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Aggiornamenti sulla diagnostica
delle patologie mitocondriali
Daniele Ghezzi
UO Neurogenetica Molecolare
Per la diagnostica…
Per la ricerca di nuovi geni malattia…
Elevata eterogeneità genetica delle malattie mitocondriali
Difetti del DNA mitocondriale
• Geni correlati alla sintesi proteica mitocondriale (rRNAs, tRNAs)• Geni codificanti proteine strutturali MRC• Grosse delezioni
Mutazioni DNA nucleare
• Geni codificanti proteine strutturali MRC• Geni codificanti fattori d’assemblaggio MRC• Geni codificanti enzimi per biosintesi di lipidi o cofattori• Geni codificanti per fattori importanti per mantenimento mtDNA• Geni codificanti per fattori per la sintesi proteica mitocondriale• Geni coinvolti nella biogenesi/dinamica mitocondriale
DNA mitocondriale
Gen
i nuc
lear
i ass
oci
ati
a pa
tolo
gie
mito
cond
rial
i
2001 Shoudbridge
2004 Zeviani&Didonato
2006 Zeviani&Carelli
2011 Ghezzi&Zeviani
2014 Rotig
2015 Turnbull&Rustin
Clinical categories
Number of distinct phenotypic entities (502 total)
Neurologic 93
Metabolic 72
Oncologic 39
Endocrinologic 34
Ophthalmologic 32
Hematologic 29
Gastrointestinal 28
Musculoskeletal 27
Genitourinary 24
Dermatologic 23
Psychiatric 21
Cardiovascular 18
Respiratory 13
Immunologic 5
Miscellaneous 44
Table 1. Clinical entities concerned by primary genetic mitochondrial disorders.Clinical entities are classified and phenotypes collected for each mitochondrial disease-causing gene according to MitoPhenome. Turnbull & Rustin, 2015
Elevata eterogeneità clinica delle malattie mitocondriali
Per la diagnostica…
Per la ricerca di nuovi geni malattia…
Targeted resequencing
< €€€ , < Time > ANSWERS
TruSeq Custom Amplicon (Illumina)
1 run= 7Gbasi di dati =7 000 000 000 bp
Pochi geni per tanti pazienti
Tanti geni per pochi pazienti
- minimo 16 massimo 1536 ampliconi (≈80-100 geni) tramite DesignStudio
- Target resequencing basato su PCR, Kit da 96 campioni
Pannello Mitoiso (difetti isolati, PDH, CoQ10)
72 geni (492 esoni; 1195 ampliconi)
Pannello Mitomix (difetti multipli)
61 geni (586 esoni; 1370 ampliconi)
Malattie mitocondrialiGeni analizzati per diagnostica: 45Pz/mese: 40-50
Pannello MitoisoB (difetti isolati, PDH, MMDS, CoQ10)
119 geni (705 esoni; 1231 ampliconi)
Pannello MitomixB (difetti multipli, alterazioni mtDNA)
94 geni (825 esoni; 1526 ampliconi)
Pannello Mitoiso (difetti isolati, PDH, CoQ10)
72 geni (492 esoni; 1195 ampliconi)
Pannello Mitomix (difetti multipli)
61 geni (586 esoni; 1370 ampliconi)
Eterogeneità genetica: cI
NDUFV1 Complex I Leukodystrophy, myoclonus, Leigh syndrome
NDUFV2 Complex I Cardiomyopathy, encephalopathy
NDUFS1 Complex I Leigh syndrome
NDUFS2 Complex I Lactic acidosis, hypertrophic cardiomyopathy
NDUFS3 Complex I Leigh syndrome
NDUFS4 Complex I Atypical Leigh syndrome
NDUFS6 Complex I Fatal infantile lactic acidosis
NDUFS7 Complex I Leigh syndrome
NDUFS8 Complex I Leigh syndrome
NDUFA1 Complex I Leigh syndrome
NDUFA2 Complex I Leigh syndrome
NDUFA10 Complex I Leigh syndrome
NDUFA11 Complex I Fatal infantile metabolic acidosis, encephalocardiomyopathy
NDUFB3 Complex I Fatal infantile encephalomyopathy
NDUFB9 Complex I Infantile encephalomyopathy
Subunità strutturali complesso IEterogeneità genetica: cI
NDUFAF1 Complex I assembler Cardiomyopathy
NDUFAF2 Complex I assembler Progressive encephalopathy, Leigh syndrome
NDUFAF3 Complex I assembler Myoclonic seizures, brain leukomalacia
NDUFAF4 Complex I assembler Encephalopathy, antenatal cardiomyopathy
NDUFAF5 Complex I assembler Leigh syndrome
NDUFAF6 Complex I assembler Leigh syndrome
NUBPL Complex I assembler, Fe/S clusters biogenesis
Leukodystrophy, myopathy, ataxia
FOXRED1 Complex I assembler, aminoacid metabolism? Leigh syndrome
ACAD9 Complex I assembler Cardiomyopathy, encephalopathy, lactic acidosis
Fattori di assemblaggio del complesso IEterogeneità genetica: cI
TSCA24 pz con difetto biochimico cI
NDUFA1, NDUFA10, NDUFS2,NDUFS3, NDUFS4 (2), NDUFV1ACAD9ELAC2
38%
Exome seq22 pz con difetto biochimico cI
NDUFV1, NDUFV2, NDUFS4, NDUFS6, NDUFA12TMEM70, ELAC2FBXL4, VARS2, COQ4
45%
18%
Eterogeneità genetica: cI
Eterogeneità clinica: AIFM1
Patient XAt 1 year walking difficulties. During childhood gait and limb ataxia, hearing loss, and cognitive impairment At puberty, evident visual deficit and distal muscle wasting and weaknessOptic atrophy and retinopathyAt 20 years chair-bound
Nerve conduction study showed axonal neuropathyOnly one (13 yrs) of several assays showed elevated lactate and pyruvate serum levels.
Brain CT scan and MRI: cerebellar atrophy (19 yrs) and mild cortical and thalamic atrophy (30 yrs), then (35 yrs) further involvement of bulbar olives, dentate nuclei and spinal cord.
Pt
Complex IV deficiency in muscle
94x
ChrX
Pt
c.784A
c.784G/A
c.784G/G
AIFM1c.784G>A p.Gly262Ser
Species Amino acid numbering and sequenceH.sapiens 249-298 SQITYEKCLIATGGTPRSLSAIDRAGAEVKSRTTLFRKIGDFRSLEK--IM.mulatta 245-294 SQITYEKCLIATGGTPRSLSAIDRAGAEVKSRTTLFRKIGDFRSLEK--IC.lupus 249-298 SQITYEKCLIATGGTPRSLSAIDRAGAEVKSRTTLFRKIGDFRTLEK--IM.musculus 248-297 SQITFEKCLIATGGTPRSLSAIDRAGAEVKSRTTLFRKIGDFRALEK--IR.norvegicus 248-297 SQITFEKCLIATGGTPRSLSAIDRAGAEVKSRTTLFRKIGDFRALEK--IG.gallus 227-276 TQISYDKCLIATGGSPRNLPAIERAGKEVQQRLTLFRKIEDFKNLEK--ID.rerio 251-300 SEISYEKCLIATGGVPRNLQVIDRAGEEVIKRTTLFRKIEDFRSLEK--IX.tropicalis 271-320 TQISYEKCLIATGGVPRSLPAIERAGEEVTKRTTLFRRISDFRTLEA--I
ct1 ct3ct2 Pt
AIF
GAPDH
129% 99% 72% 41%
WB analysis(fibroblasts)
Eterogeneità clinica: AIFM1
c.601_603del; p.Arg201delPsychomotor delay, seizures and psychomotor regressionMuscle: multiple defects, mainly IV
c.923G>A; p.Gly308Gluhypotonia, swallowing difficulties, neonatal seizures. Cardiopulmonary failureMuscle: cIV + cI
c.1478A>T; p.Glu493ValSlow progressive axonal neuropathy associated with cognitive impairmentMuscle: normal
Eterogeneità clinica: AIFM1
Anna Ardissone, MD1,*, Giuseppe Piscosquito, MD2,*, Andrea Legati, PhD3, Tiziana Langella, MSc3, Eleonora Lamantea, MSc3, Barbara Garavaglia, PhD3, Ettore Salsano, MD1, Laura Farina, MD4, Isabella Moroni, MD1, Davide Pareyson, MD2, Daniele Ghezzi, PhD3
c.784G>A; p.Gly262SerSensory and cerebellar ataxia, hearing and visual loss, muscle wasting Muscle: cIV
c.727G>T; p.Val243LeuProgressive muscular atrophy, ataxia, hearing loss and external opthalmoplegiaMuscle: cI (+II, IV)
c.1013G>A; p.Gly338GluPerinatal marked hypotonia-proximal muscle weakness (SMA-like); cortical and motor neuron involvementMuscle: cIV
Eterogeneità clinica: AIFM1
Targeted resequencing
Aspetti positivi:- Possibilità analisi di molti geni contemporaneamente
- Buona copertura
- Applicabile ad un numero elevato di pazienti
Exome sequencing
Aspetti negativi:- Analisi solo dei geni presenti
- Copertura geni presenti non completa
- Strumentazione (hardware/software) dedicata
Per la diagnostica…
Per la ricerca di nuovi geni malattia…
TRS< €€€ , < Time > ans
CollaborazioniMassimo Zeviani, Aurelio Reyes, Alan Robinson (MRC Cambridge, UK)Holger Prokisch, Tobias Haack, Thomas Meitinger (Helmoltz Center, Munich, Germany)Mingyan Fang (BGI, Shenzen, China)E. Baruffini, C. Dallabona, I. Ferrero (Università di Parma)R. Costa, C. DePittà, F. Argenton (Università di Padova) I. Moroni, A. Ardissone, G. Piscosquito, D. Pareyson (Istituto Neurologico “Besta”)E. Bertini, D. Diodato (Osp. Pediatrico Bambin Gesù, Roma), A. Burlina (Università di
Padova), M.A. Donati (Osp. Meyer, Firenze), R. Parini (Osp. San Gerardo, Monza)M. Van der Knaap (University Medical Center, Amsterdam), R. Taylor (University of Newcastle, UK)
www.mitopedia.org
Grazie! Ministero della Salute
Exome seq
Lievito
Clinici
Drosophila
Vantaggi:- Sistema molto flessibile
- Dinamico (implementabile con nuovi geni)
- basso costo per paziente (200-300 €)
- high troughput: possibilità di screening di molti geni
Svantaggi:- ottimizzazione manuale del disegno
- non copre al 100% tutti i geni
- elevato investimento iniziale (x 96 campioni 10.000-25.000 €)
- necessità di interpretazione e validazione di molte varianti nuove di significato incerto
TruSeq Custom Amplicon (Illumina)
vs. Sanger
Sonde Nextera (Illumina)
Vantaggi:- no limiti geni analizzabili
- costo competitivo (250-400 €)
- maggior copertura
Svantaggi:- analizzati anche geni non «appropriati»
- investimento iniziale
- copertura non uniforme
vs. TSCA