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• Dr. Juan Rodríguez-Tafur D.
Prof. Asociado de Farmacología e Inmunología
Facultad de Medicina
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
• Secretario General
Sociedad Peruana de Inmunología y Alergia
Fundamentos de Biología
Molecular y su utilidad en
la práctica médica.
1 Gen 1 o más funciones
ARNADN
GEN
Proteína
2-5 FUNCIONES
Expresión Génica
Transcripción / traducción
>300 ’000 funciones
(>150 ’000 funciones)
100 ’000 genes
(50 ’000 genes?)
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan Rodriguez-T
2012
Que es un gen?: un segmento de ADN que
actua como una maquina regulada para
producir ARN
ARNADN Proteína
GEN FUNCIONTranscriptión / traducción
codificanteespaciador espaciadorregulator
ADN
ARN
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan Rodriguez-T
2012
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR
1 Organismo mas de 105
funciones geneticamente controladas
2m 2 mm 0.2mm
0.02mm
ADN ARN Proteína
0.001mm
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan Rodriguez-T
2012
Organismos Modelos
Secuenciación en progreso:
Estructura Genómica
• 3 GB
• Solo el 3% codifica proteínas!!
• ~50% secuencias
repetitivas
ARN ADN
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan Rodriguez-T
2012
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR
ES POSIBLE TRANSGREDIRLO?
La hipótesis de Howard
Temin (1970) y el descubrimiento
de la Transcriptasa reversa
TRANSCRIPTASA
REVERSA
Proteína?
Inserció
n
Genoma
del
Huésped
VIH
ARN
VIH
mARN
VIH
AR
N
VIH
ARN
S. S.
VIH
ADN
VIH
proteínas
precursor
as
VIRUS
NUEVO
RIBOSOMAS
VIH LG. PROTEINAS
INTEGRASA
TRANSCRIPTASA
REVERSA
VIRUS
INFECTANTE
EMSAMBLAJE
D. S.
VIH
ADN
TRANSCRIPCION
REVERSAINTEGRACION
Paradigma de la Biología del reduccionismo
molecular (defectos génicos y transferencia
de genes)
GEN transferido FUNCION transferida
GEN KO FUNCION KO
GEN OK FUNCION OK
ADN
GEN
Proteína
FUNCION(s)
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan Rodriguez-T
2012
Variación GenéticaCCCCAGCCTCCTTGCCAACGCCCCCTTTCCCTCTCCCCCTCCCGCTCGGCGCTGACC
CCCCATCCCCACCCCCGTGGGAACACTGGGAGCCTGCACTCCACAGACCCTCTCCTT
GCCTCTTCCCTCACCTCAGCCTCCGCTCCCCGCCCTCTTCCCGGCCCAGGGCGCCG
GCCCACCCTTCCCTCCGCCGCCCCCCGGCCGCGGGGAGGACATGGCCGCGCACAG
GCCGGTGGAATGGGTCCAGGCCGTGGTCAGCCGCTTCGACGAGCAGCTTCCAATAA
AAACAGGACAGCAGAACACACATACCAAAGTCAGTACTGAGCACAACAAGGAATGTC
TAATCAATATTTCCAAATACAAGTTTTCTTTGGTTATAAGCGGCCTCACTACTATTTTAA
AGAATGTTAACAATATGAGAATATTTGGAGAAGCTGCTGAAAAAAATTTATATCTCTCT
CAGTTGATTATATTGGATACACTGGAAAAATGTCTTGCTGGGCAACCAAAGGACACAA
TGAGATTAGATGAAACGATGCTGGTCAAACAGTTGCTGCCAGAAATCTGCCATTTTCT
TCACACCTGTCGTGAAGGAAACCAGCATGCAGCTGAACTTCGGAATTCTGCCTCTGG
GGTTTTATTTTCTCTCAGCTGCAACAACTTCAATGCAGTCTTTAGTCGCATTTCTACCA
GGTTACAGGAATTAACTGTTTGTTCAGAAGACAATGTTGATGTTCATGATATAGAATTG
TTACAGTATATCAATGTGGATTGTGCAAAATTAAAACGACTCCTGAAGGAAACAGCAT
TTAAATTTAAAGCCCTAAAGAAGGTTGCGCAGTTAGCAGTTATAAATAGCCTGGAAAA
GGCATTTTGGAACTGGGTAGAAAATTATCCAGATGAATTTACAAAACTGTACCAGATC
CCACAGACTGATATGGCTGAATGTGCAGAAAAGCTATTTGACTTGGTGGATGGTTTTG
CTGAAAGCACCAAACGTAAAGCAGCAGTTTGGCCACTACAAATCATTCTCCTTATCTT
GTGTCCAGAAATAATCCAGGATATATCCAAAGACGTGGTTGATGAAAACAACATGAAT
AAGAAGTTATTTCTGGACAGTCTACGAAAAGCTCTTGCTGGCCATGGAGGAAGTAGG
CAGCTGACAGAAAGTGCTGCAATTGCCTGTGTCAAACTGTGTAAAGCAAGTACTTACA
TCAATTGGGAAGATAACTCTGTCATTTTCCTACTTGTTCAGTCCATGGTGGTTGATCTT
AAGAACCTGCTTTTTAATCCAAGTAAGCCATTCTCAAGAGGCAGTCAGCCTGCAGATG
TGGATCTAATGATTGACTGCCTTGTTTCTTGCTTTCGTATAAGCCCTCACAACAACCAA
CACTTTAAGATCTGCCTGGCTCAGAATTCACCTTCTACATTTCACTATGTGCTGGTAAA
TTCACTCCATCGAATCATCACCAATTCCGCATTGGATTGGTGGCCTAAGATTGATGCT
GTGTATTGTCACTCGGTTGAACTTCGAAATATGTTTGGTGAAACACTTCATAAAGCAG
TGCAAGGTTGTGGAGCACACCCAGCAATACGAATGGCACCGAGTCTTACATTTAAAG
AAAAAGTAACAAGCCTTAAATTTAAAGAAAAACCTACAGACCTGGAGACAAGAAGCTA
TAAGTATCTTCTCTTGTCCATGGTGAAACTAATTCATGCAGATCCAAAGCTCTTGCTTT
GTAATCCAAGAAAACAGGGGCCCGAAACCCAAGGCAGTACAGCAGAATTAATTACAG
GGCTCGTCCAACTGGTCCCTCAGTCACACATGCCAGAGATTGCTCAGGAAGCAATGG
AGGCTCTGCTGGTTCTTCATCAGTTAGATAGCATTGATTTGTGGAATCCTGATGCTCC
TGTAGAAACATTTTGGGAGATTAGCTCACAAATGCTTTTTTACATCTGCAAGAAATTAA
CTAGTCATCAAATGCTTAGTAGCACAGAAATTCTCAAGTGGTTGCGGGAAATATTGAT
CTGCAGGAATAAATTTCTTCTTAAAAATAAGCAGGCAGATAGAAGTTCCTGTCACTTTC
CCCCAGCCTCCTTGCCAACGCCCCCTTTCCCTCTCCCCCTCCCGCTCGGCGCTGACC
CCCCATCCCCACCCCCGTGGGAACACTGGGAGCCTGCACTCCACAGACCCTCTCCTT
GCCTCTTCCCTCACCTCAGCCTCCGCTCCCCGCCCTCTTCCCGGCCCAGGGCGCCG
GCCCACCCTTCCCTCCGCCGCCCCCCGGCCGCGGGGAGGACATGGCCGCGCACAG
GCCGGTGGAATGGGTCCAGGCCGTGGTCAGCCGCTTCGACGAGCAGCTTCCAATAA
AAACAGGACAGCAGAACACACATACCAAAGTCAGTACTGAGCACAACAAGGAATGTC
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AGAATGTTAACTATATGAGAATATTTGGAGAAGCTGCTGAAAAAAATTTATATCTCTCT
CAGTTGATTATATTGGATACACTGGAAAAATGTCTTGCTGGGCAACCAAAGGACACAA
TGAGATTAGATGAAACGATGCTGGTCAAACAGTTGCTGCCAGAAATCTGCCATTTTCT
TCACACCTGTCGTGAAGGAAACCAGCATGCAGCTGAACTTCGGAATTCTGCCTCTGG
GGTTTTATTTTCTCTCAGCTGCAACAACTTCAATGCAGTCTTTAGTCGCATTTCTACCA
GGTTACAGGAATTAACTGTTTGTTCAGAAGACAATGTTGATGTTCATGATATAGAATTG
TTACAGTATATCAATGTGGATTGTGCAAAATTAAAACGACTCCTGAAGGAAACAGCAT
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GGCATTTTGGAACTGGGTAGAAAATTATCCAGATGAATTTACAAAACTGTACCAGATC
CCACAGACTGATATGGCTGAATGTGCAGAAAAGCTATTTGACTTGGTGGATGGTTTTG
CTGAAAGCACCAAACGTAAAGCAGCAGTTTGGCCACTACAAATCATTCTCCTTATCTT
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AAGAAGTTATTTCTGGACAGTCTACGAAAAGCTCTTGCTGGCCATGGAGGAAGTAGG
CAGCTGACAGAAAGTGCTGCAATTGCCTGTGTCAAACTGTGTAAAGCAAGTACTTACA
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AAGAACCTGCTTTTTAATCCAAGTAAGCCATTCTCAAGAGGCAGTCAGCCTGCAGATG
TGGATCTAATGATTGACTGCCTTGTTTCTTGCTTTCGTATAAGCCCTCACAACAACCAA
CACTTTAAGATCTGCCTGGCTCAGAATTCACCTTCTACATTTCACTATGTGCTGGTAAA
TTCACTCCATCGAATCATCACCAATTCCGCATTGGATTGGTGGCCTAAGATTGATGCT
GTGTATTGTCACTCGGTTGAACTTCGAAATATGTTTGGTGAAACACTTCATAAAGCAG
TGCAAGGTTGTGGAGCACACCCAGCAATACGAATGGCACCGAGTCTTACATTTAAAG
AAAAAGTAACAAGCCTTAAATTTAAAGAAAAACCTACAGACCTGGAGACAAGAAGCTA
TAAGTATCTTCTCTTGTCCATGGTGAAACTAATTCATGCAGCTCCAAAGCTCTTGCTTT
GTAATCCAAGAAAACAGGGGCCCGAAACCCAAGGCAGTACAGCAGAATTAATTACAG
GGCTCGTCCAACTGGTCCCTCAGTCACACATGCCAGAGATTGCTCAGGAAGCAATGG
AGGCTCTGCTGGTTCTTCATCAGTTAGATAGCATTGATTTGTGGAATCCTGATGCTCC
TGTAGAAACATTTTGGGAGATTAGCTCACAAATGCTTTTTTACATCTGCAAGAAATTAA
CTAGTCATCAAATGCTTAGTAGCACAGAAATTCTCAAGTGGTTGCGGGAAATATTGAT
CTGCAGGAATAAATTTCTTCTTAAAAATAAGCAGGCAGATAGAAGTTCCTGTCACTTTC
La diferencia genómica entre dos individuos genéticamente
no relacionados es de 0.01%
No solamente el genoma determina el
estatus de la salud.....surgimiento de la
Epigenética.
genética conducta medioambiente
Distrofia Muscular
Obesidad
Arterioesclerosis
Enf. de Alzheimer
Parkinson
Drogadicción
Ca Mama Familiar
Cancer Pulmón
Ca Mama Espor.
También condiciones adquiridas
pueden tener componentes
genéticos
que modulan su reparación
trauma
fracturas
quemaduras
infecciones
Fac. Med.
UNMSM
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2012
Amplificación Génica / técnicas de
manipulación (ingenieria genética, ADN
recombinante)
segmentos de ADN genómico pueden ser
especificamente cortados y aislados
segmentos aislados pueden recombinarse con un
plasmidio vector
plasmidio vector es transferido a una bacteria donde se
multiplica
ADN aislado recombinante puede ademas ser
recombinado para obtener la molécula final deseada
molecula final es transferida dentro de las células u
organismos
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan Rodriguez-T
2012
Las TRES misiones de la medicina:
Impacto de las técnicas moleculares
Prevención
Diagnóstico
Terapia
Medicina MolecularAplicación de la
Genética
molecular a la Medicina
+
+
+
Fac. Med.
UNMSM
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2012
Las CUATRO eras de la medicina
molecular
Los Ochenta
Genes como
sondas
ok ** ** **ok1 2 4 53
Los Noventa
Genes como
factorias
80 85 90 95 99
10
50
A partir del 2000
Genes como
fármaco
80 85 90 95 00
1000
3000
Y2000+n Era post-genómica = mejoras tecnológicas
Fac. Med.
UNMSM
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2012
Inversion Alta y a largo plazo
- Costos : 300~700M U$ /producto
- Tiempo : 10~15 años
Alto riesgo
- Taza de exito : 0.02%
(Descubrimiento/Preclínico 5000 Clinico 5
Aprobación 1)
Alto retorno
- Pico de venta: 0.3~8.6B U$ /year
-Protección de Patente : generalmente, 8~12 años
despues de aprobado.
El costo verdaderamente asombroso
para Inventar nuevos medicamentos
FORBES 2/10/2012
Genética en Medicina
Nacimiento
genética
factores
medioambientales }prenatal
presintomática
enfermedad
Modelos
Genotipo
Fenotipo
Medioambiente
Modelos
Genotipo
Fenotipo
Medioambiente
Modelos
Genotipo
Fenotipo
Medioambiente
Medicina en Transformación
Dos Fuerzas ConvergentesTecnologías de la Información Genética
Test Predictivos y prevención
Estratificación de la enfermedad y blancos terapéuticos
Farmacogenética y farmacogenómica
“Medicina Individualizada”
Los más importantes retos médicos
de siglo 21: Envejecimiento
60
70
80
50
1920 1940 1960 1980 1991900
Life e
xpecta
ncy (
CH
)
aa getting oldcomp2.mov
Fac. Med.
UNMSM
Dr. JuanRodriguez-
T
2012
Los más importantes retos médicos
de siglo 21: Envejecimiento
60
70
80
50
1920 1940 1960 1980 1991900
Life e
xpecta
ncy (
CH
)
aa getting oldcomp
Fac. Med.
UNMSM
Dr. JuanRodriguez-
T
2012
4
20 40 60 80
100
10
1
cancer
incid
ence
1900 2000
Los más importantes retos médicos
de siglo 21: Envejecimiento
60
70
80
50
1920 1940 1960 1980 1991900
Life e
xpecta
ncy (
CH
)Fac. Med.
UNMSM
Dr. JuanRodriguez-
T
2012
4
20 40 60 80
100
10
1
cancer
incid
ence
1900 200020 40 60 80
100%
M
E2/E
E3/E4
E4/E4
Alz
heim
er’
s f
ree %
1900 2000
Terapia con Genes Somáticos
(transferencia de genes somaticos)
Definicion de TG:
'Uso de genes como
fármacos:
Corregir enfermedades por
Transferencia de genes
somáticos
Tratamiento Crónico
Tratamiento Agudo
Tratamiento Preventivo
Enfer. Hereditarias
Enfer. Adquiridas
Perdida función
Ganancia función
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
TRES clases de Aplicacion fisiológica de
genes
Ex-vivo In-vivo
Adm. topica
In-vivo
Adm. sistemica
V
Ejemplos:
- Medula osea
- Cels hepaticas
- Cels piel
Ejemplos:
- cerebro
- musculos
- ojos
- articulaciones
- tumores
Ejemplos:
- intravenosa
- intra-arterial
- intra-peritoneal
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
Dos clases de genes transferidos: no viral y
viral
a
b
No transf. viral
(transfeccion)
Transf. gen Viral
(Infeccion)
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
Lista de vectores populares/métodos
Adenovirus
Adeno-asociados V.
Retrovirus (incl. HIV)
ADN desnudo
Liposomas & Co.
Oligonucleotidos
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan Rodriguez-
T
2012
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
Geneterapia Historia
1990, 1993, 2000 // ADA deficiency
F Anderson, M Blaese // C Bordignon
Anderson, 1990
Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)
proves efficacy of the same protocol
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
Geneterapia Historia
1990, 1993, 2000 // ADA deficiency
F Anderson, M Blaese // C Bordignon
1997, 2000, Critical limb ischemia
J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner,
Circulation 1998
Isner, 1998
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
Geneterapia Historia
1990, 1993, 2000 // ADA deficiency
F Anderson, M Blaese // C Bordignon
1997, 2000, Critical limb ischemia
J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation
19981998, Restenosis
V Dzau, HGT 1998
Dzau, 1999
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
Geneterapia Historia
1990, 1993, 2000 // ADA deficiency
F Anderson, M Blaese // C Bordignon
Anderson, 1990
Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)
proves efficacy of the same protocol
1997, 2000, Critical limb ischemia
J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation
1998
Isner, 1998
1998, Restenosis
V Dzau, HGT 1998
Dzau, 1999
1999, Crigler Njiar (animal)
C Steer, PNAS 1999
Kmiec, 1999
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
Geneterapia Historia
1990, 1993, 2000 // ADA deficiency
F Anderson, M Blaese // C Bordignon
Anderson, 1990
Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)
proves efficacy of the same protocol
1997, 2000, Critical limb ischemia
J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation
1998
Isner, 1998
1998, Restenosis
V Dzau, HGT 1998
Dzau, 1999
1999, Crigler Njiar (animal)
C Steer, PNAS 1999
Kmiec, 1999
2000, Hemophilia
M Kay, K High
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
Geneterapia Historia
1990, 1993, 2000 // ADA deficiency
F Anderson, M Blaese // C Bordignon
Anderson, 1990
Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)
proves efficacy of the same protocol
1997, 2000, Critical limb ischemia
J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation
1998
Isner, 1998
1998, Restenosis
V Dzau, HGT 1998
Dzau, 1999
1999, Crigler Njiar (animal)
C Steer, PNAS 1999
Kmiec, 1999
2000, Hemophilia
M Kay, K High
2000, SCID
A Fischer, Science April 2000
Fischer, 2000
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
Geneterapia Historia
1990, 1993, 2000 // ADA deficiency
F Anderson, M Blaese // C Bordignon
Anderson, 1990
Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)
proves efficacy of the same protocol
1997, 2000, Critical limb ischemia
J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation
1998
Isner, 1998
1998, Restenosis
V Dzau, HGT 1998
Dzau, 1999
1999, Crigler Njiar (animal)
C Steer, PNAS 1999
Kmiec, 1999
2000, Hemophilia
M Kay, K High
2000, SCID
A Fischer, Science April 2000
Fischer, 2000
2000, correction Apo E4 (animal model)
G. Dickson, ESGT congress, 7.10.2000
Stockholm
Dickson, 2000
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan
Rodriguez-T
2012
Geneterapia Historia
1990, 1993, 2000 // ADA deficiency
F Anderson, M Blaese // C Bordignon
Anderson, 1990
Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)
proves efficacy of the same protocol
1997, 2000, Critical limb ischemia
J Isner († 4.11.2001), I Baumgartner, Circulation
1998
Isner, 1998
1998, Restenosis
V Dzau, HGT 1998
Dzau, 1999
1999, Crigler Njiar (animal)
C Steer, PNAS 1999
Kmiec, 1999
2000, Hemophilia
M Kay, K High
2000, SCID
A Fischer, Science April 2000
Fischer, 2000
2000, correction Apo E4 (animal model)
G. Dickson, ESGT congress, 7.10.2000
Stockholm
Dickson, 2000
2000, correction Parkinson (animal model)
P Aebischer, Science, Nov 2000
Aebischer, 2000
Inmunodeficiencia Combinada Severa Ligada al X
La IDCS-X es una inmunodeficiencia primaria
producida por la mutación del gen del receptor
gama común de IL2. El gen IL2RGAMMA es un
receptor para varias citoquinas. Este gen presenta
variantes que al momento alcanzan los 136 tipos.
Los pacientes presentan un compromiso profundo
del sistema inmunitario con afectación dela
inmunidad celular y humoral.
El gen ha sido mapeado en la región Xq13.1.
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan Rodriguez-T
2012
1
2
3 3
IL-2
gcsubunidad especifica
JAK3JAK1
STATSTAT
44
gen
6nucleo
membrana celular
5
IL-4
IL-7
IL-9
IL-15 desarrollo celulas NK
hematopoyesis
desarrollo celulas T
diferenciacion celular B
homeostasis celular T periferica
IL-21 maduracion/activacion celular T/B/NK
IL-2R IL-4R IL-7R IL-9R IL-15R
bg g g g
g IL-15IL-9IL-7IL-4IL-2
b
a
JAK1 JAK1 JAK1
JAK1
a
JAK3 JAK3 JAK3 JAK3 JAK3
T cell
homeostasis
T cell
development
HaematopoiesisTerminal B cell
maturation
NK cell
development
JAK1
g
JAK3
IL-21
IL-21R
T/B/NK cells
activation
a
JAK1
Otras moleculas putativas involucradas en T-B+ SCID
debido a defectos de la transducción de señales de citoquinas
David Vetter
WILCO CONRADI
En estos estudios, el ADNc γc se colocó bajo el control de la LTR vírica, y el MLVdefectuoso fue producido utilizando líneas celulares. Después de extensos estudiospreclínicos, 10 niños menores de 1 año se inscribieron entre 1999 y 2002 en un ensayodel gen SCID-X1 para terapia clínica.
En 9 de los 10 pacientes, la transferencia de genes γc en las células CD34 + resultó en laaparición linfocitos T y NK con el gen corregido. En 7 de los 9 pacientes que desarrollaronlas células T, y estas alcanzaron niveles normales al cabo de 3 meses y han permanecidoasí desde entonces, de acuerdo con los ultimos seguimientos.
Otros 2 pacientes sólo experimentan la reconstitución parcial de las células T,probablemente debido al menor número de células CD34 + con celulas γc + por kg querecibieron, lo que indica que una dosis umbral de células precursoras transducidas fuenecesario para lograr la reconstitución completa de las células T.
Ahora bien, 7.5 años más tarde, estos 7 pacientes mantener un sistema inmunefuncional, lo que les permite llevar una vida normal. La diversidad del repertorio decélulas T y las funciones de las células T se ha observado durante este período.
Ensayos terapéuticos con
el gen de SCID
Hasta la fecha, 17 de los 20 inscritos SCID-X1 pacientes han sido tratados con éxito enlos ensayos clínicos de Londres y París. Del mismo modo, la deficiencia de ADA tambiénse ha tratado con éxito utilizando un enfoque similar, que también se requiere laquimioterapia suave antes de someterse a la terapia génica. La inmunodeficiencia fueparcialmente o totalmente corregido en los 9 pacientes.
Se observó en la mayoría los vectores transgénicos integrados dentro de los genes.Esto podría ser una ventaja mejorando la transcripción del gen insertado.
Mutagénesis de inserción ocurrió en 3 pacientes con SCID-X1, la transferencia del genγc en las células CD34 + dio lugar a la proliferación clonal de células T que se convirtióen clínicamente evidente después de 3 años, lo que lleva a la muerte de un paciente,que fue controlado por la quimioterapia en otros 2 pacientes.
Estas complicaciones graves claramente son el resultado de la integración retroviralque condujo a una expresión aberrante del dominio del proto-oncogen LIM sólo 2(LMO2) en los 2 primeros casos observados.
Ensayos terapéuticos con
el gen de SCID
.
Mapa del gen LMO2 de activación de las inserciones de retrovirus vector.Los loci de inserción retroviral en las clonas de los primeros 2 casos de proliferaciónmonoclonal que se produjo en clonas de pacientes P4 y P5 se caracterizaron por PCR desecuenciación de la secuencia 5 'inserción fusión de la secuencia del gen LAM. Elpotenciador de la actividad el LTR provírico permitio la hiperexpresión de LMO2transcripciones de la esperada 3,3 kb de tamaño, así como la producción de una cantidadalta de proteína LMO2 normal.
Boy Living in Bubble Develops
Leukemia From Experimental Therapy
One of the first children in Britain to receive pioneering gene
therapy for an immune system disorder has developed
leukemia as a result of his treatment.
News of the Week
GENE THERAPY:
Second Child in French Trial Is Found to Have Leukemia
Eliot Marshall- For the second time in 4 months, a child has developed a
leukemia-like disease after receiving gene therapy at the Necker Hospital for
Sick Children in Paris. Concerned about the safety of such trials, the panel that
monitors U.S. research in the field scheduled a public meeting this week to
review the clinical data and weigh its next steps. Science 17 January 2003
El ensayo clinico se detuvo!
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan Rodriguez-T
2012
UPenn, Sept. 19, 1999, J. Wilson:in a trial with adenovirus mediated gene transfer to treat OTC
deficiency ornithine transcarbamylase ( (liver) one patient (Jesse
Gelsinger) died of a severe septic shock. Many trials were put on
hold for several months (years).
Cuatro lecciones amargas, pero solo un
tratamiento relacionado a muerte.
NY May 5, 1995, R. Crystal: in a trial with adenovirus mediated gene transfer to treat cystic
fibrosis (lung) one patient developed a mild pneumonia-like
condition and recovered in two weeks. The trial interrupted and
many others on hold.
Paris, Oct 2, 2002, A Fischer:in a trial with retrovirus mediated gene transfer to treat SCID
(bone marrow) one patient developed a leukemia-like condition.
The trial has been suspended to clarify the issue of insertional
mutagenesis, and some trials in US and Germany have been put
on hold.
Paris, Jan 14, 2003, A Fischer:a second patient of the cohort of 9 comes up with a similar
disease than the one reported in october 2002. 30 trials in USA
are temporarily suspended
Subidas y bajadas en el estado actual de la
Terapia Génica
Alto
Bajo
apre
cia
cio
n
reporte
NIH
Motulski
Lentivectores
en pre-clinica
Adeno III
J. Isner
ADA
R. Crystal
Adeno I
90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02
V.Dzau
A. Fischer
M. Kaylentivectores
en clinica?
C Bordignon
03
Eventos
Adversos
en
Paris
J. Wilson
J. Gelsinger
Fac. Med.
UNMSM
Dr. Juan Rodriguez-T
2012
TECNICAS EN BIOLOGIA
MOLECULAR
Southern Blot
Northern Blot
Westhern Blot
ELECTROFORESIS
Dogma central de la Biología Molecular
ADN ARN Proteína
Southern
Blot
Northern
Blot
Westhern
Blot
Edwin Southern
Oxford University, UK
Southern Blot
Propiedades estructurales del DNA
5’p OH3’
3’OH p5’
Las hebras de una molecula de DNA son Antiparalelas y complementarias
Complementaridad del DNA
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
5’p
p 5’
OH3’
3’ OH
Puentes
Hidrógeno
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
25°C
T G T T C A G CA
A C A A G T C GT
95°C
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
25°C
Desnaturalización/reasociación del DNA
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
25°C
T G T T C A G CA
A C A A G T C GT
25°C
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
25°C
Desnaturalización/reasociación del DNA
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
25°C
T G T T C A G CA
A C A A G T C GT
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
25°C
Desnaturalización/reasociación del DNA
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
25°C
T G T T C A G CA
A C A A G T C GT
95°C
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
25°C
Desnaturalización/reasociación del DNA
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
25°C
T G T T C A G CA
A C A A G T C GT
25°C
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
25°C
Desnaturalización/reasociación del DNA
T G T T C A G CA
AC AAG T CG T
Reasociación solo con cadenas complementarias
Hibridación
• Es la unión de dos cadenas de ácidos nucleicos complementarias para formar un duplex o molécula de cadena doble.
• Posibles híbridaciones
DNA-DNA
DNA-RNA
RNA-RNA
dsDNA ssDNA apareamiento inicial
dsDNA
DesnaturalizaciónReasociación
Renaturalización
T° T°
Sondas
• Una sonda es un fragmento de DNA que:
– Se puede marcar para ser identificado y medido
– Se hibrida a un DNA gracias a su complementaridad
• Tipo de marcajes
– Radioactivo (32P, 35S, 14C, 3H)
– Fluorescente
– Biotinilación (avidina-streptavidina)
• Hibridación de DNA inmobilizado en filtros (nylon)
Southern Blot
Nucleasas
Endonucleasa
5’ Exonucleasa 3’ Exonucleasa
Southern Blot
Enzima de Restriccion
ADN de variostamaños
Electroforesis en gel de agarosa
gel
Desnaturalizar - transferir a papel filtro.
blot
Hibridizar con la sonda
Visualizar
Desnaturalizar- transferir a papel filtro.
blot
Southern (y Northern) blot:
1. Electroforesis
Southern (y Northern) blot:
2. Transferir a papel filtro/membrana
Southern (y Northern) blot:
3. Hibridización a una sonda única marcada
Slot Blot
Southern Blot
Northern Blot
•Técnicamente es muy similar al Southern Blot,
la gran diferencia es que el ácido nucleico
inmobilizado en la membrana es ARN.
•Se utiliza primordialmente para el estudio de
la expresión de mRNA.
Northern Blot
Expresión del RNA mensajero del
transportador de colina murino mCHT
Westhern Blot
•Proteínas inmovilizadas en una membrana
(usualmente nitrocelulosa)
•Esta vez se utiliza para detectar las
proteínas un anticuerpo que esta marcado
con una enzima o un fluorocromo.
Westhern Blot
Ejemplos de Western Blots
Inducción de la
expresión de
un proteína
Verificar la
identidad de
una proteína
Dx de
enfermedades
infecciosas
Señalización
celular
Técnica de RT-PCR
C:\Users\Juan Rodriguez-Tafur\Desktop\transcriptasa reversa
Electroforesis en gel de células individuales (SCGE) o
Ensayo Cometa
Ensayo Cometa:
• Desarrollado originalmente para
evaluar el daño sobre el ADN en
células individuales
(Östling y Johanson 1984).
• Modificado posteriormente para
detectar tipos específicos de daño en el
ADN.
Evaluación de los resultados:
Clasificación visual de los cometas:
-Las células se clasifican en 4 o 5 tipos (Collins y col.; Kobayashi y col.)
de acuerdo al grado de daño que presenten.
-Tipo I : -Tipo II:
no dañadas poco dañadas
-Tipo III : -Tipo IV:
dañadas muy dañadas.
Aplicaciones el ensayo:
• Estudios de Genotoxicidad
• Apoptosis
• Biomonitoreo ambiental
• Reparación del ADN
• Daño oxidativo
Muchas Gracias…….
Dr. Juan Rodríguez-Tafur Dávila