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Dr. Claudio Martínez DebatVersión Original: Dra Mónica Marín

Sección Bioquímica

Módulo III:Vías de la información

genética2019Intro

Replicación

Módulo III:Vías de la información genética

• Estudio Bioquímico de:• Replicación• Transcripción• Traducción• Procesamiento• Regulación

• Biología Molecular• Ingeniería Genética

Bibliografía:Mathews, Van Holde, Ahern, Bioquimica, 3er EdLehningerWatson, 5ta Ed (2005)

Principales procesos:

Replicación

ADN

Transcripción Traducción

ARN Polipéptido

4 “letras” 4 “letras” 20 “letras”

Particularidad: necesidad de un moldeEspecificidad de la reacción: enzima + molde

Replicación del ADN

Sencillo, conceptualmenteComplejo, el mecanismo

Modelo de Watson-Crick

Mapa genético de E. Coli: genes que intervienen en el metabolismodel ADN

Modelos de replicación

conservativo semi-conservativo

o dispersivo

v

Experimento de Meselson-Stahl (1958)

Algunas preguntas...

• ¿Cómo se separan las hebras y se rompen los puentes que estabilizan la doble hélice?

• ¿Cómo se reconoce el origen de la replicación?• ¿Cómo se regula la síntesis del ADN?

• ¿Cómo se coordina la replicación del ADN con la división celular?

• ¿Qué mecanismos aseguran la elevada fidelidad de la replicación? mayor a la estimada por Watson y Crick?

Generalidades

• Semiconservativa

• Ordenada y secuencial

• Discontinua (fragmentos de Okazaki)

• Utiliza sustratos activados: dNTPs

• Es el proceso enzimático más exacto que se conoce

v

Dirección de la replicación:

¿ unidireccional / bidireccional ?

Unidireccional

Replicación de ADN mitocondrial: unidireccional

Replicación Bidireccional

La reacción catalizada por la ADN polimerasa:reacción de elongación

Ataque nucleofílico sobre fosfato alfa del dNTP entrante

5’ 3’

Requiere un extremo 3’OH libre

v

(dNMP) n + dNTP (dNMP) n+1 + PPi

∆G = - 3.5 kcal / mol

Hidrólisis del PPi por la pirofosfatasafavorece la síntesis

PPi 2 Pi

(dNMP) n + dNTP (dNMP) n+1 + 2Pi∆G = -7 kcal / mol

Sitio activo de la ADN pol : 2 cationes (Mg++) participan en la reacción

Replicación in vivo

•Etapas:

• Iniciación• Elongación• Terminación

v

sobre el origen de replicación....

• ¿cómo es la señal en el ADN que marca el origen?

• ¿qué proteínas reconocen esa señal? • ¿cómo se regula el inicio de la síntesis de

ADN a partir del origen?

¿Qué particularidad tiene el ADN en el sitio de inicio de la replicación?

3 secuencias repetidas,

directas, de 13 pb, ricas en AT

5 repetidos inversos, de 9 pb

Modelo de la iniciación de la replicación en oriC, en E. coli

HUIHF

DnaA (ATP, sensa lípidos)DnaB (helicasa ATP dep.)

DnaCDnaG (primasa, ARN pol.)SSB (single strand binding

Prot., 4x 19 kDa.)

Proteínas que interactúan con el ADN en el sitio de inicio de la replicación ► •Iniciación

Fragmentos de Okazaki

La síntesis es un proceso discontinuo

•Elongación

Horquilla de replicación

v

ADN polimerasa III de E. coli

D. R. Herendeen and T. J. Kelly, Cell (1996) 84:5-8.

Estructura de la holoenzima ADN pol III de E. coli

(Abrazadera deslizante)

Síntesis del ADN por la holoE ADNpol III

Una enzima sintetiza la hebra continua y dos sintetizan la hebra rezagada, en forma alternada

Animación modelo del trombon. (del CD de Biología Molecular del Gen, Watson)

ADNpol I:Reacción de corrimiento del corte, desplazamiento de la mella, o de “nick translation”

◄

Reacción catalizada por la ADN ligasa

Terminación

►

Modelo de acción de las helicasas

G. Waksman from S. Korolev et al., Cell (1997) 90:635-647.

Helicasas: catalizan el desenrollamiento de la doble hélice, rompen los puentes de hidrógeno

ADN superenrollado.

Las topoisomerasas

• Descubiertas en los años 70• Enzimas que catalizan la interconversión de

topoisómeros• Eliminan el estrés torsional generado por el

avance de la replicación

El avance de la replicación a 100 000 pb / min genera problemas topológicos en el ADN

Topoisomerasas de tipo I : cortan 1 sola hebra

La enzima se une covalentemente al extremo 5’ del corte formando un enlace fosfodiester con el OH- de la Tyr en el sitio activo.

Topoisomerasas de tipo IIcatalizan el corte de las 2 hebras

ADN girasa, la mas importante en la replicación de E. coli, adelante y atrás de la horquilla. Es un tetrámero.

Inhibidores específicos de topoisomerasas :son eficaces drogas antibacterianas

Ejemplos:

• El ácido nalidíxico- se une a la subunidad A

• Novobiocina : se une a la subunidad B

Topoisomerasas participan en la terminación de la replicación de moléculas circulares.

Fidelidad de la replicación (10-10)

Verificación del correcto apareamiento de bases se da a diferentes niveles:

• 1) durante la polimerización (10-5-10-6)• 2) prueba de lectura : exonucleasa 3’• 3) reparación de ADN nuevo, de bases mal

apareadas

Otros mecanismos reparan el ADN dañadoposteriormente (radiación uv, por ej.)

•1) durante la polimerización

2) prueba de lectura : exonucleasa 3’

►

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Replicación y ADN polimerasas en eucariotas

Cantidad de ADN, pb/ cél. 3.9 106 109

Velocidad avance horquilla µm/min 30 3

Velocidad de replicación, nt/seg 850 60-90

Número de orígenes / célula 1 103-104

Tiempo 1 replicación genómica (hs) 0.67 8

Tiempo 1 división celular (hs) 0.33 24

E. coli | Cél humanas

Replicación en E. coli | Homo sapiens

Un origen o varios orígenes de replicación ?ARS (secs. replicación autónoma, replicadores, levaduras)

Inicio de la Replicación en Eucariotas

ORC: complejo de reconocimiento del origen, Proteínas vinculadas al ciclo celular

CDC6, CDT1(DnaC) complejo MCM (heterohexámero)(prots. Mantenimiento minicromosoma)Helicasa DnaB

ADN polimerasas en células eucariotas

*~ primasa cebadores

* | ~ ADN pol IElongacion+ PCNA ~ sub β ADN pol III

Otras: RPA (prot. Repl. A) ~ SSB RFC (factor C de repl. ~ sub γ ADN pol III

Métodos de análisis: basados en la síntesis enzimática de ADN in vitro

• Secuenciación del ADN• Amplificación por PCR

Requieren: - ADN molde, cadena simple - Cebador (primer) - Precursores (dNTPs) - Enzima: ADN polimerasa - solución tampón, Mg++

dNTPs + ddNTPs

v

Desnaturalización del ADN(90-95ºC)

Hibridización de los cebadores(50-60 ºC)

Polimerización del ADN(37 ºC)

FragmentoKlenow de la

ADN polimerasa I de E.coli

Antaño:

60

Amplificación de una secuencia específica por PCR

Reacción en Cadena de la Polimerasa

(USA, n. 1944, PN 1993)

Single Cycle

Automatización del ciclado de las temperaturas de reacción

95

5572

1 min.

1 min.1 min.

30-35 ciclos

Tem

pera

tura

(ºC

)

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DiagnósticoBacteriasParásitosVirus a ADNTrazabilidad

HerenciaSNPDelecionesInserciones

Análisis de un producto de PCR por electroforesis en gel de agarosa

Visualización: con Bromuro de etidio y luz UV (b/n)

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PCR

Secuenciación enzimática del ADN

• Método de Sanger

• Se basa en la síntesis de ADN in vitroen donde la incorporación de los dNTPs compite con la incorporación de inhibidores ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP).

. La secuencia de bases en el ADN se determina por el tamaño relativo de las cadenas sintetizadas, por electroforesis

Secuenciación

Genómica

(Fred Sanger, n. 1918, PN 1958 y 1980)

(Craig Venter, USA, n. 1946)

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Secuenciación en movimiento

¿Cómo completar la replicación de genomas lineales?

Replicación de los telómeros

Los telómeros contienen una secuencia corta rica en Guanina repetida cientos de veces (por ej.emplo 5' TTGGGG 3' en el ciliado Tetrahymena). Además, los telómeros poseen extremos 3' monocatenarios que pueden autoaparearse y suministrar un extremo 3' para replicar los extremos.

La Telomerasa añade secuencias (TTGGGG) a los extremos cromosómicos. La Telomerasa tiene una secuencia corta de ARN (por ej. AACCCC) que sirve de molde para sintetizar la secuencia repetida de los extremos (TTGGGG). Es una transcriptasa inversa, ya que tomando como molde ARN sintetiza ADN.

Retrovirustranscriptasa reversa

Regulacion y control de la replicación del ADN

AZT,

3'-Azido-2'3'-Dideoxitimidina

AZT 1ra droga aprobada en EEUU para el tratamiento del HIV. Este nucleósido se transforma en el correspondiente 5' trifosfato, el cual actúa como inhibidor de la transcriptasa reversa viral

Otros inhibidores de la transcriptasa reversa.

Dímeros de timidina

Reparación del daño en el ADN por recombinación

Bricolage: Recortar y pegar el ADN

• Nota: todas las imágenes contenidas en este documento son de dominio público y libremente accesibles vía Internet. El presente material refleja el trabajo de preparación de las clases correspondientes por parte de los docentes responsables, no tiene fines de lucro y sí docentes, sin pretender sustituir a la bibliografía recomendada.