Cell-wall thickness: possible mechanism ofacriflavine resistance in Meticillin-Resistant

Staphylococcus aureus

Mako Kawai, Sakuo Yamada, Ai IshidoshiroYoshihiro Oyamada,Hideaki Ito, and Jun-ichi Yamagishi

Presentan: Niniek Yusida,drNIM : S 970109007

Pembimbing: B. Rina A,S., dr ,Sp PK

PPDS PATOLOGI KLINIK FK UNS SURAKARTA April 2012

Jurnal mikrobiologi

Evaluasi tugas stase mikrobiologi

No JUDUL PRESENTASI TANGGAL PRESENTASI KET

1 Cell-wall thickness: possible mechanism ofacriflavine resistance in meticillin-resistantStaphylococcus aureus 17 April 2012 √

MRSA : bakteri patogen resisten

thd berbagai

AB

menyebabkan INOS

luas.

Resistensi

perubahan selular

akumulasi antiseptik

perubahan cell

envelope ; membatasi

uptake / mekanisme

efflux

Pendahuluan

S.aureus qacA, qacB, smr, norA dan mdeA,

gen resisten terhadap antiseptik

gen norA dan mdeA pada kromosom

gen qacA, qacB,smr : pada plasmid.

qacA/B : MFS (major facilitator

superfamily) ,smr : small multidrug-resistance family

Tujuan penelitian

Salah satu mekanisme resistensi Acriflavine adalah overexpresi gen efflux pump.

Studi ini, memeriksa distribusi gen multidrug efflux pump dan menyelidiki mekanisme resistensi Acriflavine pada MRSA isolat KT24, yang tidak memiliki gen efflux pump .

S. aureus209P, ATCC 12600, ATCC 29210, RN4220, RN2677 digunakan sebagai strain referensi

Strain S. aureus dikultur aerobik pada soybean casein digest broth (SCDB).

METODE

Penentuan kerentanan antimikroba

MIC ditentukan dengan metode pengenceran agar ganda serial

menggunakan Mueller-Hinton agar-agar

aktivitas norA efflux pump , MIC ditentukan dengan reserpin (konsentrasi akhir 20 μg/ml).

PCR amplifikasi. gen: qacA/B, smr, qacE, qacG, qacH dan qacJ,

diamplifikasi dengan PCR dengan primer set (tabel.1).

PCR menggunakan polimerase Taq Ex (Takara) selama 30 siklus 15 detik ,94ºC, 30 detik 60ºC dan 1 menit 72ºC.

Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa.

Akumulasi dan efflux etidium bromida

Organisme ditumbuhkan di

SCDB, ,2% inokulum

ditambahkan ke MHB

Uji uptake etidium-br.

ditambahkan e.br inkubasi

Fluoresensi dengan

luminescence spectrometer

Uji efflux etidium bromida

E.br dan karbonil sianida

m-chlorophenylhy

drazone ditambahkan

inkubasi

Fluoresensi ditentukan

dengan luminescence spectrometer

• Setelah inkubasi 37 ºC, dipanen,dicuci 2x dengan PBS Dulbecco

bakteri

Elektron mikroskop analisis.

scanning mikroskop elektron

suspensi sel dipasang

pada coverslip

Sampel diwarnai 1% asam tannic

dan 1% OsO4

diperiksa dg electron

microscope 15 kV

foto ketebalan dinding sel

dengan perbesaran akhir

610 000

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada studi ini, diuji kerentanan terhadap Acriflavine dan distribusi antiseptik-resistensi gen pada clinically isolated MRSA.

S. aureus 209P (S. 209P) digunakan sebagai strain rentan representatif.

MIC Acriflavine pada S. 209P : 1 μg/ml, semua isolat klinis MRSA : 4 - >128

μg/ml.

Berdasarkan MIC Acriflavine untuk S.209P, isolat MRSA dikelompokkan menjadi tiga :

resisten tingkat tinggi (MIC>64 μg/ml) resisten tingkat menengah (MIC 16-32 μg/ml) resisten tingkat rendah (MIC 4-8 μg/ml). deteksi PCR terhadap gen qacA/B dan smr,

yang merupakan plasmid-mediated resistance gene pada Tabel 2.

S. 209P tidak memiliki gen qacA/B atau smr Qac A/B = 55% (21/38) dan smr = 21% (8/38) gen qacA / B dan smr : 13% (5/38) dan tidak

memiliki qacA / B atau smr : 11% (4/38) ˃80% isolat MRSA memiliki plasmid gen

resistensi. Gen qacA/B lebih tinggi pada kel.resisten

tinggi MIC Acriflavine pembawa gen qacA /B dan gen

smr tidak lbh tinggi dari pembawa gen qacA /B atau smr.

Temuan ini, menunjukkan :gen qacA / B tersebar luas di MRSA

penelitian sebelumnya menunjukkan reserpin mampu menghambat pompa norA .

Ekspresi norA menjelaskan pengurangan 4x lipat MIC Acriflavine dengan adanya reserpin.

Setelah penambahan reserpin, MIC Acriflavine mengalami penurunan : 42% (16/38)

multidrug efflux system tidak meningkatkan kerentanan terhadap Acriflavine di MRSA.

MRSA KT24 menunjukkan resistensi tinggi terhadap Acriflavine (MIC 128 μg/ml) tanpa memiliki gen qacA/B dan smr.

Penentuan kerentanan dengan reserpin : tidak ada ekspresi norA di MRSA KT24.

MIC antiseptik untuk MRSA KT24 dan strain rentan S. 209P ditunjukkan pada Tabel 3.

MIC Acriflavine, acrinol dan et. bromida, untuk MRSA KT24 signifikan lebih tinggi daripada terhadap S. 209P.

MRSA KT24 ,tingkat resistensi tinggi terhadap Acriflavine (MIC 128 μg /ml) tapi rendah terhadap benzalkonium klorida (MIC 4 μg /ml).

Kerentanan MRSA KT24 sangat bervariasi, MIC antara 2 μg - >128 μg /ml.

MRSA KT24 resisten terhadap eritromisin, norfloksasin dan tetrasiklin,tapi rentan terhadap vankomisin, kloramfenikol, rifampisin ,Novobiocin.

MRSA KT24 resisten terhadap berbagai macam antiseptik dan antimikroba dengan struktur dan mekanisme kerja berbeda.

Studi ini mempelajari mekanisme yang mendasari resistensi MRSA KT24 terhadap Acriflavine.

• S. 209P, serapan etidium bromida cepat, akumulasi efektif• serapan, awal dan akumulasi etidium bromida MRSA KT24 signifikan lebih rendah (Gambar 1a). • tingkat efflux etidium bromida MRSA KT24 sama dengan S.209P (Gb.1b).

Menilai aktivitas efflux dan permeabilitas sel

Active efflux pumps penting dalam resistensi mikro-organisme terhadap antiseptik

penyerapan dan akumulasi etidium bromida pada MRSA KT24, mengakibatkan berkurangnya kerentanan terhadap agen antiseptik.

Penghalang permeabilitas adalah salah satu mekanisme resistensi MRSA KT24 thd Acriflavine.

Diperiksa hidrofobisitas MRSA KT24 dan dibandingkannya dengan S. aureus209P.

MRSA KT24 memiliki permukaan hidrofobik, dan S.aureus. 209P adalah hidrofilik.

Dominan hidrofobisitas mungkin karena molekul protein di permukaan organisme dan muncul dari kurangnya teichoic asam, protein A atau produksi koagulase

protein permukaan MRSA KT24 mungkin berbeda dengan S. aureus. 209P.

Wadstro (1990) melaporkan bahwa sel-permukaan hidrofobik dapat mempengaruhi kerentanan bakteri terhadap antimikroba dan antiseptik

fase Stasioner sel MRSA KT24 dibandingkan dengan orang-209P S. aureusberdasarkan analisis mikroskop elektron scanning (Gambar 2a).

Tidak perbedaan dalam ukuran sel dan permukaan sel antara S. aureus209P dan MRSA KT24.

Pengamatan mikroskop elektron : Sel MRSA KT24 dan 209P pada fase eksponensial awal memiliki permukaan luar kasar dan ketebalan dinding sel meningkat bertahap, pada pertumbuhan ,dinding sel MRSA KT24 lebih tebal di setiap tahap daripada S. 209P (Gambar 2b).

Karakteristik mekanisme resistensi morfologi sel diamati oleh elektron mikroskop.

Fig. 2. Morphological analysis of MRSA KT24. Scanning electron microscopy (a) and transmission electron microscopy (b) of S.aureus 209P (i) and MRSA KT24 (ii) and measurements of cellwallthickness (c) at the early exponential (EE), late exponential (LE) and stationary (S) growth phases. (c) Open bars, S. aureus209P; filled bars, MRSA KT24.

diperiksa perubahan morfologi dalam MRSA KT24 sel terkena sub-MIC konsentrasi Acriflavine.

Gambar. 3 menunjukkan mikrograf elektron transmisi sel kultur di SCDB dengan Acriflavine selama 4 jam.

Penebalan dinding sel MRSA KT24 secara signifikan lebih tebal setelah paparan 16 μg Acriflavine /ml (0,125 MIC) (Gbr. 3b).

mekanisme resistensi Acriflavine MRSA KT24 melibatkan penghalang permeabilitas yang mempengaruhi ketebalan sel-dinding .

Nishino (1975) melaporkan pengobatan eritromisin mengakibatkan penebalan dinding sel dan pembengkakan permukaan di S. Staphylococcus.

Penelitian terbaru MRSA menunjukkan vankomisin terjebak di dalam lapisan peptidoglikan sebagai penghalang fisik penetrasi vankomisin dan mengakibatkan resistensi .

Penebalan dinding sel bertanggung jawab terhadap vankomisin resistensi pada S. aureus (Cui et al, 2003.)

MRSA KT24 memiliki dinding sel menebal, tapi rentan terhadap vankomisin (Hiramatsu et al., 1997).

Mekanisme penebalan dinding sel pada MRSA KT24 berbeda dengan resistensi vankomisin.

studi korelasi antara ketebalan dinding sel dan ketahanan Acriflavine diperlukan untuk memperjelas peran fisiologis sel-dinding tebal di S. aureus.

Telaah Kritis MakalahJudul Singkat, jelas, deskriptif, ekspresif,

menggambarkan keseluruhan isi, sesuai dengan permasalahan.

Abstrak - Tidak terstruktur dengan jelas, memuat latar belakang, hasil dan kesimpulan. - Tidak menyebutkan kata kunci

Latar Belakang Fakta2 ditulis secara jelas dan sistematik.Disertakan, teori/konsep terkait studi pustaka.

Permasalahan

Terdapat identifikasi masalah dan kesesuaian dengan latar belakang.

Telaah Kritis Makalah

Tujuan Jelas, dapat dimengerti dan sesuai dengan latar belakang

Manfaat Ada dan sesuai dengan latar belakang

Tinjauan Pustaka

Relevan dengan textbook, terdapat tinjauan yang komprehensif dengan yang diteliti.

Telaah Kritis Makalah

Metodologi

Populasi spesifik disebutkan dengan jelas

Data /skala numerik

Besar sampel disebutkan dengan jelas

Prosedur koleksi data disebutkan dengan jelas

Analisis statistik -

Bahan dan cara √

Hasil dan Pembahasan Sesuai tujuan dan permasalahan

Kesimpulan dan saran Sesuai tujuan dan permasalahan

Telaah Kritis Makalah

Telaah Kritis Makalah

Secara keseluruhan jurnal ini cukup baik, menambah wawasan tentang mekanisme resistensi kuman MRSA terhadap Acrilavine

maturnuwun