Microscopia - microbioblogueando.files.wordpress.com · (*): observación en fresco: se observa un objeto en las mismas condiciones en que el objeto se presenta naturalmente, pudiendo

Microscopia Microscopios ópticos

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microscopio simple:

Con él se describieron por 1º vez las bacterias

microscopio compuesto:

Mejoró significativamente la calidad de imagen

del microscopio simple


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Microscopia Microscopio ópticos invertido

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Microscopia Microscopio óptico invertido

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A)Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y amplía la imagen formada en los objetivos.

B)Objetivo: lente situada en el revolver. Amplía la imagen, es un elemento vital que permite ver a través

de los oculares.

C)Porta objetos: elemento transparente (vidrio) que sostiene el objeto a observar, y permitiendo que los

haces de luz lo atraviesen par a constituir la imagen.

D)Lentes de la iluminación (condensador): lente que concentra los rayos luminosos sobre la

preparación.

E)Sujeción del portaobjeto (platina): Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que

se coloca la preparación, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminación

situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de

cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparación de adelante hacia

atrás o de izquierda a derecha y viceversa. Puede estar fija o unida al brazo por una cremallera para

permitir el enfoque.

F)Fuente de luz: Originalmente espejos, actualmente lámparas LED, guían la luz hacia el objeto

G) Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador.

H) Tubo: es la cámara oscura que porta el ocular y los objetivos. Puede estar unida al brazo mediante

una cremallera para permitir el enfoque.

G

H I J

I) Revólver: Es el sistema que porta los objetivos de diferentes aumentos, y que rota para poder utilizar uno u otro, alineándolos con el

ocular.

J)Tornillos macro y micrométrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina o el tubo hacia arriba y hacia abajo. El macrométrico

permite desplazamientos amplios para un enfoque inicial y el micrométrico desplazamientos muy cortos, para el enfoque más preciso.

Pueden llevar incorporado un mando de bloqueo que fija la platina o el tubo a una determinada altura. Ve

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Características de la microscopía óptica con microscopios compuestos:

Se utiliza para estudiar objetos delgados, (cuanto mayor aumento se desea obtener, mas

delgada debe ser la muestra para obtener una imagen correcta), ya que la profundidad de

campo del microscopio óptico es muy limitada.

Generalmente se usan para observar extendidos finos o cortes de tejidos realizados con

equipos de corte muy delgado (micrótomos). La imagen formada depende de la luz que

atraviese la muestra, y usualmente son necesarias técnicas especiales para aumentar

el contraste de la imagen: con bajos aumentos (objetivo de 40X) se suelen realizar

observaciones directas en fresco (*), pero con máximos aumentos (objetivos de 100 X) se

requieren técnicas de tinciones y usualmente preparados en seco o fijados (**)

Las observaciones en fresco adquieren mayor definición en microscopios de luz común pero

con dispositivos especiales que permiten aplicar las técnicas de campo oscuro o contraste

de fases

(*): observación en fresco: se observa un objeto en las mismas condiciones en que el objeto se presenta naturalmente, pudiendo

agregar agua para facilitar la dispersión de las partes del material

(**) Preparados en seco o fijados: antes de observar, el objeto es «fijado» con calor y/o fijadores químicos, con el objeto de evitar

ser barridos en los procesos de tinción a los que será sometido antes de ser observado el material

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Características de la microscopía óptica con microscopios compuestos:

La imagen vista bajo un microscopio convencional, (microscopio óptico de campo claro =

MOCC) es formada por el objetivo del microscopio, y finalmente se observa en el ocular que es donde la imagen se amplía.

Preparado sin colorear

Preparado coloreado Ve

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Si la muestra no absorbe la luz, no habrá esencialmente contraste

entre los objetos que constituyen la muestra y el espacio vacío entre

dichos objetos, y no podremos observar la imagen (veremos un

campo microscópico iluminado sin objetos dentro). Por ejemplo, la

mayoría de las células vivas absorben poca luz (a excepción de las

células rojas de la sangre y los cloroplastos) y por lo tanto, son

difíciles de visualizar a través de un MOCC. Mucho menos luz

absorben diferentes estructuras de los microorganismos,

esencialmente mas pequeños que una célula eucariota. Para

solucionar esta limitación es que se utilizan los colorantes, técnicas

que «engrosan» las estructuras, o microscopio de campo oscuro ó

contraste de fases.


Límite de resolución óptica de un microscopio óptico compuesto:

El límite de resolución óptica (la menor distancia entre 2 puntos que permite a un microscopio óptico

identificar a dichos puntos como entes independientes) depende de un fenómeno físico óptico llamado

difracción .

En la determinación de la difracción participan varios factores:

1º) la apertura numérica (AN) del sistema

2º) la longitud de onda de la luz empleada

3º) aberraciones ópticas dependientes de la calidad de los lentes

Suponiendo que las aberraciones ópticas fueran despreciables, que se utiliza luz de lámpara o luz

solar mediante espejo (luz verde de 550 nm), la AN del aire (0,95) o la generada por uso de aceite

(1,5) , basándose en la siguiente fórmula podemos deducir que el limite de resolución con el mejor

microscopio óptico es de aprox. 0,2 micras.

550 nm/2*0,95= 289 nm = 0,289 µ

550 nm/2*1,5= 183 nm = 0,183 µ

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Microscopia Microscopios ópticos: contraste de fases

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El microscopio de contraste de fases permite observar

preparados en fresco (células, y algunas de sus estructuras

especializadas) con mayor definición que un MOCC, sin

necesidad de fijar y teñir, por lo que resulta especialmente útil

para células vivas.

Se basa en el aprovechamiento de pequeñas diferencias entre

los índices de refracción de distintas partes de una muestra: la

luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción

experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto

al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra.

Utiliza una serie de anillos ópticos (uno a nivel del objetivo y

otro a nivel del condensador), que permiten anular la amplitud

de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un

contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la

imagen corresponden a las porciones densas de la muestra;

las partes claras de la imagen corresponden a porciones

menos densas.

El microscopio de contraste de fases, ilumina a la

muestra mediante un cono de luz hueco (luz en la

periferia y oscuridad en el centro), de manera similar a

lo que ocurre con el microscopio en campo oscuro.

Sin embargo, en el microscopio de contraste de fases

el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de

visión del objetivo, el cual contiene un dispositivo en

forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y

provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud

de onda.

Este tipo de iluminación provoca variaciones

minúsculas en el índice de refracción del objeto

observado en una muestra transparente, haciéndolo

visible ¿Por qué razón?


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Aunque las células absorben poca luz, tienen diversos

espesores y diversos índices de refracción en sus partes,

lo que conduce a las diferencias de fase de las ondas de

luz que pasan a través de ellas. La fase de un haz de luz

es inobservable a la vista (apenas se ve la intensidad, no

la fase).


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El diseñador del método de contraste de

fase, Zernike (por lo cual obtuvo un

premio Nobel de física) calculó la

manera de hacer que las diferencias de

fase se observaran en la imagen como

si se tratara de diferencias de

intensidad, logrando así visualizar

detalles que no eran posibles apreciar

en un microscopio convencional.

Cryptosporidium spp

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Células eucariotas en cultivos in vitro: la misma muestra, con MOCC (microscopia óptica de campo claro) y MOCF (microscopía óptica de contraste fe fase)

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Basidiosporas:

Estudios de factores de virulencia en infección

de plantas por Ustilago maydis

Hernandes: INCI v.28 n.5 Caracas mayo 2003

Semen:

Estudios de calidad espermática previo uso

para inseminación.

Microscopia Microscopio óptico de campo oscuro

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Microscopia Microscopios ópticos de fluorescencia

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Fitopatologia: Ustilago maydis como fitopatógeno,

tinción fluorescente de lectina con Alexa-fluor-488


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Andrología: estudio de integridad de ADN en

espermatozoides con naranja de acridina


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Observación con inmunofluorescencia directa

Observación con tinciones convencionales

Microscopia Microscopía confocal

Un microscopio confocal es un microscopio capaz de obtener imágenes tridimensionales de

una célula.

Se basa en un principio similar al de un microscopio de fluorescencia: Para observar

preparaciones con este microscopio es necesario teñirlas con sustancias fluorescentes o

marcarlas con sustancias (como los antoicuerpos) previamente conjugadas con fluorocromos.

Pero, las siguientes diferencias hacen de la microscopía confocal una técnica que permite

revelar estructuras y funcionamientos celulares con mayor detalle y de manera dinámica:

• Se utilizan dos diafragmas confocales (uno antes de la muestra y otro después) capaces

de enfocar la iluminación en un único punto de la muestra.

• Se utiliza un láser como fuente luminosa, y con él se va barriendo la muestra por todo su

volumen, plano a plano, creando muchas imágenes bidimensionales simultáneas

• En vez de ser el ojo del operador el que captura las múltiples imágenes, éstas son

capturadas y analizadas por un ordenador, generando finalmente una imagen

tridimensional del objeto.

• Las imágenes son observadas mediante un monitor o fotográficamente.

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Colonización de un pelo de raíz de Poaceae (gramíneas) por Azospirillum spp


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Gfp-tagged bacteria (arrow heads) were visualized in the cortex (a) near the endodermis barrier (b), passing this barrier (c) and colonizing xylem vessels (d–

e). Other fluorescent microorganisms were visualized inside xylem vessels of inoculated cuttings (arrows in f) as well as of nontreated plants (arrows in g).

http://dx.doi.org/10.1111/j.1574-6941.2007.00410.x


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(a) Interaction between the wild-type strain Pseudomonas chlororaphis PCL1606 cells (in red) concentring around and colonizing R.

necatrix hyphae (in green). Disturbance of hyphal growth can be observed as changes in directionality, increase in the hyphal size and

in the number of vacuoles. (c) R. necatrix hyphal network in the rhizosphere of avocado roots not bacterized. The white asterisks in

picture a correspond to the colonies aggregates of the wild-type strain P. chlororaphisPCL1606 in close contact with the R.

necatrixCH53-GFP hyphae.

http://dx.doi.org/10.1111/1574-6941.12319

Microscopia

Microscopios electrónicos: barrido

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Microscopia

Microscopios electrónicos: barrido

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Microscopia Microscopios electrónicos: transmisión

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Microscopia

Microscopios comparación

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