Nicolas Mora

• Objetivos

• Dar a conocer los fundamentos de las técnicasbásicas en biología molecular.

• Conocer algunos métodos que permitan el estudiode la estructura molecular de la célula.

• Desarrollar habilidades y destrezas en la aplicaciónde las técnicas propuestas.

• Discutir las ventajas y limitaciones de cada uno delos métodos utilizados.

Conjunto de técnicas que nos permitentrabajar con las moléculas que contieneninformación biológica y que nos permitemanipular dicha información.

Ejemplo: ADN, ARN, proteínas, etc.

Áreas de aplicación:

• Biotecnología (medicina, microbiología,agricultura, etc)

• Bioingienería.

Es posible separar regiones determinadas de DNA.

• Se pueden obtener en cantidades prácticamente ilimitadas.

• Se puede determinar su secuencia de nucleótidos a alta velocidad.

• Un gen puede ser alterado y transferido a cultivos de células.

Impacto de la bilogía molecular:

• Determinar funciones de muchas proteínas.

• Comprender complejos mecanismos de regulación génica.

• A nivel comercial se pueden obtener gran cantidad de hormonas y vacunas a bajo costo.

Estas enzimas cortan la doble cadena de la molécula deDNA en puntos específicos definidos por la secuenciade nucleótidos, produciendo así fragmentos de DNA dediversos tamaños.

Bacterias de diferentes especies producen nucleasas derestricción diferentes, cumpliendo una función deprotección contra DNA exógeno, degradando el DNAvírico que entra a la bacteria. Las secuencias dereconocimiento propias están protegidas por lametilación de un residuo A o C, en cambio lassecuencias de DNA exógeno no se hallan metiladaspor lo que están expuestas a la acción de estasenzimas.

El nombre de cada enzima, corresponde a una abreviatura de tres letras que se refiere al organismo del cuál se aisló la enzima, la primera letra indica el género de la bacteria, las dos próximas la especie, una cuarta letra la cepa, seguida de un número romano :

Eco RI Escherichia coli

HindIII Haemophilus influenzae

HaeIII Haemophilus aegyptius

TIPO I y III

• Actividad de restricción (cortan) y de modificación ( metilan).

• Los de tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento.

• Las de tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia de reconocimiento.

• Necesitan de ATP para moverse de un lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte.

TIPO II

• Sólo actividad de restricción.

• Cortan dentro de la secuencia que reconocen.

• No necesitan de ATP, sólo utilizan Magnesio como co-factor.

APLICACIONES:

• Realizar mapas de restricción.

• Fragmentar DNA para separación en electroforesis y Southern Blot.

• Generación de sondas.

• DNA recombinante.

El resultado de la electroforesis es una especie de papel con líneas brillantes que ven en la imagen. Para saber como interpretar el resultado y graficarlo accede al siguiente link donde se explicara “el grafico del mal”http://es.slideshare.net/nikolinoroll/grafico-del-mal

MEDICINA

AGRICULTURA

ACUICULTURA

Antibiotic-sensitive

Bacterial cell

Treatment

Plasmid DNA“Transformed” bacterial cell

Selection on bacterial growth medium containing appropiate antibiotic

a) Competentes Naturales

b) Competentes Inducidas

Escherichia Coli ( E. Coli) Cepa HB101

Solución TSS:- PEG- DMSO- MgCl2- Medio LB

GPF

plásmido

Aequorea victoria

Medios Líquidos Medios Sólidos *(coloidales)

LB◦ Extracto de levadura (5g/L)◦ Triptona (10 g)◦ Agua (llevar a 1 litro)◦ NaCl (10g)◦ *Agar (15g/L)

+DNA -DNA

200 ul

Incubar 10’

En hielo

10 ulpGLO

Incubar O/N a 37 ºC

Heat-Shock

45’’ a 42 °C

Plaquear(Sembrar) en

mechero

Incubar 10’

En hielo

PROCEDIMIENTO

-ADN/LB -ADN/LB/amp +ADN/LB/amp +ADN/LB/amp/ara

-ADN/LB -ADN/LB/amp +ADN/LB/amp +ADN/LB/amp/ara

Manipulamos a la bacteria insertándole un plásmido con nuestro gen de interés. Ahora el siguiente paso es Aislar nuestro gen de interés dentro de la bacteria.

En las siguientes diapo sabrás purificarlas OMG :o!!!

Proteínas

bacterianas

Bacteria

HB101 transformada

PURIFICACION

GFP

¿Que tenemos que hacer?Purificar!!!!

Existen muchos métodos y formas. Nosotros usaremos :

CROMATOGRAFIA (proviene del griego khromatos y graphos que significan respectivamente "color" y "escribir").

En toda cromatografía existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una móvil que fluye durante el proceso de separación.

1.- Según el estado físico de la fase móvil:

FASE MÓVIL líquido Cromatografía de LÍQUIDOS gas Cromatografía de GASES

2.- Según la causa por la que se separan los componentes de la muestra.

-Tamaño Cromatografía de filtración en gel -Carga Cromatografía de intercambio iónico -Afinidad biológica Cromatografía de afinidad -Hidrofobicidad Cromatografía de interacción hidrofóbica

3.- Según el modo operativo para el desarrollo de la cromatografía (relacionado con la fase estacionaria):

FASE ESTACIONARIA Sobre superficie plana En columna

Se emplea en la purificación de proteínas

Cromatografía de intercambio iónico

La Cromatografía de Interacción Hidrofóbica implica una interacción entre los grupos hidrofóbicos expuestos de las proteínas y los grupos hidrofóbicos de la matriz cromatografía Esta interacción se produce por la asociación de regiones apolares en medio acuoso.

Buffer de Enlace : Buffer TE + Sulfato de Amonio (4 M)

Buffer de Equilibrio: Buffer TE + Sulfato de Amonio (2 M)

Buffer de Lavado : Buffer TE + Sulfato de Amonio (1,3M)

Buffer de Elución : Buffer TE pH: 8.0

Buffer TE : Tris + EDTA

sonicador

Micro centrifuga

TransiluminadorColumna cromatografía

Matriz

Si has llegado hasta esta parte de la presentación, me imagino que estas chato de tanta biología. Muy bien, ahora jugaremos para ver que tanto aprendiste de la presentación. A continuación se presentaran imágenes, tienes que saber que es, para que sirve, su característica, en el caso que estén con flechas indicar SOLO LO QUE SE INDICA

Que empiece el juego

Nombre del objeto: transiluminador

UV

Color de la punta que utiliza

Nombre del artefacto: micropipeta

amarilla

P20

Mediante que instrumento se logran visualizar las bandas:

TRANSILUMINADOR UV

Composición del gel utilizado

POLICRILAMIDA O AGAROSA, INDICAR COMPOSICION.

ACA TIENES QUE INDICAR COMO SE LLAMA EL LADO – Y EL LADO + , ME DA PAJA HACERLO ES MUY FACIL. ¬¬

Nombre que recibe las secuencias en celeste

PALINDROMICAS

Quienes reconocen estas secuencias:

enzimas de restricción

Sorry men, me da paja seguir animando las diapo, asique pondre imagen y todo listo para que estudies. No teni escusa para echarte el ramo!!

Nombre uno de los laboratorios en que

lo utilizamos: transformación genética

Nombre del tubo: ependorff o

microtubo

nombre del gen que

permite la

característica

observable.

Nombre los

componentes del

medio en que se

encuentra.

Nombre de la estructura

Tipo de rotor que usa

Nombre la estructura que esta viendo

(que wea es?)

Nombre de la

estructura: estufa de

cultivo

Función: incubar y

calentar cultivos

microbiológicos

(bacterianos )

Nombre de la

estructura:

cámara

electroforesis

vertical

Laboratorio

utilizado:

métodos de

estudio biología

molecular

Mi viejo me esta llamando para almorzar asique me tengo que ir.

Ehhmm no están todas las preguntas pero ahora ya sabes como es el tipo de pregunta, no te hare la pega facil, estudia lo que esta arriba y léelo hasta que lo sepas de memoria.

Si tienes alguna duda twitteamela(https://twitter.com/nikolino_roll)

@nikolino_roll

EXITOOOOOOO!!!!!

El año pasado esa pregunta hizo la diferencia del 3.95 y el 4.00 para aprobar. Analicemos la respuesta:

En el laboratorio de transformación genética se usa para sacar la colonia de bacterias de una placa y se pone en el tubo eppendorf marcado +ADN en el cual se gira el asa para desprender las bacterias, se hace lo mismo en el tubo -ADN. Se usa también para sacar el plásmido pGLOquedando una fina película líquida en ella.

Viste? La wea es facil es logica vo dale vo dalee!!!