Microscopie confocale balayage laser Romain Morichon IFR 65
Site St Antoine
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Principe microscope confocal Marvin Minsky Informaticien et
roboticien amricain Crateur de lintelligence artificielle et le pre
du confocal (1957)
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Structure des plateformes Plateformes d'imagerie cellulaire
Font partie de l'IFR 65 Regroupement 15 quipes INSERM, 10 quipes
d'accueil P6. -Plateforme Tenon - 1 SP1 Leica (1998), 200K -1 SP2
Leica (2004) + Multiphoton (2006), 450K -Plateforme St Antoine -1
SP2 Leica (2012) -1 Spinning disk (2008) 350K
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GFP
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Principe microscope confocal
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Au niveau de lchantillon
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Exemple Cellule Hela Epifluorescence Confocal Microtubule
F-Actine Noyaux
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Rsolution Microscopie conventionnelle d xy = 0,61. /ON d xz =
2. /ON 2 Microscopie Confocale d xy = 0,4. /ON d xz = 1,4. /ON 2
Gain : 15% en latrale 30% en axiale Exemple : 100X 1,4ON 488nm
Conventionnelle: dxy= 210nm dxz= 500nm Confocale dxy= 140nm dxz=
350nm
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Quelques exemples de confocal Nikon A1+ Zeiss LSM 710 Olympus
FLUOVIEW 1000 Leica SP5
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LASER AOTF
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LASER comme source de lumire Source lumineuse monochromatique
intense Diffrents types de LASER: Ar 457nm, 488nm, 514nm ArKr
488nm, 568nm, 647nm HeNe 543nm HeNe 633nm Diodes 405nm ou 488nm ou
561nm
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Choix des Fluorochromes Alexa 568 514nm 543nm 561nm Choisir les
fluorochromes en fonction des lasers disponibles. Plus lexcitation
sera loin du maximum dabsorption plus lmission sera faible.
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AOTF Linteraction entre la lumire et une onde acoustique
produit une diffraction de la lumire. A partir dune frquence
acoustique donne on slectionne une longueur donde. Possibilit de
slectionner jusqu 8 raies et den moduler leurs intensits Laser 1
Laser 2 Laser 3 Laser 4 Laser 5
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Leica SP5 AOBS
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AOBS vs Dichroique Permet de supprimer les filtres dichroques
classiques qui ont des caractristiques fixes et une bande passante
faible. possde une grande flexibilit et une meilleure efficacit
permet de rduire la puissance de laser tout en ralisant des
acquisitions plus rapides permet de contrler jusqu' 8 raies lasers
de faon squentielle ou simultane. Courbe de transmission
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Leica SP5 Systme de balayage XY Systme de balayage Z
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Balayage XY 1 2 Effectu par 2 miroirs orients par des moteurs
galvanomtriques ou rsonnants Balayage x en continu Balayage y
incrment Vitesse de balayage 200, 400, 800 ou 1000 Hz pour un
galvanomtre linaire et jusqu 8000Hz pour un rsonnant. GSI Lumonics
OSS 2500 1 2 Uni Bi
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Vitesse de balayage
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Balayage Z En bougeant lobjectif Z drive: grande amplitude,
prcision 10nm Objectif piezo: faible amplitude (400m), grande
prcision (n) En bougeant la platine Piezo: faible amplitude (500m),
grande prcision (nm) Galvo: grande amplitude (1,5mm), grande
prcision (10nm)
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Leica SP5 Pinhole
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ConfocalNon confocal
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ouverture du pinhole d < 0.7AU Diamtre douverture faible
-> Section optique fine =rsolution Z leve =Signal rcupr faible d
> 1AU Diamtre douverture lev -> Section optique paisse
=rsolution Z faible =Signal rcupr lev Pinhole optimis pour chaque
objectif 1AU
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Leica SP5 Systme de dtection
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Prisme/fente spectrale PMT
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Rendement 40% Photodiode Rendement 80%
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Gain et offset Gain: Amplifie le signal dentr -> luminosit
de limage augmente Offset: Permet denlever le bruit fond de limage
Effet de saturation paisseur=0,85m paisseur=1,35m Lut glow
over/under
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Image Chaque pixel (picture element) a une coordonne et une
valeur dintensit. Format de limage 512x512, 1024x1024, 2048x2048
Pour du qualitatif -> Intensit code sur 8 bits (256 niveaux de
gris) Pour du quantitatif -> Intensit code sur 12 bits (4096
niveaux de gris) Lil ne peroit que 30 40 niveaux de gris
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Rsolution La capacit dun systme optique distinguer deux points
distincts. Combien de pixel ais je besoins pour reproduire lobjet
avec la meilleur rsolution? -> Critre de Nyquist Pas
dchantionnage = r/2,3 Objectifs Longueur donde (nm) ON Rxy (nm)
Taille du pixel (nm) Zoom 512x5121024x10242048x2048
63X5001,4160704X2X1X Exemple: 1024X1024256X256
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Moyennage Sans 2X8X Fait la moyenne arithmtique de chaque
valeur dintensit de chaque pixel Amlioration du rapport
signal/bruit Moyennage par ligne utilis pour exprimentation sur le
vivant
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Accumulation Les valeurs dintensits mesures sont additionnes
pour chaque point de balayage => Permet daugmenter le signal en
cas de marquage faible Sans 2X4X
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Zoom Zoom 1 Zoom 2 Zoom 4 Une zone plus petite est scanne avec
le mme nombre de pixels -> la rsolution reste constante, Les
dtails sont augments
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Multimarquage Attention au chevauchement de spectres
Acquisition simultane 488 + 568 a = Anti RF(Alexa 488) b = C12
Bodipi 568 c = Merge Acquisition squentielle 488 puis 568 d = Anti
RF(Alexa 488) e = C12 Bodipi 568 f = Merge Acquisition squentielle
si utilisation de 2 fluorochromes proches! a bc def PMT 2
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Acquisition sections optiques Acquisition de 80 images 200nm
dintervalle en 1024x1024 Projection Cellule MDCK Vert Alexa 488
marquage de la protine MDR3 Rouge Iodure de propidium marquage
nuclaire
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Reconstruction 3D
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Coupe XZ Coupe XY Coupe XZ Cellule MDCK Vert Alexa 488 marquage
de la protine MDR3 Rouge Iodure de propidium marquage nuclaire
Accumulation apicale de MDR3
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Co-localisation A anti-FLAG M2 Alexa Fluor 546 B anti CD-3 /
Alexa Fluor 633 C Merge
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Time Laps -Cellules MA104 -Sonde Calcium MC164 cage -Sonde
desestrifie dans cellule, devient fluo quand fixe au Ca
-Acquisition toutes les 10 secondes de 5 coupes
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Applications
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Microscope confocal biphoton Confinement de lexcitation laser
-> pas de pinhole -> moins de photons perdus Grande
profondeur dobservation (jusqu 300m) Pas de photoblanchiement hors
du plan focal GFP : 1 photon 488nm 2 photons 960 nm
