Moderní světelná a elektronová mikroskopie

Doc. RNDr. Roman Kubínek, CSc.Katedra experimentální fyziky

Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého v Olomouci

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republikyv rámci projektu Vzdělávání výzkumných pracovníků v Regionálním centru pokročilých technologií a materiálů (CZ.1.07/2.3.00/09.0042)

Mikroskopické techniky● Světelná mikroskopie

● Metoda fázového kontrastu (PC)

● Nomarského interferenční kontrast (DIC)

● Hofmannův modulační kontrast (HMC)

● Fluorescenční mikroskopie (FLM)

● UV a IR mikroskopie, ultramikroskopie

● Laserová konfokální mikroskopie (LSCM)

● Digitální holografická mikroskopie (DHM)

● Optická mikroskopie v blízkém poli (NSOM)

● Elektronová mikroskopie

● Transmisní elektronová mikroskopie (TEM, HRTEM)

● Skenovací elektronová mikroskopie (SEM, eSEM)

● Mikroskopie skenující sondou – „Hrotové mikroskopy“ (speciální přednáška)

Zdroje informací:

● http://apfyz.upol.cz/ucebnice/elmikro.html

● http://apfyz.upol.cz/ucebnice/optmikro.html

● http://atmilab.upol.cz/brozura.html

● http://micro.magnet.fsu.edu/primer/

1670

1850

1930 1998

Vývoj „světelných“ mikroskopů

SM – zvětšení

Z= 0,25

f ¿=−

Δ

f 1¿. 0,25

f 2¿=Z obj. Zok

Zvětšení mikroskopu

SM – rozlišení

D=1,22.λ0

A0

⇒dmin=0,61 λ0

n .sin α0

Rozlišovací mez SM

Hloubka ostrosti SM

T = Tg + Tv + Ta

][.

1

7

1mm

ZATg = T v=

n . λ

2A2 [mm ] ][250

2mm

ZTa =

SM – objektivy suché a imerzní

SM – metoda fázového kontrastuPotřeba zvýraznit detaily průsvitných preparátů s indexem lomu nepatrně odlišným od okolí - (Fritz Zernike 1930)

Vlnová teorie zobrazení ve SM

Fázové destičky

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/phasecontrast/phasemicroscope/index.html

Nomarského diferenční interferenční kontrast (DIC)

Snaha o odstranění „halo“ efektu kolem detailů předmětu (Georges Nomarski 1950)

Nomarského diferenční interferenční kontrast (DIC)

Rozdíl oproti klasickému SM:• vložení páru Wollastonových hranolů a páru zkřížených polarizátorů.Přednosti:• Kolem detailů předmětu není v obraze rušivá „aura“ jako u FK Při malých hloubkách ostrosti lze rozlišit stupňovité vrstvy ∼ nmChod paprsků: • Lineární polarizace světla polarizátorem• Chod paprsků dvojlomým děličem Wollastonova typu (směr polarizace svírá s optickými osami hranolu 450)• Druhý Wollastonův hranol, shodně orientovaný s prvním je umístěn v zadní ohniskové rovině objektivu

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/dic/light/index.html

Hoffmanův modulační kontrast (HMC)

Výhody oproti Nomarskému DIC – Robert Hoffman 1975• podobné zobrazení při nižší ceně doplňkových komponent• možnost pozorovat objekty i na dvojlomných podložkách (např. buněčné kultury v plastových kultivačních kyvetách)

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/hoffman/pathways/index.html

Fluorescenční mikroskopie – základyFluorescence – emise světla probíhající během absorpce energie excitačního světla (interval mezi absorpcí a emisí vyzářeného kvanta 10 -6 s.

Zdroj světla: nejčastěji vysokotlaké rtuťové (50–200 W) nebo xenonové výbojky (75–150 W)

Fluorescenční mikroskopie – realizace

Fluorescence v prošlém a odraženém světle

excitační filtr (propouští jen požadovanou λ přes preparát)

bariérový filtr (potlačení nebo absorpce excitační λ, propouští jen emisní λ na detektor)dichroické zrcadlo (filtr odrážející excitační λ a propouštějící emisní λ)

Laserová konfokální mikroskopie LSCM (základní idea z r. 1957 - Marvin Minski)

Laserová konfokální mikroskopieOdlišnosti konfokálního způsobu od klasického SM• osvětlen je jen jeden bod, signály od okolních bodů (vedle, pod a nad) jsou omezeny otvorem• režim: epi (reflexní) nebo fluo – (fluorescenční)• konfokální: kondenzor = objektiv (méně odrazů)• skenování: rozmítání laserového svazku, příčné posouvání vzorku před objektivem, případně posouvání objektivu nad vzorkem• konfokální obrazy jsou vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem (pro λ = 488 nm tloušťka = 0,4 µm)

Počítačová rekonstrukce obrazu:• zvýšení hloubky ostrosti skládáním obrazů,• skládání obrazů (otáčení obrazů), pronikání do hloubky vzorku,• stereoskopické obrázky, korekce pozadí atd.

http://www.olympusconfocal.tcom/java/confocalsimulator/index.html

Digitální holografická mikroskopie(DHM)

DHM vychází z principu holografického zobrazení, objeveného v roce 1948 Denisem Gáborem.

Metoda DHM vytváří v reálném čase 3D digitální obrazy preparátů užitím holografického principu. Hologramy jsou vytvářeny skládáním koherentní referenční vlny s vlnou odraženou od předmětu (je možné i nekoherentní osvětlení s vyloučením jevu koherenční zrnitosti)

Digitální holografická mikroskopie – realizace

DHM - reflexní režim DHM - transmisní režim

Digitální holografická mikroskopie – realizace

V DHM je interference vlny odražené od předmětu a referenční vlny zaznamenána CCD kamerou a přenesena do počítače, který provádí

numerickou rekonstrukci v reálném čase. Software DHM metody umožňuje výpočet obrazu jednotlivých hologramů (během několika mikrosekund) ze

souboru vlnoploch vycházejících z objektu

Digitální holografická mikroskopie – aplikaceDHM poskytuje následující informace:• Intenzitní obrazy poskytují stejný kontrast jako klasické optické mikroskopy,• Fázové obrazy poskytují kvantitativní data definovaná v sub-vlnové škále použitá pro přesná a stabilní měření,• V reflexním režimu fázové obrazy přímo odhalují topografii povrchu se sub-nanometrovým vertikálním rozlišením,• V transmisním (procházejícím) režimu odhaluje fázový obraz fázový posun vyvolaný průsvitným objektem (preparátem). Tenje závislý na jeho tloušťce a indexu lomu

Optická mikroskopie v blízkém poli(NSOM - Near–Field Scanning Optical Microscopy)

Oblast blízkého pole je definovaná jako oblast v okolí vzorku menším než je vlnová délka dopadajícího světla. V NSOM je tato vzdálenost v řádu několika nanometrů.Detekce světla z blízké oblasti se provádí za účelem dosažení optického

rozlišení lepšího než je difrakční limit (cca 250 nm)

1972 E. A. Ash and G. Nicholls, University College - London

Optická mikroskopie v blízkém poli(NSOM - Near–Field Scanning Optical Microscopy)

http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/nearfield/nsomscan/index.htmlt

Elektronová mikroskopie● Transmisní elektronová mikroskopie (TEM a

HRTEM)● Skenovací elektronová mikroskopie (SEM a

eSEM-“environmentální“ s volitelným vakuem)

Transmisní elektronový mikroskop

Urychlené elektrony jako vlna ve vakuu

h

Ef =

Pohybující se elektron o energii E a hybnosti p má podle Lui de Broglieho teorie vlnovou povahu; tedy chová se jako vlna o:

frekvenci a vlnové délce , kde h je Planckova konstanta

λ= hme v

Pro vlnovou délku elektronu odvodíme vztah

V praxi pro výpočet λ při známé hodnotě U [V]

Příklad:

U= 10 kV → λ = 0,01226 nmU= 100 kV → λ = 0,0037 nm

λ= h

2m0eU 1 eU

2m0 c2 ≃

h

2m0eU

λ=1,226

U[nm ]

Elektrony procházející preparátem

Atomy stejného druhu v různě orientované krystalické mříži(v případě levého obrázku, prochází elektrony snadněji)

Kontrast v obraze závisí mimo jiné na:• orientaci krystalů v látce,• na průměrném protonovém čísle atomů preparátu, • na hustotě látky (počtu atomů v krystalické mříži).

Pro transmitované elektrony: v případě obrázku vlevo bude obraz světlejší než v případě obrázku vpravo

Zviditelnění obrazu vytvořeného elektrony v TEM

přeměnou kinetické energie elektronů na světlo – pozorování, záznam

dopadem elektronů na fotografickou emulzi – záznam

Přeměna energie elektronů na světloPodobně jako v klasické TV obrazovce, elektrony bombardují stínítko opatřené luminoforem (fosfor, ZnS atd.)

V komoře TEM, v  její spodní části je oválné luminiscenční stínítko (fosfor – zelená fosforescence), na němž vzniká celkový obraz

Snímání obrazu speciální CCD kamerou - registrujeme změny intenzity jako ČB (šedotónový) obraz.

Digitální kamery pro elektronovou mikroskopii instalace na 35mm port

Morada (11 MPixelů)

MegaView III (6 MPixelů)

Parametry:• Rozlišení obrazu - 11 megapixelů • Velikost pixelu - 9.0 x 9.0 µm² • Kmitočet pixelu - až 25 MHz • Dynamický rozsah - 14 bitů • Instalace kamery - příruba na širokoúhlém portu • Připojení PC - technologie FireWireTM (IEEE 1394) • Spřažení kamery - s optickými čočkami Vnitřní přenosový čip s elektronickým přerušovačem umožňuje extrémně

krátké i extrémně dlouhé expoziční časy - 1 ms až 60 s. Morada dosahuje až 10 snímků za sekundu a frekvenci pixelu 24 MHz.

CCD čip je chlazený Peltierovým způsobem a vzduchem a je stabilizovaný při 15°C, poskytuje velmi vysoký poměr signál/šum. ●Morada používá nové speciálně vyvinuté scintilátory, optimalizované pro 100 a 200 keV. ●Kamera má video výstup 640×408 pixelů (50 Hz PAL, 60 Hz NTSC).

Digitální kamery pro elektronovou mikroskopii instalace pod projekční komoru

Černobílá CCD kamera s vysokým rozlišením instalovaná ve spodní části projekční komory mikroskopu v otse elektronového svazku.

• Uspořádání CCD čipu a účinného fosforového scintilátoru na principu optického vlákna. CCD typ: rychlost: 10 nebo 20 MegaPixel/s, dynamická plocha: 4096 odstínů šedi (12 bit), rozlišení: 1280×1024), • Expoziční čas: 100 µs - 160 s. Chlazení kamery Peltierem na teplotu 10 oC, chlazení je součástí dodávky. • Obrazová data jsou odesílána přes FireWireTM (IEEE1394), což eliminuje použití přídavného framegrabberu. • Použití pro biologické aplikace a pro materiálový výzkum s požadavkem na vysoké rozlišení. • Instalace: běžné transmisní mikroskopy FEI (Philips), LEO, Jeol

Konstrukce TEMČtyři základní stavební a funkční prvky elektronového mikroskopu: zdroj elektronů (elektronové dělo), elektromagnetické čočky, preparátový stolek (držák, goniometr), vakuový systém.

Elektronové dělo

Preparátová komůrka

Systém elektromagnetických čoček a clon

Luminiscenční stínítko

Konstrukce TEM – elektronové dělozdroj elektronů:termoemisní zdroj přímo (nepřímo)žhavená katoda (2700 oC – Wolframové vlákno – vydrží měsíc)

katoda LaB6

(2100 oC – hexaborid lanthanu – vydrží rok)

autoemisní (studený) zdroj (FEG) – vydrží několik let

Wehneltův válec (obklopuje katodu) – potenciál -100 V Křižiště (zdroj elektronů, podobně jako vlákno žárovky) s průměrem cca 50 µm Urychlovací napětí 100 až 300 kV (obvyklá hodnota TEM)

elektromagnetická čočka průběh magnetického pole (aberace) (solenoid)Pro ohniskovou vzdálenost elektromagnetické čočky přibližně platí:

Bz0 – magnetická indukce v místě z na oseVýhoda: možnost měnit ohniskovou vzdálenost elmag. čočky změnou proudu ve vinutí cívky

(solenoidu).Nevýhoda:Magnetické pole v dutině cívky (čočky) se mění (podle obrázku) a to vede k vadám

zobrazení (sférická vada, chromatická vada)

∫=2

1

).(..8

1 2z

z

zo dzzBUm

e

f

elektromagnetické čočkyKonstrukce TEM –

Konstrukce TEM – tubuskondenzor• fokusuje elektronové paprsky na preparát• promítá křižiště elektronové trysky na preparát • zajišťuje jeho homogenní a intenzivní ozáření)objektiv• je určen k tvorbě obrazu (faktor zvětšení 50–100×)

projektiv• je tvořen dalšími čočkami, které určují výsledné zvětšení TEM a „promítají“ obraz na stínítko

Součástí elektronoptického systému v tubusu jsou clony: • Clona kondenzoru odcloní mimoosové elektronové svazky• Aperturní clona (součást objektivu) určuje aperturu elektronového svazku „paprsků“

Konstrukce TEM – preparátová komůrka

Držák vzorku

1. Přesný a jemný posun (krok nm)2. Posun v osách x, y, z, 3. Rychlá výměna preparátu

Konstrukce TEM – vakuový systémEM potřebuje vakuum: • ve vzduchu je elektron absorbován, (dosah elektronového svazku EM ve vzduchu je max. 1 m)• elektronové dělo musí být izolováno vakuem (vzduch není dobrý izolant),• vzduch obsahuje molekuly O2, N2, CO2 a hydrokarbonáty, které způsobují kontaminaci tubusu a vzorku.

Vakuový systém EM je tvořen řadou ventilů spojených s vývěvami

Běžné hodnoty tlaku atmosférický tlak ≈ 0,1 MPa (105 Pa)

tlak v kosmickém prostoru ≈ 10-7 Pa

Vakuum v preparátové komůrce ≈ 10-5 Pa Vakuum v prostoru katody ≈ 10-5 Pa (pro LaB6), 10-7 Pa (FEG) Vakuum v prostoru stínítka ≈ 10-3 Pa (je zde film pro záznam obrazu)

Konstrukce TEM – vakuový systém

Schema vakuového systému moderního TEM

3 oddělené vakuované komory 1. prostor katody2. prostor preparátu3. projekční komoraTypy vývěv:• rotační vývěva (předvakuum)• difúzní olejová vývěva• iontová (Ti – sublimační, 100 litrů/s)• turbomolekulárníMěření vakua: měrkami Piraniho typuCyklus vzduchem uzavíratelných ventilů

(čerpání rotačními vývěvami cca 30 s.)Čerpání preparátové komory s výměnou

vzorku trvá několik minut.Pro kryoaplikace (biologické vzorky) je nutné

odstranit usazování ledu na povrchu vzorku (kryostat s LN2)

Základní pracovní režimy TEM

Světlé a temné pole

Difrakce

TEM vysokého rozlišení

TEM Tomografie

Rentgenová mikroanalýza

Metoda světlého a tmavého poleSvětlé pole - standardní režim zobrazenírovina preparátuNa tvorbě obrazu se podílí paprsky přímo procházející preparátem,

boční difrakční maxima jsou zachycena aperturní clonou.aperturní clona (v obrazové ohniskové rovině objektivu) (obvykle 4 – 8 průměrů AC)

Obraz světlého pole krystalu MnO(krystaly leží na tenké C vrstvě na měděné síťce)

Temné polevysunutím AC excentricky mimo osu, necháme procházet

preparátem pouze paprsky 1. difrakčního maxima.Použití pro zvýšení kontrastu krystalických materiálů

TEM jako difraktograf

Příklad: dva typy elementárních buněk dvě roviny (vzdálenost rovin 1/2 délky elementární buňky) čtyři roviny (1/4 el. buňky)

Pro horizontální směr:

Pro dvě roviny – reciproká vzdálenost = 2 (dva body ve dvojnásobné vzdálenosti od středu), Pro čtyři roviny – reciproká vzdálenost = 4 (čtyřnásobná vzdálenost od středu) Při započítání ostatních směrů dostaneme 3D síť mřížových bodů

1. pro identifikaci krystalů,2. pro stanovení orientace krystalu.Difrakční obrazec vzniká v obrazové ohniskové rovině objektivu (podobnost se SM) projektiv je pro sledování obrazu zaostřen na rovinu obrazu vytvořeného objektivem. Pro studium difraktogramů je nutné přeostřit Pr na OOR.

Difraktogram Si difraktogram Si3 (hexagonální symetrie)

Elektronová mikroskopie s vysokým rozlišením – HRTEM

Splnění několika podmínek:1. náklon vzorku tak, aby umožnil průchod elektronového svazku podél

uspořádaných atomů (viz. obrázek atomů v mřížce),2. použití apertury s velmi malým průměrem pro dosažení úzkého

elektronového paprsku,3. zpravidla se používá vyšší urychlovací napětí (nad 300 kV).

TEM obraz atomů Si s vysokým rozlišenímvzdálenost mezi atomy (bližšími) 0,14 nmskutečná struktura (vlevo nahoře)

Azbestová vlákna na síťce struktura azbestu s vysokýtm rozlišením

HRTEM (High Resolution Transmission Electron Microscopy)

TEM tomografieCo je třeba k získání 3D informace?

Každý obrázek je 2D projekcí z 3D objektu

Jak získat 3D informaci v TEM?● Stereo zobrazování (TEM)

● Dva stejné obrázky získané při různých náklonech dávají stereo obraz● Nevýhoda je omezená hloubka ostrosti

● Série řezů (TEM)● Sestavení 3D obrazu ze série řezů jejich složením● Nevýhoda: značná doba pořízení dílčích řezů a jejich analýza. Dochází ke

ztrátě obrazových dat

● Tomografie (TEM)● Získání série obrazových dat z náklonu vzorku a jejich 3D softwarová

rekonstrukce ● Výhoda: + rychlost (limitovaná rychlostí zpracování dat v PC

+ obraz s vysokým rozlišením (5 nm)

TEM tomografie – princip

Automatizovaný Automatizovaný sběr datsběr dat

Objemová Objemová rekonstrukce rekonstrukce

obrazuobrazu

Vizualizace Vizualizace

‘3D

TEM tomografie – princip

Pořízení obrazů při náklonu

Seřazení projekcí

Rekonstrukce

Vizualizace a analýza

TEM tomografie – princip Pořízení obrazů při náklonu

Seřazení projekcí

Rekonstrukce

Vizualizace a analýza obrazu

TEM tomografie – princip Pořízení obrazů při náklonu

Seřazení projekcí

Rekonstrukce

Vizualizace a analýza obrazu

TEM tomografie – princip● Plně automatizovaný

sběr dat

30–60 min.● Rekonstrukce 10 min.● Objemové rozpoznání

90 min.

BaBakkteriteriee(Movie 9 sec.)

Courtesy: Dr. Kobayashi, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Osaka, Japan

Příprava preparátů pro TEMHlavní cíl:Získat morfologickou informaci (reprodukovatelným způsobem) se snahou

potlačit jakékoliv artefakty preparátu.Tenká transparentní fólie – pro zachycení ultratenkých řezů tkání nebo suspenze částicuhlíková fólie – 20 až 50 nm, plastická fólie (Formvar ředěný v etylendichloridu <0,5%) – 20 nmPodmínka: stabilita při prozařování elektrony, nízká zrnitost, kontrast porovnatelný se vzorkem.Příprava plastické fólie je snadnější než čisté C vrstvy (pro HRTEM je vhodnější

C fólie)Síťka pro TEM

– pevná podpora pro fólie (řezy) vyrobená z Cu

(antiferomagnetikum)

Označení MESH

Mesh 100 (100 čar/palec) Mesh 400

Příprava preparátů pro TEMPostup nanesení fólie na síťkua – sklíčko ponořit do roztoku s Formvaremb – vysušení v bezprašném prostředíc – fólie splavená na hladinu vodyd – síťka na proužku papíru pod fólii

Příprava uhlíkové fólie

Příprava preparátů pro TEMUltratenké řezy

Vrstvou o tloušťce 100 nm (biologický preparát o = 1 g.cm-3) prochází 50 % elektronů při UN = 50 kV není možné pozorovat celé buňky. Obvyklá tloušťka tenkého řezu 50 nm.

Pro řezání musí být tkáň speciálně připravena: odběr tkáně (krájení v kapce fixáže na polyetylénu) nebo buněk (přímo do fixativa) fixace odvodnění kontrastování zalití do bločků krájení

Zalévání vzorku do bločkuUltratenké řezy

Vlastnosti ideální zalévací hmoty (Durcupan, Vestopal, …): rozpustnost v etanolu nebo acetonu před polymerizací, neovlivňuje chemicky vzorek, nezpůsobuje pnutí ve vzorku, homogenně tuhá, ale dostatečně plastická, stabilní při ozařování elektronovým paprskem.Bloček tkáně je párátkem přenesen na dno želatinové kapsle a zalit zalévací hmotou.

Ořezání bločku do tvaru komolého jehlanu

Ploška by měla mít velikost 0,5 mm

Ultramikrotomie

Stínování těžkými kovyZvýraznění povrchové topografie odpařováním kovu ze strany

latexové kuličky (0,3 µm)

stínované a) Au b) Au–Pd

Kovy používané na stínování: vysoká hustota, inertnost vzhledem k chemickým vlivům a teplotě, Au, Pd, Cr, Ni, Ge, Pt, U. Cr pod 5 nm vykazuje granularitu. Slitina Pt-Pd (3:1) je vhodnější než čistá platina. Slitina dává tloušťku 0,3–1,5 nm.

ReplikyVzorky silnější než 0,1 µm nemohou být studovány

v TEM (rozptyl, absorpce).Metoda povrchových replik spočívá v otisku

povrchu do tenkého filmu transparentního pro elektrony (C, Formvar atd.).

Tloušťka repliky je cca 20 nm. Z důvodu malého kontrastu je dodatečně stínována.

Způsob vytváření replik:a - rozpuštěním vzorkub - odtržením z povrchu a odstraněním pásky

Negativní replika

Nanesení plastického (nebo C) filmu, sloupnutí (obtížné), stínování

Pozitivní replikapostup přípravy pozitivní repliky

Metody mrazového sušení, lomu a odpařování (Freeze Drying/ Fracturing/ Etching)

Freeze dryingzmražení v LN2

sublimace ledu ve vakuuporovnání sušení na vzduchu a metodou

Freeze–Drying(zabrání se agregaci částic)

Při mrazovém sušení buněk může být jako mezistupeň zařazeno nanesení uhlíkového filmu pro dosažení lepšího kontrastu

Freeze fracturing (etching)Metody umožňují zkoumání objektů ve zmraženém stavu. Odpadá fixace

chemickými činidly (a tedy možných chemických reakcí se vzorkem). Rozlišení je dáno zrnitostí nanášeného kovu, z něhož je vyrobena replika.

Freezing Kousek tkáně (buněčné suspenze) je rychle zmražen (LN2) a přenesen do vakuovaného prostoru s nízkou teplotou.

Fracturing Zmrzlá tkáň je zchlazeným nožem obnažena (zlomena) a dochází k sublimaci ledu z povrchu (-90 oC) do hloubky 10 – 30 nm.Vytvoří se reliéf povrchu. Povrchová topografie kopíruje buněčné membrány a organely. Povrch se bezprostředně stínuje kovem a nanáší se C film pro vytvoření repliky.

Postup:a. izolace tkáněb. zmraženíc. mrazový lomd. sublimace ledue. stínování a

příprava replikyf. čištění repliky

Trasnmisní elektronový mikroskopJEM 2010 (JEOL) Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) je

zobrazovací technikou využívající průchodu urychlených elektronů vzorkem a jeho zobrazení na fluorescenčním stínítku nebo záznamu na film nebo speciální CCD kameru. Podle zvoleného urychlovacího napětí je možné měřit velikosti nanočástic do 0,1 nm.

Aplikace: stanovení velikosti a distribuce částic,

morfologie nanočástic, chemického složení, krystalické struktury.

Rozlišovací mez 0.194 nm

Urychlovací napětí: 80–200 kV

Zvětšení: 50–1,500 000×

Závěr

http://atmilab.upol.czhttp://nanocentrum.upol.cz