MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

TL 2203

TEKNIK DASAR LABORATORIUM UNTUK ISOLASI, PEMURNIAN DAN KARAKTERISTIK BENTUK KOLONI

Nama/NIM : Tania Alpiani – 15312030

Kezhia Theresia – 15312032

Riama Maduma C – 15312042

Kelompok/Shift : Rabu Siang/10

Tanggal Praktikum : Rabu, 29 Januari 2014

Tanggal Pengumpulan: Rabu, 5 Februari 2014

PJ Asisten : Ulfi Muliane,S.T.

Asisten : Amalia Rizki Rahmani,S.Si.

Teknisi : Oleh

PROGRAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN

FAKULTAS TEKNIK SIPIL DAN LINGKUNGAN

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2014

MODUL II

MIKROSKOP

Percobaan 4 : Pengamatan morfologi sel dengan mikroskop cahaya

I. Tujuan

1. Mengetahui teori prinsip dan bagian-bagian komponen mikroskop cahaya

2. Mengetahui cara penggunaan praktis mikroskop cahaya untuk melihat

morfologi sel preparat mikroorganisme

II. Prinsip

Mikroorganisme adalah  organisme yang berukuran sangat kecil sehingga

untuk mengamatinya diperlukan alat bantuan. Mikroorganisme disebut juga

organisme mikroskopik. Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler)

maupun bersel banyak (multiseluler). Mikroskop merupakan alat untuk dapat

melihat mikroorganisme.

III. Teori Dasar

Mikroskop terdiri atas bagian optik dan non optik. Bagian optik yaitu: kondensor,

lensa objektif, dan lensa okuler. Sedangkan bagian nonoptik yaitu: kaki dan lengan

mikroskop, diafragma, meja objek/meja preparat, pemutar halus dan kasar, penjepit

kaca objek (preparat), dan sumber cahaya.

Cara menggunakan mikroskop adalah sebagai berikut:

1. Keluarkan mikroskop dari dalam kotaknya lalu periksa kelengkapan bagian

alatnya. Bersihkan mikroskop. Nyalakan lampu sebagai sumber cahaya lalu atur

lensa supaya susunannya lurus dengan lubang yang ada pada meja mikroskop,

buka diafragma sehingga cahaya yang masuk maksimum.

2. Letakkan objek berupa preparat pada meja mikroskop lalu jepitkan. Pilih lensa

objektif dengan perbesaran lensa paling lemah. Carilah obyek sehingga terlihat

jelas dengan bantuan pemutar fokus halus dan kasar. Setelah obyek terlihat jelas

gantilah lensa obyektik dengan lensa yang memiliki perbesaran lebih tinggi.

3. Apabila menggunakan perbesara 100x maka harus digunakan minyak imersi.

Minyak imersi dipakai apabila obyek telah terlihat jelas pada perbesaran 40x,

teteskan minyak imersi pada obyek yang akan diamati.

4. Bila pengamatan telah selesai, bersihkan minyak imersi dengan menggunakan

kapas yang telah diberi xylol.

5. Setelah pengamatan selesai, bersihkan mikroskop. Letakkan lensa obyektif

dengan perbesaran paling lemah tepat di atas lubang meja mikroskop. Turunkan

meja mikroskop dan kondensor. Masukkan kembali mikroskop ke dalam

kotaknya.

MODUL III

PEWARNAAN

Percobaan 5 : Pewarnaan Sederhana

I. Tujuan

Mengamati dan membedakan bentuk-bentuk morfologi dan susunan

atau rangkaian sel-sel bakteri.

II. Prinsip

Bentuk morfologi dan susunan sel-sel bakteri akan teramati dengan menggunakan

mikroskop. Pada pewarnaan basa digunakan reagen methylen blue (1-2 menit), kristal

violet (30-60 detik), dan karbol fuchsin (10-30 detik), sedangkan pewarnaan asam

digunakan nigrosin atau tinta cina. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya

ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna

yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada

komponen seluler maupun pada pewarna.

III. Teori

Bakteri akan terwarna oleh satu jenis pewarna. Berdasarkan adanya muatan maka

dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Pewarna asam dapat tejadi karena

bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding

sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan

negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarnaan basa yang

bermuatan positif akan mewarnai dinding sel bakteri yang bermuatan negatif. Pewarna

asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel yang bermuatan negatif

sehingga sel yang tidak terlihat menjadi berwarna. Pewarna basa yang paling umum

adalah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuchsin. Pewarna asam yang sering

digunakan adalah larutan nigrosin dan tinta cina. Bakteri hidup sulit untuk dilihat

dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika

diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna.

Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup.

Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan

zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari. Sel-sel mikroorganisme yang

tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati

dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya

mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang

bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara

mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna.

Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,

susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus

diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu

di dalam sel.

IV. Alat dan Bahan

A. Pewarnaan Basa

Alat

1. Kaca objek

2. Kertas isap

3. Jarum inokulasi

4. Pembakar bunsen

5. Mikroskop

Bahan

1. Biakan murni Bacillus cereus, Microrcoccus luteus, Escheria coli, dan

Pseudomonas yang berumur 24 jam

2. Reagen Methylen blue, karbol fuchsin, kristal violet

3. Minyak imersi

B. Pewarnaan Asam

Alat

1. Kaca objek

2. Mikroskop

3. Jarum inokulasi

Bahan

1. Biakan murni Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Escheria coli, dan

Pseudomonas yang berumur 24 jam

2. Larutan nigrosin

3. Minyak imersi

V. Hasil Pengamatan

Gambar Deskripsi

Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014

Pewarnaan basa Staphylococcus aureus dengan

karbol fuschin

Perbesaran 1000x

Bentuk bakteri bulat dan berwarna

merah

Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014

Pewarnaan basa Bacillus cereus

Perbesaran 1000x

Bentuk bakteri menyerupai

batang/silinder dan berwarna merah

Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014

Pewarnaan basa Staphylococcus aureus dengan

menggunakan nigrosin

Perbesaran 1000x

Bentuk bakteri bulat dan tidak

berwarna

Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014

Pewarnaan basa Bacillus cereus

Perbesaran 1000x

Bentuk bakteri menyerupai batang

dan tidak berwarna

VI. Analisis

Pada saat pembuatan apusan, lingkungan sekitar tempat praktikan

bekerja harus steril sehingga praktikan tidak boleh berpindah-pindah tempat

selama praktikum agar selama praktikum alat dan bahan tidak

terkontaminasi oleh bakteri dari luar.

Bakteri dioleskan secara tipis pada kaca preparat selebar 1-2 cm agar

pada saat mencari dan melihat bakteri di mikroskop, bakteri tidak terlalu

bertumpuk di satu titik saja sehingga dapat dicari pada sebaran olesan

bakteri.

Proses fiksasi dilakukan dengan pembakaran agar sel-sel bakteri

menempel pada kaca preparat sehingga kemungkinan sel-sel tersebut untuk

pindah kecil. Namun fiksasi ini dilakukan dengan jarak 25 cm dari sumber

panas, tidak dengan langsung pada sumber panas. Hal ini bertujuan agar sel

bakteri yang akan diamati tidak terlalu mengerut sehingga sulit untuk

diamati.

Pada proses pewarnaan pada apusan bakteri, pewarna dibiarkan

selama beberapa detik menggenang pada apusan agar pewarna dapat terikat

dengan dinding sel bakteri sehingga bakteri dapat terlihat dengan hasil

warna yang sesuai pada pemberian warna.

Pencucian pewarna yang diteteskan bertujuan agar pada saat

pengamatan di mikroskop sel bakteri yang telah terwarnai dapat dilihat

dengan jelas dan tidak hanya terlihat tumpukan pewarna. Jika pewarna lebih

tebal dan bertumpuk di satu titik maka bakteri akan sulit diamati. Oleh

karena sebelumnya pewarna telah dibiarkan terikat dengan dinding sel

maka pencucian pun boleh dilakukan karena tidak akan menghilakan

bakteri maupun zat warna.

Bakteri yang telah dicuci diamati dengan menggunakan mikroskop

dengan perbesaran 100x10 yang ditambahakan dengan minyak imersi.

Penambahan minyak imersi hanya dilakukan pada perbesaran 100x10

karena pada perbesarn ini jarak antara lensa dengan objek sangat dekat

sehingga cahaya dibiaskan tidak masuk ke dalam lensa akibatnya objek

tidak terlihat. Oleh karena itu perlu ditambahkan minyak imersi agar cahaya

yang dibiaskan masuk ke cahaya.

Hasil pengamatan terhadap bakteri Bacillus sp ,

Staphylococcus eureus,

Pada pewarnaan basa bakteri terwarnai oleh reagen sehingga bakteri

berwarna merah. Hal ini disebabkan oleh dinding sel bakteri yang

bermuatan negatif terwarnai oleh reagen yang bermuatan positif sehingga

ada proses penarikan muatan. Warna dengan dinding sel akhirnya menyatu

dan dapat dilihat.

Sedangkan pada pewarnaan asam bakteri tidak berwarna akibat tidak

terwarnai oleh reagen namun lingkungan bakteri terlihat berwarna. Hal ini

disebabkan oleh terjadinya tolak-menolak muatan antara pewarna dan

dinding sel bakteri yang sama-sama negatif. Pewarna akhirnya tidak

menyatu dengan dinding sel sehingga bakteri tidak tewarnai melainkan

lingkungan di sekitar bakteri.

Bakteri yang terlihat memiliki bentuk yang sesuai dengan referensi.

Namun, oleh karena resolusi mikroskop yang digunakan tidak terlalu tinggi

maka struktur dan susunan dalam sel bakteri tidak terlihat. Hanya saja yang

dapat diamati yaitu bentuk morfologi bakteri yang berangkai dan berkoloni

antarbakteri.

VII. Kesimpulan

A. Pewarnaan Basa

Bakteri Staphylococcus eureus berwarna merah berbentuk

bulat

Bakteri Bacillus cereus berwarna merah berbentuk batang

B. Pewarnaan Asam

Bakteri Staphylococcus eureus tidak berwarna dan berbentuk

bulat

Bakteri Bacillus cereus tidak berwarna dan berbentuk batang

VIII. Daftar Pustaka

Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta: Erlangga.

Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.

Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta: Erlangga.

Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.

www.google.com (30 Januari 2014 19.33)

http://wordbiology.wordpress.com (31 Januari 2014 19.25)

http://wapedia.mobi/id/Bakterit=8 (31 Januari 2014 20.05)

Percobaan 6 : Pewarnaan Gram

I. Tujuan

1. Mengetahui dasar teori dan reaksi kimia dalam pewarnaan gram

2. Mengetahui perbedaan hasil pewarnaan gram dari dua kelompok

bakteri

II. Prinsip

Pada pewarnaan Gram diperlukan 4 jenis reagen. Reagen pertama yang

disebut pewarna dasar, reagen kedua (larutan Mordant) yang mengikat pewarna

dasar, reagen ketiga yang mencuci warna dasar dan reagen keempat merupakan

pewarna pembanding. Teknik ini mengelompokkan bakteri berdasarkan

komposisi dinding sel bakteri. Bakteri terbagi atas 2 kelompok, yaitu bakteri

gram positif dan bakteri gram negatif. Pada sel bakteri gram positif akan tetap

terlihat ungu setelah diberi pewarna pembanding. Sedangkan pada bakteri gram

negatif akan terlihat warna merah.

III. Teori Dasar

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan

paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi karena merupakan

tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada

tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya

lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan

gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram

positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan

baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis

membran.

Gram bakteri (www. hafizluengdaneun.multiply.com)

Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus

pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar

dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama

dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar

belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-

zat warna. Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran,

bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat

pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan

hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri

atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna.

Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan

kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku yakni

mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk

membuat apusan dari bakteri yang diwarnai. Selain itu juga mempersiapkan

apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan

yang tipis. Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.

IV. Alat dan Bahan

Alat

1. Kaca obyek

2. Jarum inokulasi

3. Mikroskop

4. Lampu bunsen

5. Kertas isap

Bahan

1. Biakan murni bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus cereus

dan Eschericia coli

2. Larutan kristal violet

3. Larutan mordant

4. Alkohol 96%

5. Safranin

V. Hasil Pengamatan

Gambar Deskripsi

Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Bentuk

bakteri

bulat

berwarna

ungu

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014

Pewarnaan basa Staphylococcus aureus

Perbesaran 1000x

Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014

Pewarnaan basa Bacillus cereus

Perbesaran 1000x

Bentuk

bakteri

batang

dan

berwarna

ungu

Tanggal percobaan : 29 Januari 2014

Tanggal pengamatan : 29 Januari 2014

Pewarnaan basa

Bakteri Eschericia coli

Perbesaran 1000x

Bentuk

bakteri

batang

dan

berwarna

merah

VI. Analisis

Pada saat pembuatan apusan, lingkungan sekitar tempat praktikan bekerja harus

steril sehingga praktikan tidak boleh berpindah-pindah tempat selama praktikum agar

selama praktikum alat dan bahan tidak terkontaminasi oleh bakteri dari luar.

Bakteri dioleskan secara tipis pada kaca preparat selebar 1-2 cm agar pada saat

mencari dan melihat bakteri di mikroskop, bakteri tidak terlalu bertumpuk di satu titik

saja sehingga dapat dicari pada sebaran olesan bakteri.

Proses fiksasi dilakukan dengan pembakaran agar sel-sel bakteri menempel pada

kaca preparat sehingga kemungkinan sel-sel tersebut untuk pindah kecil. Namun fiksasi

ini dilakukan dengan jarak 25 cm dari sumber panas, tidak dengan langsung pada

sumber panas. Hal ini bertujuan agar sel bakteri yang akan diamati tidak terlalu

mengerut sehingga sulit untuk diamati.

Pada proses pewarnaan pada apusan bakteri, pewarna dibiarkan selama beberapa

detik menggenang pada apusan agar pewarna dapat terikat dengan dinding sel bakteri

sehingga bakteri dapat terlihat dengan hasil warna yang sesuai pada pemberian warna.

Pemberian pewarna pengikat warna dasar agar warna dasar yang telah diberikan

sebelumnya dapat terikat lebh kuat terhadap dinding sel sehingga pada saat pencucian

warna yang telah diberikan tidak hilang seluruhnya dan tetap terikat pada dinding sel

bakteri. Senyawa yang terkandung pada pewarna dasar mampu mengikat zat warna pada

dinding sel dengan kuat. Warna yang dihasilkan oleh pengikat pewarna dasar menjadi

lebih pekat daripada sebelumnya.

Sebagai uji selanjutnya, sel bakteri dicuci dengan menggunakan etil alkohol 95%

yang mampu melarutkan peptidoplikan dan mendehidrasi protein. Pelarutan ini

bertujuan agar dinding sel bakteri terlarut sehingga warna yang terikat pada dinding sel

juga ikut terlarut. Banyak sedikitnya warna yang ikut terlarut tergantung pada ketebalan

peptidoplikan dan lemak yang terdapat pada dinding sel bakteri. Sel bakteri yang

memiliki peptidoplikan dan lemak yang lebih banyak pada dinding selnya maka seluruh

warna yang terikat akan terlarut sehingga bakteri akan terlihat tidak berwarna. Hal ini

terjadi pada sel bakteri gram negatif. Sedangkan pada sel bakteri yang meiliki dinding

sel dengan peptidoplikan dan lemak yang tipis, maka zat warna yang terlarut pada

dinding sel tidak terlalu banyak sehingga warna sebelumnya masih terlihat. Hal ini

terjadi pada sel bakteri gram positif.

Pewarna pembanding diberikan sebagai bukti hasil pencucian warna di atas. Pada

percobaan digunakan safranin yang berwarna merah sebagai warna pembanding. Jika

warna yang teramati pada sel adalah merah berarti menandakan bahwa safranin

bertindak sebagai pewarna akhir dimana warna sebelumnya telah terlarut bersama etil

alkohol dan dinding sel. Ini terjadi pada sel bakteri gram negatif. Namun, jika warna

yag teramati pada sel adalah ungu, berarti menandakan bahwa safranin tidak

mengalahkan warna sebulumnya yang tidak ikut terlarut oleh etil alkohol. Ini terjadi

pada bakteri gram positif.

Pada percobaan, hasil bakteri yang teramati sesuai dengan referensi seperti pada hasil

pengamatan diatas. Hal ini berarti preparat pada setiap langkah percobaan tidak

terkontaminasi oleh bakteri dari luar karena sel bakteri yang teramati hanya sel yang

diambil dari biakan murni.

Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak

lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap

warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram

variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah atau mungkin

secara keseluruhan berwarna merah karena pengaruh umur.

VII. Kesimpulan

Bakteri Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus: bakteri

gram positif

Bakteri Eschericia coli : bakteri gram negatif

VIII. Daftar Pustaka

Campbell, N. A. Dan Reece, J. B., 2005. Biologi Jilid 2. Jakarta: Erlangga.

Hadioetomo, R, S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta:

Gramedia.

http://wordbiology.wordpress.com (3 Februari 2014 18.05)

http://wapedia.mobi/id/Bakterit=8 (4 Februari 2014 18.15).