Metabolismo e tossicocinetica degli xenobiotici durante la

gravidanza enelle varie fasi dello sviluppo

Emanuela TestaiIstituto Superiore di Sanità -Dipartimento Ambiente

e Connessa Prevenzione Primaria- Roma (Italy) testai@iss.it

Ogni sostanza chimica estranea all’organismo è definita uno xenobiotico.Additivi alimentari, aromatizzanti, coloranti, emollienti, emulsificanti, pesticidi, sottoprodotti della combustione e della clorazione delle acque, inquinanti ambientali, farmaci, prodotti ‘naturali’ e voluttuari sono xenobiotici.

XENOBIOTICO: Chi è costui?

Che cosa accade quando un organismo viene esposto ad uno xenobiotico?

AssorbimentoDistribuzioneMetabolismo

Escrezione

La fase tossicocinetica

Avviene attraverso membrane biologicheQuasi tutti gli xenobiotici sono liposolubili Assorbimento

Gli xenobiotici sono distribuiti ai diversi organi attraverso il circolo sanguigno (essenzialmente legati alle proteine plasmatiche). Nei vari distretti possono accumularsi (membrane e tessuto adiposo) ⇒ EFFETTI TOSSICI se si supera la soglia di tossicità

Durante la gravidanza possono raggiungere il prodotto del concepimento attraverso la placenta, entrando sia per diffusione passiva che in alcuni casi per trasporto attivo ⇒ Aborti, effetti teratogeni, effetti sullo sviluppo post-natale .

Distribuzione

Escrezione Avviene principalmente attraverso soluzioni acquose

Reazioni di fase I: inseriscono o smascherano gruppi funzionali (-OH, -NH2)

Reazioni di fase II: coniugano al parentale o al prodotto di reazione della fase I molecole endogene altamente solubili

La funzione delle reazioni di biotrasformazione è quella di aumentare la idrosolubilità degli

xenobiotici, evitandone l’accumulo negli organismi favorendone l’escrezione in

ambiente acquoso

Gli enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici (CYP, GST, UDPGT, idrolasi, esterasi) li trasforma in:

Metabolismo degli xenobiotici

• Metaboliti con attività biologica > del composto parentale (Es: OPT, carbammati): bioattivazione

• Metaboliti con attività < o nulla rispetto al parentale (Es: OPT, triazine): detossificazione

TOXIC CHEMICAL---------------------------------------------------------------------

X X*---------------------------------------------------------------------

METABOLISM TOXICITY TOXICITY high low

RISPOSTAEffetto Terapeutico

TumoreTossicità

Variabilità indotta da fattori genetici

Variazioni geniche

RecettoriModificati

Variabilità indotta da fattori socio-ambientali

DietaFumoBevande alcolicheFarmaciInquinantiStati patologici

InduzioneInibizione

Sistemi di difesa Modificati(DNA-Repair)

Espressione Polimorfica di enzimi del metabolismo

Xenobiotico

ORGANISMOFarmaco/tossico-

cinetica

Nessuna esposizione a tossici

Esposizione materna a xenobiotici tossici

Sviluppo embrio-fetale buono

Possibilità di: aborto, difetti alla nascita, disfunzioni funzionali

DRUG METABOLISM STUDIES ON

DEVELOPING ORGANISMS ADULT ORGANISMS

Rodents Humans RodentsHumans

N° + ++ +++++++ ++++

Levels -/+ ++ +++++ ++++of activity

Grandi differenze di specie nell’ontogenesi dei sistemi enzimatici

la specie umana ha capacità metaboliche relativamente buone a livello epatico nel periodo perinatale, al contrario dei roditori

Il profilo metabolico del concepito varia dinamicamente durante lo sviluppo

L’identificazione dello stadio gestionale in studio è cruciale per la produzione di dati scientificamente validi

La maggioranza delle reazione di biotrasformazione degli xenobiotici avviene nel fegato dell’adulto

Gli studi sugli organismi in via di sviluppo si sono concentrati per analogia sullo stesso organo e tra i

sistemi enzimatici il più studiato è quello del citocromo P450.

Il citocromo P450

Il P450 è una famiglia multigenica di emoproteine che catalizzano la mono-ossigenazione di substrati endogeni ed esogeni

Same gene family gene family : : sequence similarity >40%>40%Same subfamily : sequence similarity >55%>55%Same gene n° in different species: orthologous enzymesSame gene n° in different species: orthologous enzymes

CYP 2 E 1

Gene subfamilyGene number

Gene familyCytochrome P450

Co-substrates NADPH, O2

Coupled enzymes Cytochrome b5, Cyt.P450-reductasesIsoforms >500Substrates organic compounds with/without eteroatoms (N,S,Se,P)Localization microsomes, mitochondriaTissues-Organs Liver, Kidney, Lung, Adrenal, Skin, Brain,

Placenta, Reproductive organsInductors Many (PB,TCDD, EtOH)Inhibitors Competitive Substrates, Inactivators

I CYP che metabolizzano gli xenobiotici appartengono alle famiglie. 1-4 Un singolo CYP può metabolizzare substrati differenti e lo stesso xenobiotico può essere metabolizzato da vari CYP con affinità diversa.

Il citocromo P450

A) Detection of specific enzymatic activities with model (probe) substrates (Substances which are specifically metabolized by one CYP

leading to a easily detectable product)

A) Enzyme localization by means of immunoblotting or immunohysto- chemical tecniquesLIMITS: Cross-reactivity of antibodies towards rat/mouse CYP(s) with more

than one human CYP.

METODI PER DETERMINARE LA PRESENZA DI CYP E LORO ATTIVITA’ NEGLI ORGANISMI IN VIA DI SVILUPPO

LIMITS: Low activities (below limit of detection) Overlapping in substrate specificity, Probe substrates suitable for adult CYPs.

Ethoxyresorufin Resorufin (Fluorescent)

Eritrhromycin Demethylated product + HCHO

CYP1A1

CYP3A4

A) Use of PCR and reverse-transcriptase (RT)-PCR to detect even small quantities of specific mRNA

ADVANTAGES: increase in sensitivity and specificity.

FAMIGLIA 1 Isoforme CYP1A1 CYP 1A2 (CYP 1B1)Ortologhi nei roditori e nell’uomo

Substrati: idrocarburi policiclici aromatici (IPA) bifenili policlorurati (PCBs -procarcinogens) , ammine aromatiche

RODENTS CYP1A1 Non espresso costitutivamente in alcun tessuto e stadio di sviluppo prenataleAltamente inducibile per esposizione transplacentare da induttori noti di CYP1A1 (PAH, TCDD, PCBs)

CYP 1A2 Non espresse in tessuti prenataliEsperrso dopo la nascita nel fegato e nel tratto GI

CYP1A1 e CYP1A2 Presente nel fegato di embrione/feto

Le evidenze per una sua espressione costitutiva sono comunque contrastanti per l’impossibilità di escludere induzione transplacentare

Per esposizione significativa della gestante a fumo di sigaretta, caffeina, IPA, flavoni, indoli.

CYP1A1 è espresso nell’adulto in tessuti extraepatici

CYP 1A2 si esprime dopo la nascita a livelli gradualmente più elevati fino a raggiungere i livelli tipici dell’adulto a 1 anno di vita post-natale

HUMANS

FAMIGLIA 2 Famiglia molto eterogenea con molto sottofamiglie diverseRappresenta una gran percentaule del contenuto totale del fegato adulto .

Principali isoforme nel ratto CYP2A, CYP2B1/2, CYP2C11, CYP2E1 (ortologa a quella umana)

CYP2B1: la più studiata; non espressa nei tessuti prenatali di ratto. Espressione immediata dopo la nascita. Massimi livelli: 24h post natali

CYP2A1: espressa subito dopo la nascita Massimi livelli: 1 settimana dopo la nascita

CYP2A2: espresss alla pubertà solo nei maschi

RODENTS

Principali isoforme nell’uomo : CYP2A6 CYP2B6 CYP2C8, 9, 19 CYP2D6 CYP2E1 CYP2E1

CYP2E1CYP2E1 Substrati: etanolo, alcooli, solventi, composti a basso peso

molecolare ( i.e. benzene, nitrosoammine)

Dati contradditori sulla presenza di 2E1 cataliticamente attivo nel fegato durante la vita prenatale ma

2E1mRNA è presente nel fegato fetale a 16 settimane di gestazione e determinazione di attività di ossidazione di etanolo inibita da anticorpi anti-2E1

HUMANS

Presenza di 2E1mRNA e della relativa attività enzimatica nel tessuto cerebrale embrionale al 45-53° giorno di gestazione, sovrapponibile alla organogenesi (giorni 50-60)

Livelli massimi nel cervello : 80-84° giorno di gestazione.

I livelli di CYP2E1 nel feto possono essere indotti dal consumo di etanolo, da inadeguqti apporti nutrizionali (elevati intake di grassi o bassi livelli di Vit. E e A) durante la gravidanza

La presenza di CYP2E1 nel cervello fetale (organo bersaglio della teratogenesi indotta da etanolo è stata considerata una delle possibili cause della FAS (Fetal FAS (Fetal Alcohol Syndrome)Alcohol Syndrome)

Disfunzioni postnatali del SNC

Etanolo Acetaldeide, radicali liberi di O2

Radicali liberi derivati da etanolo

CYP2E1

Effetti sulla sintesi proteica e degli acidi nucleici Perossidazione lipidica delle membrane cerebrali,

ricche in acidi polinsaturi ) Danno ossidativo sul DNA (Single strend breaks)

I danni nei neonati correlati al consumo di alcol durante la gravidanza includono: aborti spontaneiridotta crescita fetaleanomalie nello sviluppo cranio faccialeritardi nello sviluppo neurologico

L’ alcol altera fattori nutrizionali e ormonali cruciali nello sviluppo cellulare negli stati embrionali

Possibile ruolo dei polimormismi degli enzimi del metabolismo nella insorgenza della FAS ⇒ il picco ematico di alcol nel circolo della madre dipende dalle sue capacità metaboliche e regola la esposizione del feto.

Metabolismo diverso ⇒ diversa esposizione fetale

FAMIGLIA 3

Le principali isoforme del ratto sono 3A1 and 3A2. Nell’uomo gli enzimi corrispondenti sono 3A4 and 3A5, che rappresentano il 40% circa del contenuto totale di P450 epatico nell’adulto e nell’intestino. Molti farmaci e anche molti ormoni steroidei sono metabolizzati dalla famiglia 3A

RODENTS

Le isoforme del 3A sono assenti nelle varie fasi dello sviluppo prenatale dei roditori e si esprimono solo dopo la nascita.

HUMAN

Il contenuto fetale di CYP 3A oscilla tra il 30 e il 100% del contenuto di 3A tipico della vita adulta.

3A7è il solo CYP conosciuto finora che si esprime specificamente durante il periodo perinatale. Nell’adulto è presente nell’endometrio e nella placenta delle donne in gravidanza.

Rappresenta il CYP principale presente nei tessuti epatici umani embrionali e fetali (30% del totale). Non è mai stato identificato in altri organi (days 50-60).

Metabolizza sostanze esogene ma soprattutto ormoni steroidei.

Alla nascita la sua espressione cessa e viene immediatamente rimpiazzato dal 3A4.

Rodents

L’esposizione fetale è dovuta al passaggio di OPT attraverso la placenta, dopo somministrazione orale alla femmina gravida

Arch. Toxicol. 76: 452-459 (2002)

•absorption across the umbilical cord •diffusion across the placenta surface •swallowing of amniotic fluid Environm. Health Perspec. 109: 417-420 (2001)

Humans

OPT e i loro metaboliti presenti nel meconio post-partum (contenuto intestinale del feto) Esposizione prenatale dovuta a :

Nessuna informazione disponibile sul ruolo del 3A7 umano nella bioattivazione di OPT

Caratterizzazione della bioattivazione di chlorpyrifos (CPF), parathion (PAR), malathion (MAL) e fenthion (FEN) con CYP

3A7 ricombinante

Fornire dati sul metabolismo fetale per la stima della tossicità durante lo sviluppo neurologico consguente alla esposizione agli

OPT in utero

9.9 ± 0.3

2.1 ± 0.1

22.6 ± 0.6

MAL

Nd(2 ± 1)a

6.6 ± 0.18.4 ± 0.23A7

Nd(28 ± 8)a

0.88 ± 0.0218.8 ± 0.93A5

19 ± 2(49 ± 5)a

32.7 ± 0.733 ± 23A4FENPARCPF

(pmol oxon • (nmolP450 •min •µM) -1 ) a = sulfoxide CLi value

Intrinsic Clearence (CLi) della formazione di oxons/sulfoxide da CYP3A4, 3A5 and 3A7

Il feto può bioattivare diversi OPT in situ se esposto in utero a questa classe di pesticidi.

Sebbene diversa in dipendenza del singolo OPT, l’efficienza della forma fetale in vitro è solo leggeremnte più bassa ma dello stesso ordine di grandezza del 3A4, la forma principale dell’adulto, e simile se non più elevata del CYP3A5.

La placentaplacenta, organo primario di comunicazione madre - feto non è una barriera protettiva che impedisce l’esposizione del feto. Gli xenobiotici attraversano la barriera placentare (passivamente e/o attivamente) entrando nella circolazione fetale.

La placenta contiene enzimi del metabolismo e biotrasforma gli xenobiotici, sia detossificandoli che bioattivandoli. Il profilo enzimatico placentare cambia durante la gravidanza (> espressione nel 1° trimestre) Gli enzimi placentari possono essere indotti/inibiti durante la gravidanza per l’esposizione della madre (es:fumo di sigaretta).

Il livello di attività degli enzimi placentari è basso rispetto a quelli della madre e del feto (ruolo nel metabolismo degli ormoni steroidei).

Durante la gravidanza le capacità metaboliche della madrecapacità metaboliche della madre diminuscono, ma l’aumento di circa il 30% del peso del fegato compensa questo calo.

E’ importante considerare l’intero sistema madre-placenta-feto

Table 3

Ontogenesis of main human alcohol metabolizing enzymes Gene Placenta Fetal

Brain Liver

Prenatal trimester Liver

Neonate Liver

1 month to 1 year

1 2

3

CYP2E1

+

+

?

+?

+?

+

+

ADH1 + - + + + + -

ADH2 + - - + + + +

ADH3 + - - - + + +

+: activity or protein detectable;

-: activity or protein not detectable

?: unclear results

Ontogenesi degli enzimi di Fase IFasce d’età Attività enzimatica

CYP1A2 CYP1B1 CYP2A6 CYP2B CYP2D6 CYP3A4 CYP3A7

Neonato +/- + ? ? +/- +/- +++

Prima infanzia + + + ++ + ++ +

Bambino +++ + ++ ? + +++ -

Adulto +++ + ++ + + +++ -

Attività uguale

al livello adulto 5-6 mesi ? 6-13a > Ia 3-5*a 1 anno calo nel

infanzia I anno**

* 20% del livello adulto a 1 mese

** Attività alta nel feto, con un picco nella prima settimana dalla nascita. Sostituito successivamente dal CYP3A4

Ontogenesi degli enzimi di Fase IIFasce d’età Attività enzimatica

UGT1A1 NAT Sulfotransferasi

Neonato +/- +/- +

Prima infanzia + +/- +

Bambino + + +

Adulto + + +

Attività uguale

al livello adulto 3-6 mesi 10-12 mesi dalla nascita

L’età in cui il metabolismo del bambino è simile all’adulto

dipende dagli enzimi coinvolti e cambia con la sostanza