UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

MODALIDAD: INVESTIGACIÓN

TEMA:

CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA Y ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE DEL ACEITE OBTENIDO DE LAS SEMILLAS

DEL FRUTO DEL MATE (Crescentia cujete L.).

TRABAJO DE TITULACIÓN PRESENTADO COMO

REQUISITO PREVIO PARA OPTAR AL GRADO DE QUÍMICO

Y FARMACÉUTICO

AUTORES:

LOURIDO SALAZAR LUIGGI RAFAEL

PALADINES SANTACRUZ GEOVANNA LISSETTE

TUTOR:

PHD. ADONIS BELLO ALARCÓN

CO-TUTOR:

Q.F ZORAIDA BURBANO GOMEZ Msc.

GUAYAQUIL-ECUADOR

2017

i

APROBACIÓN DEL TUTOR

En calidad de tutor /a del Trabajo de Titulación, Certifico: Que he asesorado,

guiado y revisado el trabajo de titulación en la modalidad de investigación, cuyo

título es “Caracterización físico-química y actividad antioxidante del aceite

obtenido de las semillas del fruto del mate (Crescentia cujete L.)”, presentado por

LUIGGI RAFAEL LOURIDO SALAZAR, con cédula de ciudadanía N° 0920028396

y GEOVANNA LISSETTE PALADINES SANTACRUZ, con cédula de ciudadanía

N° 0925641797, previo a la obtención del título de Químico y Farmacéutico.

Este trabajo ha sido aprobado en su totalidad y se adjunta el informe de Antiplagio

del programa URKUND. Lo Certifico. -

Guayaquil, 21 de Marzo del 2017

FIRMA TUTOR DE TESIS

ii

iii

CERTIFICADO DEL TRIBUNAL El Tribunal de Sustentación del Trabajo de Titulación del Sr. Luiggi Rafael Lourido

Salazar y la Srta. Geovanna Lissette Paladines Santacruz, después de ser

examinados en su presentación, memoria científica y defensa oral, da por

aprobado el Trabajo de Titulación.

DR. JULIO RODRIGUEZ ZURITA MsC PRESIDENTE - MIEMBRO DEL TRIBUNAL

Q.F. FERNANDA VÉLEZ LEÓN MsC DRA. AMALIA SUAREZ MsC DOCENTE–MIEMBRO DEL TRIBUNAL DOCENTE–MIEMBRO DEL TRIBUNAL

ING. NANCY VIVAR CÁCERES SECRETARIA ENCARGADA

iv

CARTA DE AUTORIA DE TITULACIÓN

Fecha

Guayaquil, 21 de Marzo del 2017

Nosotros, LUIGGI RAFAEL LOURIDO SALAZAR Y GEOVANNA LISSETTE

PALADINES SANTACRUZ, autores de este trabajo declaro ante las autoridades

de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil, que la

responsabilidad del contenido de este TRABAJO DE TITULACIÓN, nos

corresponde a nosotros exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la misma a

la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Guayaquil.

Declaro también es de nuestra autoría, que todo el material escrito, salvo el que

está debidamente referenciado en el texto. Además, ratifico que este trabajo no

ha sido parcial ni totalmente presentado para la obtención de un título, ni en una

Universidad Nacional, ni una Extranjera.

LUIGGI RAFAEL LOURIDO SALAZAR

NOMBRES DEL AUTOR C.I. 0920028396

GEOVANNA LISSETTE PALADINES SANTACRUZ

NOMBRES DEL AUTOR C.I. 0925641797

v

AGRADECIMIENTO

En primer lugar agradezco a Dios por haberme dado sabiduría y salud para poder

culminar esta etapa en mi vida y sobre todo a mis padres por brindarme su apoyo

incondicional y aconsejándome en cada paso en esta etapa de mi vida.

Agradezco al apoyo incondicional de mi familia, tanto a mi padre como a mi madre

por haberme sabido guiar en toda mi vida, me ayudaron a formarme con buenos

sentimientos, hábitos y valores, lo cual me ha ayudado a salir adelante en los

momentos más difíciles.

Agradezco a mi compañera, amiga y más, Geovanna Paladines para poder

culminar este trabajo, ya que gracias a su curiosidad se pudo salir adelante con

esta investigación y estoy muy orgulloso de ti, Dios permitió poder realizar este

trabajo junto y nos ayudó a forjarnos como profesionales.

Agradezco a mi tutor de tesis el Lcdo. Adonis Bellos Alarcón PhD. y Co-Tutora

Q.F. Zoraida Burbano Gómez Msc. Por haberme brindado la oportunidad de

recurrir a su capacidad y conocimiento científico y a su vez poder guiarme en este

largo camino durante el desarrollo de mi tesis.

Mi agradecimiento también va dirigido al Gerente Propietario de la Empresa

GUSTAFF S.A., el Ing. Gustavo Argüello por haberme permitido poder dar mis

primeros pasos en su prestigiosa empresa y formarme como profesional.

Para finalizar, agradezco de igual manera a todas las personas que fueron mis

compañeros y amigos más cercanos de clase durante todos los niveles de

Universidad, que siempre estuvieron apoyando y aconsejando formando así un

gran vinculo duradero, ya que gracias al compañerismo, amistad y apoyo han

aportado a mis ganas de seguir adelante en mi carrera profesional.

Luiggi Rafael Lourido Salazar

vi

AGRADECIMIENTO

Gracias Dios por todo lo que me has dado, gracias por no soltar mi mano y

mantenerme a tu lado contra vientos y mareas. Gracias Dios por haber caminado

junto a nosotros , dándonos tu ayuda ,fortaleza, sabiduría y paz , para permitirnos

alcanzar una más de nuestras metas de vida.

Agradezco a mi hermosa familia, que me ha dado su total apoyo incondicional,

desde mis primeros pasos, ya que con su amor, cariño y valores me han dado la

motivación para escalar en mi vida y no desfallecer en el camino .Han sido y serán

siempre mi pilar fundamental, gracias a ellos he podido forjarme como persona, y

ser la persona que ahora soy con sus virtudes y defectos de noble corazón. Cada

uno que aporto de una forma maravillosa para que logre conseguir mi meta, ya

sea con ayuda, regaño, consejo, sonrisa o un abrazo, me hicieron saber que

siempre van a estar ahí y aunque los tiempos estén difíciles, harán que el día sea

alegre. Por eso y más siempre les estaré eternamente agradecida.

Agradezco a nuestro tutor el Dr. Adonis Bello Alarcón y Co-Tutora Q.F. Zoraida

Burbano Gómez Msc, que con su paciencia y sabiduría nos guiaron con excelencia

y disposición durante toda la etapa de desarrollo de la tesis.

Agradezco a las personas que conocí durante mi etapa Universitaria, que de

alguna manera aportaron en mí de forma positiva en mi camino hacia la meta.

Agradezco a mis compañeros, con los cuáles pasamos muchos obstáculos y

vivimos muchas aventuras y a los que hoy puedo llamar amigos. A su vez a mis

amigos más cercanos, que siempre estuvieron ahí, alentando y apoyando en toda

esta etapa. Agradezco a los docentes que me formaron como profesional e

inculcaron en mí la curiosidad de investigar.

Agradezco de manera especial a mi compañero de tesis, por haberme dado su

apoyo, soporte y entusiasmo, para seguir adelante, y estoy muy orgullosa y feliz

de decir que lo logramos y que esta meta lograda, es un paso más que nos

acerca a la meta final de lograr el éxito profesional, personal y de vida.

Geovanna Paladines Santacruz

vii

INDICE GENERAL

Pág.

INTRODUCCIÓN 1

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 3

HIPÓTESIS 3

VARIABLE

VARIABLE DEPENDIENTE 4

VARIABLE INDEPENDIENTE 4

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL 4

OBJETIVO ESPECÍFICOS 4

CAPITULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

I.1. Antecedentes del trabajo 5

I.2. Mate, jícaro o totumo 5

I.2.1. Origen y distribución 5

I.2.2. División taxonómica 6

I.2.3. Denominaciones o sinonimias 6

I.2.4. Sinonimia botánica 6

I.2.5. Descripción botánica 7

I.3. Composición química 7

I.3.1. Ácidos grasos 8

I.3.2. Análisis fisicoquímico para aceites vegetales 11

I.4. Actividad biológica 11

I.4.1. Uso medicinal 11

I.4.2. Actividad antioxidante 12

I.4.3. Determinación de la actividad antioxidante in vitro por el método DPPH 13

viii

I.5. Caracterización fisicoquímica para aceites comestibles 15

I.5.1. Densidad relativa 15

I.5.2. Perdida por calentamiento 15

I.5.3. Índice de Yodo 15

I.5.4. Índice de Peróxido 16

I.5.5. Acidez 16

I.5.6. Índice de acidez 17

I.5.7. Índice de saponificación 17

I.6. Cromatógrafo de gases acoplada a espectrómetro de masas 17

CAPITULO II. MATERIALES Y MÉTODOS

II.1. Metodología 19

II.2. Extracción de aceite 19

II.3. Análisis fisicoquímicos 20

II.3.1. Densidad relativa 20

II.3.2. Pérdida por calentamiento 20

II.3.3. Índice de Yodo 21

II.3.4. Índice de peróxido 21

II.3.5. Acidez 22

II.3.6. Índice de refracción 22

II.3.7. Índice de saponificación 22

II.3.8. Contenido de ácidos grasos 23

II.4. Determinación de la actividad antioxidante in vitro por el método del DPPH 24

Capítulo III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

III.1. Extracción de aceite 25

III.2. Análisis Fisicoquímicos de los aceites 25

III.2.1. Densidad relativa 25

III.2.2. Pérdida por calentamiento 25

III.2.3. Índice de refracción 25

ix

III.2.4. Índice de saponificación 26

III.2.5. Acidez 26

III.2.6. Índice de peróxido 26

III.2.7. índice de Yodo 27

III.2.8. Contenido de ácidos grasos 27

III.3. Ensayo DPPH 29

CONCLUSIONES 32

RECOMENDACIONES 33

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 34

ANEXOS 40

x

ÍNDICE DE TABLAS

TABLA N° Pág.

TABLA N° I. Compuestos obtenidos en la hoja 8

TABLA N° II. Ácidos grasos saturados 9

TABLA N° III. Ácidos grasos monoinsaturados 10

TABLA N° IV. Ácidos grasos poliinsaturados 10

TABLA N° V. Composición de ácidos grasos del aceite 28

TABLA N° VI. Relación entre la conc. del blanco estandarizado Trolox y la absorbancia 29

TABLA N° VII. Datos de la absorbancia del blanco y la muestra 30

ÍNDICE DE GRÁFICAS

FIGURA N° Pág.

FIGURA N° 1. Estructura del DPPH antes y después de reacción antioxidante 14

FIGURA N° 2. Curva de regresión lineal obtenida del Trolox 29

ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO Nº Pág.

ANEXO Nº 1. Herbario guay, descripción taxonómica del mate 40

ANEXO Nº 2. Fotografías de la fase experimental 41

ANEXO Nº 3. Gráficas del GC-MS 47

ANEXO Nº 4. Decoloración de solución DPPH 48

ANEXO Nº 5. Certificado de presentación de tema en II Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología 49 ANEXO N° 6 Certificado de análisis del Laboratorio PROGECA 50

xi

RESUMEN

El interés científico por el empleo de los aceites vegetales muestra una tendencia

ascendente. La necesidad de desarrollar nuevos alimentos funcionales y la

creciente demanda de la industria de los nutracéuticos hacen que estos

compuestos constituyan diana de investigación de muchos grupos fitoquímico del

mundo. El presente trabajo tiene como objetivo caracterizar desde el punto de

vista físico-químico el aceite obtenido de las semillas del fruto Crescentia cujete L.

Los procedimientos para el análisis de las características fisicoquímicas se

llevaron a cabo en PROGECA; Laboratorio de la Facultad de Ciencias Químicas

de la Universidad de Guayaquil.

La metodología empleada en esta investigación fue de tipo experimental, donde

se emplearon alrededor de 30 frutos de mate con un rendimiento de 250 a 500

semillas. La obtención del aceite se realizó por Soxhlet utilizando hexano como

solvente. La caracterización físico-química se realizó por triplicado siguiendo la

Norma Técnica Ecuatoriana NTE INEN para grasas y aceites comestibles. La

extracción por Soxhlet permitió obtener un rendimiento promedio de 36,57%. Los

análisis fisicoquímicos del aceite obtenido están dentro de la norma ecuatoriana:

densidad relativa (0,9045 g/ml), pérdida por calentamiento (1.38%), índices de

refracción (1,464), índice de saponificación (191,39 mgKOH/g), índices de acidez

(1,32 % como ácido oleico), índice de peróxidos (3,997 %) e índice de yodo

(120,97 mg/100g aceite). El análisis de CG-EM muestra más de un 80% de ácidos

grasos insaturados, siendo el ácido oleico el componente mayoritario con un 63,9

%, el cuál cumple numerosas funciones favorables a nivel fisiológico y metabólico

en nuestro organismo. Además, se realizó el ensayo del DPPH de este aceite.

xii

ABSTRACT

The scientific interest in the use of vegetable oils shows an upward trend. The need

to develop new functional foods and the growing demand of nutraceutical

industries, made that these compounds constitute a target for many phytochemical

research groups. The present study aims to characterize from the physical-

chemical point of view the oil obtained from the seeds of the fruit of Crescentia

cujete L. Procedures for the analysis of physicochemical characteristics were

carried out in PROGECA; Faculty of Sciences Chemical laboratory of the

Guayaquil University.

The methodology employed in this research was of experimental type, where were

use around 30 fruits of Crescentia cujete L. which had around 250 to 500 seeds.

The oil was obtained by the method of Soxhlet using hexane as solvent. The

physical and chemical characterization was performed in triplicate according to the

standard technique Ecuadorian NTE INEN for fats and edible oils. The Soxhlet

extraction allowed to obtain an average yield of 36, 57%. The physico-chemical

analysis of the oil obtained are within the Ecuadorian standard: relative density (0,

9045 g/ml), loss on heating (1.38%), refractive index (1,464), saponification value

(mg KOH/g 191, 39), rates of acidity (1.32% as oleic acid), peroxides (3,997%) and

rate of iodine (120, 97 mg / 100 g oil). The analysis of CG-EM shows more than

80% of unsaturated fatty acids, being the oleic acid the majority component with

63.9%, which is known for its favorable physiological and metabolic functions in

our organism. In addition, the DPPH assay of this oil was carried out.

xiii

LISTA DE SÍMBOLOS μg microgramos

μL microlitros

mL mililitros

mg miligramos

μm micrómetros

μM micromolar

mm milímetros

nm nanómetros

ºC grado centígrado

cm centímetro

m metro

ppm partes por millón

N normalidad

I Índice

meq miliequivalentes

KOH Hidróxido de Potasio

NaOH Hidróxido de Sodio

ClH Ácido Clorhídrico

ATP Trifosfato de adenosina

ADN Ácido Desoxirribonucleico

AOCS American Oils Chemist´s Society

VLDL Lipoproteína de muy baja densidad (Español)

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

OPS Organización Panamericana de la Salud

OMS Organización Mundial de la Salud

IEPI Instituto Ecuatoriano de Propiedad Intelectual

INVIMA Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamento

INEN Instituto Ecuatoriano de Normalización

ERO Especie Reactivas del Oxígeno

1

INTRODUCCIÓN

Los productos naturales han sido de preferencia en las personas, desde la

antigüedad, pero en el mercado existe una gran competencia de productos

sintéticos que a pesar de su gran acogida no han logrado reemplazar, en varios

casos, los beneficios que un producto natural puede ofrecer. Pero a pesar de ello,

todavía se desconoce en qué medida puede ser utilizado un producto natural,

siendo este muchas veces abandonado en el transcurso de su estudio y a su vez

no investigado debido a la falta de interés o por el desconocimiento y simplemente

creyendo que solo se lo puede utilizar para un solo fin (Pomilio, 2012; Jimenez,

2013).

Los aceites fijos están constituidos por mezclas de ácidos grasos unidos

mediante enlace covalente a moléculas de glicerol. En general se trata de

compuestos insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos, cuya

composición no se ve alterada al ser expuestos al calor o la destilación. En los

vegetales los aceites se encuentran principalmente en las semillas de los frutos;

de los cuales pueden ser extraídos por dos métodos: expresión en frío o en

caliente en prensas hidráulicas o extracción con el empleo de disolventes

orgánicos (Etong et al., 2014).

Los árboles del género Crescentia de la familia Bignoniaceae, son muy

abundantes en los hábitats secos tropicales. En toda América se les conoce con

diferentes nombres como mate, jícaro o totumo, siendo un árbol originario de

México y Centroamérica, que puede alcanzar entre 5 a 10 m de altura. Su vida

oscila entre los 100 y 200 años, presentan una forma irregular con copa ligera y

muchos intersticios entre las ramas (Hernandez-Rivas & Campos-Sosa, 2007).

Estudios químicos y nutricionales demuestran que la semilla del mate es una

fuente potencial de proteínas y aceite carente de toxicidad, con un olor y sabor

muy parecido al aceite de olivo (Figueroa, 2000). Según Figueroa (2000) las

semillas poseen un 33.4% de grasa, 16.8% de fibra cruda y 25.1 % de proteína,

sin especificar la composición química de la fracción lipídica, a diferencia del

2

reporte de Luna (2007) que señala un 37% de aceite con un 59.4% de ácido oleico

como componente mayoritario. Finalmente Espitia-Baena (2011) indica que las

semillas contienen un 20% de aceite.

En la región costera del Ecuador, éste fruto es comercializado de forma

artesanal, donde se utiliza su cáscara, fuerte y resistente, como base para elaborar

utensilios de cocina, joyerías e instrumentos musicales como las maracas (Bravo

et al., 2016).

La determinación de propiedades fisicoquímicas de un aceite vegetal no

conocido puede dar como resultado una nueva fuente de ácidos grasos, cuyo

contenido en ácidos saturados e insaturados determina su capacidad para

intervenir en el funcionamiento fisiológico y cumplir un papel importante en el

funcionamiento del organismo. Los ácidos grasos insaturados desempeñan roles

en la prevención de enfermedades cardiovasculares, mediante la reducción de

acumulación de lípidos en las paredes arteriales y reducción de la presión arterial

(Moreno, 2010).

Tomando como base todo lo anteriormente expuesto, la presente investigación

tiene como objetivo evaluar las características fisicoquímicas y antioxidantes del

aceite que se obtiene a partir de las semillas de los frutos de Crescentia cujete L.,

mediante una extracción por Soxhlet utilizando n-hexano como disolvente.

3

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El interés científico de la presente investigación, se basa en la obtención y la

caracterización fisicoquímica del aceite de las semillas de los frutos de C. cujete

L. y evaluar la capacidad antioxidante in vitro de los componentes presentes.

Basándose en experiencias anteriores, con estudios del fruto Espitia et al. (2011)

un tamizaje preliminar fitoquímico muestra la presencia de alcaloides cuaternarios,

altos contenidos de lípidos, compuestos polifenoles, saponinas y naftoquinonas.

Además se detectaron y aislaron ácidos orgánicos como el ácido cianhídrico,

ácido tánico y ácido crescéntico.

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

El interés científico de la presente investigación, se basa en la obtención y

caracterización del aceite de las semillas de Crescentia cujete L. Por todo lo

anterior, este trabajo plantea la siguiente problemática: ¿Podrá obtenerse

mediante extracción por método de Soxhlet, el aceite de la semilla del fruto del

mate con capacidad antioxidante?

HIPÓTESIS

Las semillas del Mate (Crescentia cujete L) presentan aceites fijos con capacidad

antioxidante al ser evaluados por un modelo farmacodinámico in vitro: DPPH.

4

VARIABLES

VARIABLES DEPENDIENTES

Rendimiento de aceite fijo

Características del aceite fijo

Capacidad antioxidante in vitro del aceite fijo

VARIABLE INDEPENDIENTE

Condiciones de extracción

Propiedades fisicoquímicas del aceite

Condiciones experimentales del método de DDPH

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar las propiedades fisicoquímicas y antioxidante in vitro del aceite

obtenido de las semillas del fruto de Crescentia cujete L,

OBJETIVOS ESPECÌFICOS

Determinar el rendimiento de aceite obtenido por método de Soxhlet de la

semilla del fruto de C. cujete L.

Determinar las propiedades fisicoquímicas del aceite obtenido.

Evaluar la actividad antioxidante in vitro del aceite de las semillas por

captura de radicales libres de DPPH.

CAPÍTULO I

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

5

I.1. ANTECEDENTES DEL TRABAJO

El árbol del mate está distribuido en toda la América intertropical, desde la

Florida hasta Brasil, en África y Asia tropical. Es utilizado como medicina y fuente

de alimento de animales, e igualmente, de utilería de cocina (Botero et al., 2015).

En Nicaragua se han creado técnicas Industriales para obtener productos a

partir de este fruto como alcohol a partir de la pulpa; aceite comestible de uso

industrial, torta y harina de las semillas y carbón de las cáscaras. En la medicina

natural se emplea la pulpa de Mate como laxante, emoliente y expectorante

(Recalde, 2015).

Por otro lado, estudios químicos y nutricionales demuestran que las semillas

tienen un alto porcentaje de aceites. En la región caribeña de Colombia se utiliza

el totumo desde tiempos ancestrales en la alimentación de bovinos, cerdos y

gallinas con buenos resultados nutricionales (Botero et al., 2011). La semilla del

mate seca contiene 33,4% de grasa, 16,8% de fibra cruda y 25,1 % de proteína

(Figueroa et al, 2000).

I.2. MATE, JÍCARO O TOTUMO

I.2.1. ORIGEN Y DISTRIBUCIÓN

El totumo se adapta a diferentes ecosistemas y siendo probablemente nativa

de las sabanas del sur de México, América Central y zona norte de Sudamérica,

donde es cultivado o aparece por regeneración natural. Su distribución latitudinal

varía de 0 a 1000 metros sobre el nivel del mar y temperaturas de 16 a 33ºC

(Salazar, 2001). Su amplia diversidad se expresa, por ejemplo, en la variedad de

formas y tamaños de las hojas, frutos y de los árboles mismos. Se desarrolla mejor

en suelos profundos, aunque también crece en suelos arcillosos, pesados y con

drenaje típicos de las sabanas sujetas a inundaciones frecuentes. Tolera suelos

6

bajos en nutrientes, es resistente y estimulada en su germinación por el fuego

(Botero et al., 2012; Lim, 2012).

I.2.2. DIVISIÓN TAXONÓMICA

CLASE: Equisetiopsida C. Agardh

SUBCLASE: Magnoliidae Nóvak ex. Takht

SUPERORDEN: Asteranae Takht

ORDEN: Lamiales Bromhead

FAMILIA: Bignoniaceae Juss

GÉNERO: Crescentia L.

NOMBRE CIENTÍFICO: Crescentia cujete L

(Herbario GUAY, 2016) I.2.3. DENOMINACIONES O SINONIMIAS

En el continente americano, se reconoce con diferentes nombres vulgares entre

los que están: Calabash, Calabash tree en Estados Unidos; Cujete, Cirián,

Tecomate, Guaje en México; Jícaro, Morro, Guacal, Calabacero totumo en

América Central, Higuero en Puerto Rico, Calabasa en Cuba, Taparo en

Venezuela, Mate, Pilche en Ecuador, Huingo en Perú, Cuite en Brasil (Salazar,

2001; Lim, 2012).

I.2.4. SINONIMIA BOTÁNICA

Crescentia acuminata Kunth; Crescentia angustifolia Willd. ex

Seem; Crescentia arborea Raf; Crescentia cujete var. puberula Bureau & K.

Schum; Crescentia cuneifolia Gardner; Crescentia ovata Burm.f; Crescentia

cuneifolia Gardner; Crescentia spathulata Miers; Crescentia fasciculata Miers

(Lim, 2012).

7

I.2.5. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

Es un árbol que alcanza una altura que oscila entre los 5 a 12 m y diámetros

de hasta 30cm. Su vida oscila entre los 100 y 200 años, presentan una forma

irregular, copa amplia y muchos intersticios entre las ramas, estas siguen un

patrón dicotómico en su tronco y a medida que crecen se dividen a su vez en dos.

Hojas simples, fasciculadas, de varios tamaños en cada fascículo, láminas

espatuladas a oblanceoladas de 5-20*3-6cm, base cuneada, ápice usualmente

obtuso hasta redondeado y corto-acuminado, cartáceas, 5-14 pares de venas

laterales, glabras. Inflorescencia caulinar, una flor solitaria, o en pares, pedicelos

lepídotos. Cáliz bajo bilabiado, verde. Corola gamopétala verde claro, 4-7*3-

4.5cm. Estambres 4, insertos. Ovario superior, ovoide, lepídoto, 1-locular (Jarquin

, 2012). Frutos globosos, indehiscentes, de 15 a 40cm de diámetro con un

pericarpio duro y abundante pulpa cuyo interior rodea numerosas semillas

(Salazar, 2001).

I.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA

Según estudios de Espitia et al., (2011), revelan la presencia de lapachona,

ácido gentísico, saponinas y 1,4-naftoquinonas, esta última con actividad

citotóxica. La pulpa del fruto con la semilla triturada contiene un 14% de proteína

y un 60% de carbohidratos (Botero et al., 2012). Recalde (2015) menciona que la

pulpa cruda del fruto de C.cujete L. contiene ácidos orgánicos como el cianhídrico,

clorogénico, cítrico, crescéntico, tánico, tartárico y alcaloides cuaternarios,

polifenoles y cromóforos lipófilos.

El tamizaje fitoquímico de las hojas y tallo demuestra alcaloides cuaternarios,

esteroles insaturados y polifenoles. Las hojas contienen ácido caféico. La madera

contiene naftoquinonas (Recalde, 2015). El estudio fitoquímico preliminar mostró

la presencia en el fruto de alcaloides cuaternarios y polifenoles. Como se indica

en la tabla Nº I, realizado en la hoja, se demostró que contiene diversos grupos de

compuestos cuya relación varía dependiendo del extracto utilizado (TRAMIL,

2005).

8

(TRAMIL, 2005)

Existe también la presencia de terpenos: α y ß-amirina, ß-sitosterol,

estigmasterol, asperulósido, aucubina, plumierida; bencenoides: ácido gentísico-

3-hidroxi metil-diona; alcanos: triacontanol (TRAMIL, 2005).

En cuanto a las semillas, (Espitia-Baena et al., 2011; Recalde, 2015) señalan

que éstas contienen un 37% de aceite fijo parecido al aceite de oliva, que está

constituido por ácidos oleico 59.4%, linoléico 19.3% y saturados 19.7%. Luna

(2007) menciona que aproximadamente en el aceite de mate, el 52 % corresponde

a ácido oleico, 17 % a ácido linoléico, 16 % a ácido palmítico y 10,6 % es ácido

esteárico; otros constituyentes de la semilla son azúcares, ácido crescéntico, b-

sitosterol, estigmasterol, glucósidos iridoides como la asperulosida y la plumierida.

I.3.1. ÁCIDOS GRASOS

Los ácidos orgánicos monocarboxílicos con estructura de cadena lineal, forman

parte de otros lípidos unidos casi siempre por medio de enlaces éster, y rara vez

amida (Luna, 2007). Tiene estructura de cadena lineal anfipática con un extremo

polar carboxilo y una cadena apolar que finaliza con un grupo metilo (Argüeso et

al., 2011). Según la naturaleza de la cadena carbonada, los ácidos grasos pueden

ser saturados o insaturados, lineales, ramificados o alicíclicos, y pueden contener

como sustituyentes grupos hidroxilo u oxo (Luna, 2007).

Tabla Nº I. Compuestos obtenidos en la hoja

Extracto Esteroide

triterpeniode

Cumarina

flavónica

Heterósido

flavónico

Compuesto

fenólico

Éter de

petróleo + - - -

Cloroformo + - - -

Etanol 90% + - ++++ ++

Infusión ++

9

Tabla Nº II Ácidos grasos monoinsaturados

Por razones de biosíntesis, en los organismos superiores sólo existen ácidos

grasos con un número par de átomos de carbono y en función de ese número se

clasifican como indican las Tabla Nº II, III y IV ácidos grasos de cadena corta (≤

10 átomos de carbono), de cadena media (12 o 14) y de cadena larga (≥16). Según

la presencia o no de dobles enlaces en su cadena, se habla de ácidos grasos

saturados cuando carecen de ellos, monoinsaturados cuando tienen un doble

enlace, y poliinsaturados cuando tienen al menos 2 dobles enlaces (Argüeso et al,

2011).

Los más abundantes son por lo general, los ácidos grasos lineales, con número

par de átomos de carbono, generalmente superior a 12 e inferior a 24. Son

frecuentes las cadenas insaturadas con enlaces dobles en cis, como el oleico, 9-

octadecenoico, o el linoléico, 9,12-octadecadienoico (Luna, 2007). Según la

posición del último doble enlace respecto al último átomo de carbono como indican

las Tablas Nº II y III, los ácidos grasos insaturados se clasifican en w3, w6, w7 y

w9. Por reacciones multienzimáticas los ácidos grasos insaturados pueden

transformarse entre sí, aunque los mamíferos carecen de enzimas desaturasa que

permitan incluir dobles enlaces en las posiciones w3 y w6 ,por lo que los ácidos

grasos de esas dos series no son interconvertibles entre sí en el hombre y sus

precursores, siendo así incorporados en la dieta (Argüeso et al, 2011).

Ca

de

na

La

rga

Nombre Símbolo y estructura Características y

procedencia

Oleico

CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH) cis; w9

Líquido, más

abundante en el ser

humano; presente

en oliva, aguacate

Elaídico

CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH) trans; w9 Semilíquido.

Hidrogenación del

ác. oleico, presente

en margarinas

(Argüeso et al, 2011)

10

Tabla Nº IV Ácidos grasos poliinsaturados

Tabla Nº III Ácidos grasos saturados

Nombre Símbolo y estructura Características y procedencia

Ca

de

na

co

rta

Capróico CH3(CH2)4COOH Líquido, incoloro y

viscoso. Grasas y aceites vegetales.

Caprílico

CH3(CH2)6COOH

Leche de mamíferos, aceite de coco y palma.

Ca

de

na

me

dia

Laúrico CH3(CH2)10COOH Sólido, aceite de semilla

de palma y coco, leche humana, vaca y cabra.

Mirístico CH3(CH2)12COOH

Líquido, incoloro, manteca de nuez moscada, aceite de palma y ballena.

Ca

de

na

larg

a

Palmítico CH3(CH2)14COOH

Sólido, blanco, presente en carnes, lácteos y aceites de coco y palma.

Esteárico CH3(CH2)16COOH

Sólido de aspecto céreo, presente en grasas y aceites vegetales y animales.

Nombre Símbolo y estructura Características y procedencia

Ca

de

na

larg

a

Linoléico

HOOC(CH2)7CH=CH–CH2CH=CH(CH2)4CH3

Ác. Graso esencial, presente en semillas de girasol, soja, huevos, aves de corral.

Docosapent

aenoico (DPA)

HOOC(CH2)5CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH3

Leche de mamíferos, aceite de coco y palma.

Eicosapentaenoico (EPA)

HOOC(CH2)3CH=CH-CH2CH=CH-CH2-CH=CH-CH2-CH=CH-CH2CH=CH-CH2CH3

Aceite de pescado

α-Linolénico

HOOC(CH2)7CH=CH-CH2CH=CH-CH2CH=CH-CH2-CH3

Ác. Graso esencial, presente en pescado, semillas de lino y grasa animal

(Argüeso et al, 2011)

(Argüeso et al, 2011)

11

I.3.2 ANÁLISIS FISICOQUÍMICOS PARA ACEITES VEGETALES

El análisis de las propiedades fisicoquímicas de los alimentos es uno de los

aspectos principales en el aseguramiento de su calidad. Este análisis cumple un

papel muy importante en la determinación del valor nutricional de los alimentos,

en el control del cumplimiento de los parámetros exigidos por los organismos de

salud y también para el estudio de las posibles irregularidades como

adulteraciones, falsificaciones, etcétera. Tanto en alimentos terminados como en

sus materias primas (Uriel, 2012).

Las grasas y los aceites son triglicéridos con diferentes composiciones de las

cadenas de alquilo en función de su origen (Salimon et al., 2012). La identificación

de las características fisicoquímicas del aceite tiene una importancia práctica y

proporciona las bases para la calidad e idoneidad de los aceites (Barkatullah et

al., 2012), en particular las cualidades físicas y el valor nutricional (Angaye et al.,

2015).

La composición química proporciona información sobre el contenido total de

ácidos grasos saturados e insaturados, que a menudo se utilizan como

indicadores de calidad para determinar la estabilidad y la oxidación de grasa y

aceite (Ogungbenle, 2014). Los aceites que contienen ácidos grasos insaturados,

son más deseables como alimentos y sirven para reducir niveles de colesterol en

suero sanguíneo. (Ogungbenle et al., 2015).

I.4. ACTIVIDAD BIOLÓGICA

1.4.1. USO MEDICINAL

El totumo en la medicina se emplea para diferentes infusiones: el extracto

hidroalcohólico (95%) de hoja (5 mg/mL) presentó una actividad antimicrobiana in

vitro contra Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus. La maceración

hidroalcohólica de hoja inhibió el crecimiento in vitro de Salmonella typhi. El

12

extracto etanólico de hoja y tallo mostró acción antibacteriana in

vitro contra Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus

aureus y Escherichia coli (TRAMIL, 2005). Las hojas se usan para tratar

problemas de hipertensión (Botero et al., 2011),

La pulpa cruda se consume como un antiparasitario y cocida se utiliza para

quitar la sarna a los perros y caballos (Álvarez Henao, 2010), y se ingiere para

tratar la diarrea, dolor de estómago, resfriados, bronquitis, tos, asma y uretritis

(Botero et al., 2011). En 2008, en Colombia se publicó el listado de plantas

medicinales aprobadas con fines terapéuticos por el INVIMA, donde se permite el

uso del jarabe con extracto de pulpa del fruto fresco como coadyuvante en el

tratamiento de trastornos respiratorios leves (Espitia-Baena et al.,2011).

Según un estudio realizado en el noroeste de Colombia por Otero et al., (2000)

sobre la capacidad neutralizante de extractos de plantas contra el efecto

hemorragico del veneno de Bothrops atrox, indica que el extracto del fruto

inmaduro de C.cujete L, presenta una moderada actividad antihemorrágica en

dosis de 4mg/ratón. La pulpa de fruto inhibió el crecimiento de cepas

de Streptococcus pneumoniae (TRAMIL, 2005).

En la ganadería se lo ha estado implementando como suplemento y fitofármaco

para tratar la mastitis, los golpes de los animales y la retención placentaria debido

a su efecto abortivo (Botero et al., 2012).

I.4.2. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

El estudio de la capacidad antioxidante de las plantas medicinales y

alimenticias ha crecido en las últimas décadas ya que un número importante de

productos obtenidos de éstas, como los aceites, alcaloides y los polifenoles,

poseen efectos antioxidantes, los cuales son evidenciados mediante diferentes

ensayos in vitro e in vivo (Rivas et al., 2016).

13

Los antioxidantes son compuestos que pueden inhibir o retardar la oxidación

de otras moleculas como lípidos ,proteínas y ácidos nucleicos (Angulo, 2014),

inhabilitando la iniciación y/o propagación de las reacciones en cadena de los

radicales libres (Rivas et al., 2016).

Pueden actuar de las siguientes formas:

Previniendo la formación de especies reactivas de oxígeno (ERO).

Interceptando ataque de ERO.

Secuestrando los metabolitos reactivos y convirtiéndose en moléculas menos

reactivas.

Amplificando la resistencia de las dianas biológicas sensibles al ataque de

ERO.

Facilitando la reparación del daño causado por ERO.

Manteniéndose un ambiente favorable para la actuación de otros antioxidantes.

(Martinez, 2011).

I.4.3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO POR EL MÉTODO DEL DPPH

El ensayo consiste en determinar la capacidad capturadora del radical libre

estable 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) del aceite siguiendo el procedimiento

propuesto por Brand-Williams y col., (1995).

DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo), es un radical libre estable, el cual disuelto

en un alcohol como etanol o metanol tiene una coloración azul-violeta. En

presencia de un antioxidante el DPPH es convertido a 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo

con un color amarillo (Cervato y col, 2000).

14

En su forma de radical libre, el DPPH• absorbe a 515 nm - 517 nm y cuando

sufre reducción por un antioxidante, esta absorción desaparece. En consecuencia,

la desaparición del DPPH• proporciona un índice para estimar la capacidad del

compuesto de prueba para atrapar radicales. El modelo que explica la actividad

de un compuesto como antirradical se ejemplifica con la siguiente ecuación:

Donde AH es un antioxidante que actúa como antirradical donando átomos de

hidrógeno, dando como resultado radicales con estructuras moleculares neutras

que detendrán la reacción en cadena, tal es el caso de los fenoles. El nuevo radical

formado (A∙) puede interactuar con otro radical para formar moléculas neutras

(DPPHA, A-A). La reacción entre el DPPH• y un compuesto depende de la

conformación estructural del mismo, por lo que las comparaciones cuantitativas

no siempre son apropiadas (Martínez, 2011).

Los resultados de este método son expresados en IC50, el cual se define como

la concentración necesaria de muestra para reducir el 50% de la cantidad inicial

de DPPH y se expresa como la relación molar de cada componente por radical.

Los niveles bajos de IC50 indican alta eficacia en la donación de hidrógeno (Silva

y col., 2000).

Figura 1. Estructura del DPPH antes y después de la reacción antioxidante

(Tovar, 2013).

15

Desde el punto de vista metodológico, el DPPH es un método fácil y exacto

para la medición de actividad antioxidante en frutas y verduras por lo que es

recomendado para medir la actividad antioxidante en este tipo de muestras (Gil y

col., 2000).

Este método presenta también la ventaja de ser una prueba no enzimática y es

utilizado para proveer información básica en la reactividad de compuestos para el

secuestro de radicales (Silva y col., 2000).

I.5. CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA PARA ACEITES

COMESTIBLES

1.5.1. DENSIDAD RELATIVA A 25/25°C, (D25)

Es la relación entre la masa de un volumen dado de una sustancia y la masa

de un volumen igual de agua en las mismas condiciones de presión y temperatura

a 25°C para aceites. La densidad relativa es un número abstracto. (Norma INEN

035, 1973-08).

1.5.2. DETERMINACIÓN DE PÉRDIDA POR CALENTAMIENTO

La determinación exacta de humedad es difícil, pero en los alimentos es de

gran importancia, el porcentaje de humedad en alimentos es menor en relación al

de las frutas y verduras; Incluso en los aceites existe una pequeña cantidad de

agua. Es muy importante determinar la humedad ya que sirve para conocer en

qué proporción se encuentran los nutrientes, además indica la estabilidad de los

alimentos (Recalde, 2015).

Ayuda a determinar el contenido de humedad y otras sustancias volátiles. Se

calienta el producto a 103 °C hasta eliminar completamente la humedad y las

materias volátiles (Norma INEN 039, 1973-08).

1.5.3. ÍNDICE DE YODO

16

En condiciones normalizadas, los glicéridos de los ácidos grasos insaturados

presentes en el aceite, se unen con una cantidad definida de halógeno, contenida

en la solución de Wijs, de monocloruro de Yodo. El índice de Yodo esta

correlacionado con el índice de refracción y densidad. El grado de absorción se

estima valorando el yodo en exceso con sustancias halogenadas (Rodriguez,

2013).

Es una medida del grado medio de insaturación de ciertas sustancias

orgánicas, expresada como centigramos de yodo absorbidos, bajo condiciones

determinadas, por cada gramo de sustancia (Norma INEN 037, 1973-08).

1.5.4. ÍNDICE DE PERÓXIDO

Con la medida de este parámetro, se estima el grado de oxidación inicial del

aceite, indica igualmente el deterioro que se puede haber dado en compuestos

antioxidantes, como polifenoles y tocoferoles, se expresa en miliequivalentes de

oxígeno activo por kilogramo de grasa (Norma INEN .0277, 1978-02).

Es la medida de peróxidos contenidos en el aceite. Durante el almacenaje la

formación de peróxidos es baja durante el periodo inicial. Pero puede variar en

unas pocas semanas o algunos meses, de acuerdo al aceite o grasa en particular,

la temperatura, etcétera y esto debe tomarse en cuenta, cuando se interpretan los

resultados cuantitativos (Velez de Aviles, 1998).

1.5.5. ACIDEZ

La acidez de los aceites, determina el porcentaje expresado en ácido oleico de

ácidos grasos libres de un aceite, expresado convencionalmente como gramos de

ácido oleico, laúrico o erúcico por cada 100 g de sustancia (Norma INEN 038,

1973-08).

La presencia de ácidos libres en una grasa, es la consecuencia de

fermentaciones, frutos en mal estado sanitario, frutos caídos al suelo, frutos

17

atrojados, etc., de procesos de transformación de fruto incorrectos (Jiménez,

2011).

1.5.6. ÍNDICE DE ACIDEZ

Es el número de miligramos de hidróxido de potasio requeridos para neutralizar

los ácidos grasos libres contenidos en 1 gramo de grasa o aceite (Norma INEN

038, 1973-08).

1.5.7. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN

Es el número de miligramos de hidróxido de potasio (KOH) requeridos para

saponificar 1 gramo de grasa o aceite (Norma INEN 040, 1973-08).

I.6. CROMATOGRAFO DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRO

DE MASAS (GCMS)

La cromatografía de gases es una técnica separativa que tiene la cualidad de

conseguir la separación de mezclas muy complejas. Pero una vez separados,

detectados, e incluso cuantificados todos los componentes individuales de una

muestra problema, el único dato del que se dispone para la identificación de cada

uno de ellos es el tiempo de retención de los correspondientes picos

cromatográficos. Este dato no es suficiente para una identificación inequívoca,

sobre todo cuando se analizan muestras con un número elevado de componentes,

como es frecuente en cromatografía de gases (Gutiérrez et al., 2002).

Por otra parte, la espectrometría de masas puede identificar de manera casi

inequívoca cualquier sustancia pura, pero normalmente no es capaz de identificar

los componentes individuales de una mezcla sin separar previamente sus

componentes, debido a la extrema complejidad del espectro obtenido por

superposición de los picos de cada componente (Gutiérrez et al., 2002).

18

La unión GC-MS es sumamente propicia, sinérgica, ya que los compuestos

aptos para el análisis tanto por GC como por MS con impacto de electrones (EI,

técnica de ionización de las moléculas más usada en GC-MS), son moléculas con

temperaturas de ebullición, pesos moleculares o polaridades bajos o medianos,

presentes en mezclas en el rango de concentraciones (ppb– ppm) similar para

ambas técnicas. Además su análisis transcurre en el mismo estado de agregación

(fase vapor) (Stashenko & Martínez , 2010).

En principio, se trata de dos técnicas que trabajan en fase gaseosa y necesitan

una muy pequeña cantidad de muestra para su análisis, por lo que son muy

compatibles (Gutiérrez et al., 2002).

CAPÍTULO II

MATERIALES Y MÉTODOS

19

II.1. METODOLOGÍA

En el presente trabajo de titulación, se emplearon alrededor de 30 frutos de

mate o totumo con un rendimiento de 250–500 semillas por fruto, proveniente de

la ciudadela: La Kennedy en la Avenida San Jorge de la ciudad de Guayaquil,

provincia del Guayas. Estas semillas obtenidas se secaron y se procedió a la

extracción de aceite de las semillas por el método de Soxhlet con el empleo de n-

hexano como disolvente. La especie fue identificada en la facultad de Ciencias

Naturales, en el Herbario Guay y el número de herbolización asignado fue: 015

(ver Anexo 1).

Para determinar las características fisicoquímicas del aceite, se realizaron los

respectivos análisis, en los Laboratorios de Productos Naturales y PROGECA de

la Facultad de Ciencias Químicas. Para este estudio el material vegetal se

subdividió en 12 grupos de 40 g cada uno y fueron extraídos por Soxhlet por un

tiempo aproximado de 3 a 4 horas. Se realizó una investigación de tipo

experimental.

II.2. EXTRACCIÓN DE ACEITE

Las semillas colectadas fueron lavadas y secadas en estufa MEMMERT a 40°C

antes de ser empleadas. Una vez secadas fueron molidas con el empleó de un

molino manual para grano Toolcraft Tc2541 con un tamaño de tamiz de 500 mm.

Para la extracción se empleó un equipo Soxhlet en el cual se colocó un dedal con

el polvo de las semillas (40 g) pesado en balanza de precisión marca BOECO

(Alemania). En cada proceso de extracción se utilizaron 250 mL de n-hexano, que

después de trascurrido entre tres o cuatro horas fue concentrado en

rotaevaporador Heidolph. Se realizó 12 veces el experimento.

FÓRMULA

%𝑅 =𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 (𝑚𝐿)

𝑃𝑒𝑠𝑜 (𝑔)∗ 100

R: Rendimiento expresado el porcentaje

V: Volumen del aceite fijo obtenido en mL

P: Peso de semillas empleado

20

II.3. ANÁLISIS FÍSICO-QUÍMICO

Los métodos empleados en esta fase experimental fueron basados bajo la

norma técnica ecuatoriana INEN para Grasas y aceites comestibles.

II.3.1. DENSIDAD RELATIVA A 25/25°C, (D25)

El ensayo se realizó por triplicado.Pesa el picnómetro limpio y seco con tapa

en balanza Analítica BOECO, el picnómetro con agua al ras con tapa . pesó la

muestra en el picnometro previamente seco y con tapa,calcular.

FÓRMULA

𝑑 =𝑚2 − 𝑚

𝑚1 − 𝑚

II.3.2. DETERMINACIÓN DE PÉRDIDA POR CALENTAMIENTO

Se pesó la cápsula de vidrio vacía en la balanza analítica, luego se pesó de 2-

3 g de muestra en la cápsula de vidrio en la balanza analítica KERN. Se llevó a

la estufa MEMMERT a temperatura de 105ºC por 2 horas, luego se sacó de la

estufa la cápsula, se dejó enfriar y se pesó la cápsula con la muestra. Este ensayo

se realizó por triplicado pero reduciendo el período de calentamiento a 30 min,

hasta que la diferencia entre los resultados de dos operaciones de pesaje

sucesivas no exceda de 0,002 g.

FÓRMULA

P =m1 − m2

m1 − m∗ 100

m1: picnómetro con agua

m2 : picnómetro con muestra

m: picnómetro vacío

p: pérdida por calentamiento, en porcentaje de masa

m: masa del cristalizador, en gramos (g)

m1: masa del cristalizador, con muestra, antes del

calentamiento, en (g)

m2: masa del cristalizador, con muestra, después del

calentamiento, en (g)

21

II.3.3. ÍNDICE DE YODO

En una fiola de 125 mL se pesó de 0.5-1 g de muestra en balanza analítica

KERN, se disuelve en 10 mL de cloroformo y se añade con pipeta volumétrica 25

mL de reactivo de Wijs, se deja en una gaveta para proteger de la luz por 30

minutos, agitando de vez en cuando; en la misma forma, se procedió con un

blanco. Transcurrido el tiempo indicado, se lo sacó de la gaveta y se añadió 10

mL de solución de yoduro de potasio a 15% y 100 mL de agua destilada. Se tituló

inmódicamente con la solución de tiosulfato de sodio 0.1N, utilizando solución

reactiva de almidón, como indicador final de la titulación. Se agitó el líquido del

frasco enérgicamente mientras se tituló. Con el objeto de que reaccione el yodo

que pueda hallarse disuelto en el cloroformo. Simultáneamente, se procedió a

titular el blanco.

FÓRMULA

I1 =0.127∗(V−V1)∗N

Peso de la Muestra *100

II.3.4. ÍNDICE DE PERÓXIDO

En una fiola de 125 mL con un tapón de vidrio se pesó 5.00 ± 0.05 g de muestra

de aceite en balanza analítica KERN. Se agregó 30 mL de solución de ácido

acético–cloroformo, luego se agitó para disolver la muestra. Se Agregó 0.5 mL

de solución saturada de ioduro de potasio KI y se dejó que la solución repose,

agitando ocasionalmente 1 minuto exacto y luego se agregó inmediatamente 30

mL de agua destilada. Se realizó la titulación con tiosulfato de sodio 0.1N,

acondicionándolo gradualmente, agitando constantemente hasta que el color

amarillo casi desaparezca. Se agregó 0.5 mL de la solución de almidón, y se

continuo la titulación con agitación. Cerca del punto final se agregó el tiosulfato

en gotas hasta que desaparezca el color azul. Finalmente se hizo una

determinación con un blanco. La titulación no debe exceder 0.1 mL de la solución

de tiosulfato de sodio 0.1N.

22

FÓRMULA

I =Consumo TioSulfato ∗ N Tiosulfato

Peso de la Muestra∗ 1000

II.3.5. ACIDEZ

En una fiola se pesó la fiola en balanza analítica KERN, tarar y luego pesar 5g

de muestra. Añadir 20 mL de alcohol neutro y 20 mL de Dietil éter. Agitar y añadir

2-3 gotas de solución indicadora Fenolftaleína. Proceder a titular con Hidróxido de

Sodio 0.1N hasta aparición de color rosado.

FÓRMULA

A =Consumo Na(OH) ∗ N Na(OH) ∗ Peso Molecular en mLeq Ác. Graso

Peso de la Muestra∗ 100

II.3.6. ÍNDICE DE REFRACCIÓN

En el refractómetro THERMO Electron Corporation, se limpió con alcohol la

superficie donde se agrega la muestra, luego se agregó una gota de muestra en

el Refractómetro a 25 ˚C y anotar la medida. Realizar prueba por triplicado.

II.3.7. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN

Se pesó alrededor de 3g en balanza analítica BOECO GERMANY, dentro de

un frasco Erlenmeyer de 250 mL de capacidad. Agregue cuidadosamente por

medio de una pipeta volumétrica, 25 mL de una solución alcohólica de 0.5 N de

KOH. Calentar en baño María por 30 minutos o hasta que la muestra esté

totalmente homogenizada que indica que está totalmente saponificada, dejar

enfriar. Agregar 1mL de solución indicadora de fenolftaleína y se titula el exceso

de álcali con solución 0.5 N de HCl. Realizar determinación en blanco y muestra

por triplicado.

23

FÓRMULA

SAP =56.1 (V1 − V2) ∗ N

m

II.3.8. CONTENIDO DE ÁCIDOS GRASOS

Se pesó 30 mg muestra en una balanza analítica BOECO (Alemania), se

agregaron 3 mL de cloruro de acetilo al 10 % en metanol (disolución metilante).

Se cerró herméticamente y se calentó a 85 °C por 2 h con agitación vigorosa

ocasional. Al cabo de ese tiempo se llevó a temperatura ambiente, se adicionaron

4 mL de n˗hexano y 4 mL de agua destilada. Agitar en una zaranda por 15 min y

dejar reposar. De la fase orgánica (superior) se extrajeron 3 mL hacia otro tubo de

ensayo, se le adicionaron 4 mL de n˗hexano y 4 mL de NaOH a 1 mol/L en

metanol, se cerró y se agitó en zaranda durante 15 min. Se dejó reposar y

extrajeron 2 mL de la fase orgánica, de la cual se tomó 1 µL para el análisis por

cromatógrafo de gases (Shimadzu, Japón) GCMS-QP2010 Plus, equipado con un

detector selectivo de masas, serie QP2010. La inyección de la muestra se realizó

manualmente por el modo “split” con una relación de 1:20, siendo la temperatura

del inyector 250 °C. La separación se realizó en una columna capilar Crossbond

de 30 m × 0,25 mm DI y 0,25 µm de espesor de película. La temperatura del horno

se programó a 100 °C (3 min), 250 °C (10 min) y 280 °C hasta completar los 30

min. Como gas portador se utilizó helio a un flujo de 1 mL/min. El espectrómetro

de masas fue operado en el modo de ionización electrónica (IE) a 70 eV y con una

temperatura de la fuente iónica e interfase de 280 °C. La detección se realizó en

el modo de barrido total desde 30-500uma. Las estructuras de los ácidos grasos

fueron propuestas sobre la base del proceso de fragmentación general así como

por la base de datos NIST 21, con más un 93 % de confiabilidad en todos los

SAP: índice de saponificación del producto, en

mg/g

V2: volumen de solución de ClH o H2SO4

empleado en la titulación de la muestra, en mL

V1: volumen de solución de ácido clorhídrico o

sulfúrico empleado en la titulación del ensayo en

blanco, en mL

N: normalidad de la solución de ácido clorhídrico o

sulfúrico.

m: peso de la muestra, en g

24

casos. La cuantificación de los compuestos fue realizada por normalización

interna del área bajo la curva de cada pico cromatográfico (Indarti et al., 2005).

II.4. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO POR EL MÉTODO DEL DPPH

El ensayo consistió en determinar la capacidad capturadora del radical libre

estable 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) del aceite siguiendo el procedimiento

propuesto por Brand-Williams y col., (1995).

Para la preparación del estándar Trolox se emplea metanol a partir de una

solución madre de 2 mM y posteriores disoluciones, de 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 y 0,9 mM

en metanol, para preparar la curva patrón. La absorbancia se mide con cubetas

de vidrio estándar de 10 mm a 515 nm en Espectrofotómetro UV-VIS modelo

4001/4. La absorbancia característica de este radical que posee un color violeta

intenso, disminuye en presencia de un antioxidante (que sea capaz de capturar

un electrón libre) u otro radical, lo que permite cuantificar la capacidad capturadora

de radicales libres que poseen ciertos compuestos mediante la determinación del

grado de decoloración que provoca a una solución metanólica de DPPH (Brand-

Williams y col., 1995).

Muestra:

El aceite (2 mL) se mezcló en metanol en proporción 1:1 V/V, se agitó durante

una hora y se centrifuga a 2500-3000 rpm durante 15 minutos a temperatura

ambiente. Del extracto obtenido se tomó 100 µL y se diluyeron en proporciones

con metanol de 1:1, 1:2 y 1:3 hasta lograr una absorbancia dentro del rango de

linealidad. Las lecturas del Trolox y los aceites se realizaron por triplicado de

manera cinética hasta 30 minutos (cada 10 minutos) para comparar las

velocidades de reacción.

CAPÍTULO III

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

25

III. 1. EXTRACCIÓN DE ACEITE

El rendimiento del aceite fijo en la extracción por Soxhlet fue de 36,57 ± 1,21

%. El valor obtenido en la fase experimental fue superior a otros reportes de la

literatura como por ejemplo 19,31 %, Luna (2007) y 28,12 % López et al. (2015).

Este resultado sugiere que la extracción por Soxhlet es un método eficiente de

extracción de aceites vegetales, con la ventaja de que los mismos pueden ser

obtenidos en cortos períodos de tiempo. El tiempo promedio de extracción fue de

3 horas.

III.2. ANÁLISIS FISICOQUÍMICO

III. 2.1. DENSIDAD RELATIVA

El valor obtenido fue de 0.9045 g/mL, valor mayor a los obtenidos por Luna

(2007), siendo estos resultados de 0.8874 g/mL y 0.8876 g/mL. También es

comparable a otros de usos alimenticios e industriales como el aceite de soya

(Glycine max L.) con una densidad de 0.919g/mL, el aceite de maní (Arachis

hypogaea L.) con 0.914g/mL y el aceite de oliva (Olea europea L.) refinado con

0.910g/mL.(Stevenson et al., 2007; Sakouhi et al. 2008; Russo et al., 2012).

III.2.2. PÉRDIDA POR CALENTAMIENTO

El ensayo dio como resultado un valor de 1.38 %, dicho valor resulta de la

pérdida de agua y materias volátiles presentes en la muestra.

III. 2.3. ÍNDICE DE REFRACCIÓN

El índice de refracción dio un valor de 1.46 a 25ºC, valores similares a los

obtenidos por Luna (2007) del aceite de mate obtenidos de dos regiones

Estanzuela y San Agustín, Guatemala, dando 1.46 a 25°C en ambos casos. En

relación con otros tipo de aceites, como el aceite de oliva cuya especificación dada

en la NTE INEN 29:2012 es de 1,466 -1,4685 a 25 ºC y los resultados dados por

Navas, (2010), del aceite de uva de 1.453 a 25°C.

26

III.2.4. ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN

El valor promedio obtenido en el ensayo fue de 191.39 mg KOH/g, en

comparación a los valores obtenidos por Luna, (2007) que fueron de 174.78 mg

KOH/g muestra y 179.90 mg KOH/g muestra respectivamente. Según el Codex

Alimentarius para el aceite de oliva, el índice de aceptabilidad oscila de 184 mg

KOH/g -196 mg KOH/g.

III. 2.5. ACIDEZ

El valor promedio obtenido en este ensayo de ácido graso libre fue de 1.314

expresado como g de ácido oleico por cada 100 g de aceite fijo, debido a que éste

ácido graso predomina en la muestra. Siendo éste un valor mayor a los datos

obtenidos por Luna, (2007) de 0.065 % y 0.090 % en aceite de semilla de mate.

En comparación con el aceite de oliva el Codex Alimentarius, especifica un

valor máximo de 2,0 % para aceite de oliva virgen y 3,3 % para aceite de oliva

común.

III.2.6. ÍNDICE DE PERÓXIDO

El valor promedio obtenido en este ensayo fue de 3,997 meq O2/Kg ± 2.081*10-

3%, siendo un resultado superior en comparación a los valores obtenidos por Luna

(2007) de 0.43 y 0.80 meq O2/Kg ,encontrándose dentro de las especificaciones

establecidas por el Codex Alimentarius para aceites comestibles siendo aceptable

hasta 15 meq O2/Kg de aceite.

Comparada con otro tipo de aceite como el de sacha inchi, Martinez, (2011)

obtuvo 11,5313 meq O2/Kg, siendo un valor mayor al obtenido del aceite de mate.

La NTE INEN 29:2012 para aceite de oliva indica que debe tener un valor

máximo de10 y 20 meq O2/1Kg, dependiendo de la clase de aceite de oliva.

27

III.2.7. INDICE DE YODO

El valor promedio obtenido en este ensayo fue de 120,97 mg/100g aceite.

Resultado superior a los valores obtenidos por Luna (2007) de 90.95 mg/100g

aceite y 89.32 mg/100g aceite. En comparación con otro tipo de aceite como el

de girasol el Codex Alimentario establece un rango de 118-141mg/100g,

encontrándose dentro de este rango.

El valor obtenido es superior a los permitidos por la NTE INEN 29:2012 para

aceites de oliva siendo estos de 79 mg/100g aceite – 89 mg/100g aceite.

III.2.8. CONTENIDO DE ÁCIDOS GRASOS

Como se muestra en la Tabla N° V, los ácidos insaturados son los principales

componentes del aceite, siendo el éster metílico del ácido oleico (63,9%) el

componente mayoritario, seguido del éster metílico del ácido palmitoleico (16,7%).

En general, el contenido de ácidos grasos insaturados sobrepasa el 80%, de

los cuales 77,97% corresponde a ácido oleico. Los ácidos grasos saturados en

conjunto constituyen el 17,61% del total y el éster del ácido esteárico constituye el

74,38%.

Los aceites que contienen más cantidad de ácidos grasos insaturados, son más

deseables como alimento y pueden ser utilizados en la reducción de colesterol

(Ogungbenle & Afolayan, 2015). Espitia-Baena et al., (2011) informan un

contenido de un 20% de aceite en las semillas y como componente mayoritario al

ácido oleico con un 52%. En este reporte no se establece las condiciones de

extracción, ni la forma en que fue evaluada la composición química.

28

Tabla N° V Composición de ácidos grasos (%) del aceite de C. cujete.

PICO TIEMPO DE RETENCIÓN

NOMBRE %

1 3.857 Estireno 0,02

2 20.773 n-Pentadecanoato de metilo 0,03

3 21.371 Éster metílico del ácido Palmitoleico (C16:1) 16,74

4 21.556 Éster metílico del ácido palmítico (C16:0) 0,26

5 21.791 Ácido palmítico (C16:0) 0,04

6 22.148 Éster metílico del ácido margárico (C17:0) 0,25

7 22.720 Éster metílico del ácido oleico (C18:1) 63,92

8 22.835 Éster metílico del ácido esteárico (C18:0) 13,31

9 22.905 Ácido oleico (C18:1) 0,72

10 23.045 Ácido esteárico (C18:0) 0,33

11 23.229 Ácido linoléico (C18:2) 0,10

12 23.299 Ácido behénico (C22:0) 0,10

13 23.496 Éster metílico del ácido nonadecanoico (C20:0) 0,10

14 24.107 Ácido Cis-13-eicosenoico (C20:1) 0,44

15 24.336 Ácido araquídico (C20:0) 1,91

16 25.055 Ácido lignocérico (C24:1) 0,05

17 25.360 Éster metílico del ácido heneicosanoico (C21:0) 0,10

18 26.270 Ácido pentacosanoico (C25:0) 0,22

19 26.665 Éster metílico del ácido behénico (C22:0) 0,66

20 27.810 Ácido cerótico (C26:0) 0,06

21 28.325 Éster metílico del ácido tricosanoico (C23:0) 0,06

22 29.801 Ácido montánico (C28:0) 0,07

23 30.494 Éster metílico del ácido tetracosanoico (C24:0) 0,38

29

III.3. ENSAYO DPPH

En la literatura consultada no se encontró información sobre capacidad

antioxidante in vitro para aceites obtenidos a partir de especies de C. cujete L.

Para poder establecer una comparación de estos resultados se consideró el

procedimiento de extracción empleado en esta investigación.

La selección del Trolox como sustancia de referencia en este estudio se debió

en primer lugar a su uso reiterado en estos ensayos, a la estabilidad química de

la molécula y la disponibilidad en el laboratorio. En la tabla N° VI se presentan los

resultados obtenidos para el análisis de linealidad por el método de Lambert-Beer

a una longitud de onda de 515 nm.

TABLA N° VI. Relación entre la concentración del blanco estandarizado

Trolox y la absorbancia (Tabla Patrón)

Conc (Trolox) A(515nm) A(515nm) A(515nm) Promedio

0,1 0,146 0,143 0,147 0,145

0,3 0,302 0,298 0,304 0,301

0,5 0,458 0,453 0,460 0,457

0,7 0,613 0,607 0,617 0,613

0,9 0,769 0,762 0,773 0,768

El análisis estadístico de la recta de absorbancia contra concentración se presenta

en la figura 2.

Figura 2. Curva de regresión lineal obtenida del Trolox

y = 0,8923x + 0,0262R² = 0,9863

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

0 0 , 1 0 , 2 0 , 3 0 , 4 0 , 5 0 , 6 0 , 7 0 , 8 0 , 9 1

AB

SOR

BA

NC

IA

CONCENTRACIÓN

30

La significación del modelo dio una p˂ 0,05 y un R2 de 0,9863. Este valor de

R2 demostró que la recta tuvo un buen ajuste en el rango de concentración de

Trolox (0,1 a 0,9 µM). Valores semejantes han sido reportados en otros estudios

con esta sustancia de referencia: R2= 0,919, (Upadhya et al., 2015) y R2= 0,992,

(Parikh et al., 2017).

El aceite se procesó según se indicó en el acápite II.4, por lo tanto se obtuvo el

comportamiento de la capacidad de captar radicales libres en tres valores de

concentración como se muestra en la Tabla Nº VII.

TABLA N° VII. Datos de la Absorbancia del Blanco y de la Muestra

Dilución Absorbancia Media: A(515) m Dif. Blanco

1:1

0,526

0,526 0,450 0,521

0,531

1:2

0,401

0,408 0,332 0,412

0,411

1:3

0,207

0,21 0,134 0,211

0,212

BLANCO 0,0768

A partir de los valores de absorbancia obtenido se calculó el porcentaje de

inhibición según la siguiente ecuación:

%DPPH:D. O. m − D. O. b

D. O. DPPH∗ 100

1) %DPPH:0.526−0.076

0.768∗ 100 ∶ 𝟓𝟖. 𝟓𝟗𝟒%

2) %DPPH:0.408−0.076

0.768∗ 100 ∶ 𝟒𝟑. 𝟐𝟐𝟗% (Valor más cercano al 50%)

3) %DPPH:0.21−0.076

0.768∗ 100 ∶ 𝟏𝟕. 𝟒𝟒𝟖%

31

Como se puede deducir de los resultados en el aceite fijo extraído de las

semillas del mate hay capacidad de capturar radicales libres, lo cual le da a este

aceite vegetal un valor agregado. Como se pudiera esperar de una sustancia con

capacidad antioxidante en la medida que disminuye la concentración disminuye la

capacidad de inhibición de la recaptura de radicales.

En la dilución 1:2 se obtuvo el valor más cercano al 50 % de inhibición por lo

que fue utilizada para calcular el valor del IC50. La absorbancia promedio a esta

dilución fue de 0,408 lo que equivale a 0,428 µM de Trolox según la ecuación de

la recta:

𝐀𝐛𝐬 = 0,8923 x Concentración (trolox) + 0,0262

Considerando que el valor de densidad relativa del aceite es 0,9045 g/mL

entonces 2 mL pesan 1,809 g. Es decir, que la capacidad antioxidante del aceite,

según la metodología realizada, corresponde a 0,236 µM Trolox/g de aceite o

como más comúnmente se expresa 236,5 µM Trolox/Kg de aceite. Este resultado

sugiere una buena capacidad antioxidante comparable con otros aceites de uso

humano. Por ejemplo el aceite de oliva en condiciones de procesamiento similares

presenta en este ensayo de DPPH un valor de 409.78 µmol Trolox/ Kg de aceite

y hasta un valor de 779.14 µmol Trolox/ Kg de aceite oliva extra virgen

(Samaniego, 2006).

La capacidad antioxidante por este ensayo del DPPH por sí solo no da un

resultado que garantice la capacidad antioxidante in vivo del aceite, pero en

muchos reportes científicos es un parámetro de referencia. Los estudios de

composición química realizados no identifican los posibles compuestos

responsables de esta capacidad de atrapar radicales de DPPH por lo que sería

muy interesante continuar el análisis del aceite del mate para caracterizar la

fracción de insaponificables. La identificación de estos compuestos conjuntamente

con la abundancia de ácidos grasos insaturados permite establecer el valor

comercial de los aceites vegetales.

32

CONCLUSIONES El presente trabajo de Tesis permitió realizar la caracterización fisicoquímica del

aceite fijo de mate (Crescentia cujete L.) y con base a los resultados obtenidos, se

puede arribar a las siguientes conclusiones:

Mediante extracción por Soxhlet se logró obtener un rendimiento promedio de

36.57% de aceite fijo de las semillas de la especie.

Las propiedades fisicoquímicas del aceite obtenido de las semillas son

similares a otros aceites vegetales de uso humano como el aceite de oliva, de

soya o maíz.

El perfil lipídico obtenido por CG-EM reveló un contenido de ácidos grasos

insaturados totales de alrededor del 80%, siendo el ácido oleico el mayor

porcentaje con 63.92%.

El aceite obtenido mostró capacidad antioxidante mediante el método DPPH,

siendo el CI50 igual a 236,5 µmol Trolox/kg de aceite.

33

RECOMENDACIONES

Realizar estudios toxicológicos del aceite de la semilla del Mate, con el fin de

garantizar su uso como productos alimenticio y/o cosmético.

Realizar los mismos análisis en otras especies del género Crescentia tomando

en cuenta su ubicación geográfica, tiempo de cosecha o madurez, para

comparar el rendimiento de aceite y los resultados obtenidos con la especie

estudiada.

Identificar los compuestos antioxidantes presentes en la fracción

insaponificable del aceite obtenido.

34

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ANEXOS

ANEXO 1: HERBARIO GUAY, DESCRIPCIÓN TAXONOMICA DEL MATE

41

ANEXO 2: FOTOGRAFÍAS DE LA FASE EXPERIMENTAL

RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

EXTRACCIÓN DE LAS SEMILLAS

SECADO DE LAS SEMILLAS

42

MOLIENDA DE LAS SEMILLAS

EXTRACCIÓN DE ACEITE

a) Peso de la Muestra

43

b) Preparación del equipo

c) Rotaevaporador: Separación de Solvente y Aceite

d) Aceite obtenido

44

ANALISIS FISICO-QUÍMICO

a) Índice de refracción

b) Densidad Relativa

c) Índice de Acidez

45

d) Índice de Saponificación

e) Índice de Yodo

46

f) Humedad

g) Índice de Peróxido

47

ANEXO 3: GRÁFICAS DEL GC-MS

4.0

06

.00

8.0

01

0.0

01

2.0

01

4.0

01

6.0

01

8.0

02

0.0

02

2.0

02

4.0

02

6.0

02

8.0

03

0.0

0

20

00

00

0

40

00

00

0

60

00

00

0

80

00

00

0

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29

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32

9.2

07

29

.80

0

30

.49

7

48

ANEXO 4. DECOLORACIÓN DE SOLUCIÓN DPPH

49

ANEXO 5. Certificado de presentación de tema en II Congreso

Internacional de Ciencia y Tecnología

50

ANEXO Nº 6 Certificado de análisis de Laboratorio PROGECA