP des
plaques des patients dans le milieu de culture a été dosée. Les échantillons de milieux
conditionnés des CP et de l’hémoglobine bovine commerciale ont été mis en contact avec de
l’acide formique (49-51%, Fluka). L’absorbance obtenue a été lue à 420 nm et la concentration
d’hémoglobine des échantillons ont été calculée par rapport à la courbe étalon d’hémoglobine
bovine allant de 10,4 à 0,1625 mg/mL.
Les résultats de tous les dosages effectués sont répertoriés dans un tableau Excel destiné aux
data managers et aux statisticiens pour l’analyse des données de l’étude clinique.
4.5 Résultats et discussion
Tableau 1 : Descriptif de la population avec les comparaisons statistiques entre les groupes des patients diabétiques (DT2) et des patients non diabétiques (NDT2). Les différentes variables ont été comparées par des tests du Χ² Chi-deux (ou Fisher ou Wilcoxon).
94
Variable étudiée Tous les patients n = 109
Patients diabétiques n = 58
Patients non diabétiques n = 51
Valeur de p (D vs ND)
Données démographiques Age (années) 68,52
(±9,12) 67,51 (±10,95) 0,7451
60-69 ans n, (%) 21 (19,27)
9 (8,26) 0,0294 70-75 ans n, (%) 18
(16,51) 12 (11,01)
Hommes n, (%) 77 (70,64)
38 (34,86)
39 (35,78) 0,212 Femmes n, (%) 32
(29,36) 20 (18,35)
12 (11,01)
Indication à la chirurgie carotidienne Symptomatique n, (%) 28
(25,69) 16 (14,68)
12 (11,01) 0,6286 Asymptomatique n, (%) 81
(74,31) 42 (38,53)
39 (35,78)
Facteur de risque Hypertension artérielle n, (%) 96
(88,07) 55 (50,46)
41 (37,61) 0,0351
Dyslipidémie n, (%) 87 (80,56)
50 (46,30)
37 (34,26) 0,11
Traitements médicamenteux Statines n, (%) 88
(81,48) 47 (43,52)
41 (37,96) 0,7828
IEC n, (%) 67 (61,47)
44 (40,37)
23 (21,10) 0,001
Beta bloquant n, (%) 38 (34,86)
23 (21,10)
15 (13,76) 0,2628
Examen clinique Taille cm 161,79
(± 8,01) 165,33 (± 8,86) 0,0159
IMC kg/cm² 25,29 (± 4,36)
23,15 (± 3,50) 0,0036
Examen biologique Micro albuminurie mg/L 110,48
(± 152,41) 15,46 (± 16,06) 0,017
Créatinurie mmol/L 9,13 (± 7,17)
11,72 (± 7,14) 0,0284
Hémoglobine g/dL 13,10 (± 1,84)
14,26 (± 1,68) 0,0015
Hémoglobine glyquée HbA1c %
7,28 (± 1,07)
5,95 (± 0,41) <0,0001
Glycémie g/L 1,97 (± 1,23)
0,96 (± 0,12) 0,0004
Cholestérol total g/L 1,55 (± 0,39)
1,77 (± 0,38) 0,0068
LDL cholestérol g/L 0,82 (± 0,30)
1,01 (± 0,32) 0,0131
HDL cholestérol g/L 0,41 (± 0,13)
0,49 (± 0,14) 0,0019
Triglycérides g/L 1,64 (± 0,97)
1,15 (± 0,77) 0,2048
Biomarqueurs dans le plasma ADN libre 0,69
(± 0,13) 0,77 (± 0,12) 0,0023
sCD163 1143,20 (± 586,25)
854,14 (± 451,63) 0,0091
Fluorescence AGE 4,76 (± 2,89)
3,78 (± 2,22) 0,0077
Fructosamines 45,70 (± 9,13)
36,83 (± 6,24) <0,0001
Apolipoprotéine M 1,79 (± 0,43)
1,97 (± 0,48) 0,0276
Biomarqueurs dans les milieux liquides conditionnés ADN libre 5,362
(± 0,55) 3,828 (± 0,50) 0,0443
95
Description des données générales des patients de l’étude : données démographiques,
indication à la chirurgie carotidienne, facteurs de risques et traitements médicamenteux.
Notre étude comporte 109 participants parmi lesquels il y a 58 patients diabétiques de type 2
(DT2) et 51 patients non diabétiques (NDT2). La répartition des genres montre que
l’échantillon est constitué de plus d’hommes (70,64%) que de femmes (29,36%). De plus pour
chaque genre, la proportion de patients diabétiques de type 2 est plus importante que celle
des patients non diabétiques. L’âge moyen des participants DT2 est de 68,5 ans et celui des
NDT2 est de 67,5S ans. Des groupes de différentes catégories d’âges ont été créés et les
patients DT2 sont plus âgés que les patients NDT2 pour les tranches d’âges 60-69 ans et 70-
75 ans (p=0,0294).
Bien que tous les patients aient reçu une indication de chirurgie carotidienne, la majorité
d’entre eux étaient asymptomatiques quel que soit le groupe considéré, cela signifie que les
patients n’ont pas fait d’AVC ou d’accident ischémique transitoire (AIT) avant d’avoir été
opérés. De plus, parmi les patients de l’étude, 96 d’entre eux étaient sujet à l’hypertension
artérielle (HTA) et la proportion des patients DT2 hypertendus s’avère supérieure à celle des
patients NDT2 (p=0,0351). D’ailleurs, la proportion de patients DT2 prenant des IEC
(traitement antihypertenseur à base d’inhibiteurs de l’enzyme de conversion de
l’angiotensine) est supérieure à celle des patients NDT2 (p=0,001). En revanche, bien qu’il y
ait plus de patients DT2 qui prennent des béta bloquants (médicaments antihypertenseurs)
que de NDT2, la différence observée n’est pas significative (p=0,2628). Enfin, le nombre de
patients ayant des dyslipidémies (taux de LDL cholestérol élevé, une hypertriglycéridémie, LDL
cholestérol et triglycérides élevés ou faible taux de HDL cholestérol) est plus important chez
les DT2 par rapport aux NDT2. De ce fait les patients DT2 placés sous statines (médicaments
hypolipémiants) sont plus nombreux que les patients NDT2 bien que ces différences ne soient
pas significatives.
Pour terminer la description des données générales des patients, on constate que les patients
NDT2 sont de plus grande taille que les patients DT2 (165,33 cm ± 8,86 NDT2 vs 161,79 cm ±
8,01, p=0,0159) et un indice de masse corporelle (IMC) plus élevé pour les patients DT2 par
rapport à celui des patients NDT2 (25,29 kg/m² ± 4,36 DT2 vs 23,15 kg/m² ± 3,50 NDT2,
p=0,0036).
96
Description des données cliniques de l’étude : examen clinique et biologique.
La fonction urinaire des patients de l’étude a été évaluée (micro albuminurie et la créatinurie).
Ces marqueurs permettent d’évaluer la fonction rénale des patients. De plus, la présence de
protéines dans les urines des patients est un marqueur pronostique de risques
cardiovasculaires. On constate d’une part que la micro albuminurie des patients DT2 est
supérieure à celle des patients NDT2 (110 mg/L ± 152,41 DT2 vs 15,46 mg/L ± 16,06 NDT2,
p=0,017). En revanche, la créatinurie des patients DT2 est plus faible que celle des patients
NDT2 (9,13 mmol/L ± 7,17 DT2 vs 11,72 mmol/L ± 7,14 NDT2, p=0,0284).
Ensuite, on remarque que le taux d’hémoglobine des patients DT2 est plus faible que celui des
patients NDT2 (13,10 g/dL ± 1,84 DT2 vs 14,26 g/dL ± 1,68 NDT2, p=0,0015). Comme attendu,
lorsque l’on observe le taux d’hémoglobine glyquée (HbA1c), marqueur qui permet le suivi de
la glycémie des patients sur plusieurs mois, on note que le pourcentage d’HbA1c des patients
DT2 est supérieur à celui des patients NDT2 (7,28 % ± 1,07 DT2 vs 5,95 % ± 0,41 NDT2,
p<0,0001). De plus, la glycémie des patients DT2 est supérieure à celle des patients NDT2 (1,97
g/L ± 1,23 DT2 vs 0,96 g/L ± 0,12 NDT2, p=0,0004).
Le suivi des lipides chez les patients est assuré dans le but de vérifier la présence ou non de
dyslipidémies. Globalement, les taux de cholestérol total, LDL cholestérol, HDL cholestérol des
patients DT2 sont plus faibles que ceux des patients NDT2. En revanche, les taux de
triglycérides des patients DT2 sont supérieurs à ceux des patients NDT2. En regardant ces
résultats, il faut cependant garder à l’esprit que certains de ces patients sont sous statines
dans le but de contrôler leur dyslipidémie.
Description des résultats des dosages des biomarqueurs plasmatiques et diffusants de la de la plaque d’athérothrombose.
Les marqueurs plasmatiques de la glycation sont la mesure de la fluorescence des AGE et le
taux de fructosamines circulants. On constate que les valeurs de ces marqueurs sont plus
élevées chez les patients DT2 par rapport aux patients NDT2. On remarque aussi que le taux
de CD163 soluble est plus élevé chez les patients DT2 par rapport aux patients NDT2. Enfin, la
mesure d’ADN libre, dans le plasma est différente de celle issu des milieux conditionnés des
plaques des patients. Ainsi, on constate que l’ADN libre plasmatique des patients DT2 est
inférieur à celle des patients NDT2. En revanche, l’ADN libre diffusant des plaques des patients
DT2 est plus important que celui des patients NDT2.
97
Les résultats que nous avons présentés sont des résultats d’analyses statistiques préliminaires
après une simple comparaison des deux groupes de patients. Parmi les biomarqueurs que
nous avons dosés dans les plasmas et les milieux conditionnés, seulement quelques-uns
montrent une différence de concentration entre nos deux populations. Afin de mettre en
évidence d’éventuelles différences entre nos deux groupes, il faudrait discriminer les groupes
plus finement en tenant compte de différents facteurs tels que le genre du patient, la prise de
médicaments ou encore catégoriser la sévérité du diabète en fonction du taux d’HbA1c. Il faut
aussi considérer que tous les patients sont opérés car ils ont une sténose carotidienne et sont
tous atteints d’athérosclérose, ce qui peut aplanir les différences entre diabétiques et non
diabétiques. De plus, certains diabétiques sont bien équilibrés grâce au traitement qu’ils
suivent.
98
99
5 Etude in vitro : Impact de la glycation des érythrocytes sur
l’endothélium de la plaque
Il a été montré que la densité de néo vaisseaux est augmentée dans les plaques
d’athérothrombose des patients atteints de diabète de type 2 [212]. Ces néo vaisseaux
fragiles et perméables sont souvent à l’origine d’hémorragies amenant des globules rouges
ainsi que d’autres éléments du sang à l’intérieur de la plaque, participant ainsi activement à
sa déstabilisation et son expansion [81, 94]. De plus, l’adhérence des globules rouges pour
l’endothélium de ces patients est plus forte que celle des globules rouges de sujets sains [22].
Nous avons donc souhaité caractériser la capacité des cellules endothéliales à participer à la
clairance des globules rouges en situation de diabète de type 2. Pour cela, nous avons d’une
part voulu reproduire la glycation des globules rouges qui est un processus se déroulant de
manière physiologique chez les patients diabétiques de type 2. Nous avons donc mis au point
un modèle de glycation des globules rouges que nous avons ensuite caractérisé. D’autre part,
nous avons exposé une lignée de cellules endothéliales humaines, les EA.hy926, à ces
érythrocytes glyqués in vitro afin d’étudier l’interaction entre ces différents éléments et les
effets qu’ils induisent sur l’endothélium. Dans un premier temps, nous avons étudié la
capacité des cellules endothéliales à capter et à phagocyter les érythrocytes. Dans un
deuxième temps nous avons exploré l’effet de ces globules rouges glyqués sur la
fonctionnalité de l’endothélium en termes de capacité de réparation, à externaliser des
molécules d’adhésion suite à un stress et à maintenir ou non sa fonction de barrière. Dans un
troisième temps nous avons analysé la production de ROS et les systèmes de défenses
antioxydantes cellulaires sollicitées par l’endothélium suite au stress induit par les
érythrocytes glyqués.
100
5.1 Caractérisation du modèle de glycation des globules rouges et de la
phagocytose des globules rouges par les cellules endothéliales humaines.
Dans cette première partie, nous avons mis au point, caractérisé la glycation in vitro de
globules rouges issus de sujet sains et mis en contact ces globules rouges glyqués avec des
cellules endothéliales pendant 24h. Les résultats obtenus dans cette étude sont exposés dans
l’article qui suit dont voici les principaux résultats.
5.1.1 Principaux résultats
Nous avons d’abord incubé des globules rouges de sujets sains avec différentes concentrations
de glucose allant de 5 mM (1 g/L) à 130 mM (26 g/L) pendant 5 jours à 37°C. Nous avons
quantifié la glycation des érythrocytes (Figure 22 A et B) en mesurant le taux d’hémoglobine
glyquée HbA1c et celui de 5-hydroxyméthylfurfural (5-HMF) qui est un marqueur de la
dégradation du glucose au cours de la réaction de Maillard [246]. Dans le contexte de
l’athérothrombose et à la suite d’hémorragies intraplaque successives les globules rouges
résidant de manière prolongée dans la plaque, deviennent sénescents et pourraient participer
à son extension [81]. Nous avons aussi évalué le pourcentage de globules rouges externalisant
leur phosphatidylsérines (PS) marqueurs de sénescence des globules rouges (Figure 22 C).
Tous les globules rouges qui ont été incubés pendant 5 jours à 37°C sont considérés comme
vieillis ; afin de faciliter la rédaction et la lecture, nous simplifierons « globules rouges vieillis
et glyqués » par « globules rouges glyqués », étant donné que la glycation nécessite une
incubation pendant 5 jours (pas de globules rouges non vieillis). Le modèle que nous avons
mis au point induit une externalisation des PS à la surface des globules rouges, ainsi qu’une
glycation croissante avec les fortes concentrations en glucose.
101
Figure 22 : Caractérisation des érythrocytes glyqués in vitro avec des concentrations croissantes en glucose. A) Quantification de l’hémoglobine glyquée HbA1c en %. *, p<0,05 comparé aux globules rouges glyqués avec 5 mM de glucose. B) Evaluation de la production de 5-HMF. ***, p<0,001 comparé aux globules rouges glyqués avec 5 mM de glucose. C) Mesure de l’externalisation des phosphatidylsérines à la surface des globules rouges par cytométrie en flux. ***, p<0,0001 comparé aux globules rouges frais. °, p<0,05 et °°, p<0,01 comparé aux globules rouges âgés. Suite à la caractérisation du modèle, les érythrocytes glyqués ont été incubés pendant 24h
avec une lignée de cellules endothéliales humaine, les EA.hy926. Nous avons ensuite étudié la
capacité des cellules endothéliales à phagocyter les érythrocytes par un dosage
colorimétrique et en utilisant les techniques d’immunofluorescence (Figure 23).
Figure 23 : Liaison et phagocytose des érythrocytes par les cellules endothéliales. A) Immuno-marquage des cellules endothéliales en rouge (α tubuline) et des globules rouges en vert (glycophorine A). Photos de droite en microscopie confocale vs épifluorescence à gauche et au centre. B) Quantification indirecte de la liaison et de l’internalisation des globules rouges par les cellules endothéliales. *, p<0,05 ; **, p<0,01 ; ***, p<0,001 et ****, p<0,0001 comparé aux globules rouges frais. °, p<0,05 ; °°, p<0,01 et °°°°, p<0,0001 comparé aux globules rouges âgés.
102
On remarque que plus les érythrocytes sont glyqués plus ils se lient aux cellules endothéliales
et de la même manière plus la glycation des érythrocytes est forte et plus ces derniers sont
internalisés par les cellules endothéliales.
Nous avons également évalué la capacité de réparation de l’endothélium après une lésion
(Figure 24). Ici on remarque une capacité amoindrie des cellules endothéliales à migrer et à
proliférer au niveau de la lésion lorsqu’elles ont été au préalable en contact avec les globules
rouges glyqués.
Figure 24 : La glycation des érythrocytes altère la capacité de réparation de l’endothélium après une lésion. A) Test de réparation suite aux lésions induites (« Wound Healing assay »). Photos représentatives de l’aire lésée des tapis cellulaires au moment de la lésion (T0) et 10h après la lésion (T10h). B) Quantification de l’aire lésée par Image J. *, p<0,05 comparé aux globules rouges frais.
L’ensemble des résultats de cette étude fait l’objet d’un article en cours de rédaction pour une
publication dans le journal Haematologica (Journal of the European Hematology Association),
inclus ci-après.
103
Pour la suite des expérimentations réalisées, nous avons décidé de n’utiliser que les globules
rouges glyqués avec 130 mM de glucose. Cette condition de glycation correspond en moyenne
à celle observée pour les globules rouges des patients diabétiques sur lesquels nous avons pu
travailler dans l’article. Les premiers résultats obtenus sur la capacité de réparation de
l’endothélium suggérant une altération des fonctions endothéliales, nous avons dans un
premier temps souhaité vérifier ces modulations de la fonctionnalité de l’endothélium à
travers l’évaluation de certains paramètres. Dans un second temps, nous nous sommes
intéressés au stress oxydant résultant de la mise en contact des globules rouges avec les
cellules endothéliales. Les résultats préliminaires obtenus sont présentés dans les parties
suivantes.
104
5.2 Conséquences de la phagocytose des érythrocytes sur la fonctionnalité de
l’endothélium.
Les résultats de la première partie suggérant une altération de la fonctionnalité de
l’endothélium après un contact prolongé avec les globules rouges, nous avons étudié
l’activation et la perméabilité de l’endothélium.
5.2.1 Activation de l’endothélium
Lorsque l’endothélium est activé à cause de stimuli physiques, de stress oxydant ou encore de
LDL oxydées, il externalise des molécules d’adhésion pour les leucocytes à sa surface afin de
permettre le recrutement de cellules spécialisées. Les cellules endothéliales expriment à leur
surface des molécules d’adhésions telles que VCAM-1, ICAM-1 ou l’E-sélectine. Ici, nous avons
voulu évaluer l’activation de l’endothélium suite à une incubation de 24h avec des globules
rouges glyqués en nous focalisant sur certains aspects fonctionnels (l’adhésion et la
perméabilité) et sur certains paramètres d’expression des protéines (ICAM-1, PECAM-1et VE-
Cadhérine).
Méthode :
1- Quantification de l’adhésion cellule-cellule.
Ce test repose sur l’étude de l’adhérence de monocytes préalablement marqués par
fluorescence (THP1) à la monocouche de cellules endothéliales. Ce test d’adhérence, réalisé
après une incubation de 24h à 37°C des cellules endothéliales avec les érythrocytes glyqués
(18,6 x 106 cellules/cm²) correspondant à une adaptation du protocole de l’équipe de Schmitz
[247]. Les globules rouges ont été aspirés puis le tapis de cellules endothéliales a été lavé à
trois reprises avec du PBS stérile. En parallèle, le marquage des monocytes humains THP1
(ATTC® TIB-202™) est réalisé de la manière suivante : environ 10 x 106 cellules THP1 en
suspension dans du tampon HBSS (1 mL – PAN Biotech®) ont été incubées avec 20 µM de la
sonde fluorescente BCECF-AM (2’7’bis(2-carboxyethyl)5,6carboxyfluorescein
acetoxymethylester – SIGMA) pendant 15 min à 37°C. Après 2 lavages au tampon HBSS pour
105
éliminer l’excédent de BCECF, les TPH1 marqués sont mises en suspension dans du milieu
RPMI 1640 complet sans rouge de phénol. Les TPH1 marquées et les cellules endothéliales ont
été incubées pendant 1h à 37°C. Trois mesures de fluorescence ont été réalisées ( longueurs
d’onde d’excitation à 485 nm et d’émission à 520 nm) : une première mesure de la
fluorescence du tapis de cellules endothéliales en absence des THP1 (Fluo sans THP1), une
deuxième mesure en présence des THP1 marqués sur le tapis de cellules endothéliales (Fluo
THP1 totaux) et une troisième mesure élimination de l’excédent de THP1 marqués non liés
aux cellules endothéliales (Fluo THP1 adhérents) avec 4 lavages au tampon PBS stérile. Le
pourcentage de cellules THP1 adhérentes aux cellules endothéliales a été calculé pour chaque
condition, de la manière suivante :
% adhésion = (𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭 𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻 𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂𝒂é𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓−𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭 𝒓𝒓𝒂𝒂𝒓𝒓𝒓𝒓 𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻 )
(𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭 𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻 𝒓𝒓𝑭𝑭𝒓𝒓𝒂𝒂𝑭𝑭𝒕𝒕−𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭 𝒓𝒓𝒂𝒂𝒓𝒓𝒓𝒓 𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻𝑻)
L’expérience a été reproduite 6 fois et un test ANOVA one way a été appliqué suivi du test de
Dunnett pour les comparaisons multiples sur le logiciel PRISM.
2- Mesure de l’expression génique d’ICAM-1.
ICAM-1 est une molécule d’adhésion exprimée à la surface des cellules endothéliales en
réponse à un stress, ayant un rôle dans le recrutement et la migration transendothéliale des
leucocytes vers les sites d’inflammations. Cette méthode repose sur la quantification de
l’expression de gènes cibles par RT-PCR quantitative suite à l’extraction des ARN totaux des
cellules endothéliales suivi de leur transcription inverse en ADNc. Ainsi, après la incubation
des érythrocytes glyqués et des cellules endothéliales pendant 24h, l’excédent de globules
rouges a été éliminé puis les cellules endothéliales ont été lavées 3 fois avec du tampon PBS.
L’extraction d’ARN a été réalisée avec du TRIzol® Reagent (Total RNA Isolation Reagent – Life
technologies) en suivant la méthode préconisée par le fabricant, adaptée du protocole de
l’équipe de Chomczynski [248]. Suite à cette étape d’extraction, une réverse transcription de
6 µg d’ARN totaux en ADNc est réalisé avec l’enzyme de transcription inverse M-MLV Reverse
Transcriptase (Moloney-Murine Leukemia Virus - Invitrogen) en utilisant le protocole du
fournisseur. L’ADNc du gène codant pour ICAM-1 a ensuite été amplifié par PCR quantitative
dans un mélange réactionnel contenant les amorces sens et anti-sens spécifiques du gène
106
correspondant (amorce sens 5’GGCCTCAGTCAGTGTGA3’ et amorce anti-sens
5’AACCCCATTCAGCGTCA3’) à 10 µM. L’amplification a été effectuée sur l’appareil ABI PRISM
7000 thermal cycler (Applied Biosystems) puis la quantification des amplicons générés a été
réalisée par la mesure de la fluorescence de l’agent intercalant SYBR green (Eurogentec). Le
logiciel ABI PRISM 7000 SDS a permis l’analyse des données et la quantité relative de
l’expression des gènes a été déterminée en utilisant la GAPDH (amorce sens
5’TCCCTGAGCTGAACGGGAAG3’ et amorce anti-sens 5’GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT3’)
comme gène constitutif de référence.
3- Expression protéique de PECAM-1(CD31) par Western Blot.
PECAM-1 est une molécule d’adhésion exprimée à la surface des cellules endothéliales, elle
joue un rôle dans la cohésion de l’endothélium et aussi dans la migration transendothéliale
des leucocytes après leur recrutement. Cette méthode repose sur la reconnaissance de
protéines spécifiques par des anticorps suite à leur séparation sur gel d’acrylamide/bis
acrylamide et leur transfert sur membrane. Après l’incubation des érythrocytes glyqués et des
cellules endothéliales pendant 24h à 37°C, l’excédent de globules rouges est éliminé par 3
étapes de lavages avec du PBS. Les protéines ont été extraites à l’aide d’un tampon de lyse
contenant les éléments suivants : Urée 8 M, Tris-HCl 25 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM
et Triton X100 1%. Après la quantification des protéines par la méthode BCA, 20 µg de
protéines de chaque échantillon ont été séparés par gel d’électrophorèse à 10%
d’acrylamide/bis acrylamide. Les protéines ont ensuite été transférées depuis le gel sur une
membrane de nitrocellulose via un transfert semi-sec. La saturation de la membrane est
ensuite réalisée avec une solution de PBS/Tween 20 0,05%/Lait 5% à température ambiante
pendant 45 min sous agitation. Puis la membrane est incubée avec l’anticorps primaire suivi
de l’anticorps secondaire dirigé contre l’espèce de l’anticorps primaire couplé à la peroxydase
(HRP). Les incubations avec les anticorps ont été réalisées à température ambiante pendant
2h sous agitation. Les anticorps primaires et secondaires utilisés dans cette partie sont les
anticorps anti-PECAM-1humain (Dako, dilution 1 :1000), anti-α-tubuline humaine (Sigma) et
Igg Lapin anti mouse (hôte de production des anticorps primaires utilisés, Jackson, dilution
1 :10000) tous dilués dans une solution de PBS/Tween 20 0,05%/Lait 1%. Chaque étape
d’incubation est suivie d’une étape de 3 lavages au PBS/Tween 20 0,05%. La révélation des
protéines d’intérêts est ensuite été réalisée par incubation de la membrane avec le réactif
107
ECL. Le western blot a été reproduit 3 fois de manière indépendante, les résultats
représentatifs sont présentés et l’aire des bandes obtenues a été quantifiée sur le logiciel
ImageJ.
Figure 25 : Le stress induit par les érythrocytes glyqués n’active pas l’endothélium. A) Quantification de l’adhésion des THP1 au tapis de cellules endothéliales après incubation avec les globules rouges glyqués pendant 24h. (N=6). B) Mesure de l’expression du gène codant pour ICAM-1 par RT-Q-PCR. (N=1) C1) Evaluation de l’expression protéique de PECAM-1 et de l’α-tubuline des cellules endothéliales par western blot. C2) Quantification de l’aire des bandes correspondants à PECAM-1 rapportée à l’α-tubuline en pixels. Images représentatives de 3 expériences indépendantes.
Si le pourcentage d’adhésion des THP1 à l’endothélium (Figure 25 A) à tendance à augmenter
après contact avec les globules rouges vieillis/ glyqués, les différences observées ne sont pas
significatives (p>0,5). En ce qui concerne la modulation des facteurs d’adhésion (Figure 25 B),
la stimulation pendant 24h des cellules endothéliales avec les globules rouges glyqués
entraîne une augmentation de l’expression génique d’ICAM-1 en comparaison avec les
conditions globules rouges frais et globules rouges âgés. Concernant une autre molécule
d’adhésion PECAM-1 (CD31 – Figure 25 C), on n’observe pas de modifications significatives de
son expression protéique suite à l’incubation des cellules endothéliales pendant 24h avec les
globules rouges glyquées.
108
Nous n’avons donc pas observé d’activation de l’endothélium suite au stress induit par les
globules rouges glyqués ni même par les globules rouges vieillis. Il est possible que la durée
d’incubation de 24h ne soit pas suffisante pour observer une activation franche de
l’endothélium.
5.2.2 Modulation de la perméabilité de l’endothélium
Suite à l’exploration de l’activation de l’endothélium, l’effet des globules rouges glyqués sur
la perméabilité de cet endothélium a été étudié. Après 24h d’incubation des cellules
endothéliales avec les globules rouges, la perméabilité de l’endothélium et l’expression
protéique de la VE-Cadhérine (une molécule d’adhésion cellulaire importante dans
l’attachement cellule-cellule), ont été évaluées.
Méthode :
1- Mesure de la perméabilité.
Ce test repose sur la capacité de l’endothélium à former une barrière dont la perméabilité aux
protéines et molécules de la circulation sanguine est finement régulée. Nous avons évalué la
perméabilité de l’endothélium selon la méthode utilisée par Bao Dang et al. [249] avec
quelques modifications. Les cellules endothéliales ont été mises en culture dans du milieu
DMEM complet dans des inserts de culture contenant des filtres en PCF avec des pores d’une
taille de 0,4 µm (Millicell ®-24 Millipore) à une densité de 100 000 cellules par cm². Les cellules
ont été gardées en culture jusqu’à dépasser l’état de confluence soit une durée de 7 jours
pendant lesquels le milieu est renouvelé régulièrement. Les cellules endothéliales sont ensuite
incubées avec les érythrocytes glyqués pendant 24h à 37°C puis ces derniers ont été aspirés
avant de laver 3 fois le tapis cellulaire au PBS stérile. Les inserts de culture ont été placés dans
des plaques 24 puits contenant 2 mL de RPMI 1640 sans rouge de phénol dans la partie
inférieure et 800 µL de ce même milieu contenant du FITC-dextran FD4 d’un poids moléculaire
de 4kDa (Sigma – 0,385 mg/mL) dans la partie supérieure. L’évaluation de la perméabilité des
échantillons repose sur la diffusion du FITC-dextran FD4 à travers les pores de la membrane
et donc à travers le tapis cellulaire. Toutes les 15 min, le milieu en dessous de l’insert de culture
109
a été changé et remplacé par du milieu RPMI 1640 sans rouge de phénol frais, ne contenant
pas de FITC-dextran (Figure 26).
Figure 26 : Schéma du déroulement du test de perméabilité. Les cellules endothéliales ont d’abord été ensemencées dans les inserts de culture. Après 7 jours de croissance, les cellules ont été incubées pendant 24h avec les érythrocytes puis la mesure de la perméabilité a été réalisée pendant 1h avec du FITC-dextran FD4.
La mesure de la fluorescence émise par le FITC-dextran FD4 qui a potentiellement diffusé dans
le milieu (longueurs d’ondes d’excitation à 485 nm et d’émission à 520 nm) est ensuite réalisée
en plaque 96 puits. Pour calculer la quantité de FITC-dextran dans chaque échantillon, la
fluorescence du FITC-dextran des échantillons est rapportée à celle d’une gamme étalon
établie à partir d’une solution de FITC-dextran FD4 (0,385 mg/mL - 0,006 mg/mL). Pour chaque
temps (15, 30, 45 et 60 min) la quantité cumulée de FITC-dextran de chaque échantillon est
calculée, ce qui permet de déterminer la pente de diffusion et par la suite de calculer la
surface de perméabilité (PS) de chaque échantillon de la manière suivante :
𝑻𝑻𝑻𝑻𝑷𝑷
= ( 𝑻𝑻𝑻𝑻𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒓𝒓𝒆𝒆𝒂𝒂𝒂𝒂𝒓𝒓𝒓𝒓𝒆𝒆𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝑭𝒓𝒓
) – ( 𝑻𝑻𝑻𝑻𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒆𝒆𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒗𝒗𝒆𝒆𝒂𝒂𝒓𝒓
)
Puis le coefficient de perméabilité Pe en cm/min de chaque échantillon est calculé de la
manière suivante :
Pe = 𝑻𝑻𝑷𝑷𝒓𝒓𝑭𝑭𝒓𝒓𝒔𝒔𝒂𝒂𝒆𝒆𝒓𝒓 𝒂𝒂𝒓𝒓 𝑭𝑭′𝒆𝒆𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓
L’expérience a été reproduite 4 fois et un test ANOVA one way a été appliqué suivi du test de
Dunnett pour les comparaisons multiples sur le logiciel PRISM.
110
2- Mesure de l’expression protéique de VE-Cadhérine par Western blot.
Le western blot de VE-Cadhérine a été réalisé de la même manière que celui de PECAM-1
décrit précédemment. Les anticorps primaires suivant ont été utilisés : anti-VE-Cadhérine
humaine (Abcam, dilution 1 :1000) et anti-α tubuline humaine (Sigma, dilution 1 :1000). Le
western blot a été reproduit 3 fois de manière indépendante, les résultats représentatifs sont
présentés et l’aire des bandes obtenues a été quantifiée sur le logiciel ImageJ.
Figure 27 : Le stress induit par les érythrocytes glyqués ne modifie pas la perméabilité de l’endothélium. A) Mesure du coefficient de perméabilité du tapis de cellules endothéliales après incubation de 24h avec les globules rouges glyqués. (N=4) Les différences observées ne sont pas significatives p>0,5. B1) Evaluation de l’expression protéique de la VE-Cadhérine et de l’α tubuline des cellules endothéliales par western blot. B2 et B3) Quantification de l’aire des bandes correspondants à la VE-Cadhérine à 120 et 90 kDa rapportée à l’α-tubuline. Images représentatives de 3 expériences indépendantes.
L’impact des globules rouges frais, vieillis et glyqués sur la modification de la perméabilité de
la barrière endothéliale a été évaluée en calculant les coefficients de perméabilité (Pe)
respectifs (Figure 27 A). Une légère tendance à la diminution du Pe est observée pour les
cellules ayant été au contact des globules rouges vieillis et des globules rouges glyqués par
rapport à celles exposées aux globules rouges frais. Concernant l’expression de la protéine de
la jonction cellulaire VE-Cadhérine, exprimée à la surface des cellules endothéliales, la
révélation de la membrane de western blot (Figure 27 B) montre la présence de deux bandes
111
à 120 kDa et à 90 kDa. Nous pouvons faire l’hypothèse que nous observons deux formes de
VE-Cadhérine, la molécule native (125 kDa) attendue aux alentours de 120 kDa et la forme
tronquée correspondant au domaine extracellulaire retrouvée à 90 kDa [250]. On remarque
que l’expression de la forme native de la VE-Cadhérine diminue dans les cellules endothéliales
incubées avec les globules rouges âgés et les globules rouges glyqués par rapport à celles
incubées avec les globules rouges frais. Dans une moindre mesure, il semble que le profil
d’intensité de la bande à 90 kDa correspondant au domaine extracellulaire de la VE-Cadhérine
soit identique à celui de la bande à 120 kDa.
Bien que nous observions une légère diminution de l’expression protéique de la VE-Cadhérine,
protéine importante dans l’intégrité vasculaire et le maintien de l’imperméabilité de
l’endothélium, la perméabilité de l’endothélium ne semble pas affectée de manière
significative après 24h d’incubation avec les globules rouges glyqués.
112
5.3 Conséquence de la phagocytose des érythrocytes sur la production de stress
oxydant par l’endothélium
Le globule rouge regorge d’éléments pro-oxydants [251] qu’il libère après sa lyse. De ce fait, il
peut participer à la formation de ROS dans les cellules endothéliales. Nous avons quantifié la
production et ROS et l’activation de l’activation de certaines enzymes impliquées dans les
défenses antioxydantes cellulaires.
5.3.1 Production de ROS par l’endothélium
Méthode :
Mesure de la production de ROS par DCF-HDA
Ce test repose sur la capacité des ROS, produits au sein de la cellule, notamment par les
mitochondries à hydrolyser le DCFH-DA en DCF fluorescent. Les cellules endothéliales ont été
incubées pendant 1h ou 24h avec les érythrocytes glyqués supplémentés ou non avec une
solution de DFO (déferroxamine - Sigma) à 10 µM. Le DFO est un agent permettant la chélation
du fer libre sous sa forme ferrique (Fe3+) qu’il soit circulant ou intracellulaire, et son utilisation,
permet ici de déterminer la part de ROS produits de manière fer-dépendante. Après
élimination des érythrocytes, suivie d’une étape de lavage au PBS stérile, les cellules ont été
incubées avec une solution de DCFH-DA (Sigma) à 10 µM dans du PBS stérile pendant 45 min
à 37°C à l’obscurité. La fluorescence de la forme oxydée du DCF est mesurée (longueurs
d’ondes d’excitation à 485 nm et d’émission à 520 nm) et les résultats sont exprimés par
rapport à la condition contrôle. L’expérience a été répétée 4 fois, les tests statistiques suivants
ont été appliqués : ANOVA two way suivi du test de Tukey pour les comparaisons multiples
sur le logiciel PRISM.
113
Figure 28 : Le stress induit par les érythrocytes glyqués engendre la production de ROS par les cellules endothéliales. Détermination de la production de ROS par les cellules endothéliales après 1h et 24h d’incubation avec les globules rouges supplémentés ou non en DFO. A) Détermination de la production des ROS en absence de DFO. (N=4) *, p=0,0132 et **, p=0,0027 comparé aux globules rouges frais. °, p=0,0222 comparé aux globules rouges vieillis. B) Détermination de la production de ROS en présence de DFO. (N=4) **, p=0,0295 comparé aux globules rouges frais. Tableau 2: Effets du traitement des cellules et du DFO sur la production de ROS. Résultats du test ANOVA two way effectué pour la production de ROS en présence ou non de DFO (Figure 28 B) :
Durée du traitement
Influence
sur la production de ROS
1h 24h
Incubation avec les globules
rouges glyqués
****
P<0,0001
****
P<0,0001
DFO Non significatif
P=0,1323
Non significatif
P=0,1045
La quantification de la production de ROS par les cellules endothéliales est effectuée après
différents temps d’incubations avec les érythrocytes (1h et 24h) (Figure 28 A). On remarque
une production de ROS accrue par les cellules endothéliales induite par les globules rouges
glyqués que ce soit après 1h ou après 24h d’incubation par rapport aux autres conditions.
Aucune différence significative n’est observée en présence de DFO par rapport aux autres
114
conditions (Figure 28 B), attestant que la chélation des ions ferriques n’impacte pas cette
génération de ROS intracellulaire.
On peut donc conclure que l’incubation des cellules endothéliales avec les globules rouges
glyqués entraîne la production de ROS par les cellules endothéliales et que l’absence d’effet
du chélateur de fer signifie que d’autres éléments autre que le fer apporté par les globules
rouges glyqués contribue à cette production de ROS par les cellules endothéliales.
5.3.2 Les défenses antioxydantes de l’endothélium
Suite à un stress oxydant, la cellule met en place naturellement un système de défense faisant
intervenir différents acteurs enzymatiques afin de réduire les principales espèces réactives de
l’oxygène et ainsi diminuer le stress oxydant présent. Dans notre cas, après incubation des
cellules endothéliales avec les globules rouges pendant 24h, nous avons mesuré l’activité de
l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase (SOD) ainsi que son expression génique. Nous
avons également évalué l’activité du protéasome qui intervient dans la dégradation des
protéines oxydées. Enfin, nous avons aussi exploré l’expression génique et protéique de
l’hème oxygénase 1 (HO-1) impliquée dans la dégradation de l’hème.
Méthode
Les activités de la SOD totale et celles du protéasome sont mesurées après extraction des
protéines des cellules endothéliales après incubation de 24h à 37°C avec les érythrocytes
glyqués dans un tampon phosphate 20 mM pH 7, EDTA 1 mM ne contenant pas d’inhibiteurs
de protéases ni de détergents. Au moins 3 cycles de congélations/décongélation dans l’azote
liquide et un bain marie à 37°C sont nécessaire pour réaliser l’extraction des protéines dans
ce tampon.
1- Mesure de l’activité de la SOD totale.
La SOD est une enzyme antioxydante qui catalyse la conversion de l’anion superoxyde O2°- en
peroxyde d’hydrogène H2O2 et oxygène O2. L’activité de la SOD totale est évaluée grâce à un
dosage enzymatique indirect du taux de conversion du cytochrome C oxydé en sa forme
115
réduite par l’anion O2°- généré par le couple xanthine/xanthine oxydase. Ainsi plus l’activité
de la SOD des échantillons sera élevée, moins le cytochrome C réduit sera produit et
quantifiable par spectrométrie à 550 nm (Figure 29).
Figure 29 : Schéma du principe du la mesure de l’activité de la SOD totale. Les échantillons ont été incubés dans le mélange réactionnel suivant : tampon phosphate 50
mM pH 7,8, EDTA 2,5 mM, cytochrome C 55 µM, Xanthine 6,5 mM et Xanthine oxydase X4500
1-2U/ mg protéines. La formation du cytochrome C réduit produit dans le mélange réactionnel
avec et sans échantillons a été mesurée à 550 nm pendant 1 min. Ainsi la mesure de
l’apparition du cytochrome C réduit sans échantillon a permis la détermination de la pente
témoin (PT) et la mesure de l’apparition du cytochrome C réduit dans les échantillons a permis
la détermination de la pente de l’échantillon (PE). L’activité de la SOD totale de chaque
échantillon en unité catalytique par µg de protéines (U/ µg protéines) est calculée grâce à la
formule suivante :
AE SOD tot = (𝑻𝑻𝑻𝑻−𝑻𝑻𝑷𝑷)𝒒𝒒𝑭𝑭𝒂𝒂𝒓𝒓𝒓𝒓𝒆𝒆𝒓𝒓é 𝒂𝒂𝒓𝒓 𝒑𝒑𝒓𝒓𝑭𝑭𝒓𝒓é𝒆𝒆𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒑𝒑𝒓𝒓é𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒂𝒂𝒂𝒂𝒓𝒓𝒓𝒓 𝑭𝑭𝒓𝒓 𝒎𝒎é𝑭𝑭𝒂𝒂𝒓𝒓𝒍𝒍𝒓𝒓 𝒓𝒓é𝒂𝒂𝒆𝒆𝒓𝒓𝒆𝒆𝑭𝑭𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝑭𝑭
Les résultats obtenus sont exprimés par rapport aux valeurs obtenues pour les échantillons
contrôles. La mesure de l’activité de la SOD totale a été répétée 3 fois de manière
indépendante et un test ANOVA one way a été appliqué suivi du test de Tukey pour les
comparaisons multiples sur le logiciel PRISM.
116
2- Mesure des activités protéolytiques du protéasome.
L’altération des protéines de manière irréversible suite à un stress oxydatif entraîne la
dégradation de ces protéines par le protéasome qui est un complexe protéolytique capable
de reconnaître les protéines qui lui sont adressées par ubiquitinylation et de dégrader ces
dernières en libérant des peptides et acides aminés. Ainsi, les activités de type chymotrypsine
par la dégradation du substrat LLVY (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7amino-4-methylcoumarin) et de
type trypsine par la dégradation du substrat LSTR (N-t-Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-7amino-4-
methymcoumarin) ont été mesurées par la fluorescence émise par le fluorochrome 7-amino-
4-methylcoumarin libéré. Les échantillons ont été incubés dans un tampon Tris-HCL 25 mM
pH 7,4 contenant soit le substrat LLVY soit le substrat LSTR à 12,5 µM. La fluorescence émise
après libération du fluorochrome a été mesurée toute les 60 s en présence ou non d’un
inhibiteur du protéasome MG132 (Z-Leu-Leu-Leu-al) à 20 µM. Ainsi la cinétique d’apparition
du fluorochrome pendant 30 min à 37°C a été suivie aux longueurs d’ondes d’excitation 355
nm et d’émission 440 nm. La mesure de l’apparition du fluorochrome dans les échantillons
contenant le MG132 a permis la détermination de la pente témoin (PT) et la mesure de
l’apparition du fluorochrome dans les échantillons sans MG132 a permis la détermination de
la pente de l’échantillon (PE). Les activités protéolytiques de chaque échantillon en unité
catalytique par µg de protéines (U/ µg protéines) ont été calculées de la manière suivante :
AE LLVY ou LSTR = (𝑻𝑻𝑻𝑻−𝑻𝑻𝑷𝑷)𝒒𝒒𝑭𝑭𝒂𝒂𝒓𝒓𝒓𝒓𝒆𝒆𝒓𝒓é 𝒂𝒂𝒓𝒓 𝒑𝒑𝒓𝒓𝑭𝑭𝒓𝒓é𝒆𝒆𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒑𝒑𝒓𝒓é𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓 𝒂𝒂𝒂𝒂𝒓𝒓𝒓𝒓 𝑭𝑭𝒓𝒓 𝒎𝒎é𝑭𝑭𝒂𝒂𝒓𝒓𝒍𝒍𝒓𝒓 𝒓𝒓é𝒂𝒂𝒆𝒆𝒓𝒓𝒆𝒆𝑭𝑭𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝒓𝑭𝑭
Les résultats obtenus ont été rapportés aux valeurs obtenues pour les échantillons contrôles.
La mesure des activités protéolytiques du protéasome a été répétée 3 fois de manière
indépendante et un test ANOVA one way a été appliqué suivi du test de Tukey de pour les
comparaisons multiples sur le logiciel PRISM.
3- Mesure de l’expression génique de la SOD-1 et de HO-1.
Comme pour la mesure de l’expression du gène codant pour ICAM-1 décrite précédemment,
nous avons quantifié la modulation de l’expression des gènes codant pour la SOD-1 (Cu/Zn
SOD, amorce sens 5’GAAGGTGTGGGGAAGCATTA3’ et amorce anti-sens
5’ACATTGCCCAAGTCTCCAAC3’) et HO-1 (amorce sens 5’AGAGCCTGCAGCTTCTCAGA3’ et
117
amorce anti-sens 5’ACAAAGTCTGGCCATAGGAC3’). La méthode utilisée a été la même mais
l’amplification par PCR quantitative a été réalisée sur l’appareil CFX 96 C1000 thermal cycler
(Bio-Rad). L’analyse des données a été effectuée sur le logiciel CFX Manager 3.1 de Bio-Rad et
la quantification de l’expression relative des gènes a été déterminée en utilisant la GAPDH
(amorce sens 5’TCCCTGAGCTGAACGGGAAG3’ et amorce anti-sens
5’GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT3’) comme gène constitutif de référence.
4- Mesure de l’expression protéique de HO-1 par Western blot.
L’enzyme HO-1 participe à la dégradation de l’hème, sa détoxification et au recyclage du fer à
partir de l’hémoglobine. Le western blot de HO-1 a été réalisé de la même manière que celui
de PECAM-1 décrit précédemment. Les anticorps primaires anti-HO-1 humain (Abcam,
dilution 1 :1000) et anti-α tubuline humaine (Sigma, dilution 1 :1000) ont été utilisés. Le réactif
Novared ® (Promega) a permis la révélation des protéines d’intérêts. Le western blot a été
reproduit 3 fois de manière indépendante, les résultats représentatifs sont présentés et l’aire
des bandes obtenues a été quantifiée sur le logiciel ImageJ.
Les protéines en contact avec des éléments pro-oxydants tels que les ROS subissent des
modifications de leurs structures qui peuvent altérer leurs fonctions. Ces modifications
peuvent soit être prévenues par l’action d’enzymes antioxydantes ou deviennent irréversibles.
A ce moment-là, les protéines sont adressées au complexe protéolytique d’élimination des
protéines le protéasome. Nous avons mesuré l’activité d’une enzyme antioxydante la SOD
dans les lysats protéiques des cellules endothéliales ayant été en contact avec les érythrocytes
pendant 24h (Figure 30 A). Bien que non significatives, une augmentation de l’activité totale
de la SOD est observée pour les cellules endothéliales exposées aux globules rouges vieillis et
aux globules rouges glyqués par rapport à celles ayant été en contact avec les globules rouges
frais. De la même manière, une augmentation non significative de l’activité de type
chymotrypsine (LLVY) du protéasome est observée dans les cellules endothéliales en contact
avec les globules rouges vieillis et les globules rouges glyqués par rapport à celles exposées
aux globules rouges frais. En ce qui concerne l’activité de type trypsine (LSTR), celle-ci
augmente de manière non significative après incubation des cellules endothéliales avec les
globules rouges vieillis.
118
Figure 30 : Influence des érythrocytes glyqués sur le système de défenses antioxydantes des cellules endothéliales. A) Activité de la SOD totale par mesure de l’absorbance générée par le cytochrome C réduit à 550 nm (N=3), activité de type chymotrypsine (LLVY) et de type trypsine (LSTR) du protéasome par mesure de la fluorescence émise par la libération du fluorochrome 7-amino-4-methylcoumarin (N=3). Les différences observées ne sont pas significatives p>0,2. B) Mesure de l’expression des gènes codants pour la SOD (N=1) et HO-1 (N=4). *, p<0,05 comparé aux globules rouges frais. C1) Evaluation de l’expression protéique de HO-1 et de l’α tubuline des cellules endothéliales par western blot. C2) Quantification de l’aire des bandes correspondants à HO-1 rapportée à l’α-tubuline. Images représentatives de 3 expériences indépendantes.
En parallèle aux activités, la modulation de l’expression des gènes codant pour la SOD-1 et
pour l’enzyme HO-1 a été étudiée (Figure 30 B). L’expression génique de la SOD-1 apparait
augmentée dans les cellules endothéliales préalablement exposées 24h aux globules rouges
vieillis et aux globules rouges glyqués. Dans les mêmes conditions de traitement, nous
constatons également une surexpression du gène codant pour HO-1 qui apparait significative
et plus importante en présence des globules rouges glyqués. De manière similaire à son
expression génique, l’expression protéique de HO-1, révélée par western blot par une bande
autour de 35 kDa (Figure 30 C), est également augmentée. Ces résultats montrent que le
vieillissement des globules rouges en contact avec les cellules endothéliales induit la
surexpression de HO-1 et que la glycation de ces érythrocytes exacerbe cette surexpression.
Comme nous n’avons pas observé de différences significatives entre les différentes conditions
pour les activités de la SOD et du protéasome après 24h d’incubation des globules rouges avec
les cellules endothéliales, il est possible que nous ayons dépassés la fenêtre d’activation de
ces enzymes. En effet, dans la partie précédente nous avons mis en évidence une production
de ROS supérieure aux autres conditions après incubation avec les globules rouges glyqués
119
pendant seulement 1h. Il est possible que les activités enzymatiques soient plus fortes dans
les premières heures qui suivent l’incubation avec les globules rouges glyqués. En revanche,
l’enzyme HO-1 voit son expression génique et protéique augmentée après 24h d’incubation
avec les globules rouges vieillis et les globules rouges glyqués. L’activité de HO-1 est
conditionnée par la phagocytose des globules rouges par les cellules endothéliales. On peut
donc supposer que le temps d’exposition avec les globules rouges impacte sur la quantité qui
seront phagocytés et par conséquent sur la stimulation de la synthèse protéique de HO-1.
D’ailleurs, au vu des résultats de la première partie, nous avons montré que la glycation des
globules rouges amplifie leur phagocytose par les cellules endothéliales ce qui explique une
expression protéique et génique accrue de HO-1.
120
5.4 Discussion de l’étude in vitro : Impact de la glycation des érythrocytes sur
l’endothélium.
Cette étude in vitro avait 3 objectifs :
- mettre au point un modèle de glycation in vitro des globules rouges,
- mettre en évidence la phagocytose des globules rouges par les cellules endothéliales,
- évaluer les effets de cette érythrophagocytose sur la réponse des cellules
endothéliales suite au stress oxydant engendré, en particulier sur la fonctionnalité de
l’endothélium.
Dans un premier temps, nous avons mis au point un modèle de glycation des globules rouges
afin d’étudier les effets de ces modifications sur leur interaction avec l’endothélium. Pour ce
faire, après avoir incubé des globules rouges isolés à partir de sujets non diabétiques en
présence de concentrations croissantes en glucose pendant 5 jours à 37°C, nous avons évalué
différents paramètres en lien avec la morphologie et la physiologie des globules rouges. Dans
le contexte de l’athérothrombose, l’extravasation d’érythrocytes suite à des hémorragies
intraplaque successives conduit non seulement à l’apport d’érythrocytes dans la plaque mais
aussi à leur accumulation prolongée conduisant à leur lyse [252, 253]. Nous avons donc
analysé l’impact du vieillissement et de la glycation in vitro des globules rouges en mesurant
l’externalisation des phosphatidylsérines (PS). D’une part, nous avons montré que le
vieillissement induit d’une part la perte de l’asymétrie des lipides membranaire des globules
rouges à travers l’externalisation des PS de manière similaire à ce qu’avait observé Kolb et al.
[242]. D’autre part, les fortes concentrations en glucose (30 mM à 130 mM) amplifient cette
externalisation des PS à la surface des globules rouges par rapport aux globules rouges frais
et aux globules rouges vieillis en conditions normo-glycémiques. D’autres équipes ont aussi
mis au point différents modèles de glycation érythrocytaire [254, 255], en utilisant différentes
durées de glycation allant de 1 à 3 jours avec des concentrations en glucose de 5, 45 et 100
mM. Pour ces équipes, la glycation induit une externalisation modérée des PS à la surface des
globules rouges. En effet, après 1 jour d’incubation avec 5 et 45 mM de glucose, ces équipes
ont observé environ 2% d’externalisation des PS et 17% après 3 jours d’incubation avec 45 et
121
100 mM de glucose [254, 255]. En revanche dans notre modèle, le vieillissement des globules
rouges pendant 5 jours avec 5 mM de glucose suffit à induire 76% d’externalisation des PS
alors que la glycation avec de fortes concentrations en glucose (30 à 130 mM) amplifie ce
phénomène en induisant 92 à 95 % d’externalisation des PS. L’externalisation des PS à la
surface des globules rouges reflétant leur sénescence est donc plus marquée dans des
conditions mimant un diabète. L’hyperglycémie chronique des diabétiques entraîne l’entrée
massive de glucose dans les globules rouges grâce au transporteur Glut1 [256], de cette
manière et grâce à la longue durée de vie des érythrocytes (120 jours) la glycation affecte les
protéines de surface et intracellulaires des globules rouges. Ainsi, la glycation de
l’hémoglobine A1 permet le suivi glycémique du diabétique sur plusieurs mois [221, 257].
Nous avons donc mesuré le pourcentage d’hémoglobine glyquée de nos échantillons de
globules rouges après glycation. Comme montré par Sompong et al. [255], la glycation des
globules rouges induit des taux croissants d’HbA1c avec des concentrations croissantes en
glucose. Ce taux atteint d’ailleurs 11,4%, lorsque les globules rouges sont incubés avec 130
mM de glucose pouvant correspondre à celui des patients diabétiques ayant un diabète
déséquilibré [258]. De plus, les échantillons de globules rouges issus de patients diabétiques
sur lesquels nous avons pu travailler présentaient un taux moyen d’HbA1c autour de 11,5%,
ce qui conforte notre choix de continuer les expérimentations avec ce modèle d’érythrocytes
glyqués avec 130 mM de glucose. En parallèle à la mesure d’HbA1c, nous avons également
quantifié un autre marqueur de la glycation, le 5-HMF, composé libéré après la dégradation
des produits de glycation obtenus par la réaction non enzymatique entre le glucose et des
protéines. Comme l’équipe de Viskupicova [254], nous avons observé que les concentrations
élevées en glucose induisent une teneur importante de 5-HMF qui traduit une glycation
importante des érythrocytes. Nous avons donc mis au point un modèle de glycation des
érythrocytes in vitro capable d’induire la sénescence tout en présentant une relevance au
niveau physiologique.
Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre les érythrocytes
glyqués et les cellules endothéliales dans le but de mettre en évidence la capacité des cellules
endothéliales à les phagocyter. En effet, dans le contexte d’athérothrombose, suite aux
hémorragies intraplaque répétées, les cellules spécialisées comme les macrophages sont
capables de phagocyter les érythrocytes sénescents résidants dans la plaque [259, 260].
Cependant, la clairance des globules rouges peut aussi se faire par d’autres types cellulaires
122
présents dans la plaque comme les cellules musculaires lisses [242] ou les cellules
endothéliales [261]. En effet, Fens et al. a montré que les cellules endothéliales sont
également capables de phagocyter des globules rouges sénescents opsonisés par la
lactadhérine [262]. Dans notre étude, nous avons mis en évidence que les cellules
endothéliales sont capables de se lier et de phagocyter les globules rouges âgés et glyqués de
manière dose dépendante. La liaison et la phagocytose des érythrocytes par les cellules
endothéliales augmentent avec leur taux de glycation. L’interaction entre les érythrocytes et
les cellules endothéliales peut se faire via différents acteurs, notamment grâce à
l’externalisation des PS à la surface des globules rouges sénescents reconnus par leurs
récepteurs à la surface des cellules endothéliales. Ainsi, la liaison des érythrocytes sénescents
aux cellules endothéliales peut se faire par l’intermédiaire des récepteurs aux
phosphatidylsérines (PSR) [253, 263] mais aussi par l’intermédiaire du récepteur CXCL16/SP-
PSOX [264]. De plus, les protéines de surfaces des érythrocytes subissent des modifications
lors de la glycation. De cette manière, des AGE se forment à la surface des globules rouges
[222]. Ces AGE peuvent être reconnus par leurs récepteurs RAGE [225] mais aussi par le
récepteur « scavenger » CD36 à la surface des cellules endothéliales [265]. Nous avons donc
montré que les cellules endothéliales sont capables de phagocyter des globules rouges qu’ils
soient âgés et/ou glyqués. Ces résultats corroborent plusieurs études qui montrent que dans
un environnement hyperglycémique, les globules rouges ont une adhérence accrue pour
l’endothélium [22, 223, 266].
Dans un troisième temps nous nous sommes intéressés à la fonctionnalité de l’endothélium
suite à l’érythrophagocytose. Nous avons alors évalué trois paramètres : sa capacité de
réparation, son activation et sa perméabilité. Dans un contexte d’athérothrombose chez le
diabétique, l’endothélium qui subit diverses contraintes (stress mécanique, stress oxydant,
stress inflammatoire…) est activé, le rendant plus fragile et plus susceptible aux lésions. De ce
fait, les cellules endothéliales doivent être capables de migrer au niveau des lésions [267] afin
de les réparer. De plus, la formation de néo vaisseaux dans la plaque est conditionnée entre
autre par la migration de cellules endothéliales qui adoptent des phénotypes spécifiques. Les
cellules endothéliales ont alors soit un phénotype en forme de pointe ou « tip » où elles
pointent en direction de la lésion, ou un phénotype en forme de tige ou « stalk » où elles
forment le tube à la base du nouveau vaisseau [267]. C’est pourquoi nous nous sommes
intéressés à la capacité de réparation de l’endothélium après un contact avec des globules
123
rouges glyqués. Dans notre étude, nous avons montré que la phagocytose de globules rouges
glyqués par les cellules endothéliales diminue leur capacité à migrer et à proliférer. D’ailleurs,
d’autres travaux ont montré que l’hyperglycémie chez le diabétique est capable d’altérer la
prolifération et la migration des cellules endothéliales en modulant les voies de signalisation
PI3k/Akt [268] et p38 MAP kinase [269]. Chez les diabétiques ainsi que dans les situations
d’athérothrombose, l’endothélium dysfonctionnel produit plus d’anions O2°-, au détriment du
NO. Ce déséquilibre implique l’activation de l’endothélium et l’expression à sa surface des
molécules d’adhésions de type ICAM-1, VCAM-1 et E-sélectine dans le but de recruter
notamment des cellules immunitaires [54]. Les premières interactions qui permettent le
ralentissement puis l’arrêt des leucocytes à la surface des cellules endothéliales (« tethering »
et « rolling ») passent par les sélectines de type L, P ou E [270], mais l’adhésion ferme des
leucocytes à l’endothélium est assurée par les molécules d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1 [271].
Suite à cette étape d’adhésion, la transmigration des leucocytes à travers la barrière
endothéliale est assurée en partie par PECAM-1 (CD31) [272]. Dans notre étude, nous avons
évalué l’activation de l’endothélium suite à une incubation de 24h avec les globules rouges en
quantifiant l’adhésion des monocytes THP1 aux cellules endothéliales, en quantifiant la
modulation de l’expression génique d’ICAM-1 et l’expression protéique de PECAM-1. L’étude
de Rattan et al. a mis en évidence que lors d’une incubation des cellules endothéliales
humaines (HUVEC) avec des érythrocytes issus de patients diabétiques et des cellules de types
monocytes (HL-60), on observe une augmentation de la transmigration des monocytes à
travers la monocouche de cellules endothéliales ainsi que l’augmentation de la
phosphorylation de PECAM-1 [273]. D’ailleurs, Wagener et al. a montré qu’une stimulation
des cellules endothéliales pendant 24h avec l’hème induit une augmentation de l’expression
des molécules d’adhésions ICAM-1, VCAM-1 et E sélectine mais augmente aussi l’expression
de l’enzyme HO-1 ainsi que son activité enzymatique [274]. Cependant, dans nos expériences,
après 24h d’incubation des cellules endothéliales avec les globules rouges, nous n’avons
observé aucunes différences significatives en termes d’adhésion des THP1 dans ni même de
variations dans l’expression protéique de PECAM-1. Ces résultats montrent que dans nos
conditions expérimentales l’endothélium n’est pas activé bien qu’il semble que l’expression
génique d’ICAM-1 soit augmentée (tendance). Il est possible que la durée d’incubation de 24h
ne soit pas suffisante afin de stimuler l’activation de l’endothélium. Il est aussi probable que
l’incubation des monocytes avec les cellules endothéliales doive se faire de manière
124
simultanée avec les globules rouges afin d’observer une activation franche de l’endothélium.
Nous avons ensuite évalué l’impact des érythrocytes sur la modulation de la fonction de
barrière endothéliale. Bien que nous n’ayons pas observé d’effets de la phagocytose des
globules rouges sur la perméabilité de l’endothélium, nous avons montré que les érythrocytes
âgés et glyqués diminuent l’expression protéique de VE-Cadhérine. Cette dernière est
impliquée dans l’intégrité et la perméabilité de l’endothélium [275]. Les travaux d’Otero et al.
ont montré que l’albumine glyquée peut induire la diminution de l’expression de la VE-
Cadhérine et l’augmentation de la perméabilité de l’endothélium in vitro dans des modèles
humain (HUVEC) et murin [276]. Dans notre étude, on peut supposer que la glycation des
érythrocytes entraîne une formation importante de produits intermédiaires de glycation ou
d’AGE dans et à la surface des globules rouges. Ainsi, la diminution plus marquée de
l’expression protéique de la VE-Cadhérine dans la condition globules rouges glyqués pourrait
être due à la concentration élevée en produits intermédiaires et/ou avancés de glycation
présents dans le milieu.
Enfin, ayant montré que les érythrocytes sont une source de production de ROS, nous avons
étudié leur impact sur l’homéostasie redox de l’endothélium. Après incubation des cellules
endothéliales avec les érythrocytes glyqués pendant différents temps, nous avons montré que
la glycation des érythrocytes augmente de manière significative la production de ROS par les
cellules endothéliales après seulement 1h d’incubation. Cette production de ROS par les
cellules endothéliales se poursuit pendant 24h. Ce résultat est en concordance avec d’autres
études montrant que les globules rouges issus de patients diabétiques ou sénescents peuvent
entraîner la production de ROS par les cellules endothéliales ou d’autres cellules vasculaires
comme les cellules musculaires lisses. Par exemple, une étude de Wautier et al. a rapporté
une production de ROS par les HUVEC après seulement 30 min d’incubation avec des globules
rouges issus de patients diabétiques [277]. De même, Delbosc et al. a mis en évidence une
augmentation de la production de ROS après une incubation de 3 jours des globules rouges
sénescents avec des cellules musculaires lisses [261]. Parmi les différentes sources possibles
de ROS dans la cellule endothéliale suite à l’incubation avec les globules rouges, nous nous
sommes intéressés au fer lié à l’hème libéré après la lyse des érythrocytes. Nous avons donc
évalué la production de ROS des cellules endothéliales en présence de DFO, un chélateur de
fer libre sous sa forme ferrique (Fe3+). Nous avons constaté que la présence de DFO dans le
milieu n’influence pas cette production de ROS après 1h et 24h contrairement à ce qu’avait
125
observé Delbosc et al. [261]. En effet, dans leur étude, l’augmentation de la production de
ROS engendré par des concentrations croissantes d’hémoglobine est diminuée par la présence
du DFO dans le milieu. Dans l’athérosclérose, lorsque les érythrocytes arrivent au niveau du
cœur nécrotico-lipidique de la plaque, ils sont rapidement lysés à cause du stress oxydatif qui
y règne comme le montrent notamment les travaux de Nagy et al. [87]. Dans nos conditions
expérimentales, lorsque les globules rouges sont phagocytés, on peut supposer qu’ils libèrent
leur contenu en hémoglobine puis en hème et en fer. De plus, ayant subi la glycation pendant
5 jours, les érythrocytes peuvent présenter à leur surface des produits intermédiaires ou
avancés de glycation comme dans l’étude de Nagai et al. [222]. Nous supposons aussi que les
érythrocytes ont subi d’autres modifications telles que la peroxydation de leurs lipides
membranaires comme dans les travaux de Viskupicova et al. [254], une rigidification et une
altération de leurs formes comme dans l’étude de Babu et al. [223] ou encore la modification
de la protéine de surface band 3 suite au vieillissement comme le montrent Kay et al. dans
leurs travaux [278]. Ces éléments combinés peuvent expliquer que le fer n’est pas le seul
facteur pouvant induire une production de ROS par les cellules endothéliales dans nos
conditions. De surcroît, pour Wautier et al. la production de ROS par les cellules endothéliales,
suite à l’interaction entre les AGE à la surface des érythrocytes des diabétiques et leurs
récepteurs RAGE est dépendante de la NADPH oxydase activée par la voie de signalisation
MAP kinase [277]. Nous pouvons donc supposer que dans nos conditions, en plus de la
glycation de l’hémoglobine A1, d’autres produits intermédiaires ou avancés de glycation
soient formés. Ainsi, la NADPH oxydase pourrait également participer à la production de ROS
par les cellules endothéliales grâce à l’interaction de ces produits intermédiaires ou avancés
de glycation formé sur/dans les érythrocytes avec les récepteurs RAGE ou CD36 à la surface
des cellules endothéliales.
Nous avons ensuite exploré les réponses de certains acteurs de l’homéostasie redox de la
cellule endothéliale en nous intéressant à l’enzyme antioxydante superoxyde dismutase
(SOD), au protéasome et à l’enzyme hème oxygénase 1 (HO-1). Les résultats préliminaires
obtenus montrent que la stimulation pendant 24h des cellules endothéliales par les globules
rouges glyqués n’induit pas une augmentation significative de l’expression du gène de la SOD-
1 ainsi que de l’activité enzymatique de la SOD totale. Il en est de même pour les activités du
protéasome. Nous avons mis en évidence que la production précoce de ROS (1h) suite à
l’incubation des globules rouges avec les cellules endothéliales, alors que nous avons étudiés
126
les activités enzymatiques après 24h de stimulation. Il est donc possible qu’à 24h nous ayons
dépassé la fenêtre d’action de ces enzymes en termes d’expression et/ou d’activité. En effet,
il est probable que les enzymes antioxydantes soient activées rapidement suite au pic de stress
oxydant observé dès la première heure d’incubation avec les globules rouges. Cette activation
précoce n’est probablement pas maintenue au cours du temps le système et peut s’épuiser
en se traduisant par la diminution de l’activité et par conséquent l’absence de significativité
après 24h. L’hème oxygénase 1 est une enzyme qui permet la dégradation de l’hème en
monoxyde de carbone, biliverdine et fer sous sa forme Fe2+. Son expression est inductible via
une surproduction de ROS, de grandes concentrations d’hème, ou encore une réponse
antioxydante cellulaire insuffisante [95]. Dans notre cas, l’expression génique et protéique
d’HO-1 a été augmentée après 24h notamment grâce à l’accumulation de globules rouges
glyqués phagocytés par les cellules endothéliales. D’ailleurs, Wagener et al. a mis en évidence
l’augmentation de l’expression génique et de l’activité enzymatique de HO-1 par les cellules
endothéliales (HUVEC) après incubation avec 100 µM d’hème pendant 24h [274]. Dans une
autre étude, la surexpression génique et protéique d’HO-1 a été observée après 3 jours
d’incubations des cellules musculaires lisses avec des érythrocytes sénescents, associés à une
augmentation de l’expression génique et protéique de la ferritine protéine impliquée dans le
stockage du fer [261]. Dans un autre modèle d’érythrophagocytose des globules rouges
sénescents par des macrophages, l’augmentation de l’expression génique et protéique de HO-
1, mais aussi de la ferroportine (enzyme de transport du fer) et de la ferritine a été démontrée
[279]. Dans notre modèle, on peut alors supposer d’une part que l’activité enzymatique de
HO-1 est augmentée favorisant ainsi la dégradation et la détoxification de l’hème et d’autre
part que les protéines impliquées dans le recyclage du fer libéré de l’hème sont soit
surexprimées. Lors des premières étapes de formation de la plaque, dans le contexte de
l’athérosclérose Delbosc et al. a mis en évidence l’augmentation de l’expression de hème
oxygénase 1 dans les stries lipidiques et les fibroathéromes chez l’humain mais aussi dans les
lésions aortiques de l’intima chez le lapin en situations d’hypercholestérolémies [261]. En
outre, des dépôts de fer et la présence de globules rouges ont aussi été mis en évidence dans
ces travaux à la fois chez l’humain et dans des modèles animaux.
127
Conclusion et perspectives
128
129
Les travaux de cette thèse ont permis d’étudier les biomarqueurs associés aux plaques
d’athérothrombose carotidiennes de patients diabétiques et de non diabétiques dans le cadre
de l’étude clinique MADI. Parmi les marqueurs que nous avons quantifiés dans le plasma et
les milieux conditionnés de carotides, seuls quelques-uns apparaissent caractéristiques de la
population diabétique. Ainsi, les taux circulants de CD163 soluble, marqueur de la clairance
de l’hémoglobine, sont plus élevés dans le plasma des patients diabétiques par rapport aux
patients non diabétiques. Bien que ces résultats ne soient que préliminaires, on peut supposer
que l’importante concentration de CD163 soluble dans le plasma des patients diabétiques
indique une possible altération de la clairance de l’hémoglobine dans les plaques des patients
diabétiques. Ce niveau élevée en CD163 soluble associé à la forte densité de néovaisseaux
[220], à des hémorragies intraplaques plus importantes [280], à une activité élastase accrue
reflet de l’activation neutrophilaire et à une adhérence accrue des globules rouges glyqués
des patients diabétiques pour l’endothélium [223]. Nous pouvons supposer que les globules
rouges et l’hémoglobine qu’ils libèrent ont un rôle plus important dans la déstabilisation de la
plaque du diabétique. L’ADN libre présente des concentrations plus élevées dans le plasma
des patients non diabétiques. Ce marqueur parfois considéré comme reflétant l’activation des
neutrophiles, cependant, il est intégratif de la totalité de l’ADN double brin qui peut être libéré
au cours de la nécrose de n’importe quelle cellule et pas seulement consécutivement à la
NETose. En observant les marqueurs diffusant des plaques d’endartériectomies carotidiennes
des patients, on constate en revanche, que la concentration d’ADN libre chez les patients des
diabétiques apparait plus importante que celle des patients non diabétiques. Il semble que
localement, au niveau des plaques d’athérothrombose les diabétiques ont plus de nécrose ou
NETose conduisant à la libération de plus d’ADN libre.
Dans le but de vérifier l’hypothèse selon laquelle les cellules endothéliales peuvent participer
à la clairance des érythrocytes glyqués dans les plaques d’athérothrombose dans un contexte
de diabète de type 2, cette thèse a permis d’explorer les effets des érythrocytes diabétiques
sur l’endothélium. Nous avons mis au point un modèle de glycation in vitro d’érythrocytes
ayant une relevance d’un point de vue physiopathologique en mimant les modifications
pouvant être observées au cours d’un diabète déséquilibré. Nous avons aussi montré que les
globules rouges glyqués et âgés peuvent être phagocytés par les cellules endothéliales de
même que les globules rouges de patients diabétiques. Si cette érythrophagocytose n’impacte
130
pas la viabilité, la fonctionnalité et la réponse antioxydante des cellules endothéliales (dans
les conditions expérimentales utilisées), nous avons montré une altération de leur capacité de
prolifération et de migration associée à une production de ROS intracellulaires et la
surexpression de l’HO-1. Dans nos expériences, nous avons évalué les effets de la phagocytose
des érythrocytes glyqués après 24h d’incubation avec les cellules endothéliales, il est probable
que les différents paramètres que nous avons étudiés soient sollicités à différents temps. Ainsi
il est possible que les défenses antioxydantes des cellules endothéliales soient activées de
façon précoce alors que dans notre cas, l’activité et l’expression de HO-1 semblent modulées
par la présence de l’hème accumulée par les cellules endothéliales. De plus, il est possible qu’à
24h, l’action antioxydante de HO-1 ne pas soit uniquement du fait de la dégradation de l’hème
mais aussi due à la présence de monoxyde de carbone et de biliverdine qui peuvent agir sur
la signalisation cellulaire notamment sur l’apoptose et aussi sur l’inhibition de la NADPH
oxydase diminuant la production d’anion superoxyde. Il est aussi probable que la phagocytose
des globules rouges se poursuive au-delà de 24h entraînant alors l’accumulation
d’érythrocytes dans les cellules endothéliales ce qui permettrait potentiellement d’observer
des effets beaucoup plus important sur la fonctionnalité de l’endothélium. Des travaux ont
montré que les cellules musculaires lisses sont capables de phagocyter les érythrocytes dont
la membrane plasmique est riche en cholestérol, elles peuvent aussi se transformer en cellules
spumeuses après avoir phagocyté les lipides de plaque d’athérosclérose et perdent ainsi leur
fonction principale contractile. On alors peut supposer que les cellules endothéliales ayant
phagocytées les globules rouges voient leur fonction de barrière altérée. De cette manière,
les globules rouges phagocytés pourraient participer à l’amplification de l’expansion du cœur
nécrotique et aussi à l’amplification de la déstabilisation de la plaque.
Il serait intéressant d’étudier les mécanismes par lesquels la phagocytose des érythrocytes se
produit. Dans cette optique, l’étude de l’expression des récepteurs des phosphatidylsérines,
des récepteurs RAGE et CXCL16 à la surface des cellules endothéliales permettrait de voir
l’implication de ces derniers dans l’attachement et l’entrée des érythrocytes aux cellules
endothéliales. De plus, l’étude de l’érythrophagocytose des globules rouges par les cellules
endothéliales sur différents temps (court et long) permettrait d’observer l’évolution de l’effet
de la phagocytose des globules rouges sur la fonctionnalité de l’endothélium. Les temps longs
d’expérimentation pourraient permettre d’observer le devenir des cellules endothéliales une
fois gorgées d’érythrocytes. Enfin, des expérimentations in vivo sur un modèle d’animaux
131
diabétiques développant des plaques d’athérosclérose permettraient d’explorer les effets de
la phagocytose des globules rouges glyqués par les cellules endothéliales des néo vaisseaux
des plaques d’athérosclérose.
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Annexes
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Résumé
Sur l’île de La Réunion, la prévalence du diabète de type 2 est 3,5 fois plus élevée que celle de la France
hexagonale. Parmi les diverses complications qu’engendre le diabète, les AVC qui en résultent sont
responsables d’une forte mortalité faisant des maladies cardiovasculaires un problème de santé publique
majeur sur l’île. Les AVC ischémiques proviennent de l’occlusion d’une artère cérébrale par un thrombus
généré localement ou qui s’est détaché d’une plaque d’athérothrombose généralement localisée au
niveau des bifurcations carotidiennes. Les plaques compliquées sont souvent caractérisées par des
hémorragies intraplaques, responsables de l’extravasation des cellules sanguines. Différents marqueurs
moléculaires, protéiques et physiques peuvent refléter ces processus et renseigner le médecin sur
l’instabilité de la plaque du patient. Il est donc important d’étudier ces marqueurs de risque de rupture
de plaques carotidiennes chez les patients diabétiques, afin d’en prévenir les complications et la mortalité
associée.
L’hémorragie intraplaque, notamment pourvoyeuse d’érythrocytes et de neutrophiles libérant leurs
contenus cytoplasmiques, participe activement à la déstabilisation de la plaque d’athérothrombose chez
le diabétique. Cette thèse a permis l’étude de l’influence de ces marqueurs à travers une étude clinique
et de proposer un nouveau concept de phagocytose des érythrocytes glyqués par les cellules
endothéliales in vitro. Ainsi, les résultats préliminaires de l’étude clinique nous permettent de supposer
que la clairance des globules rouges des patients diabétiques est altérée, ce qui leurs permettraient de
résider sur une période plus longue dans les plaques de ces patients. De cette manière, les globules rouges
pourraient y être pris en charge par d’autres types cellulaires comme les cellules endothéliales. Nous
avons tout d’abord mis au point un modèle de glycation des érythrocytes in vitro reflétant un diabète mal
équilibré. Nous avons ensuite mis en évidence que les globules rouges glyqués pouvaient être phagocytés
par les cellules endothéliales humaines, conduisant à une prolifération limitée et à la surexpression de
l’HO-1. Ces données suggèrent qu’une ingestion des érythrocytes glyqués par les cellules endothéliales
pourrait amplifier la déstabilisation des plaques d’athérothrombose carotidiennes des diabétiques.
Mots clés : diabète de type 2, hémorragie intraplaque, érythrocytes, glycation, érythrophagocytose,
athérothrombose.
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Abstract
Type 2 diabetes prevalence in Reunion Island, a French overseas department, is 3.5 higher than in France
mainland. Among the various diseases caused by diabetes, stroke induces high mortality making
cardiovascular diseases a major public health problem on the island. Ischemic stroke results from a
cerebral artery occlusion by a thrombus that is locally produced or has detached from an
atherothrombotic plaque usually located at the carotid bifurcations. Complicated plaques can are often
characterized by intraplaque hemorrhages, responsible for blood cell extravasation. Several molecular
and physical markers can reflect these processes and inform the physician about the instability of the
patient's plaque. It is therefore of major importance to study the markers of carotid plaque rupture in
diabetic patients in order to prevent complications and associated mortality.
Intraplaque hemorrhage, providing erythrocytes and neutrophils releasing their cytoplasmic contents,
plays an active role in destabilizing atherothrombotic plaque in diabetic subjects. The objectives of the
present thesis were to study these markers in a clinical study and to suggest a new concept of red blood
cell phagocytosis by endothelial cells in vitro. According to the first results of the clinical study, we can
suggest that in diabetic patients, the clearance of red blood cells is impaired. This prolonged residence of
red blood cells in atherosclerotic plaques from diabetic patients. In this way, red blood cells could be
phagocytosed by other cell types such as endothelial cells. In this work, we have also set up an in vitro
model of erythrocyte glycation that reflects a clinical situation of poorly controlled diabetes. We have
demonstrated that glycated red blood cell phagocytosed by human endothelial cells, leading to their
limited proliferation and to HO-1 overexpression. These data suggest an ingestion of glycated erythrocytes
by endothelial cells may amplify the destabilization of carotid atherothrombotic plaques in diabetics.
Key words: type 2 diabetes, intraplaque hemorrhage, erythrocytes, glycation, erythrophagocytosis,
atherothrombosis.
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