Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin

3. Izolace DNA

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013

Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických

oborů PřF JU

reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

Sběr materiálu na izolaci DNA

Obecné zásady:

v principu je možné použít kteroukoli část rostliny

• ideální je čerstvý materiál

• problematické můžou být kořeny (příp. vzorky půdy), herbáře

• brát tkáně s co nejnižším obsahem sek. metabolitů pokud možno zdravou tkáň, neinfikovanou ostatními organismy radši na jeden typ tkáně

• výsledky některých metod mohou být ovlivněné typem tkáně

(např. tkáňově nebo i sezonně specifická methylace DNA může ovlivnit restrikční krok u AFLP)

zabránit rozkladným procesům, kterými vznikají látky poškozující nebo jinak znehodnocující DNA (fixace materiálu)

Fixace materiálu před izolací

Vysoušení

silikagel – asi ideální; při recyklování silikagelu je vhodné aby použitý silikagel nebyl v přímém kontaktu se vzorky (vzorek dát do papírového sáčku a ten teprve to plastikového se silikagelem)

při pokojové teplotě nebo v sušárně taky funguje (mechorosty, lišejníky); ale herbářové položky rostlin mohou být problematické

vysušený materiál je vhodné zamrazit (-20º nebo -80ºC) nebo alespoň skladovat v ledničce, a pokud možno co nejdřív dále zpracovat

Nakládání do koncentrovaného NaCl-CTAB roztoku

vhodné pro sukulenty, ale i křehké vodní rostliny, vydrží až měsíce při pokojové teplotě

Fixace materiálu před izolací

Nakládání do ethanolu

není příliš výhodné (DNA tvoří nerozpustné komplexy s proteiny, nižší výtěžek, řeší to přidání proteinázy)

Zamrazováním čerstvého materiálu

bez problémů, ale není nutné

Vlastní DNA izolace

Volba extrakční metody

jak moc kvalitní DNA potřebujeme a v jakém množství

kolik máme peněz a času:

komerční kity vs. klasické protokoly (běžné chemikálie)

dražší (50-150 Kč/vz.) velmi levné (několik Kč/vz.)

ca 2h ca > 2h (dl. inkubační kroky)

čistá DNA, ale někdy málo vyšší výtěžek DNA, někdy problémy s čistotou


Kroky izolace DNA:

homogenizace - rozrušení buněčné stěny

lyze buněčných membrán - pomocí detergentu za zvýšené teploty (DNA se uvolní do roztoku, zvýšená teplota denaturuje proteiny, ale může způsobovat fragmentaci DNA)

purifikace DNA - odstranění kontaminantů:• proteiny – DNázy štěpící DNA, histony a mnoho dalších...• fenolické látky – jejich oxidací vznikají chinonické sloučeniny,

které můžou degradovat DNA nebo inhibovat enzym. reakce• huminové kyseliny – silný inhibitor, vznikají rozkladem tkání• polysacharidy• RNA

čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo vodě


Homogenizace materiálu - mechanicky:

drobné vzorky pomocí homogenizačních tyčinek, v malém množství extrakčního pufru, příp. se sterilním pískem

středně velké kousky tkáně (<10 cm) v mlýnku, drcení kovovými kuličkami (za sucha) – ideální pro větší počty vzorků (ale hlučné)

nebo klasická drtící miska (+ kapalný N2) pro velké vzorky


Homogenizace materiálu – chemicky nebo jinak:

sodium nebo potassium ethyl xanthogenát rozpouštějící celuózu

střídáním cyklů povaření/zamražení (např. řasy a sinice)

Nevysušený materiál:

je třeba homogenizovat pomocí kapalného N2 (zamražení chrání DNA před degradací DNazami)

pouze v případě materiálu naloženého v NaCl-CTAB je ideální drcení za pokojové teploty


Příklady klasických protoklů izolace DNA:

NaOH metoda

velmi rychlá a jednoduchá (1 vz. několik minut!)

zvýšené pH denaturuje proteiny (DNazy), pomáhá rozložit buněčnou stěnu; centrifugací se odstředí zbytky tkáně, supernatant se naředí pufrem (Tris-HCl)

i pro malé množství materiálu (mechorosty, lišejníky, cév. rostliny), který by ale neměl obsahovat příliš kontaminantů

nepříliš čistá DNA, použitelná pouze pro PCR (nikdy ne např. AFLP!)

vyizolovanou DNA nelze kvantifikovat



CTAB extrakce

NaCl-CTAB pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA) CTAB je detergent; přidání PVP vychytá fenolické látky; RNasa A rozštěpí

RNA

CTAB vytváří komplex s proteiny, polysacharidy i DNA; za vysoké koncentrace solí (NaCl) ale zůstává CTA-DNA komplex rozpustný ve vodě

přidání směsi chloroform - isoamylalkohol, po centrifugaci:

◄ vodní fáze s DNA - opatrně odpipetovat

◄ rozhraní (proteiny) + odpadní organická fáze (lipidy, proteiny)

(krok s přidáním směsi a odpipetováním DNA fáze lze i 1-2 zopakovat)



CTAB extrakce

přidáním isopropanolu se vysráží CTA-DNA sůl, centrifugací DNA pelet (většina polyfenolů, proteinů a polysacharidů zůstane v supernatantu)

pozn.: selektivní vysrážení DNA - přidáním CTAB pufru s nižší konc. NaCl, odstranit supernatant, přidat NaCl nutný pro rozpuštění DNA peletu, zopakovat chloroform - isoamylalkoholovou separaci a pokračovat semikvantitativním isopropanolovým přesrážením

bílý DNA pelet(zabarvení značí nečistoty)

DNA pelet přečišťován přesrážením ethanolem a rozpuštěn v TE nebo vodě – použitý objem ovlivní koncentraci DNA roztoku

vhodné i pro malé množství materiálu, někdy problémy s čistotou DNA zabere ~4 h a víc



SDS extrakce

izolační pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA)

po přidání SDS a octanu draselného se za snížené teploty vysráží kontaminanty (proteiny, polysacharidy)

vysrážené kontaminanty centrifugací sednou na dno, odebere se DNA supernatant, který je dále přečišťován přesrážením např. isopropanolem

RNasa A rozštěpí RNA

podobně jako CTAB někdy problémy s čistotou DNA

výhoda proti CTAB - nepoužívá toxické chemikálie

izolační pufr se sodium nebo potassium ethyl xanthogenátem rozpouštějící polysacharidy – u buněk s obtížně narušitelnými buněčnými stěnami (sinice)


Princip komerčně dostupných kitů na izolaci DNA:

lyzační fáze, příp. odstranění proteinů proteinazou, vysrážení kontaminantů octany a ošetření RNasou A

navázání DNA na matrix – nejčastěji silika membrána (příp. magnetické silika kuličky nebo iontoměničová pryskyřice)

1. za vysoké koncentrace solí se DNA selektivně váže na membránu

2. DNA na membráně je dále promývána (roztoky s ethanolem)

3. uvolnění DNA z membrány snížením koncentrace solí, tj. vymytím TE pufrem nebo vodou

- objem použité kapaliny ovlivní koncentraci DNA (min. objem většinou udáváno 30 µl; čím víc kapaliny, tím více se DNA naředí)

koncentrace získané DNA ale často nižší! existují i speciální CleanUp kity na přečištění vyizolované DNA

1

2

3


Skladování DNA:

čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo voděTE pufr brání degradaci DNázami (EDTA vychytává ionty, které jsou kofaktorem enzymů)

krátkodobě (týdny) v ledničce, dlouhodobě v -20º nebo -80ºC

roztok DNA nevortexovat (mechanické poškození - fragmentace)

nevystavovat opakovanému rozmražování a zamražování(používat alikvoty)

DNA teoreticky velmi stabilní (několik let) – nejvíc záleží asi na čistotě

Kontrola kvality a kvantity DNA

1) fluorimetricky barvivo selektivní pro DNA (např. PicoGreen aj. komerční barviva) vysoce přesné stanovení koncentrace DNA senzitivní i pro koncentrace ~0.1 ng/µl naměřená koncentrace není ovlivnění kontaminanty, ale nezjistíme

jejich přítomnost!


2) pomocí spektrofotometru

A260 (vln. délka 260 nm = max. absorbance nukl. kyselin)• přístroj měří ~ 5 µl vzorku• z vlastní hodnoty A260 přístroj vypočítá koncetraci DNA • nutno brát s rezervou!!!

A260 je zkreslená absorbancí kontaminantů... (např. proteiny – mají sice max. pík při A280, ale určitá hodnota absorbance je i při A260, proto má směs DNA/protein vyšší celkovou A260)

proto se používá A260/280, A260/230: čistá DNA má obě hodnoty >1.8(absorbance DNA směrem k A230 a A280 klesá)

A320: mělo by být blízké 0

jiné hodnoty → znečištění, odhad koncentrace DNA je nadhodnocený(časté zejm. u CTAB izolace)


nanodrop - spektrofotometr pro malé objemy vz. (~ 1 µl)

3) ´od oka´ zelené, hnědé, žluté nebo jiné zabarvení roztoku DNA, nebo přítomnost

sraženin indikuje kontaminaci nežádoucími látkami, které můžou, ale taky nemusí inhibovat enzymatické reakce

Kontrola kvality a kvantity DNA4) elektroforéza (ELFO)

pro DNA stačí horizontální, agarózový gel (0.8-2% w/v) v TAE nebo TBE pufru

vzorky DNA se smíchají s loading buffer (glycerol pro zapadnutí vz. do jamky, obvykle 2 modrá barva pro detekci migrace vzorku)

záporně nabité molekuly DNA migrují k anodě (+), délková separace

vizualizace fluorescenčními barvivy, které se vážou na DNA (GelRed, SybrGreen, ethidium bromid) – potenciální mutageny

Kontrola kvality a kvantity DNAELFO genomové DNA

• fragmentace příliš nevadí, pokud plánujeme PCR metody; obvyklá u klasických protokolů (u kitové izolace se fragmenty <100 bp nezachytí na membránu a jsou tak odstraněny)

• pokud na gelu vidíme alespoň nějakou DNA, je koncentrace dostačující na PCR • zabarvení izolátu: kontaminanty, které můžou inhibovat enzym. reakce!

... důležité je, aby DNA fungovala na další aplikace (i DNA viditelná na gelu nemusí fungovat, a naopak neviditelná DNA může dát PCR amplifikaci)

◄ ´stín´ jamek může indikovat špinavou DNA

◄ vysokomolekulární genomová DNA (intenzita bandu koreluje s koncentrací)

smear: fragmenty DNA (degradace) nečistoty, zbytky RNA

čistá, kvalitní DNA:

Shrnutí

Jakou metodu izolace DNA zvolit?

(aneb některé typické situace, které můžou nastat) potřebujeme kvalitní DNA v dostatečné kvantitě (např. AFLP), nebo

pracujeme s problematickým materiálem (sek. metabolity):

• komerční DNA kity; nepodcenit fixaci materiálu! (např. silikagel)

máme hodně vzorků (desítky-stovky), ale plánujeme metodu nepříliš náročnou na kvalitu a kvantitu DNA (sekvenování, SSR, příp. ISSR), a pracujeme s neproblematickým materiálem:

• ideálně NaOH izolace

zpracováváme vzorky z malého množství tkáně, a kitová izolace má malý výtěžek; navazující metody nepříliš náročné na kvalitu DNA:

• zkusit NaOH nebo CTAB protokol

nemáme dost peněz, nebo kitová izolace s malým výtěžkem, a potřebujeme metodu středně (ISSR) nebo vysoce (AFLP) náročnou na kvalitu a kvantitu DNA:

• zkusit CTAB nebo SDS protokol (bez záruky, zejm. pro AFLP!)

Co s herbářovým materiálem?

cenný zejména typový materiál taxonů, histor. sběry vzácných taxonů,

histor. populační sběry apod. recentní položky (< 15? let) můžou být celkem bez problémů pro běžné

PCR metody - ale může se velmi lišit druh od druhu! obvykle použitelné pouze pro některé metody analýzy DNA (zejména

sekvenace PCR produktů nebo analýza SSR)

Herbářový a historický materiál (Ancient DNA)

Andreasen et al. 2009. Successful DNA amplification of a more than 200-year-old herbarium specimen: recovering genetic material from the Linnaean era. Taxon 58: 959-962.

zatím nejstarší sekvenovaná herbářová položka rostliny je stará ca 200 let (Phaulopsis talbotii – Acanthaceae, Andreasen et al. 2009)

názory na optimální metodiku nejsou jednotné, každý druh (položka) funguje jinak...

... radši nemít přehnaná očekávání

Co s herbářovým materiálem?


pozor na kontaminaci recentním materiálem!

• např. z úlomků čerstvých položek skladovaných se starým

herbářovým materiálem

• u mechů a hub patrně i sporami aj. mikroskopickými částicemi!

• při manipulaci s položkou zacházet opatrně, pinzety atd. čistit lihem

• výhodná je povrchová UV sterilizace herb. materiálu

• doporučuje se separace místností na DNA izolaci, od prostor na

další (PCR) zpracování, použití filtrovaných špiček

Co tvrdí ti, kterým se povedlo získat data z herbářového materiáu:

patrně preferovat čistotu DNA nad její kvantitou; uváděné úspěšné metody izolace se často navzájem liší, nutné optimalizovat (pokus-omyl)


Drábková et al. 2002. Comparison of seven DNA extraction and amplification protocols in historical herbarium specimens of Juncaceae. Plant Molecular Biology Reporter 20: 161-175.

Särkinen T. et al. 2012. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS One 7: e43808.

• Särkinen et al. (2012) preferuje kombinaci CTAB izolace (vysoký výtěžek) + následné přečištění izolátu na kitové silika membráně (zvýší čistotu)• Drábková et al. (2002) preferuje pro Juncaceae kitovou izolaci (Qiagen), popř. CTAB protokol• u hub a lišejníků byly úspěšné pokusy s kitovou izolací (Qiagen, Sohrabi et al. 2010), CTAB protokol (Redchenko et al. 2012), příp. jejich kombinace (May et Ristiano 2004)

Co tvrdí ti, kterým se povedlo získat data z herbářového materiáu:


• některé typy komerčních polymeráz dávají lepší úspěšnost PCR amplifikace

Särkinen T. et al. 2012. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS One 7: e43808.

Telle et Thines 2008. Amplification of cox2 (~620 bp) from 2 mg of up to 129 years old herbarium specimens, comparing 19 extraction methods and 15 polymerases. PLoS One 3: e3584.

nejnižší úspěšnost u materiálu naloženého v lihu; nepotvrdil se negativní vliv vysoušení za vyšších teplot (Särkinen et al. 2012)

velmi záleží i na metodice následného zpracování vyizolované DNA:

fragmenty genomové DNA

(CTAB izolace Spergularia sp., 2 položky staré ca 70

let)

►

• DNA hist. vzorků je fragmentovaná → větší šance na úspěch při amplifikaci kratších úseků DNA (< ca 300 bp, např. SSR)

Documents

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA