22

Click here to load reader

Microbiologia de Los Huevos

Embed Size (px)

DESCRIPTION

documento importantisimo para el curso de microbiologia en la carrera de ingenieria agroindustrial espero les sirva mucho

Citation preview

Page 1: Microbiologia de Los Huevos

MICROBIOLOGIA DE LOS HUEVOSI. INTRODUCCION:

En nuestro país, por consumo de huevos se suele entender consumo de

huevos de gallina, si bien en los últimos años se están utilizando también los

huevos de codorniz y de otras aves, con fines fundamentalmente ornamentales

de diferentes preparaciones culinarias. Así pues, en el Código Alimentario

Español, cuando se habla de huevos se hace referencia a los huevos de

gallina, y los de otras especies deben ir acompañados obligatoriamente de la

denominación de la especie de que se trate.

Podemos intuir el valor bromatológico del huevo si pensamos que su destino es

la alimentación completa de un embrión hasta su salida del cascaron. No

obstante, es un alimento delicado, que se altera con facilidad y que puede

trasmitir graves toxiinfecciones para el ser humano.

El huevo es un componente culinario usado tanto en aperitivos como en

postres. También se emplea en la preparación de determinadas bebidas y es

además, un útil de laboratorio de primer orden. Se aconseja su consumo en

cantidades adecuadas a todas las edades, y por si solo basta para completar

algunas dietas adaptadas a diferentes patologías.

Los huevos de las diversas especies animales que los producen, sobre todo,

los de aves domesticas tienen una composición característica y poco variable.

Como ya se ha indicado, el huevo de gallina es el mas utilizado en la

alimentación humana y por tanto, el mejor estudiado. El peso promedio de los

huevos producidos por razas de gallinas seleccionadas es de 58 gramos, con

un reparto porcentual promedio de un 8% a un 11% de cáscara, de un 51% a

un 61% de clara y un 27% a un 32% de yema.

Podemos hablar de tres constituyentes básicos del huevo: uno mineral externo,

la cáscara y dos orgánicos: El Vitelo o yema, que es la célula gigante formada

en el óvulo, y el albumen o clara, que recubre la yema a lo largo de su

migración. Además existen unas membranas que cubren al resto de los

constituyentes orgánicos.

Los tipos de microorganismos contaminantes de los huevos, en el momento de

la postura, son estériles o contienen muy pocos microorganismos. La

contaminación se produce después de la puesta, y es causada por las materias

1

Page 2: Microbiologia de Los Huevos

del nido, la suciedad, y las materias fecales. La flora dominante son los cocos grampositivos ; los bacilos gramnegativos, aunque presentes en menor

numero, penetran mas fácilmente a través de las membranas de la cáscara y

se multiplican mejor que los cocos grampositivos. El numero de bacterias

contenidas en un producto ovular liquido dependerá del estado bacteriológico

de las cáscaras de los huevos en el momento de romperlos de las condiciones

higiénicas de la fábrica y de las condiciones en que se almacena el liquido. Los

géneros más comunes de las bacterias encontradas en los huevos son la

Pseudomona, Alcalígenes, Proteus y Escherichia.Estos organismos son los principales causantes de la descomposición, con los

cambios de olor y de color característicos.

Las bacterias que sobreviven a la pasteurización de los huevos, son por lo

general, especies del genero Bacillus, que es resistente al calor, los

enterococos y los micrococos.

El patógeno más importante de los huevos y sus productos es la Salmonella, el cual muere a las temperaturas de pasteurización, por lo consiguiente la

presencia de éste microorganismo se debe exclusivamente a recontaminación.

II. DEFINICION:

Cuerpo redondo u ovalado, con una membrana o cáscara exterior, que ponen

las hembras de algunos animales y que contiene en su interior el embrión de

un nuevo ser y el alimento necesario para que crezca.

El huevo de forma genérica se refiere al que proviene exclusivamente de

gallináceas. Si el huevo procede de otra ave, se designa indicando además la

especie de la que procede.

ESQUEMA DE LA ESTRUCTURA DE UN HUEVO DE GALLINA

2

Page 3: Microbiologia de Los Huevos

III. CLASES DE HUEVOS:

EL HUEVO FRESCO

3

Page 4: Microbiologia de Los Huevos

Las características del huevo fresco están claramente definidas en el código

alimentario Español y a su epígrafe 3.14.03 nos remitimos: son huevos frescos

“aquello que, presentando un color y sabor característicos, no hay sufrido mas

manipulaciones que una limpieza en seco. Observados al ovoscopio

aparecerán completamente claros, sin sombra alguna, con yema apenas

perceptible y cámara de aire pequeña, de no más de 7 milímetros de altura. La

cáscara será fuerte, homogénea y limpia; la clara firme, transparente y sin

enturbiamientos, y la yema de color uniforme, pudiendo oscilar desde el

amarillo claro al anaranjado rojizo, sin adherencias con la cáscara y

conservándose centrada y entera”.

Los huevos se clasifican en diferentes categorías según su tamaño,

clasificación que en nada hace referencia a la frescura del alimento, de tal

modo que un huevo de cuarta clase, en un momento determinado, puede estar

más fresco que todo de clase superextra.

CATEGORÍAS DEL HUEVO SEGÚN SUS TAMAÑOS

CATEGORIA PESO EN GRAMOS

Superextra Mas de 65 gramos

Extra De 61 a 65 gramos

Primera De 56 a 65 gramos

Segunda De 51 a 55 gramos

Tercera De 46 a 50 gramos

Cuarta 45 o menos gramos

HUEVOS DEFECTUOSOS

Son defectuosos los huevos rotos, incluso, parcialmente, pero cuyas

membranas permanece intactas; aquellos que, sin estar exteriormente

alterados, carecen del olor y sabor característicos; los que, al ovoscopio,

muestran una sombra oscura; finalmente, los que tienen una cámara de aire

con una altura superior a 12mm.

HUEVOS AVERIADOS

4

Page 5: Microbiologia de Los Huevos

Los huevos averiados proceden de gallináceas o palmípedas; son impropios

para el consumo humano por concurrir en ellos una de las siguientes

circunstancias:

Tiene mal olor o sabor

Están contaminados por bacterias u hongos

Están podridos

Tienen la clara de color verdosos

Son sanguíneos o encubados

Su cámara de aire tiene mas de 20 mm de altura y es muy movible

Han sido conservados mediante procedimientos no autorizados

HUEVOS PUTREFACTOSLos huevos podridos contienen una mezcla de bacterias gram negativas

acompañado a veces por algunos microorganismos Gram + , pertenecen a los

géneros alcaligenes, Achromobacter, Pseudomonas, Serratia, Hafnia,

Citrobacter, Proteus y Aeromonas (Board 1977).

Las propiedades internas del huevo son las que seleccionan la flora de la

putrefacción. Estos microorganismos son poco exigentes desde el punto de

vista nutritivo y además son Psicrotolerantes.

Los mohos dan menor problema durante la conservación de los huevos

frescos. Sin embargo en condiciones de humedad alta pueden desarrollarse en

la superficie de la cascara y el micelio penetra al interior a través de los poros.

El desarrollo de las bacterias en las membranas testáceas va acompañado a

menudo de un proceso de gelificacion de la clara y a veces de la ruptura de la

membrana vitelina. Los mohos más frecuentes son Cladosporium y

Sporotrichum.

IV. DEFENSAS NATURALES DE LOS HUEVOS:Los huevos enteros, con cáscara presentan las defensas antimicrobianas

naturales más eficaces. Esto permite al embrión a desarrollarse y llegar hasta

la eclosión con las máximas posibilidades de sobrevivir.

Estas defensas son de naturaleza física (cutícula, cáscara, membranas

testáceas, viscosidad de la clara) y química (factores antimicrobianos naturales

5

Page 6: Microbiologia de Los Huevos

del albumen). La conservabilidad de los huevos dependerá, en principio, de la

integridad de su envoltura natural: la cáscara.

DEFENSAS FÍSICAS:

1. LA CUTÍCULA :

Desde la formación el oviducto, la cáscara se encuentra recubierta por una

capa de naturaleza proteica de un espesor medio de 0.01mm: la cutícula

(WEDRAL y col., 1974, Simkiss, 1968). Esta membrana impide la penetración

de bacterias, mohos y virus al interior del huevo ya que obtura la mayor parte

de los poros de la cáscara. Los golpes, el lavado, los cambios de temperatura,

la humedad y la temperatura ambiente, etc. son factores que puedan alterar

esta cutícula, que pierde integridad y hace que la cáscara se haga más

permeable a los microorganismos.

Generalmente se admite que la cutícula pierda eficacia como barrera a la

penetración de las bacterias en el huevo, al cabo de unas horas de la puesta,

Por otra parte, algunas pseudomonas son capaces de digerir la cutícula

permitiendo entonces la colonización por levaduras de la cáscara (BOARD y

COL. 1979). El grosor de la cutícula, las manipulaciones de los huevos, el

tiempo de almacenamiento, la temperatura y el lavado, favorecen el desarrollo

de los microorganismos y su posible penetración al interior de los huevos

(MAYES y TAKEBALLI,1983).

2. LA CÁSCARA:

Para permitir al futuro embrión respirar, la cáscara se encuentra perforada por

numerosos agujeros o poros (de 7.000 a 17.000) de un diámetro que varía de 6

a 13um. La mayor parte de estos poros se encuentran obturados por tapones

constituidos por fragmentos de cutícula. Son estos tapones los que confieren a

la cáscara su función de barrera, ya que el diámetro de los poros desnudos

permite el paso fácil de los microorganismos. Esta es la razón por la que la

contaminación de los huevos es mucho más frecuente después del lavado o de

cualquier otro tratamiento que dañe la cutícula.

El espesor de la cáscara es el factor principal que se opone al paso de los

microorganismos. Depende de factores genéticos o zootécnicos (alimentación,

6

Page 7: Microbiologia de Los Huevos

condiciones de cría, edad de las ponedoras, estado de puesta) (SAUTER y

PETERSEN, 1974). Para la mayor parte de los autores, el mecanismo de paso

de las bacterias a través de la cáscara se debe a un efecto de succión,

después de la formación de la cámara de aire (BOARD, 1966, MAYES y

TAKEBALLI, 1983). Por último, la presencia de poros de diámetros

anormalmente elevados puede representar un factor de contaminación rápida

de los huevos.

ESQUEMA DE LA SECRECIÓN RADIAL DE LA CÁSCARA DE HUEVO

7

Page 8: Microbiologia de Los Huevos

3. MEMBRANAS TESTÁCEOS :

Las membranas testáceos son dos membranas adheridas al interior de la

cáscara y soldadas la una a la cara en toda su extensión, salvo en el extremo

del huevo donde se separan para constituir la cámara de aire. Están separadas

por una red de fibras de queratina y actúan como filtro microbiano la membrana

interna, rica, es la más eficaz a este respecto (MORAN y HALE,1936). El

mecanismo de penetración de las bacterias a través de los hidrólisis enzimático

8

Page 9: Microbiologia de Los Huevos

(proteolosis y lipólisis), al no existir poros, aunque ello no implica que haya en

aumento de permeabilidad hacia las bacterias (BROWN y COL, 1965). Entre

todas las defensas físicas del huevo contra la invasión microbiana, las

membranas testáceos representan seguramente la barrera más eficaz.

DEFENSAS QUÍMICAS:

Existen varios factores que pueden entorpecer la progresión de las bacterias o

de los virus de las membranas testáceas hacia la yema. Primero, la viscosidad

elevada de la clara (en particular la fracción de clara densa), debido a la

estructura de las proteínas que la componen, que frena el desplazamiento de

las bacterias (YADAV, y VADEHRA, 1977). Segundo, la organización de las

chalazas que mantienen, en el huevo fresco, la yema en posición central,

alejada de la cáscara y por tanto del origen de la contaminación.

A lo largo del periodo de conservación de los huevos, pueden darse

modificaciones de cierta importancia. La licuefacción de la clara y la

destrucción parcial de las chalazas traen consigo el que la yema se desplace

hacia las paredes internas dela cáscara. La membrana vitelina se hace más

frágil. En definitiva, las defensas naturales del huevo disminuyen.

1. PH ALCALINO:

El pH de la clara del huevo fresco recién puesto se sitúa alrededor del 7,5 este

pH es favorable para el desarrollo de la mayor parte de los gérmenes

saprofitos.

Durante la conservación de los huevos se produce una pérdida importante de

CO2, a través de la cáscara, que trae consigo un aumento del pH que se

estabiliza un poco por encima de 9, tanto más rápidamente, cuanto más alta

sea la temperatura de conservación. Para su crecimiento e incluso para su

supervivencia. Así, Pseudomonas fluorescens, Proteus Vulgaris y Alcaligenes

sp. Son incapaces de desarrollarse en estas condiciones (GARBALDO, 1960).

2. LISOZIMA:

9

Page 10: Microbiologia de Los Huevos

La lisozima es una proteína que posee actividad biológica de naturaleza

enzimática. Es una 1-4--N, acetilmuramidasa, que hidroliza el enlace

glucosídico entre el carbono C-1 del ácido N-acetilmurámico y el C-4 del a N-

Acetilglucosamina del peptidoglicano de la pared de las bacterias Gram +. Esta

acción de lisis ha podido ponerse con facilidad en evidencia “in vitro”. Sin

embargo, algunos microorganismos son capaces, bajo ciertas condiciones, de

resistir el ataque de la lisozima, como es el caso del Staphyloccus aureus o el

de algunas especies esporuladas (clostridium tyrobutyricum) (WASSERFALL y

TEUBER, 1979). En general, se admite que el hecho de no encontrar nunca

bacterias Gram + en los huevos se debe a su sensibilidad a la lisozima.La

lisozima puede, igualmente, actuar sobre las bacterias Gram + en función del

elevado carácter electropositivo de su molécula. A pH superior a 8, las

membranas bacterianas se cargan negativamente, en presencia de lisozima se

forma un complejo que aglutina las células entre si (NO y GARIBALDI, 1975).

3. CONALBUMINA: Denominada todavía ovotransferrina, es una heteroproteína cuya fracción

proteica es análoga a la transferina de suero de pollo. Impide el desarrollo de

los microorganismos gracias a su poder quelante, principalmente de iones de

hierro (Fe++). La canulbúmina ejerce una acción de privación del hierro, que

depende de varios factores, entre ellos el pH y la propia concentración de

hierro. Si ésta es alta, como ocurre en los ovoproductos almacenados en

recipientes previamente lavados con aguas ferruginosas, las defensas

naturales del huevo disminuyen frente a la infección microbiana. Este tipo de

inhibición depende también del tipo de microorganismos: Micrococcus sp. Son

más sensibles que Bacillus sp., y estos más que la baterías Gram – (FEENEY y

COL, 1952).

V. ALTERACIONES POR MICROORGANISMOS:La contaminación del interior del huevo por microorganismos es bastante

frecuente, ya que, contrariamente a lo que se cree, los microorganismos

penetran en él por los poros de la cáscara. La práctica del lavado de los

huevos, que se hace en muchas granjas avícolas, acelera este proceso, ya que

elimina la cutícula protectora que cierra los poros. Inicialmente, los procesos

10

Page 11: Microbiologia de Los Huevos

alterativos ocasionados por microorganismos tienen lugar en el interior del

huevo, de modo que en el exterior no podemos apreciar nada más que un

típico ruido de bamboleo cuando los agitamos, el cual es consecuencia de la

rotura de la cámara de aire. Cuando se cascan, estos huevos presentan

distintas características de alteración que pueden ayudar a identificar el agente

contaminante:

Putrefacción blanca, causada por Coliformes y Micrococcus.

Putrefacción roja, causada por Pseudomonas

Putrefacción verde, causada por el bacilo piociánico.

Putrefacción negra, causada por Proteus melanogenes.

A esto hay que añadir el típico olor a huevo podrido, cuyo origen está en la

producción de anhídrido sulfuroso. A medida que la putrefacción avanza,

aparecen modificaciones en la cáscara, normalmente, aspectos jaspeados de

distintas tonalidades grises o azuladas. Por otra parte, se pueden producir

también alteraciones fúngicas, ocasionada por diferentes tipos de hongos y que

se manifestarán sólo en la cáscara o en el interior del huevo:

Hongos que crecen en la cáscara: Como consecuencia de la humedad existente en los locales de almacenaje,

surgen moteados verdosos de consistencia más o menos mucosa.

Hongos que crecen en el interior del huevo:

Estos hongos atraviesan la cáscara formando colonias en el interior,

concretamente, en la zona de la clara. Las colonias son verdosas si el

contaminante es Aspergillus; azuladas en el caso de contaminación por

Penicillium; grises cuando el contaminante es el Mucor. Al ovoscopio pueden

verse manchas de diferentes tamaños.

VI. CONTAMINACION DEL HUEVO Y PROTOCOLO DEL CONTROL MICROBIOLOGICO:

Ya se ha señalado que los huevos frescos poseen numerosas medidas de

defensa físicas y químicas que les permiten resistir la invasión microbiana. En

ausencia de manipulaciones extraordinarias, las defensas naturales mantienen

su eficacia a lo largo de la conservación y evitan el deterioro del producto.

11

Page 12: Microbiologia de Los Huevos

No obstante, por sus características de composición nutricional, en los

huevos los gérmenes pueden proliferar bastante; hay dos momentos en los que

se pueden contaminar: antes y después de la puesta.

CONTAMINACION ANTES DE LA PUESTA.

Evidentemente, antes de la puesta, la contaminación, con

microorganismos, patógenos o no, está ligada a su presencia en el aparato

genital de la ponedora, lo que es difícil de evidenciar no siempre la toma de

muestras estériles del interior del huevo es fácil, ni las técnicas de esterilización

de la cáscara eficaces, y el riesgo de contaminación a partir de! aire siempre

existe.

Diferentes estudios han puesto de manifiesto que casi una de cada dos

ponedoras tiene el oviducto y el ovario contaminados con bacterias no

patógenas, pertenecientes, por lo general, a los géneros Lactobacillus y

Micrococcus. Estos huéspedes habituales de los genitales de las gallinas se

encuentran raramente en los huevos y su función es poco importante en su

alteración.

Es diferente lo que ocurre con algunos gérmenes que llegan al huevo en el

curso de su formación: suelen proceder de los alimentos que recibe el animal y

transitan por la vía digestiva y sanguínea hasta el ovario; ésta es caso de las

Salmonelas patógenas para el ser humano. No, obstante, esta transmisión

Trans-ovárica necesita un elevadísimo nivel previo de contaminación de los

alimentos, Al parecer, el origen más frecuente es el agua que se bebe, Gracias

a los progresos que se han logrado en la cría y en la alimentación animal en la

actualidad, el grado de infección por Salmonelas en ponedoras es bajísimo.

Se han señalado otros gérmenes como responsables de contaminación de los

huevos antes de la puesta, entre ellos, Staphylococcus, Pasteurella, Listeria y Pseudomonas, si bien se puede afirmar que el 80% se contamina tras la

puesta.

La contaminación depende de la limpieza de los lugares de puesta y de la

manera en que los huevos son manipulados tras obtenerlos. Hay que tener en

cuenta que la integridad de la cáscara es fundamental para asegurar la

12

Page 13: Microbiologia de Los Huevos

correcta conservación del huevo: si permanece intacta, la única posible vía de

penetración de los microorganismos son los poros. En ambientes húmedos se

pueden desarrollar en su superficie mohos que hidrolizan la cutícula,

provocando un agrandamiento de los poros y facilitando la penetración de los

gérmenes. Así pues, es fundamental que el embalaje utilizado para el

transporte de los huevos contribuya a eliminar esta humedad, por lo que son

preferibles los envases de cartón o celulosa a los de plástico.

CONTAMINACIÓN DESPUÉS DE LA PUESTA.

En la cáscara de un huevo, la cantidad de microorganismos presentes puede

variar de algunos cientos a varias decenas de millones, con una media de cien

mil. Esta contaminación depende muy estrechamente de las condiciones de

higiene de la cría; así, los huevos procedentes de granjas no industriales

suelen estar mucho más contaminados que los de granjas industriales. Una

parte importante de esta contaminación externa procede de las camas de los

animales, de sus heces y del polvo del aire. La flora que se encuentra suele

estar constituida por G+ y micrococus, bastante resistente a las condiciones de

sequedad que representa la superficie de la cáscara.

La contaminación microbiana de los huevos depende fundamentalmente del

estado de limpieza de los lugares de puesta y de la manera en que son

manipulados después de obtenidos. La menor fisura en las cáscaras puede

tener consecuencias nefastas en la conservación de los huevos. Si la cáscara

permanece intacta, la única vía de penetración de los microorganismos al

interior del huevo son los poros. En ambientes húmedos pueden desarrollarse

en la superficie mohos, cuyo micelio puede hidrolizar la cutícula, provocando un

agrandamiento de los poros y facilitando por tanto la penetración al interior de

los microorganismos (WESTON y HALNAN, 1927). Es muy importante que el

embalaje de los huevos contribuya a eliminar la humedad, por eso son

preferibles los envases de cartón a los de plástico. En resumen, las

condiciones de almacenamiento (tiempo, temperatura, humedad), así como el

lavado de los huevos tienen una gran influencia sobre la contaminación).

13

Page 14: Microbiologia de Los Huevos

Tipo de

Microorganismos

Frecuencia

Sobre la cáscara En huevos podridos

Micrococcus

Achromobacter

Aerobacter

Alcalígenos

Arthrobacter

Bacillus

Cytophaga

Escherichia

Flavobacterium

Pseudomonas

Staphylococcus

Aeromonas

Proteus

Sarcina

Serratia

Streptococcus

+++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

++

+

+

+

+

+

+

+

-

+++

+

+

+

+++

+

+++

-

++

+++

-

-

+

ALTERACIONES BACTERIANAS Putrefacción verde: Por P. fluoresceínas. Emisión de fluorescencia. Olor a

fruta

Putrefacción incolora: Pseudónimas, Achromobacter, doliformes… Se rompe

la pared de la yema, que se vuelve acuosa. A veces, olores muy desagradables

Putrefacción negra: Por Proteos, ciertas Pseudónimas… Alteración típica de

huevos mantenidos a temperaturas elevadas. Clara acuosa, color marrón,

yema disgregada y ennegrecida. Fuerte olor a sulfhídrico.

Putrefacción roja: Por Serraría marcasen. Sin olor. Coloración roja.

ALTERACIONES FÚNGICAS Manchas: Superficiales en el interior de la cáscara, por la entrada de micelios

(hifas). Depende del moho, distinto color (Penicillium, Cladosporium.

14

Page 15: Microbiologia de Los Huevos

Putrefacción: Clara gelatinosa que muestra color típico de la especie

responsable. La membrana de la yema se rompe y se mezcla con la clara.

Olores: Variados (por ejemplo, a tierra, por Streptomyces)

VII. METODOS DE CONSERVACION DE LOS HUEVOS:

Se ha de distinguir entre la conservación que se hace por el frio, ya sea de

forma industrial o doméstica, y la que se practica por métodos tradicionales.

Conservación por el frío

La acción del frío, en sus distintas modalidades, permite la conservación idónea

de los huevos, así como también la regularización del mercado, manteniéndose

los precios dentro de unos márgenes más o menos estrechos. El Código

Alimentario Español especifica claramente los métodos de conservación:

Huevos refrigerados:

Son huevos enteros que, durante un tiempo superior a quince días, sin exceder

de treinta desde su puesta, se mantienen aislados del medio ambiente en

cámaras frigoríficas o en locales con temperaturas que no superen los 4°C.

Huevos conservados:

Son aquellos que han permanecido en cámara frigorífica a 0°C durante un

período de tiempo superior a treinta días e inferior a seis meses.

Conservación por métodos tradicionales

Todos los métodos tradicionales tienen como objetivo esterilizar, en la medida

de lo posible, la cáscara del huevo y, además, taponar sus poros para que los

posibles gérmenes contaminantes no penetren por ella. Algunos de los

sistemas utilizados son los siguientes:

El método chino.

Consiste en pincelar toda la superficie de los huevos con una fachada de cal

apagada, al 1 %. Esta cal reacciona con el dióxido de carbono atmosférico,

formando carbonato cálcico que tapa los poros.

Utilización de salicilato sódico o vidrio soluble.

15

Page 16: Microbiologia de Los Huevos

Se trata de un método más moderno que el precedente que permite conservar

los huevos durante meses en cuevas o locales fríos. El sistema es muy

parecido al método chino: los huevos se sumergen en soluciones al 1%, pero

tiene el inconveniente de que adquieren un cierto sabor jabonoso.

Adición de sal común.

Los huevos se introducen en disoluciones de salmuera (15 gramos de sal por

litro de agua). Así se conservan más de un mes.

Otros métodos.

Existen muchas otras variantes de los sistemas anteriores, con resultados más

o menos buenos: enterrar los huevos con sal seca y ceniza de madera, pincelar

con bórax, alumbre o glicerina, etc.

16