Metody molekulární biologie v ekologii a systematice

rostlin

4. PCR

Historie

Co bylo před PCR?

k dispozici pouze DNA, kterou se podařilo vyizolovat

fragmenty DNA bylo možné namnožit klonováním (zač. 70. let)

sekvenování NK (od konce 70. let)

RFLP

RFLP

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) variabilita generována restrikčními enzymy z bakterií

- rozpoznávají krátkou specifickou sekvenci dsDNA vyizolovaná genomová DNA naštěpena jedním nebo

více enzymy

• může být použita např. pouze cpDNA nebo mtDNA (nutná speciální izolace, např. ultracentrifugace v CsCl gradientu pro cpDNA)

fragmenty separovány ELFO, vizualizovány přímo obarvením, nebo přeneseny na membránu, a vizualizace hybridizací se značenou DNA sondou (Southern-blot)

sondy:

• specifické pro určitý lokus (např. rDNA; další využití – restrikční mapování

genomu, určování pořadí genů pomocí genově specifických sond)

• multilokusové (např. hypervariabilní repetitivní sekvence: mini- a mikrosatelity)

RFLP

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Lokusově specifická sonda: variabilita RFLP patternů 11 izolátů Candida albicans

(A - celková genomická DNA po naštěpení enzymem EcoRI)

B - Southern blot hybridizace se sondou pro oblast 28S, 18S a 5S rDNA

RFLP

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Multilokusová sonda:

variabilita patternů generovaných pomocí 2 mikrosatelitových sond (r. Candida)

RFLP

Výhody: kodominantní

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

solidní variabilita - při použití sond hybridizujících s hypervariabilními lokusy

Nevýhody: nutné získat dostatek kvalitní DNA relativně komplikovaná metoda

sonda ELFO

PCR

PCR:

Polymerase Chain Reaction

in vitro namnožení určité části DNA

*1983, ale první (zapomenuté) pokusy už v r. 1971; Nobelova cena za chemii (1993)

Princip PCRPrincip PCR

(DNA polymeráza)

PCR cycling

vždy musíme mít k dispozici primery: levý-forward a pravý-reverse

elongace produktu 5´→3´!

první nasynt. vlákna jsou o něco delší než cílový produkt, cyklováním ale téměř absolutně převládne cílový produkt

teoreticky by měla stačit 1 molekula, v reálu je potřeba o něco víc (aspoň 10?)

1)

2)

3) Elongace

Templát. DNA

Princip PCRPrincip PCR

enzymatická syntéza DNA: prodlužování vlákna vždy ve směru 5´→3´(nezapomenout na to ani při designu primerů!)

Princip PCRPrincip PCR

počet kopií narůstá exponenciálně, postupně ale pokles - opotřebování polymerázy, inhibice narůstajícím množstvím nově nasynt. DNA (nastává obvykle po 30-35 cyklech)

Princip PCR

PCR cyklus:

1) denaturace – rozpletení dvouvlákna templátové DNA, obvykle stačí 94-95°C, 30-60 s

(záleží na CG obsahu, lze ovlivnit přidáním aditiv)

Princip PCR

PCR cyklus:

2) annealing (nasedání) primerů

obvykle v rozmezí ca 48-62°C, 30-60 s specifické pro každý primerový pár, nutné optimalizovat,

příp. odhadnout podle sekvence primerů přibližně o 3-5°C pod metling temperature (Tm) primerů:

Tm =  64.9°C + 41°C x (počet G + C – 16.4) / délka primeru [bp] – pro primery >14bp

(Tm = 4°C  x  ( počet G + C) + 2°C  x  (počet A + T) – pro primery <14bp, Wallace rule)

http://www.promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm

http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx

Princip PCR

PCR cyklus:

3) elongace – syntéza komplement. vlákna DNA polymerázou

teplota podle typu polymerázy, obvykle 72°C (ale ~10% aktivity v 37°C)

délka podle aktivity polymerázy a délky amplifikovaného úseku Taq: 1000 bp/min

Taq polymerázy před odpadnutím z vlákna DNA dávají na jeho konec jeden A (terminal transferase activity; využití při AT klonování)

Princip PCR

Složení PCR reakce:

primery: 0.1-1 µM každého primeru reakční pufr (Tris-HCl):

• MgCl2 příp. MgSO4: 1-4 mM (Mg2+ je kofaktor polymeráz)

• KCl: 50 mM deoxynukleotidy (dNTP): 40-200 µM každého typu dNTP polymeráza: 0.5-2U / 25 µl reakce

templát: 1-1000 ng / 25 µl reakce (pro genomovou DNA)

s PCR chemikáliemi pracovat na ledu, skladovat v -20°C (hlavně polymeráza!)

ideálně alikvoty (dNTP jsou senzitivní na opakované zamražování; výhodné i proti kontaminacím)

PCR produkt naopak snese hodně…

Princip PCR

Střídání teplot: speciální PCR zkumavky pro optimální tepelnou vodivost nejdříve manuálně (vodní lázně o příslušných teplotách) termální cyklery

Princip PCR

Vlastní příprava PCR:

objem 1 reakce může být libovolně v rozmezí 5-100 µl namíchat premix pro požadovaný počet vzorků, vždy používat

negativní kontrolu (PCR směs bez DNA → kontrola reakčních komponent, zda nejsou kontaminované DNA)

komerčně dodávané tzv. mastermixy – obsahují všechny složky reakce kromě primerů a templátu

před přesunem do cykleru držet vzorky na ledu

Příklad PCR cyklování: 95°C – 3 min počáteční denaturace DNA

35x: 95°C – 3 min denaturace

Ta – 1 min nasedání primerů

72°C – 1 min elongace

72°C – 10 min závěrečná elongace (dosynt. případná neúplná vlákna)

5°C hold temp. drží teplotu dokud nevyzvedneme vzorky z cykleru

Princip PCR

ELFO produktu PCR:

amplifikace 1 lokusu (za předpokladu, že se alely neliší délkou):

cílový PCR produktnespecifický PCR produkt

dimery primerů

neg. kontrola

(bez templátu)

Princip PCR

PCR polymerázy:

nejdříve se musely měnit po každém PCR cyklu (zničení tepelnou denaturací; Klenowův fragment)

různé typy PCR polymeráz se liší:

• procesivitou - počet nasynt. bp/min

• chybovostí - inkorporace nesprávného nukleotidu

• reakčními podmínkami - složení reakčního pufru, optimální elongační teplota, kolik musíme dát enzymu atd.

průlomem izolace termostabilní Taq polymerázy *1965

(bakterie Thermus aquaticus)

Princip PCR

nejčastěji používané PCR polymerázy:

Taq (Thermus aquaticus; 1965)

1 kb/min (<5 kb), 72°C, frekvence chyb 1x10-4 – 2x10-5 , tvoří polyA-konce; nejlevnější

Ex Taq – modifikace Taq, 5x míň chyb (proof-reading = 3´to 5´ exonuclease activity), tvoří polyA-konce

Pfu (Pyrococcus furiosus; 1991)

0.5-1 kb/min, 72°C, frekvence chyb ~2x10-6 (proof-reading); MgSO4 jako zroj Mg2+

Vent polymerase (Tli, Thermococcus litoralis)

1 kb/min (<6 kb), 72°C, chybovost ~mezi Taq a Pfu (proof-reading); více teplotně stabilní

(Taq half-life ~1h/94-95°C, Vent half-life ~7h/94-95), proto celkově lepší pro delší úseky

Princip PCR

amplifikace dlouhých úseků, genomových fragmentů:

◄ fúze dvou proteinů:

modrá jednotka váže dsDNA

zelená jednotka (~Pyrococcus) syntetizuje

Phusion polymerase (<20 kb)

1 kb/15-30s; 6x míň chyb než Pfu (proof-reading)

LA polymerase (<30-40 kb; Long and Accurate)

1kb/min; Taq polymeráza + proof-reading jednotka

Optimalizace PCR

1. Odstranění nespecifických produktů:

příčina: nespecifická vazba primerů

teplota annealingu – zkusit různé Ta, nebo gradient (např. po 1-2°C)

• touch-down PCR: první cykly PCR jsou zásadní pro specifitu → pokud primery nenasedají specificky, tak se případný mismatch zafixuje; v prvních cyklech začít s vyšší Ta, a postupně ji v následujících cyklech snižovat (např.: 1. cyklus – 60°C, 2. cyklus 59°C, ...)

zkrácení času annealingu snížit koncentraci primerů, polymerázy

koncentrace MgCl2 (např. po 0.5 mM) - spíše snižovat (Mg2+ ale vychytává dNTP, pokud zvyšujeme výrazně, je třeba navýšit dNTP; nebo se naopak dá použít pro redukování dlouhých nespecif. produktů – zvýšení Mg2+ sníží dostupnost dNTP)

koncentrace KCl (ovlivňuje denaturaci DNA, kratší fragmenty preferenčně denaturují za vyšší koncentrace KCl)

• krátké nespecif. produkty: ↓ KCl

• dlouhé nespecif. produkty: ↑ KCl (> 50 mM může inhibovat Taq)

Optimalizace PCR

1. Odstranění nespecifických produktů:

příčina: nespecifická vazba primerů

dlouhé nespecif. produkty může redukovat zkrácení elongace Cold-start: vzorky před umístěním do cykleru držet na ledu! (omezení

aktivity polymerázy)

Hot-start polymerázy: blokovány navázanou protilátkou, aktivovány až počáteční denaturací → nevznikají nespecifické PCR produkty způsobené sníženou aktivitou polymerázy před umístěním vzorků do cykleru

ředění DNA templátu (např. 1:10)

snižování počtu PCR cyklů

Optimalizace PCR

1. Odstranění nespecifických produktů:

příčina: krátké, zdánlivé nespecif. produkty mohou být

nedosyntetizovaná vlákna cílového úseku

podpořit činnost polymerázy

• prodloužením času elongace

• zvýšením koncentrace polymerázy

• koncentrace MgCl2• aditiva vázající inhibitory polymerázy (BSA, T4 protein)

prodloužit čas denaturace, nebo přidat aditiva usnadňující denaturaci templátu (10% DMSO, 5% formamid)

Optimalizace PCR

extrakce - vyřezávání cílových bandů z agarózy po ELFO (vhodné např. pro sekvenaci, klonování)

asi nejefektivnější postup pro odstranění dimerů primerů

1. Odstranění nespecifických produktů:

• celý vzorek nanést na 1-1.5% agarozový gel, nechat rozjet v ELFO

• ideálně Sybr Green + modré světlo (UV fragmentuje DNA, proto minimalizovat dobu expozice / odstínit např. skleněnou petriskou)

• vyřízlý kousek agarózy s cílovým bandem purifikovat běžně dostupnými kity (lyze agarózy, purifikace DNA na membráně)

• může být ztrátové → dělat větší PCR reakce (např. 30 a víc µl)

Optimalizace PCR

2. Slabá nebo žádná amplifikace

chyba při míchání PCR, nesprávný program apod. – odhalí se pomocí pozitivní kontroly (= vzorek templátu, u kterého máme ověřené, že amplifikuje)

teplota annealingu – pomůže především snižování zvýšit počet cyklů PCR (max. ca 45)

• pokud je málo cílové DNA, pozor na kontaminace! zvýšit koncentraci templátu nebo naopak templát ředit (1:10 – 1:1000) – pokud obsahuje inhibitory

• spike control: vezmeme pozitivní kontrolu, a smícháme ji se vzorkem který nefunguje → pokud nedá produkt, tak je to inhibitory ve vzorku

zvýšit koncentraci primerů, polymerázy

gradient koncentrace MgCl2 adititva vázající inhibitory polymerázy (BSA, T4 protein), aditiva

usnadňující denaturaci templátu (DMSO, komerční PCR enhancery)

Optimalizace PCR

použití více PCR: více cyklů PCR, méně opotřebované polymerázy

a) reamplifikace

• vzorek PCR reakce (např. 1 µl z 25 µl rce), která na gelu nedala band, se použije jako templát pro novou PCR za ± stejných reakčních podmínek

• někdy nefunguje (dané typem použitých primerů???)

b) nested PCR

• vzorek PCR reakce (např. 1 µl z 25 µl rce), která na gelu nedala band, se použije jako templát pro novou PCR za použití vnitřních primerů (příp. se použije jeden vnitřní primer + jeden z primerů původní PCR = semi-nested PCR)

• obvykle funguje lépe

• umožňuje větší specifitu

(selektují až 4 primery!)

• x musíme mít vnitřní primery...

2. Slabá nebo žádná amplifikace

Optimalizace PCR

zkontrolovat primery: zda sedí na naši cílovou sekvenci - kritický je mismatch na 3´ konci, kde nasedá polymeráza

2. Slabá nebo žádná amplifikace

pokud nesedí, pokusit se o design nových primerů:

• shromáždit co nejvíc cílových sekvencí, vytipovat vhodná místa

- co nejvíce konzervované mezi cílovými sekvencemi

• někdy jsou sekvence tak variabilní, je nutné použít tzv. degenerované báze (IUPAC kód - např. M značí A nebo C)

http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ - program na design primerů, umožňuje mj. zvolit oblast kam chceme v sekvenci umístit primery, testuje jejich parametry

http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx - pokročilejší testování parametrů primerů

Optimalizace PCR

◄ stabilní dimer primerů (Delta G<6 kcal/mol),

který je při PCR elongován (5´- 3´!)

pro důslednou eliminaci dimerů nastavit např. v Primer3:Max Self Complementarity: 3Max Self Complementarity: 1

• neměly by tvořit smyčky, které nedenaturují za annealingové teploty (někdo naopak preferuje slabé smyčky, aby primery nenasedaly nespecif. za nižší teploty)

• pozor na dimery primerů:

někdy i ideální primery nefungují a naopak teoreticky špatné fungují bez problémů...

Obecná pravidla pro design primerů:

• 15-28 bp dlouhé, GC obsah 40-60%

• pro optimální specifitu by 3´ konec měl být bohatší na GC, ale ne víc jako 3 GC v posledních 5 bázích (zvyšuje riziko nespecif. nasedání)

• oba primery by se neměly příliš lišit v teplotě nasedání (max. ~3°C)