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11/04/2019
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Diagnóstico bacteriológico de mastitis
bovina, marco teórico y práctico
Luis Calvinho
Curso de Actualización en Mastitis Bovina
Cnia. Vignaud APROCAL – INTA Rafaela
Resumen de temas
Diagnóstico bacteriológico de mastitis: fundamentos ¿Qué
información puede darme el laboratorio? ¿Qué debo
solicitarle?
Pruebas de susceptibilidad a antibióticos (fundamento y
valor de las mismas)
Patógenos contagiosos
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Mycoplasma
Corynebacterium bovis
Transmisión durante el ordeño
Patógenos ambientales
Estreptococos y organismos
coliformes
Streptococcus uberis,
dysgalactiae, otras especies
Transmisión principal en intervalo entre ordeños
S. dysgalactiae: ambas formas de transmisión
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Organ
ismo
s co
ntagio
sos
Organismos ambientales Sandholm, 1995
Prevalencia organismos patógenos en Argentina (MSC)
ORGANISMOS A B C D E F G H I J
S. aureus 54 43,2 21,7 17 25,3 31,5 16,6 21,9 13,9 21,3
S. agalactiae 23,4 13,5 2,7 - 8,8 11,6 5,4 5,8 1,6 4,4
S. uberis 2,8 19,2 5,9 - - - 9,2 - - 0,4
S. dysgalactiae 1,8 5,3 2,2 - 3,6 - - - - 4,4
Strepto. spp. 4,1 1,7 23,4 19,3 5,82 13,3 4,34 6,5 -
Coliformes 2,8 1,6 0,9 - 2,7 3,1 5,9 2 - 2,1
A: Tessi et al. (1979) (Cuenca central santafesina), B: González et al. (1980) (Cuenca de Córdoba), C: Calvinho
et al. (1991a), (Cuenca Central Santafesina), D: Giraudo et al. (1995) (Cuenca de Córdoba), E: Chertcoff et al.
(1996) (varias cuencas); F: Tirante et al. (1998) (varias cuencas); G: Acuña et al. (2001) (varias cuencas); H:
Chaves et al. (2001) (varias cuencas); I: Amand de Mendieta et al. (2001) (Cuenca Mar y Sierras); J: Dieser et al.
(2014) (Cuenca Villa María)
Prevalencia organismos patógenos en Argentina (MC)
ORGANISMOS A
(n=278)
B
(n=342)
C
(n=238)
D
(n=1458)
E
(n=2138)
F
(n=310)
G
(n=585)
S. aureus 34,45% 18,1% 30,5% 29,2% 23,24 6,45 10,25
SCN 2,1% - 19,4% 12,7% 17,96 12,26 18,46
S. agalactiae 13% 36,5% 7,7,% 3,9% 1,49 - -
S. uberis 11% - 10% - 27,5 32,9 44,78
S. dysgalactiae 1,7% - 19,8% 15,9% - - -
Streptococcus spp. - 6,4% 1,4% 19,8% 13,23 18,06 6,49
Coliformes 20% 2,6% 7,1% 4,4% 11,4 24,51 7,52
Otros 17,75 36,4 4,1 14,1 5,18 5,82 12,5 A: González & Echaide (1983) (Valle de Lerma, Salta); B: Rivero et al. (1984) (Cuenca Abasto a Buenos Aires); C: Calvinho et al. (1991b), (Cuenca Central Santafesina); D: Chertcoff et al. (2001) (Buenos Aires), E: Izak et al. (2007) (Varias cuencas), F: Izak & Ackerman (2010) (Varias cuencas), G: Rodriguez et al. (2015) (Oeste Buenos Aires)
Programa de 10 puntos (NMC)
• Establecer objetivos
• Mantener ambiente limpio
y seco
• Adecuada rutina de ordeño
• Llevar registros
• Manejo adecuado mastitis
clínicas
• Manejo adecuado vaca
seca
• Bioseguridad patógenos
contagiosos
• Monitoreo salud mamaria
• Revisión periódica
programa control
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Definición IIM y mastitis
Infección
intramamaria
Mastitis
Federación
Internacional de
Lechería (FIL)
Infección en tejido
secretorio y/o ductos y
túbulos de GM
Inflamación de uno o
más cuartos de GM,
causada casi siempre
por microorganismos
Diagnosticada por: Cultivo bacteriológico
de muestras obtenidas
asépticamente
Subclínica: indicadores
de inflamación en
muestras de leche
(RCS o CMT)
Clínica: observación
visual de leche y/o
examen físico de GM 10
Cultivo bacteriológico
A nivel de cuarto, vaca o rodeo (tanque)
Información para: diagnóstico inicial, optimizar
estrategias de control, optimizar tratamientos
antibióticos, detectar reservorios
11
Conocimiento del agente causal
Distintas características
patológicas y
epidemiológicas
Distintas estrategias y
programas de control
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Cultivo de leche de vaca
Mastitis clínicas: cuartos mamarios
Información histórica sobre evolución patógenos
Selección de cuartos por CMT ó RCS: aumenta
posibilidad aislamiento (cocos ambientales y S. aureus)
Programas especiales: segregación en control S. aureus,
terapia blitz Str. agalactiae
¿Cuándo es necesario? ¿Para qué?
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Procedimientos básicos del cultivo
Incubación en
ambiente aerobio
Medio de
aislamiento
primario: agar
sangre
Siembra de un
inóculo (muestra)
Identificación de organismos
Nivel mínimo de identificación
Streptococcus
Diferenciar Str. agalactiae de otros Streptococcus
Las otras especies pueden indicarse como: Streptococcus no agalactiae
Nivel mínimo de identificación
Staphylococcus
Diferenciar Staphylococcus coagulasa pos de neg
Aproximadamente el 95% de coagulasa + son S. aureus
Prueba de clumping factor Coagulasa en tubo
16
Staphylococcus coagulasa negativos
Varias
especies (>40)
Colonizadores
residentes de piel de
glándula mamaria
Daño menor o
leve al tejido
mamario
Posible
permanencia en
tejido y
disminución de
producción láctea
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Coliformes
Corta duración (más del 50% menores a 10 días)
80-90% IIM en lactancia dan signos clínicos
Desde casos leves a sistémicos
Alrededor de 10% de casos clínicos resultan en peragudas (periparto) Bannerman et al (2004)
Nivel mínimo de identificación
Coliformes y otros Gram negativos
Morfología colonial y pruebas bioquímicas básicas
Es factible llegar a nivel de Género en laboratorio de rutina
Colonias en agar sangre Medio TSI
Diagnóstico bacteriológico de rutina
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También detecta
organismos ante
los cuales no se
recomienda
administración de
terapia antibiótica
o requieren
terapia no usual
Prototheca, Nocardia,
Trueperella
Bacillus cereus
Levaduras
Prototheca
Algas aclorofílicas causantes de
mastitis subclínica, clínica (aguda o
crónica)
P. zopfii y P. wickerhamii
Fuentes: suelo, plantas, aguas estancadas, corrales de espera,
heces bovinas y porcinas Diseminación: higiene pobre,
transferencia de vaca a vaca en ordeño
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Bacillus cereus
Puede causar mastitis aguda, a veces gangrenosa (Penicilina resistente)
Fuentes: suelo, agua, polvo, aire, materia fecal, vegetación, silos en mal estado, heridas,
abscesos, prácticas poco higiénicas
Bacillus cereus
Leche compuesta vs. Leche de cuartos (Reyher & Dohoo, 2011)
• Se para S. aureus y S. dysgalactiae fue de 77,1%
y 73,4% respectivamente
• Se S. uberis 62,1%
• La especificidad para patógenos mayores y
menores superó el 95%
Limitantes
23
10 – 40% muestras MC sin desarrollo
Nº organismos debajo límite
detección
Organismos no cultivables en medios estándar
(Mycoplasma)
TRATAMIENTO ANTIBIÓTICO DE MASTITIS CLÍNICAS
Coliformes vs S. aureus
Bannerman et al., 2004
Vacas promediando lactancia.
Diagnóstico bacteriológico de
coliformes no siempre eficaz
Casos leves: beneficio de
uso de ATM discutido
¿Cepas crónicas?
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Limitantes
Infecciones subclínicas sin
desarrollo
Infecciones latentes
Ciclos de eliminación de patógenos
¿Es posible incrementar la recuperación de patógenos?
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Preincubación
Mayor inóculo (0.05-0.1 mL)
Congelado-preincubación
¡¡¡Posible contaminación!!!
$$$
S. aureus
Cultivo en tambo
Guía para elegir tratamiento
Fincas con alto número
casos clínicos
27 LDS (2008)
Patógenos más frecuentes
Costo beneficio positivo
Requiere entrenamiento
Métodos moleculares
Principio de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
Costoso PCR separada para cada agente
Multiplex PCR (Phuektes et al.,
2003; Bottero et al., 2004)
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PCR en tiempo real
Disponible comercialmente
Resultados en pocas hs
11 patógenos de mastitis y gen de β-
lactamasa
Muestras con conservante (control
lechero) 29
PCR en tiempo real
30
Alta sensibilidad (100%) y especificidad (99%)
Mayor inversión inicial
Alto costo por muestra
Pruebas de susceptibilidad a atb (PSA)
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PSA: desarrolladas con
objetivo terapéutico
Procedimientos
estandarizados
(CLSI u otros):
antibiograma y CIM
Escasa información
sobre criterios
interpretación
antibiograma en MV
Predecir
eficacia de
curación
¿Qué es la CIM?
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La Concentración Inhibitoria Mínima es la mínima
concentración de ATB que es capaz de inhibir in
vitro el crecimiento bacteriano en un período
determinado de tiempo
CIM90 y CIM50
Diluciones seriales
Desarrollo Sin desarrollo
Inoculación desde
CIM
a medio sin atb
CIM
CBM
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Criterios de interpretación del antibiograma
¿Cómo se establecen?
CIM de colección de cepas y datos de farmacocinética del antibiótico: selección de un
punto de corte inicial de CIM
Parámetro final: respuesta clínica con dosis aprobada (eficacia >
85%)
¿Qué criterios de interpretación usamos para patógenos de mastitis?
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GRUPO A: pirlimicina, penicilina+novobiocina y ceftiofur (datos
PSA de patógenos de mastitis y datos cinéticos obtenidos por
infusión intramamaria)
GRUPO B: ampicilina, cefalotina, cloxacilina, eritromicina,
penicilina y tetraciclina basados en criterios de interpretación
para seres humanos
Thornsberry et al (1997)
Falsos resistentes
Russi et al. (2015)
¿Hay relación entre PSA y respuesta a la terapia?
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Mayores tasas de curación
con beta lactámicos en IIM
clínicas y subclínicas por S.
aureus Pen sensibles (Ziv &
Storper, 1985; Pyörala &
Pyörala, 1998)
Falta de asociación
entre curación y PSA
frente a Streptococcus
ambientales (Catell et
al., 2001; Constable &
Morin, 2002)
Buena predicción en casos por S.
aureus y Streptococcus, pero
disminuye en casos crónicos por
S. aureus (Owens et al., 1997)
Valor del antibiograma
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Susceptibilidad in
vitro no garantiza
eficacia in vivo
(Hoe & Ruegg, 2005)
La resistencia a
antibióticos no se
considera un
problema mayor
Hay menores tasas
de curación en S.
aureus penicilino-
resistentes
Alrededor de un 50%
de los aislamientos de
S. aureus de Argentina
son penicilino-
resistentes (Gentilini
et al., 2000; Russi et
al., 2008)
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Patrones de susceptibilidad a atm
• Útiles para monitorear cambios temporales
• Uso de resultados de PSA dilución en caldo o
agar (CIM) o difusión en agar (“antibiograma”)
• Análisis para detectar emergencia de resistencia
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Estudios sobre tendencias
38 Oliver & Murinda, 2012
Estudios sobre tendencias
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Oliver & Murinda, 2012
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Conclusiones
El cultivo de leche de vaca brinda importante
información para establecer y monitorear programas
de control, así como para seleccionar los antibióticos
más adecuados
El antibiograma es un recurso con limitaciones para
predecir eficacia de curación, aunque puede brindar
información de utilidad para la elección del
antibiótico
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