INTRODUCCIÓN

Las células son organismos microscópicos, semitransparentes, que presentan

diversos organelas como: pared celular, flagelos, membrana celular, cápsulas,

etc. Los cuales son más pequeños que los mismos, es por eso que se

necesitan hace coloraciones especiales para poder observar dichos organelas

y poder distinguirlos de otros. Dichas coloraciones tiñen a los organelas debido

a que los colorantes son compuestos orgánicos que tienen una afinidad

específica con los últimos.

El siguiente informe muestra nuestros resultados obtenidos en el trabajo de

laboratorio por los diversos procedimientos de tinción, se pudieron observar las

esporas del bacillus aureus con el méto de Ertz – conklin, a los leuconostoc por

el método de tinción negativa, los diversos microorganismos presentes en la

saliva humana, la membrana celular del Bacillus subtilis por el método de

Kanaysi, y el núcleo bacteriano y de levaduras. Cada muestra al ser observada

por el microscopio mostró diversos resultados debido al trabajo relacionado con

los diferentes métodos de tinción.

MARCO TEÓRICO

COLORACIÓN DE ESPORAS: MÉTODO DE WIRTZ-CONKLIN:

Los microorganismos que las forman deben encontrarse en condiciones

adversas. Se evidencian en la etapa de vida latente. Caracterizan a los géneros 1Bacillus y Clostridium y su localización y forma ayudan en cierto modo a la

identificación presuntiva específica.

Por la naturaleza y grosor de la membrana y bajo contenido en agua, las

esporas son muy difíciles de teñir; se hace actuar el tinte en caliente en idéntico

procedimiento al efectuado para 2ÁCIDO-RESISTENTES. La coloración de

contraste para el cuerpo bacteriano se consigue con Safranina.

Si el cultivo es joven no hay esporas y los- microorganismos se teñirán

uniformemente. Es necesario que éste permanezca por 3-4 días a temperatura

ambiente, después de una incubación óptima de 24 horas o sembrar el cultivo

en un medio específico de esporulación.

De esta manera el material resulta ideal para ensayos de cualquiera de las

técnicas específicas de tinción. Al finalizar el proceso de esporogenesis , la

célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es

favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La

capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias

productoras de 3endosporas son patógenas para el hombre, por lo que el

estudio y observación son de enorme interés.

COLORACIÓN DE CÁPSULAS: MÉTODO DE 4TINCIÓN NEGATIVA:

1 Bacilos: Células bacterianas en forma de bastón, compuesto por bacilos gram positivos con una capacidad para producir endosporas.FUENTE: http://www.monografias.com/trabajos/bacilosgram/bacilosgram.shtml2Ácidos resistentes: Procedimiento en ciertos microorganismos que no son teñidos por una mezcla de alcohol y ácido denominados acido alcohol resistente.FUENTE:”MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA”-María de los Ángeles Equihuatl Ramos-Pag.29-343Endosporas: Son elementos específicos de las bacterias que consisten en células deshidratadas con una supervivencia prolongada.FUENTE: Tortora-Fanke-Case “MICROBIOLOGIA GENERAL”9 ava edición Buenos Aires Mexico Editorial Panamericana 2007.4Tinción negativa: Se llama Tinción negativa porque tiñe el fondo de la preparación y no de los microorganismos.FUENTE:http://www.danival.org/600%20microbio/5000micro_dvf/micro_dvf_222b.html

De ordinario la cápsula se compone de material soluble en agua, así como de

sustancias no iónicas, generalmente polisacáridos. Las técnicas de tinción

frecuentemente se basan en una interacción química entre sustancias

ionizadas. El mejor modo de visualizar cápsulas consiste en usar el

microscopio de fase para observar los organismos en un medio que

proporcione un fondo adecuado. En los laboratorios más modestos, donde no

se cuenta con equipo de contraste de fase, es posible duplicar los resultados

preparando un montaje húmedo que contenga, junte con las bacterias

encapsuladas, algunas partículas de carbón en suspensión. Si se reduce la

intensidad lumínica con el iris del diafragma (o bajando el condensador) se

puede obtener un efecto como de contraste de fase y así, las cápsulas se

observarán como halos o anillos incoloros en derredor de los organismos.

Algunas veces es posible emplear con éxito técnicas de tinción en las que el

material de la cápsula se deshidrata primero con solución salina concentrada;

pero en los laboratorios estudiantiles esta técnica rara vez produce resultados.

Desde el punto de vista formal no es una tinción propiamente dicha, porque no

fija a los microorganismos. Se parece más a una preparación de fresco, su

realización es sencilla, consiste en colocar la muestra húmeda sobre el porta

objetos y mesclar con5 tinta china, en los microorganismos se observa el fondo

negro.

En el microscopio se observa el fondo negro y los microorganismos con

capsula sin color.

COLORACIÓN DE FLAGELOS: MÉTODO DE LEIFSON:

5Tinta china: La capa de material extracelular que se deforma con facilidad, es incapaz de excluir partículas y no tiene un límite definido, se denomina capa mucosa o glucocálix.FUENTE:”MANUAL DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA”- Maria de Lourdes Perez Cahbela-Pag,47-50 1era edición 2004- México

Para teñir los 6flagelos se requiere mucha experiencia de laboratorio. La teoría

de procedimiento es bastante sencilla. El colorante se aplica junto con el 7ácido

tánico como mordiente, el cual se adhiere a la célula y a los flagelos en capas

sucesivas hasta que la bacteria y los flagelos aumentan sus dimensiones. Esto

es necesario debido a que los flagelos son demasiado delgados para ser

percibidos con el microscopio óptico. Las células y los flagelos recubiertos por

capas de mordiente nos dan una imagen algo aumentada y distorsionada.

La ejecución de la tinción de flagelos presenta muchos inconvenientes. Una de

las cosas que hay que evitar es la presencia de materia orgánica, ajena a las

células a teñir, en la porta. El mordiente por cualquier tipo de, materia orgánica

y, por eso cualquier rastro de desecho orgánico presente en el porta. Por lo

tanto, antes de empezar debe asegurarse de que el portaobjetos este

extremadamente limpio. De preferencia, los portas deben ser nuevos y nunca

haber sido tocados con las manos excepto por los bordes. Otro problema con

esta tinción es que los flagelos son tan delgados y frágiles que tienden a

romperse con facilidad. Debido a esto, en cualquier preparación donde se

hayan teñido flagelos se observarán gran cantidad de flagelos libres,

despegados de las células y desparramados por todo el frotis. Sin embargo, su

paciencia y atención a los detalles lo recompensarán con una preparación

excelente.

COLORACIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS: MÉTODO DE

LOEFFLER:

6Flagelos: Son estructuras de locomoción demasiado pequeñas para ser vitascon microscopio óptico o sin tinción.FUENTE: Tortora-Fanke-Case “MICROBIOLOGIA GENERAL”9 ava edición Buenos Aires Mexico Editorial Panamericana 2007.7Ácido tánico: se adhiere en capas sucesivas hasta que los flagelos aumenten su dimensión.FUENTE:http://www.ge-iic.com/index.php?option=com_fichast&Itemid=83&tasko=viewo&task=view2&id=13

Muchas bacterias acumulan en su protoplasma grandes reservas de fosfato

insolubles en agua. Estos son los gránulos 8metacromáticos o de velutina que

aparecen como gránulos refráctiles, cuando se observan al microscopio sin

teñir. Con colorante de Azul de Toluidina u otros tintes azules, se tornan de

color violáceo o ligeramente rojo violáceo; de ahí el nombre de metacromático.

Los bacilos diftéricos y difteroides, poseen numerosos gránulos de este

material; los primeros son agentes causantes de la difteria y sólo están

presentes en casos agudos. Los segundos, saprofíticos, constituyen una

material útil para las experiencias de coloración. Se pueden encontrar en

muestras de saliva de humanos. Estos gránulos tienen una fuerte afinidad por

colorantes básicos como fucsina básica o cristal violeta el azul de metileno o

verde malaquita. Cuando se tiñen de azul de metileno los gránulos toman un

color azul oscuro, mientras que si se tiñen con el colorante de Albert que

contiene verde malaquita, se observa de un color café verdoso oscuro.

DEMOSTRACIÓN DE PARED CELULAR BACTERIANA: MÉTODO DE

ROBINOW:

La pared celular bacteriana se puede tornar visible, a pesar de que ésta no se distingue como entidad discreta en las coloraciones ordinarias. La tinción para la pared celular se aprovecha del hecho de que los contenidos citoplásmicos se pueden hidrolizar diferencialmente o fijar dejando la pared celular sin afectar. Después de teñir correctamente, se puede observar la pared celular con citoplasma como "ahuecado". También es posible tornar visible la pared celular de una manera indirecta aprovechándose del hecho de que ciertos colorantes simples (por ejemplo, azul de metileno) no tiñen la pared celular mientras que otros (violetas cristales) tiñen tanto la pared celular como el citoplasma. Esta es la razón por la cual las mismas células se ven más pequeñas cuando se tiñen con azul de metileno que cuando se tiñen con violeta cristal.

COLORACIÓN DE MEMBRANA CELULAR: MÉTODO DE KNAYS:

La membrana citoplasmática es de naturaleza lipoproteína y da una reacción

acida uniéndose intensamente con colorantes básicos y neutros. No obstante

esta propiedad, el doble contorno de la membrana se aprecia mejor cuando se

8Meta cromático: Son ejemplos de inclusiones que constituyen acumulaciones de polifosfato y se conoce como gránulos de volutina.FUENTE:”BACTERIOLOGIA GENERAL: PRINCIPIOS Y PRACTICAS”- Evelyn Rodriguez Cavallini-Pag. 189

retrae el protoplasma o cuando se trata con algún solvente orgánico que pueda

diluir las grasas y deje expuesto el contorno a la acción de los colorantes.

TINCIÓN DE NÚCLEO BACTERIANO: MÉTODO DE ROBINOW:

Una estructura abundante pero difícil de visualizar dada su complejidad, es el

núcleo bacteriano, pues el RNA y el citoplasma se colorean tan intensamente

que impiden la visualización del DNA. Esto se evita tratando los frotices con

ribonucleasa o con ácidos para destruir la afinidad del citoplasma por el

colorante y aumentar la del ADN.

TINCIÓN DE NÚCLEO EN LEVADURAS:

Ciertos factores citoplásmicos (que normalmente interfieren con el teñido del

núcleo) deben hidrolizarse antes de aplicar la tinción nuclear (azul de toluidina).

En el siguiente experimento también se tendrá la oportunidad de estudiar la

morfología general de la9 levadura típica .En el procedimiento se incorpora el 10azul de toluina.

9Levadura: Son hongos que carecen de gemación, en forma de agregados sueltos de célula independientes, que pueden ser globosas, cilíndrica, alargadas.FUENTE:http://www.telefonica.net/web2/carlosmartinezanton/pdf/7.%20Hongos%20y%20levaduras.pdf

10Azul de toluina: Colorante que tiñe estructuras basòfilas, tales como la cromatina.FUENTE: http://www.e-histologia.unileon.es/1inicio/home/tecnicas.htm

DISCUSIÓN

DISCUSIÓN 01 (Tinción de corpúsculos metacromáticos):

(V. R. Randazzo, S. R. Costamagna) “El objetivo de la presente investigación

fue determinar si la coloración con azul de metileno, de probada utilidad para

demostrar la viabilidad de protoescólices de Echinococcus granulosus, puede

evidenciar también la viabilidad de larvas libres de Trichinella spiralis. Para ello

se utilizaron tres suspensiones de larvas de T. spiralis (M1, M2 y M3), las que

fueron expuestas a diferentes condiciones y observadas a distintos tiempos:

M1 se expuso a -30 °C y se observó a los 70 días; M2 a 80 °C durante 5

minutos y se observó inmediatamente, y M3 se mantuvo a 4 °C durante todo el

experimento, como testigo del 100% de vitalidad. Cada suspensión contenía

500 estadios larvarios libres. Se emplearon 100 μl de solución de azul de

metileno 1:10 000 en agua destilada, agregados a igual volumen de suspensión

de larvas, y las muestras fueron observadas al microscopio óptico para evaluar

la motilidad. Los resultados evidenciaron que cuando las larvas de T. spiralis

estaban muertas (M1 y M2), el 100% se coloreaban totalmente de azul en su

interior, y las estructuras internas, en relación con la capa quitinosa, aparecían

retraídas y algunas fragmentadas. En la suspensión testigo M3 las larvas no se

coloreaban, y como prueba adicional de viabilidad se pudo observar su típico

movimiento en espiral en el 100% de ellas.”

- En el resumen de las estudiantes de la Universidad del sur

San Juan (Argentina), las señoritas estudiantes

mencionan que las larvas de Trichinella spiralis no se

colorean siempre y cuando estén vivas, pero si estas

están muertas la coloración se dará. Esto nos pone un

poco a reflexionar ya que pensábamos que las bacterias

se coloreaban sin importar su movilidad y mucho menos

sin distinguir entre las diferentes especies. En nuestro

trabajo de laboratorio, en el método de coloración por

Loeffler para corpúsculos metacromáticos, la muestra

siempre se sellaba con ayuda del fuego lo que,

suponemos, mataba a los microorganismos facilitando su

tinción con el azul de metileno.

DISCUSIÓN 02:

Utilidad de técnicas histológicas para el diagnóstico de infección en piezas anatómicas Hospital Militar Central "Dr. Luis Díaz Soto"Se realizó un estudio para la introducción y el montaje de técnicas histológicas

de coloraciones especiales más empleadas en los centros especializados, con

el objetivo de identificar los distintos tipos de gérmenes nosocomiales a nivel

celular en muestras de biopsias, citología y necropsias. Estas técnicas

histológicas especiales como son verde metilo pironina, Gleen, Gram, plata

metenamina, entre otras, además de realizar modificaciones de algunas de las

técnicas histológicas especiales que permiten mejor su identificación. Los

resultados del montaje de estas técnicas posibilitan un diagnóstico histológico

específico del germen causal de la sepsis, lo que permite una rápida aplicación

de conductas preventivas y terapéuticas al paciente.

En la actualidad la biología molecular logra identificar cepas de virus, bacterias

y parásitos que han revolucionado estudios en hospitales y en el medio

ambiente. Los estudios histológicos con técnicas histológicas convencionales y

especiales le brindan una información básica al clínico acerca de la naturaleza

del proceso infeccioso, etc., lo que permitiría su aplicación y contribución a

elevar la calidad diagnóstica en casos de infiltrado inflamatorio agudo,

inflamación aguda, etc. e informar el agente causal de infección, por la

morfología, forma de agrupación y características clínicas e histología.

MÉTODOS

Se realizó un montaje de técnicas histológicas más usadas para el diagnóstico

de gérmenes causales de infección: técnica histológica convencional de

hematoxilina/eosina, de origen vegetal, extraída del palo azul de campeche, el

azul de azafrán, el índigo y la orseína. Esta técnica vino a sustituir al azul de

metileno, siendo un colorante básico nuclear que colorea al núcleo de azul, y la

eosina es un colorante ácido que colorea al citoplasma de rojo a rosado.

CUADRO 1. Técnicas histológicas según grupo de agentes infecciosos y forma

de identificación

Técnica histológica Agente infecciosoTinción de

identificación

Brown Brenn

Bacterias

grampositivas

Bacterias

gramnegativas

Azul

Rojo

Verde metiloBacterias

gramnegativasRojo

Pironina Grampositivas Violeta

Glenn Gramnegativas Rojo

PAS Hongos Rosado

Zielh Nielsen Bacilos Rojo

Parásitos

Algunos hongos

Gridley's Hongos Variable

Mucicarmin Hongos Rojo

Giemsa Parásitos Violeta

Levaditis Espiroquetas Negro

Hematoxilina/eosina Hongos Carmelita

Bacterias Violeta

Parásitos Variable

Inclusiones virales Variable

Plata metenamina Hongos Negro

Waysson Espiroquetas Azul

Warthin Starry Espiroquetas Negro

CUADRO 2. Identificación de gérmenes según tipo de agente causal y técnica

histológica empleada

Germen Coloraciones

BacteriasH/

E

Glen

n

Plat

a

Brow

n

Bren

n

Gra

m

Pironi

na

PA

SOtras

Cocos

grampositivos

Streptococcus N. X X X

Staphylococcus X X X

Neumococo X X

Enterococo X X

Cocos

gramnegativos

Meningococo X X X

Gonococo X X X

Bacilos

grampositivos

Clostridium X X X X

Actinomyces X X X X X

Bacilos

gramnegativos

Klepsiella X X X

Haemophilus X X X

E. coli X X

Piocianico(Pseudom

ona)X X X X

Proteus X X

Enterobacter X X

Salmonella X X X

Espirilos X XLevadi

ti

La validación de estas técnicas para el diagnóstico histológico de germen causal de infección utilizó muestras de tejidos humanos sugestivos de infección en órganos como pulmón, hígado, cerebro, vesícula biliar, cordón umbilical, piel y otros, obtenidos mediante biopsias y necropsias realizadas en el Departamento de Anatomía Patológica del Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto".

RESULTADOS:

En las muestras estudiadas sugestivas de infección por hematoxilina/eosina se

observó la presencia de infiltrado inflamatorio agudo, con presencia de

necrosis, exudado purulento, presencia de gérmenes en la luz de algunos

vasos. Estos órganos fueron pulmón, cerebro, riñón, cordón umbilical, vesícula

biliar, etcétera. Se observaron lesiones ampolladas y costrosas en la piel y se

procedió a realizar estudio citológico de estas, en las que se encontraron

inclusiones virales. Se realizó punción biópsica a lesiones tumorales que por

las características del material aspirado se sospechó de origen infeccioso y se

determinó la presencia de bacterias gramnegativas. En ellas se realizó

coloraciones especiales y se agruparon, mostrando los órganos con la

coloración.

CUADRO 3. Relación de órganos muestreados con las técnicas empleadas.

ÓRGANOS TÉCNICAS EMPLEADAS

Pulmón Gram, Gleen, Plata, Brown Breen

Cerebro Gram, Gleen y Plata

Hígado Plata y Gram

Riñón H/E, PAS y Plata

Cordón umbilical Gram y Gleen

Vesícula biliar Gram y Gleen

Mama Gram y Gleen

Piel H/E y PAS

Cuadro 5. Relación del diagnóstico morfológico con cultivo positivo

DIAGNÓSTICO

MORFOLÓGICOCULTIVO POSITIVO

Cocos grampositivosStaphilococus

epidermitidis

Cocos grampositivosNeumococo (látex

positivo)

Cocos grampositivos Enterococus

Cocos grampositivosEstreptococo

betahemolítico

La hematoxilina/eosina, técnica histológica convencional, vino a sustituir al azul

de metileno considerado un colorante básico nuclear que colorea al núcleo de

azul, y la eosina, colorante ácido que colorea al citoplasma de rojo a rosado.2, 3

El Zielh Nielsen sirve para identificar bacilo de Koch.

El Gram es la técnica especial más utilizada para detectar gérmenes Gram

positivos y Gram negativos además de permitir diferenciarlos. El uso y difusión

de esta técnica ha sido recomendada por León como método rápido y fácil en

la detección de bacteriemia relacionada con el catéter en pacientes críticos.

Las técnicas de Giemsa modificada son eficaces para los grampositivos.3

- Al comparar nuestras observaciones aplicando

coloraciones especiales (azul de metileno, safranina,

lugol, tinta china, etc.) las cuales nos permitieron

observar la diferentes estructuras microbianas de los

cultivos realizados previamente (24 horas), se puede notar

que existen otras coloraciones histológicas que permiten

un mejor reconocimiento de la estructura, fisiología,

funcionamiento, etc. de una bacteria utilizando como

medio el cuerpo humano. Siendo la técnica Gram las más

utilizada en los laboratorios (tinción diferencial).

Los cuadros previos nos muestran que existen técnicas

especiales para la detección de infecciones y su

aplicación correcta nos brinda mayores posibilidades de

detección anticipada y su posible tratamiento.

DISCUSIÓN 03 (Tinción de esporas):

Seguido de la explicación por parte del auxiliar de laboratorio se procedió a

colocar con la punta del asa bacteriológica una gota de solución salina, luego

se esterilizo el asa en el mechero, se enfrió y se tomo la muestra de un cultivo

bacteriológico utilizado con muestra y se realizo el frotis. La placa se flameo

hasta que se evaporara toda el agua y se coloreo con verde de malaquita. Se

flameo durante 5 minutos, adicionando colorante cada vez que se secaba la

muestra. Se lavo con agua hasta retirar el exceso de colorante y se realizo la

tinción con safranina durante un minuto. Posteriormente se lavó con agua y se

secó con papel absorbente.

La muestra se rotuló y observó al microscopio óptico con el objetivo de

inmersión. Finalmente se esquematizaron y anotaron los resultados obtenidos.

RESULTADOS: La bacteria es una estructura muy pequeña, sin embargo, por

medio de esta tinción pudimos observar la estructura interna de la célula

bacteriana, particularmente las endosporas, en este experimento se utiliza una

tinción simple debido a que la misma permite que se coloree toda la célula

excepto la espora que se observa de un tamaño bien aceptable.

- En el párrafo mencionado anteriormente se menciona que

cada vez que se secaba el verde de malaquita con el

flameado se le agregaba mas, este procedimiento no fue

realizado por nosotros debido a que no estaba en la guía,

pero cabe mencionar que al comparar nuestros resultados

por esta tinción fueron iguales ya que las endosporas

quedaron coloreadas de color verde. El texto no menciona

si se le agrega safranina para colorear el resto del cuerpo

bacteriano, pero en nuestro caso la safranina agregada

solo tiño parcialmente el cuerpo (solo bordes) de las

bacterias y sirvió para distinguirlo de las esporas.

DISCUSIÓN 04 (Tinción negativa):

Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared denominada cápsula, la cual está compuesta de azúcares y proteínas. No es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cápsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la presencia de cápsula dificulta de algún modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cápsulas constituyen un factor de virulencia de los microorganismos.

- La tinción de cápsula se denomina tinción negativa

porque tiñe el fondo de la preparación y no el

microorganismo. Desde el punto de vista formal no es una

tinción propiamente dicha, porque no fija los

microorganismos. Su realización es sencillísima, porque

consiste en colocar la muestra húmeda sobre la porta

objetos y mezclarla con tinta china. La cual la tinta cubre

toda la preparación a excepción de las cápsulas. En el

microscopio se observa el fondo negro y los

microorganismos con cápsula sin color.

CONCLUSIONES

- El azul de metileno colorea, en su mayoría, a los

microorganismos muertos, esto se pudo rescatar del paper

“Coloración de azul de metileno como alternativa para

determinar viabilidad de larvas libres de Trichinella spiralis”

debido a que en ese documento indica que dicha larva solo es

coloreada si está muerta.

- Conforme avance la ciencia y tecnología nos brinda métodos y

técnicas que contribuyen en el desarrollo de vacunas,

anticuerpos, etc. que se pueden aplicar para disminuir la tasa

de mortandad y mejorar la calidad de vida de las personas.

Las características tintoriales nos ayudan a deducir el tipo de

agente causal, es decir si es una bacteria Gram positivo

(bicapa recubierta de peptidoglicanos) o Gram negativo (tiene

2 capas de fosfolípidos y una capa de proteoglicano en su

pared celular); esto nos permite emitir un diagnostico de

infección. Es importante introducir y aplicar estas técnicas

histológicas con una nueva visión de calidad diagnóstica, lo

que suple la falta de recursos de costosas técnicas como es la

reacción en cadena a la polimerasa (PCR). Se debe señalar

que existe limitación en el diagnóstico histológico, pues si bien

se puede conocer al agente causal, no es posible llegar a

determinar la cepa ni la resistencia a los antibióticos, esto solo

a través del diagnóstico microbiológico.

- El verde de malaquita es un indicador de estructura

trifenilmetano que se caracteriza por presentar tonalidades

fuertes y brillantes a distintos pH.