Moleculaire karakterisering van methicilline resistente

0

Moleculaire karakterisering van methicilline resistente

Staphylococcus aureus isolaten afkomstig van

varkensvlees

Kaat LUYCKX

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master in de Biochemie en de Biotechnologie,

Major Microbiële Biotechnologie

Academiejaar 2011-2012

Promotor: Prof. dr. Peter Vandamme

Vakgroep Biochemie en Microbiologie

Laboratorium voor Microbiologie

Promotor: Prof. dr. Marc Heyndrickx

Wetenschappelijk begeleiders: Dr. Geertrui Rasschaert en Lic. Marijke Verhegghe

ILVO – Departement Technologie en Voeding – Voedselveiligheid

Moleculaire karakterisering van methicilline resistente

Staphylococcus aureus isolaten afkomstig van

varkensvlees

Kaat LUYCKX

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master in de Biochemie en de Biotechnologie,

Major Microbiële Biotechnologie

Academiejaar 2011-2012

Promotor: Prof. dr. Peter Vandamme

Vakgroep Biochemie en Microbiologie

Laboratorium voor Microbiologie

Promotor: Prof. dr. Marc Heyndrickx

Wetenschappelijk begeleiders: Dr. Geertrui Rasschaert en Lic. Marijke Verhegghe

ILVO – Departement Technologie en Voeding – Voedselveiligheid

Dankwoord

Graag wil ik alle mensen bedanken die rechtstreeks en onrechtstreeks geholpen hebben aan

het tot stand komen van deze thesis.

Allereerst wil ik Prof. dr. Marc Heyndrickx bedanken die het mogelijk heeft gemaakt mijn

thesis uit te voeren in het microbiologie-labo van het ILVO – Departement Technologie en

Voeding – Voedselveiligheid.

Ik wil Prof. dr. Peter Vandamme zeker niet vergeten bedanken. Dankzij zijn lessen heeft hij

mijn interesse voor microbiologie opgewekt.

Daarnaast zou ik graag Dr. Geertrui Rasschaert bedanken voor haar uitstekende begeleiding

tijdens het schrijven van mijn masterproef.

In het bijzonder wil ik Marijke Verhegghe vermelden. Zij stond mij elke dag bij met raad en

daad. Bedankt voor alle moeite en tijd dat je geïnvesteerd hebt in mijn thesis! Je was een

fantastische begeleidster!

Mijn dank gaat ook uit naar alle collega’s en mede-stagiairs voor de toffe werksfeer!

Ik wil ook graag mijn vrienden alias “vriendschap” en klasgenootjes bedanken: Merci voor

alles!

Gerrit: bedankt voor jouw onuitputtelijke steun en liefde!

Tenslotte ben ik vooral mijn ouders dankbaar: jullie hebben alles mogelijk gemaakt voor mij!

Bedankt!

i

Inhoudsopgave

Dankwoord.................................................................................................................................................................... i

Inhoudstafel ................................................................................................................................................................ ii

Lijst van afkortingen .............................................................................................................................................. iv

Samenvatting ............................................................................................................................................................ vi

Summary .................................................................................................................................................................... vii

I. INLEIDING ............................................................................................................................................ 1

1.1 STAPHYLOCOCCUS .............................................................................................................................. 1

1.2 STAPHYLOCOCCUS AUREUS ................................................................................................................ 2

1.3 DE EVOLUTIE TOT MRSA ..................................................................................................................... 3

1.3.1 Penicilline resistente Staphylococcus aureus ................................................................................... 3 1.3.2 Methicilline resistente Staphylococcus aureus................................................................................. 5

1.4 DE VERSCHILLENDE MRSA TYPES ........................................................................................................ 6

1.4.1 Ziekenhuisgebonden MRSA ...................................................................................................................... 6 1.4.2 Gemeenschapsgebonden MRSA .............................................................................................................. 6 1.4.3 Diergebonden MRSA ................................................................................................................................... 7

1.5 IMPLICATIES OP DE VOLKSGEZONDHEID ............................................................................................ 8

1.6 MOLECULAIRE TECHNIEKEN ............................................................................................................. 10

1.6.1 Multi-Locus Sequentie Typering (MLST) ......................................................................................... 10 1.6.2 Spa typering ................................................................................................................................................ 10 1.6.3 SCCmec typering ....................................................................................................................................... 11 1.6.4 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) .............................................................................................. 12 1.6.5 Multi-Locus Variable numer tandem repeat Analyse (MLVA) ................................................ 12

1.7 ANTIBIOTICA-RESISTENTIEBEPALING ................................................................................................ 13

II. PROBLEEM- EN DOELSTELLING ................................................................................................... 14

III. RESULTATEN .................................................................................................................................. 16

3.1 AFLEZEN VAN DE MRSA EN SA-ID PLATEN ........................................................................................ 16

3.1.1 Rechtstreekse isolaties ............................................................................................................................ 16 3.1.2 Isolaties na aanrijking ............................................................................................................................ 19

3.1.3 Overzicht van de MRSA positieve stalen .......................................................................................... 20

3.2 MRSA ST398 SPECIFIEKE PCR ............................................................................................................ 21

3.3 MOLECULAIRE TYPERING VAN DE STAMMEN .................................................................................. 22

3.3.1 Spa typering ................................................................................................................................................ 22 3.3.2 SCCmec typering ....................................................................................................................................... 22 3.3.3 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) .............................................................................................. 22 3.3.4 Multi-Locus Variable numer tandem repeat Analyse (MLVA) ................................................ 23

3.4 ANTIBIOGRAMMEN .......................................................................................................................... 27

IV. DISCUSSIE EN CONCLUSIE ............................................................................................................ 33

4.1 PREVALENTIE VAN MSSA EN MRSA OP VARKENSVLEES ................................................................... 33

4.2 TYPERINGEN VAN DE MSSA EN MRSA ISOLATEN ............................................................................. 34

4.3 ANTIBIOTICA RESISTENTIEBEPALING ................................................................................................ 36

4.4. CONCLUSIE ....................................................................................................................................... 37

ii

V. MATERIAAL EN METHODEN ......................................................................................................... 38

5.1 VLEESSTALEN .................................................................................................................................... 38

5.2 HET VERWERKEN VAN DE VLEESSTALEN .......................................................................................... 38

5.3 AFLEZEN EN UITZUIVEREN VAN DE SA-ID EN MRSA-ID PLATEN ....................................................... 40

5.3.1 Rechtstreekse uitplaten van de stalen .............................................................................................. 40 5.3.2 Uitplaten van de stalen na aanrijking ............................................................................................. 40 5.3.2 CBA en BP platen....................................................................................................................................... 41

5.4 IDENTIFICATIE VAN DE MRSA ISOLATEN ........................................................................................... 41

5.4.1 DNA extractie ............................................................................................................................................. 41 5.4.2 Triplex PCR .................................................................................................................................................. 41 5.4.3 Agarosegelelektroforese ........................................................................................................................ 42 5.4.4 MRSA ST398 specifieke PCR ................................................................................................................. 42

5.5 HET BESTUDEREN VAN LANGE TERMIJN EVOLUTIES ........................................................................ 43

5.5.1 Spa typering ................................................................................................................................................ 43 5.5.2 SCCmec typering ....................................................................................................................................... 43 5.5.3 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) .............................................................................................. 46

5.6 HET BESTUDEREN VAN KORTE TERMIJN EVOLUTIES: MULTI-LOCUS VARIABLE NUMER TANDEM

REPEAT ANALYSE (MLVA)........................................................................................................................ 47

5.7 ANTIBIOTICA RESISTENTIEBEPALING ................................................................................................ 49

ADDENDUM .......................................................................................................................................... 50

A.1. RESULTATEN .................................................................................................................................... 50

A.2 VERWERKING VLEESSTALEN ............................................................................................................. 61

A.3 DNA EXTRACTIE ................................................................................................................................ 64

A.4 TRIPLEX PCR ...................................................................................................................................... 65

A.5 CC398 PCR ........................................................................................................................................ 67

A.6 SCCMEC TYPERING............................................................................................................................ 68

A.7 PULSED FIELD GEL ELEKTROFORESE (PFGE) VOOR 10 PLUGS ........................................................... 71

A.8 MULTI-LOCUS VARIABLE NUMER TANDEM REPEAT ANALYSE (MLVA) ............................................ 74

A.9 ANTIBIOGRAMMEN .......................................................................................................................... 75

REFERENTIES ....................................................................................................................................... 77

iii

Lijst van afkortingen ArcC Carbamaat kinase

AroE Shikimaat dehydrogenase

BHI Brain/ Heart Infusion

BlaZ Gen coderend voor een β-lactamase

Bp Basenparen

BP Baird parker

BstZI Bacillus stearothermophilus

BURST Based upon related sequence types

CA-MRSA Community-acquired MRSA

CBA Columbia base blood agar

CC Clonaal complex

Ccr Chromosome recombinase-genen

CIP Ciprofloxacine

Clf Clumpingfactor

CLR Chloramphenicol

CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute

Coa-gen Coagulase gen

DLV Dubbel locus variant

dNTP Deoxyribonucleotide trifosfaat

ERYTR Erythromycin

EUCAST European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing

6-FAM 6-Carboxyfluorescein

FAVV Federaal Agentschap voor de veiligheid van de voedselketen

GC Guanine-cytosine

GEN Gentamicine

Gglp Glycerol kinase

Gmk Guanylaat kinase

GW grootwarenhuis

HA-MRSA Hospital-acquired MRSA

ISS Integration site sequence

J-regio Junkyard-Joining region

KANAM Kanamycine

Kb Kilobasenparen

Kve Kolonievormende eenheden

LA-MRSA Livestock-associated MRSA

LINCO Lincomycine

LINEZ Linezolid

LPS Lipopolysacharide laag

MecA Methicilline resistentiegen

MecI Gen coderend voor mecA repressor eiwit

MecR Gen coderend voor signaaltransductie eiwit dat de aanwezigheid van β-lactam

antibiotica kan detecteren

MHA Mueller hinton agar

MHB Mueller hinton broth

MIC Minimale inhibitorische concentratie

MLST Multi-Locus Sequence Typing

MRSA Methicilline resistente S. aureus

iv

MSSA Methicilline sensitieve S. aureus

MUPIR Mupirocine

NA Niet aanwezig

NB Niet bepaald

NT Niet typeerbaar

NT ST398 Niet ST398

Nuc Nuclease gen

PBP Penicilline bindende proteïne

PBP2a of PBP2’ Gemodificeerd penicilline bindende protein 2a

PCR Polymerase ketting reactie

PFGE Pulsed Field Gel Elektroforese

Pta Fosfaat acetyltransferase

RIFAM Rifampicine

Rpm Revolution per minute

SA Staphylococcus aureus

S. aureus Staphylococcus aureus

SCCmec Staphylococcale-cassettechromosoom mec

Sdr SD repeat

SDS Natriumdodecylsulfaat

SIRU21 Staphylococcal interspersed repeat unit 21

SL Slager

SLV Single locus variant

SmaI Serratia marescens

Spa Staphylococcus proteïne A

ST Sequentie type

SULFA Sulphonamides

SYN Quinupristine/daflopristine

TET Tetracycline

TOBRA Tobramycine

Tpi Triosefosfaat isomerase

TRIME Trimethoprim

TSA Tryptone Soya Agar

TSB Tryptone Soya broth

TSS Toxisch schock syndroom

TYLOS Tylosine

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean

VNTR Variabel number tandem repeats

XbaI Xanthomonas badrii

YqiL Acetyl coenzym A acetyltransferase

v

Samenvatting

Methicilline resistente Staphylococcus aureus (MRSA) vormt reeds jarenlang een probleem

in ziekenhuizen en in de gemeenschap. In 2004 werd een derde MRSA type geïsoleerd bij

dieren en dan vooral bij varkens. Dit diergebonden MRSA of MRSA type ST398 zorgt voor

heel wat onrust, daar het niet alleen bij varkens en andere dieren teruggevonden wordt

maar ook bij varkenshouders, hun gezinsleden, dierenartsen en occassioneel bij

ziekenhuispatiënten. Aangezien varkens nutsdieren zijn, deed dit allerlei vragen oproepen

omtrent de aanwezigheid van MRSA ST398 op het varkensvlees en de mogelijke verspreiding

ervan onder mensen. Deze thesis kadert in een IWT project waarbij het voorkomen van

MRSA ST398 onderzocht wordt doorheen de varkensproductieketen. Zo werden er stalen

genomen op boerderijen, in slachthuizen, grootwarenhuizen en bij slagers. De focus van

deze thesis ligt bij het bepalen van het percentage methicilline sensitieve Staphylococcus

aureus (MSSA) en MRSA aanwezig op varkensvlees, verkrijgbaar in grootwarenhuizen (A en

B) en bij slagers (C en D). Hiervoor werden er wekelijks vleesstalen aangekocht bij

verschillende slagers en grootwarenhuizen (n=137). Er werd eveneens nagegaan of de

gevonden MRSA isolaten van humane of dierlijke (ST398) afkomst waren. Tevens werden de

mogelijke genetische verwantschappen tussen de verschillende gevonden humane en

diergebonden MRSA isolaten onderzocht door middel van spa-typering, SCCmec typering en

Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE). Korte termijn evoluties werden onderzocht door

middel van Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis (MLVA). Ten slotte

werden er antibioticaprofielen opgesteld om na te gaan tegen welke antibiotica de isolaten

resistent waren.

Bij vijf vleesstalen (4%) werd er rechtstreeks S. aureus teruggevonden. De teruggevonden

aantallen voldeden aan de criteria opgesteld door het Federaal Agentschap voor de veiligheid

van de voedselketen (FAVV). Er werd bij 13 stalen (9%) rechtstreeks MRSA gevonden, waarvan

de stalen voornamelijk poten en oren waren. Aangezien poten en oren weinig

geconsumeerd worden, vormden deze vleesstalen weinig tot geen direct gevaar voor de

volksgezondheid. Tevens werd nagegaan of de MRSA isolaten tot het nieuwe diergebonden

MRSA type, ST398, behoorden. Hieruit bleek dat 97% van de isolaten, MRSA ST398 waren.

Bij deze isolaten werden drie SCCmec types gevonden: SCCmec cassette V (77%), cassette

IVa (18%) en cassette IVc (1%). Daarnaast werd een spa typering uitgevoerd op een selectie

van de MSSA en MRSA (ST398) isolaten. De meeste (71%) isolaten behoorden tot spa type

t011. Daarnaast werden volgende types teruggevonden: t008, t034, t2370, t091 en t127.

Vervolgens werd een typering uitgevoerd door middel van PFGE op een selectie van de

isolaten en MLVA op alle MSSA en MRSA isolaten. Bij beide typeringsmethodes werden veel

profielen teruggevonden. Ten slotte werd de antibiotica resistentie onderzocht bij de MSSA

en MRSA (ST398) isolaten. Enkele isolaten waren resistent tegen geneesmiddelen (fucidine,

chloramfenicol en quino/dalfopristine) die uitsluitend gebruikt worden in de humane

geneeskunde. De MRSA ST398 isolaten waren grotendeels resistent aan tetracycline (97%)

en trimethoprim (78%), beide vaak gebruikt in de veeteelt. Binnen de vier slagerijen werden

veel verschillende genotypes en antibiotypes gevonden, wat deed vermoeden dat de MRSA

op de vleeswaren afkomstig zijn van meerdere contaminatiebronnen.

vi

Summary During the last 50 years methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) has caused major

problems in hospitals and in the community. In 2004, a third type has been isolated in

pigfarmers and pigs. To date, this livestock-associated MRSA or MRSA type ST398 was also

found in other livestock animals, people working with these animals and hospital patients.

Questions arose about the possible spread of this type from livestock animals to the general

human population. The present study was a part of an IWT-project, during which the

presence of MRSA ST398 was examined throughout the pig-food chain by sampling pig

farms, slaughterhouses, supermarkets and butchers. The main goal of this study was to

examine the potential carryover from live animals to meat and to estimate the methicilline

sensitive Staphylococcus aureus and MRSA percentage, present on pig meat. To determine

the origin of the retrieved isolates, a molecular typing occurred on the obtained isolates.

During six weeks, six pig meat samples (roast meat, chopped meat, bacon, ribs, feet and

ears) were purchased weekly in two supermarkets (A en B) and the butcher shops (C en D),

with a total of 137 samples. The obtained isolates were screened for the presence of ST398

and subsequently spa-typing, SCCmec typing, Pulsed Field Gel Electrophorese (PFGE) and

Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis (MLVA) were used. Finally, the

isolates’ susceptibility to 16 antibiotics was determined.

Five (4%) and 13 (9%) meat samples tested positive for S. aureus and MRSA, respectively.

The number of colony forming units were beneath the indicated limit of the Federal Agency

for food safety (FAVV). The contamination rates were highest on feet and ears, but due to the

the fact that these amples are not bought a lot, the risk of colonization is considered very

low. The majority (97%) of the MRSA isolates belonged to MRSA ST398. These isolates

carries three types of SCCmec types: SCCmec cassette V (77%), cassette IVa (18%) and

cassette IVc (1%). The remaining SCCmec types were non-typeable. Spa typing revealed the

presence of six spa types (t001, t008, t034, t2370, t091 and t127) of which too1

predominated (77%). When using both PFGE and MLVA, a variety in profiles was observed.

Most of the MRSA ST398 isolates were resistant against tetracyclin (97%) and trimethoprim

(78%), both commonly used in animal husbandry. Few isolates were resistant to drugs

(fucidin, chloramphenicol and Quino/dalfopristin) which are exclusively used in human

medicine. In conclusion, the variation of genotypes and antibiotypes within the four

butcheries and over time suggests that the MRSA isolates on the meat orginated from

multiple contamination sources. But the contamination risk to the general human

population appears low.

I. INLEIDING

1

I. Inleiding 1.1 Staphylococcus Staphylococcus is één van de genera van de familie Staphylococcaceae, bestaande uit gram-

positieve cocci. De naam Staphylococcus is afgeleid van het Griekse woord staphyle dat

“trosje” betekent en verwijst naar de clusters die deze ronde bacteriën of “kokken” vormen

(Fig 1.1).

Figuur 1.1: Clustervorming bij Staphylococcus aureus. Deze foto is genomen door middel van een

elektronenmicroscoop scanning (http://phil.cdc.gov/phil/home.asp).

Staphylococci zijn facultatief aerobe, chemo-organotrofe, asporogene, niet-mobiele,

catalase-positieve en vaak halo-tolerante bacteriën met een GC-waarde van ongeveer

30-40% (Brock, 2007). Bovendien zijn ze resistent aan dehydratatie waardoor ze

maandenlang in lucht, grond en water kunnen overleven (Kluytmans, 2010). Naast de

omgeving komen ze ook voor op de huid, de huidklieren, de slijmvliezen, de pharynx, de

mond, het bloed, de faeces enzovoort van hun gastheren (mensen en warmbloedige dieren).

Traditioneel werd het genus onderverdeeld in twee groepen, afhankelijk van de aan- of

afwezigheid van het coagulase-gen (coa-gen): coagulase positieve Staphylococci

(bijvoorbeeld S. aureus, een geel gepigmenteerde species) en coagulase negatieve

Staphylococci (bijvoorbeeld S. epidermidis, een niet gepigmenteerd species).

Het coa-gen draagt bij tot de pathogeniciteit van de bacterie en codeert voor een

extracellulair eiwit, het coagulase. Coagulase bindt en activeert protrombine, een

enzymprecursor van de gastheer, en vormt het staphylotrombine complex. De protease

activiteit van trombine leidt tot de conversie van fibrinogeen naar fibrine, het

basisbestanddeel van bloedstolsel (Friedrich et al, 2003). De accumulatie van fibrine rond de

bacteriële cellen geeft bescherming tegen een mogelijke immuunrespons van de gastheer.

De meest geïsoleerde pathogenen van het genus zijn Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis en Staphylococcus saprophyticus (Brock, 2007).

I. INLEIDING

2

1.2 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus is een belangrijke opportunistische pathogeen van zowel mens als

dier en werd voor het eerst beschreven rond 1880 door Alexander Ogston (Deurenberg &

Stobberingh, 2008). Ongeveer één derde van de bevolking is asymptomatische drager van

deze bacterie op de huid, in de neus en/of in de mond. Staphylococcus aureus zal pas

infecties veroorzaken wanneer de bacterie open wonden of zweren gaat koloniseren. Dit kan

dan leiden tot milde huidinfecties en abcessen maar ook tot levensgevaarlijke ziektes zoals

pneumonie, septicemie en osteomyelitis (Haesebrouck et al, 2006; Nunan & Young, 2007).

Dit levensgevaar doet zich vooral voor wanneer de bacterie wonden gaat koloniseren van

immunogecompromitteerde mensen (Nunan & Young, 2007).

De virulentie van S. aureus is een complex proces dat gecoördineerd wordt door

verschillende genproducten zoals oppervlakte-eiwitten, toxines en gesecreteerde

exoproteïnen (zoals het eerder vernoemde coagulase).

Een groep van oppervlakte-eiwitten zijn adhesines, die interageren met weefsels,

serumeiwitten en/of polypeptiden (bijvoorbeeld laminine en fibronectine) van de

extracellulaire matrix van de gastheer. Zo zijn er de clumpingfactoren (Clf) A en B die

fibrinogeen, de bloedplaatjes en beschadigd epithelium kunnen binden. Naast adhesines

codeert het genoom van S. aureus ook voor andere oppervlakte-eiwitten, zoals bijvoorbeeld

Staphylococcus proteïne A (Spa), die kunnen interfereren met het defensiemechanisme van

de gastheer. Spa biedt bescherming aan S. aureus tegen antilichamen door te binden aan het

Fc-fragment van immunoglobulines, wat opsonisatie en fagocytose inhibeert. Na het binden

van de gastheercellen en het onderdrukken van het immuunsysteem kan de bacterie zich

vermenigvuldigen en de infectieplaats koloniseren.

Na adhesie en kolonisatie gaat de pathogeen de weefsels binnendringen, beschadigen en zo

de infectie verspreiden. Verscheidene toxines zijn in dit proces betrokken zoals hemolysines

(die de membraan van erythrocyten beschadigen en zo hemolyse veroorzaken) en

leukocidines (die de membraan van leukocyten beschadigen). Deze toxines zorgen

hoogstwaarschijnlijk voor de symptomen die gepaard gaan met de infectie.

Verder codeert het genoom van S. aureus voor exoproteïnen zoals coagulase en

staphylokinase. Staphylokinase is een plasminogeen activator dat zorgt voor de vorming van

plasmine. Deze heeft een proteolytische activiteit en breekt fibrineklonters af. Fibrinolyse

zou helpen bij de verspreiding van de bacterie (Daum & Spellberg, 2012; Foster, 1996).

Tevens kan S. aureus voedselvergiftigingen veroorzaken door de productie van

enterotoxines (Nunan & Young, 2007). Enterotoxines zijn kleine gesecreteerde eiwitten die

vaak hitte stabiel zijn en resistent zijn tegen proteolytische enzymen. Hierdoor behouden

deze toxines hun activiteit na ingestie (Foster, 1996). Naast voedselvergiftiging kunnen

enterotoxines ook het toxisch shock syndroom (TSS) veroorzaken. TSS komt voor wanneer

het toxine systemisch wordt uitgedrukt en leidt tot een polyclonale T cel activatie. Dit zorgt

vervolgens tot een storm van cytokine-aanmaak en bijgevolg systemische infecties.

I. INLEIDING

3

1.3 De evolutie tot MRSA 1.3.1 Penicilline resistente Staphylococcus aureus

In 1929 heeft Alexander Fleming penicilline per toeval ontdekt. Cultuurplaten geïnoculeerd

met Staphylococcus varianten waren accidenteel gecontamineerd met een fungus, die de

groei van deze Staphylococcus kolonies inhibeerde. Uit verder onderzoek door Fleming bleek

dat deze schimmel een Penicillum species was en een bacteriolytische component, namelijk

penicilline, produceerde (Fleming, 1929) (Fig. 1.2). In 1939 vonden Ernst Chain en Howard

Florey een manier om penicilline te isoleren en gebruikten ze dit antibioticum om bacteriële

infecties te behandelen (Sulek, 1968).

Figuur 1.2: Structuurformule van Penicilline (Solomon & Donnenfeld, 1986).

Penicilline behoort tot de β-lactam antibiotica, die de celwandproductie van voornamelijk

gram-positieve bacteriën verhinderen. Gram-negatieve bacteriën zijn impermeabel voor het

antibioticum. Dit komt omdat de celwandstructuur van gram-positieve en gram-negatieve

bacteriën verschillend is. De celwanden van gram-positieve bacteriën bevatten een dikke

peptidoglycaanlaag. Bij de gram-negatieve bacteriën hebben de celwanden een complexere

structuur door de aanwezigheid van een buitenste membraan bestaande uit fosfolipiden,

eiwitten en polysachariden. Deze buitenste hydrofobe laag wordt ook de lipopolysachariden

laag (LPS) genoemd (Brock, 2007).

β-lactam antibiotica bevatten een typische β-lactam ring (Fig. 1.3). Deze antibiotica binden

transpeptidasen die instaan voor de aanmaak van de bacteriële celwand [zoals bijvoorbeeld

penicilline bindende proteïnen (PBP)]. Hierdoor kan de transpeptidase reactie niet doorgaan

en gebeurt er geen cross-linking van peptidoglycaan ketens. Dit zorgt ervoor dat de nieuw

gesynthetiseerde celwand zijn sterkte verliest. Bovendien kan het antibiotica-transpeptidase

complex de productie van autolysines stimuleren die de reeds verzwakte celwand verder

afbreken. Tot slot zal het osmotische verschil tussen het milieu binnen en buiten de cel

leiden tot celdood (Brock, 2007).

Figuur 1.3: β-lactam ring structuur. (http://flashcarddb.com/cardset/140084-antibacs-i-anaerobes-oppor-

infections-flashcards)

I. INLEIDING

4

In 1942 werd de eerste penicilline resistente S. aureus stam beschreven door Rammelkamp

en Maxon (Rammelkamp & Maxon, 1942). Resistente stammen hebben het resistentiegen

BlaZ, dat codeert voor een β-lactamase. Dit enzym verhindert de werking van penicilline

door de β-lactam ring open te breken (Nunan & Young, 2007). Door het veelvoudig gebruik

van β-lactam antibiotica in de ziekenhuizen, stierven gevoelige bacteriën af en werd de

overleving van resistente bacteriën in de hand gewerkt. In 1950 kwamen penicilline

resistente stammen overal ter wereld voor in ziekenhuizen. Tot dan toe waren de S. aureus

isolaten, afkomstig van de gemeenschap, nog gevoelig aan penicilline. Hierdoor bleef men

penicilline als antibioticum gebruiken tegen S. aureus infecties. In 1969 werd in

Denenmarken een grootschalige studie uitgevoerd door Jessen et al waarbij de

epidemiologie van penicilline resistente S. aureus stammen onderzocht werd in de

gemeenschap en in ziekenhuizen (Jessen et al, 1969). Daaruit bleek dat het niveau van

penicilline resistente S. aureus stammen bijna hetzelfde was in de gemeenschap als in de

ziekenhuizen (Fig. 1.4). Daar dit niet alleen het geval was in Denenmarken maar ook in de

Verenigde Staten en Europese landen, werd vanaf 1970 penicilline niet meer gebruikt om

S. aureus infecties te behandelen.

Figuur 1.4: De stijging van het aantal penicilline resistente S. aureus stammen in de ziekenhuizen en

gemeenschap vanaf 1942 tot midden jaren ‘70. Het aantal penicilline resistente S. aureus stammen uit het

ziekenhuis (gesloten symbolen) en de gemeenschap (open symbolen) wordt uitgedrukt in percent (Chambers,

2001).

I. INLEIDING

5

1.3.2 Methicilline resistente Staphylococcus aureus

Door de snelle toename van penicillineresistentie in de jaren 50 was er nood aan nieuwe

antibiotica om S. aureus infecties te behandelen. In 1959 leidde dit tot de ontwikkeling van

een semi-synthetisch antibioticum: methicilline (Fig. 1.5). Methicilline is een penicilline-

derivaat dat resistentie vertoonde tegen β-lactamasen en zo pencilline resistente stammen

kon doden (Nunan & Young, 2007). Slechts twee jaar na het eerste gebruik van methicilline

werden de eerste methicilline resistente S. aureus (MRSA) stammen beschreven in het

Verenigde Koninkrijk (Jevons, 1961). Sindsdien werden er ook MRSA stammen

gerapporteerd in andere Europese landen, Japan, Australië en de Verenigde Staten (Enright

et al, 2002).

Figuur 1.5: Structuurformule van Methicilline (Solomon & Donnenfeld, 1986).

De methicillineresistentie is gelinkt aan het mecA gen (methicilline resistentie gen), dat

chromosomaal gelegen is op een mobiel genetisch element, het Staphylococcale-

cassettechromosoom mec (SCCmec) (Vanderhaeghen et al, 2010). Er heerst een sterk

vermoeden dat het mecA gen afkomstig is van het genoom van een ander bacterieel species

en in het verleden geïntegreerd is in het chromosoom van S. aureus (Ito et al, 1999). Het

mecA gen codeert voor een gemodificeerd penicilline bindend eiwit (PBP2a of PBP2’) met

een lagere bindingsaffiniteit voor β-lactam antibiotica. PBP2a blijft functioneel actief terwijl

andere PBP’s geïnactiveerd worden door penicilline/methicilline (Leonard & Markey, 2008;

Vanderhaeghen et al, 2010).

De expressie van het mecA gen wordt gereguleerd door mecI en mecR1. Het mecI gen

codeert voor het mecA repressor eiwit dat de transcriptie van mecA onderdrukt wanneer

β-lactam antibiotica afwezig zijn. Het mecR1 gen codeert voor een signaaltransductie eiwit

dat de aanwezigheid van β-lactam antibiotica kan detecteren. Hierbij wordt mecRI

autokatalytisch gekliefd en wordt het metalloprotease domein actief. Dit metalloprotease

zal op zijn beurt mecI, gebonden aan de mecA operator regio, splitsen waardoor de

transcriptie van mecA kan starten met als gevolg de vorming van PBP2a (Deurenberg &

Stobberingh, 2008).

I. INLEIDING

6

1.4 De verschillende MRSA types 1.4.1 Ziekenhuisgebonden MRSA

Sinds 1960 vormt MRSA een groot probleem in ziekenhuizen waar ze endemisch kunnen

voorkomen. Dit komt doordat in ziekenhuizen patiënten vaak een verzwakt immuunsysteem

hebben, waardoor ze gevoeliger zijn voor MRSA infecties. MRSA kan verspreid worden via

direct contact met een MRSA-drager. Doordat er soms meerdere patiënten op één kamer

verblijven en/of verzorgend personeel asymptomatisch drager van MRSA kunnen zijn,

bestaat de mogelijkheid dat patiënten geïnfecteerd geraken. Daarenboven kan een patiënt

via contact met gecontamineerde stofdeeltjes, huidschilfers, voorwerpen en oppervlakten

besmet geraken met MRSA. In ziekenhuizen veroorzaakt MRSA vaak huidinfecties.

De ziekenhuisgebonden MRSA (“hospital-acquired” of HA-MRSA) is vaak niet alleen resistent

tegen β-lactam antibiotica maar ook tegen andere antimicrobiële middelen, waardoor MRSA

ook wel multiresistente S. aureus genoemd wordt. MRSA is hierdoor moeilijk te behandelen

en zorgt zo voor ernstige morbiditeit en mortaliteit in ziekenhuizen (Weese, 2010).

De meeste MRSA-stammen zijn nog gevoelig aan vancomycine, maar door veelvoudig

gebruik van dit antibioticum, werden intussen ook vancomycine resistente S. aureus (VRSA)

stammen gerapporteerd(Haesebrouck et al, 2006).

1.4.2 Gemeenschapsgebonden MRSA

In 1990 kwam er een tweede grote epidemiologische schift waarbij MRSA voorkwam in de

gemeenschap. Bij dit MRSA type spreekt men van “community-acquired” MRSA (CA-

MRSA)(Haesebrouck et al, 2006; Weese, 2010). CA-MRSA is meestal gerelateerd met

infecties van de huid en zachte weefsels wat bij HA-MRSA minder het geval is (Aarestrup &

Schwarz, 2006).

De eerste gevallen van CA-MRSA infecties kwamen voor in inheemse populaties in het

westen van Australië. Na uitvoeren van “Pulsed Field” Gel Elektroforese (PFGE) op deze

MRSA stammen werden andere klonen onderscheiden dan degene die circuleerden in de

Australische ziekenhuizen. De CA-MRSA stammen bleken gevoelig voor andere

antimicrobiële middelen dan β-lactam antibiotica. Mogelijk waren deze stammen verre

afstammelingen van HA-MRSA ofwel S. aureus stammen die op een ander moment het mecA

gen verworven hadden via horizontale gentransfer.

In 1995-1999 werden in de Verenigde Staten de eerste CA-MRSA stammen afkomstig van

gezonde kinderen goed gedocumenteerd. Deze kinderen konden niet gelinkt worden aan

gekende risicofactoren voor MRSA en stierven allemaal aan ernstige infecties. Door de

productie van toxines, zoals bijvoorbeeld Panton-Valentine leukocidine-toxine en phenol

soluble moduline-toxine, kon CA-MRSA ernstige infecties veroorzaken over het hele lichaam

met soms de dood tot gevolg. Ook deze CA-MRSA stammen bleken niet gerelateerd aan HA-

MRSA stammen en waren gevoelig voor de meeste antibiotica (Chambers & Deleo, 2009).

Tegenwoordig is CA-MRSA een groot probleem. Zeer typisch is dat veelal jonge mensen

zonder gezondheidsproblemen geïnfecteerd worden. Bovendien verspreidt het zich

gemakkelijk in de bevolking. Een voorbeeld hierbij is de verspreiding van CA-MRSA in

sportclubs door het delen van handdoeken (http://www.phila.gov/health/pdfs/CA-

MRSA_guidelines.pdf).

I. INLEIDING

7

1.4.3 Diergebonden MRSA

Een volgende stap in de evolutie van MRSA is bij dieren te vinden. Zo werd in 1972 MRSA

voor het eerst geïsoleerd uit (melk van) runderen met mastitis (Devriese et al, 1972).

Sindsdien werd ook MRSA geïsoleerd uit huisdieren. Deze dieren bleken meestal

geïnfecteerd met humane MRSA stammen afkomstig van de eigenaar(s). Door dekolonisatie

van dieren, stopte meestal de MRSA kolonisatie van de eigenaars en omgekeerd.

Vanaf 2004 werd er echter MRSA gevonden bij mensen die een link hadden met

veehouderij. Zo werd bij een zes maanden oud meisje MRSA gevonden. Ondanks

verscheidene pogingen om de bacterie te elimineren bleef het meisje maandenlang door

MRSA gekoloniseerd. Bij de ouders, die varkenshouders waren, werd eveneens MRSA

gevonden (Voss et al, 2005). In hetzelfde jaar werd er een jonge moeder in het ziekenhuis

opgenomen met mastitis veroorzaakt door MRSA, waarvan de partner een varkenshouder

bleek te zijn. Ook hier waren de gezinsleden besmet met MRSA. De medewerkers (n=3) en

varkens (n=10) aanwezig op het bedrijf werden getest op MRSA. Bij alle drie de

medewerkers en acht van de geteste varkens werd MRSA gevonden (Nunan & Young, 2007).

Begin 2005 werd er opnieuw MRSA gevonden bij een varkensboer en een zoon van een

varkensdierenarts. Dit zorgde voor het vermoeden dat varkens een mogelijke bron van

MRSA konden zijn.

Vervolgens werden 30 varkens, afkomstig van de boerderij van het baby-meisje en van

andere boerderijen uit de buurt, getest op MRSA aanwezigheid. Bij één varken, afkomstig

van de boerderij van het baby-meisje, kon MRSA geïsoleerd worden. Ook werden andere

varkensboeren uit de regio getest, waarvan er meerdere MRSA drager bleken te zijn.

Wetenschappers probeerden de verkregen stammen te typeren door middel van PFGE met

SmaI (Serratia marescens) restrictie, maar deze stammen bleken niet-typeerbaar (NT). Na

spa-typering van de stammen bleek dat het babymeisje, haar familie en het varken

afkomstig van hun boerderij besmet waren met éénzelfde type, namelijk spa-type t108.

Deze resultaten vormden het eerste bewijs van transmissie van MRSA tussen varken en

varkenshouder en tussen varkenshouder en zijn familie (Nunan & Young, 2007; Voss et al,

2005). Door nog een andere typeringsmethode te gebruiken, namelijk Multi-Locus Sequence

Typing (MLST), werden alle isolaten geïdentificeerd als sequentie type ST398. MRSA ST398

wordt ook wel “pig-associated” MRSA genoemd.

Bij verdere studies omtrent de verspreiding van MRSA in varkens in verschillende landen

zoals Nederland, Duitsland, Canada, België, Singapore en de Verenigde Staten werden

telkens door SmaI PFGE niet typeerbare isolaten, behorende tot sequentie type 398

gevonden. Door deze studies werd het duidelijk dat dit MRSA type wijd verspreid was bij

varkens. De isolaten behoorden tot verschillende spa-types (vooral t011, t108 en t1254)

(Weese & van Duijkeren, 2010). Tevens zag men dat MRSA ST398 stammen bijna altijd

tetracycline resistent waren (de Neeling et al, 2007). Van Duijkeren et al. (2008) testten tien

varkens op MRSA aanwezigheid voor en na toediening van tetracycline. Na gebruik van

tetracycline werd een stijging gezien in MRSA kolonisatie. Dit kleinschalige onderzoek was

echter niet statistisch significant maar heeft geleid tot de suggestie dat het veelvoudig

gebruik van tetracycline als antibioticum en groeipromotor in de varkensteelt geleid heeft

tot het voorkomen en verspreiden van MRSA ST398 (van Duijkeren et al, 2008).

I. INLEIDING

8

Tegenwoordig wordt dit type ook teruggevonden in andere nutsdieren, zoals runderen en in

mindere mate bij kippen en kalkoenen. Tevens werd MRSA ST398 beschreven bij

gezelschapsdieren zoals honden, katten en paarden. Het veelvuldig beschrijven van MRSA

ST398 bij deze verschillende diersoorten heeft geleid tot een verandering van naam:

“pig-associated” MRSA werd “livestock-associated” of diergebonden MRSA (LA-MRSA)

genoemd (Smith & Pearson, 2011; Vanderhaeghen et al, 2010; Weese, 2010; Weese & van

Duijkeren, 2010).

1.5 Implicaties op de volksgezondheid De impact van MRSA ST398 op de volksgezondheid wordt nog steeds onderzocht. Tot op

heden veroorzaakt MRSA ST398 weinig infecties bij mensen, maar doorheen de jaren

werden er toch een aantal gevallen beschreven, met soms ernstige infecties tot gevolg

(Graveland et al, 2011; van Cleef et al, 2011).

Eén van de risicofactoren voor dragerschap van MRSA ST398 bij mensen is het rechtstreeks

en langdurig contact met varkens. Dit zijn bijvoorbeeld mensen die op boerderijen leven en

werken, slachthuismedewerkers en dierenartsen (van Duijkeren et al, 2008). De vraag rees

of deze stam zich kan verspreiden van personen met direct varkenscontact naar de

maatschappij. Indien deze verspreiding kan optreden, kan dit leiden tot grote problemen

(Nunan & Young, 2007).

Tot op heden zijn er een aantal studies geweest om deze vraag te beantwoorden. Zo

onderzochten Cuny et al. (2009) de prevalentie van MRSA ST398 in individuen met contact

met varkens, personen die leven op boerderijen zonder contact met varkens en

schoolkinderen in de buurt van de MRSA positieve boerderijen. Tijdens deze studie werd

gezien dat de verspreiding van MRSA ST398 van gekoloniseerde varkensboeren naar de

gemeenschap voorkomt, maar niet frequent(Cuny et al, 2009). Toch neemt het aantal

rapporten betreffende MRSA ST398 besmettingen van patiënten in ziekenhuizen en

individuen die geen contact hebben met levende varkens geleidelijk aan toe (Smith et al,

2010). Zo was er in juni 2007 een ST398 uitbraak in een ziekenhuis in Nederland. Wulf en

collega’s (2008) vonden MRSA bij vijf patiënten en vijf verzorgenden. Geen van de patiënten

kwam in contact met varkens. Eén van de verzorgenden woonde op een varkensboerderij

maar kwam zelf niet in contact met de varkens. De onderzoekers vermoedden dat deze

verpleegster hoogstwaarschijnlijk de bron was van MRSA ST398. Dit werd echter niet

bewezen omdat de varkens op de boerderij niet onderzocht mochten worden (Wulf et al,

2008).

In een studie van Rijen et al. (2008) werd de transmissie van MRSA ST398 in vergelijking met

HA-MRSA onderzocht. Hieruit bleek dat personen gekoloniseerd met MRSA ST398 minder

snel anderen infecteerden ten opzichte van HA-MRSA patiënten (van Rijen et al, 2008). Dit

werd tevens bevestigd door andere studies. Vancleef et al. (2011) onderzochten hoe lang

een persoon die kort in de varkensstallen verblijft, MRSA ST398 draagt. Na 24 uur bleken de

personen terug negatief voor MRSA (van Cleef et al, 2011).

Bovendien heeft MRSA ST398 weinig tot geen humane virulentiegenen, waardoor deze

moeilijker in staat is om mensen te contamineren (Price et al, 2012). Price et al.

suggereerden dat MRSA ST398 ontstaan is in mensen als MSSA (methicilline sensitieve

S. aureus). Vervolgens verspreidde de bacterie zich snel en infecteerde vee via zoönose.

I. INLEIDING

9

Deze “sprong” van mens naar vee ging samen met het verlies van humane virulentiegenen

en acquisitie van tetracycline en methicilline resistentiegenen. Verder is ook bevestigd dat

transfer van deze bacterie in twee richtingen voorkomt (Price et al, 2012).

Naast rechtstreeks contact met varkenshouders en dergelijke, kan er ook secundaire

transmissie van MRSA ST398 optreden. Zo kunnen mensen gekoloniseerd geraken door

bijvoorbeeld luchtcontaminatie. Uit onderzoek blijkt dat bacteriën afkomstig van een

varkensbedrijf tot 150 meter verder terug te vinden zijn (Gibbs et al, 2006; Smith et al,

2010). Daar MRSA ST398 veelvuldig voorkomt bij voedselproductiedieren is het vlees van

deze dieren een andere mogelijke contaminatiebron. Kan via vlees en vervolgens

kruiscontaminatie MRSA ST398 verspreid worden onder mensen (Vanderhaeghen et al,

2010)?

In een Nederlands onderzoek van juni 2007 tot mei 2008 onderzocht men de prevalentie van

MRSA ST398 op 2217 rauwe vleesstalen, zoals aangeboden door grootwarenhuizen en

slagers. MRSA werd geïsoleerd uit 264 (11,9%) vleesmonsters, waarvan 28 (10,7%)

varkensvleesstalen. MRSA isolaten uit de verschillende vleessoorten behoorden grotendeels

(87%) tot het type ST398. Het aantal bacteriën teruggevonden op vlees, was zeer laag wat

doet vermoeden dat MRSA ST398 op deze producten tot op heden geen groot risico vormt

voor de volksgezondheid (de Boer, 2008). Beneke et al. (2011) hebben in 2011 het

voorkomen van MRSA in de varkensvleesproductieketen onderzocht. Op deze manier wilden

ze het overdragen van MRSA van levende dieren doorheen het slachtproces bepalen met als

eindproduct het vlees in de winkels. Uit de resultaten bleek dat MRSA over de gehele

productieketen voorkwam (Beneke et al, 2011). Meer onderzoek is nodig om dit de

bevestigen en mogelijke transmissieroutes van MRSA in de vleesproductieketen te

onderzoeken om zo potentiële contaminatie te verminderen.

I. INLEIDING

10

1.6 Moleculaire technieken Tegenwoordig zijn er een aantal technieken beschikbaar om lange-termijnevoluties binnen

MRSA stammen na te gaan, zoals Multi-Locus Sequentie Typering, spa-typering, SCCmec

typering en Pulsed Field Gel Elektroforese. Voor korte-termijnevoluties wordt er onder

andere Multi-Locus Variable number tandem repeat Analyse gebruikt.

1.6.1 Multi-Locus Sequentie Typering (MLST)

Multi-locus sequentietypering (MLST) kan gebruikt worden om lange termijn evoluties te

analyseren tussen MRSA isolaten. Deze methode meet de genetische diversiteit in zeven

huishoudgenen: carbamaat kinase (arcC), shikimaat dehydrogenase (aroE), glycerol kinase

(glp), guanylaat kinase (gmk), fosfaat acetyltransferase (pta), triosefosfaat isomerase (tpi) en

acetyl coenzym A acetyltransferase (yqiL). Dit zijn essentiële genen coderend voor eiwitten

die constitutief worden aangemaakt. Bij MLST worden deze genen geamplificeerd en

vervolgens gesequeneerd. Elke locus krijgt een specifiek nummer of allel type toegekend.

Zo heeft één isolaat zeven nummers, wat een allelisch profiel wordt genoemd. Het allelisch

profiel krijgt vervolgens een nummer of sequentie type (ST) toegewezen. Stammen die maar

één of twee loci verschillen worden respectievelijk “single” locus varianten (SLV) of dubbel

locus varianten (DLV) genoemd. In onder andere Bionumerics® worden de bekomen STs,

SLVs en DLVs geanalyseerd met BURST (“based upon related sequence types”) en

gegroepeerd in clonale complexen (CC) om tenslotte fylogenische bomen te maken. In een

clonaal complex wordt de ST met het grootste aantal verschillende SLVs en DLVs de

“voorouderlijke ST” genoemd en het CC wordt genummerd naar zijn voorouderlijke ST

(Vanderhaeghen et al, 2010). Er bestaat een website (http://mlst.ox.ac.uk) waarop een allelisch

profiel toegevoegd vergeleken kan worden met andere MRSA en MSSA profielen (Enright et

al, 2000). Een nadeel zijn de hoge kosten die gepaard gaan met deze methode. Daarenboven

is MLST labo-intensief en dus niet geschikt voor honderden isolaten.

1.6.2 Spa typering

Spa-typering is een “single locus” typeringsmethode ontwikkeld door Frenay et al. (1996)

waarbij de repeat regio of polymorfische regio X geanalyseerd wordt van de S. aureus

proteïne A (spa) locus (Deurenberg & Stobberingh, 2008).

Deze repeat-regio in het spa-gen is gevoelig aan het verliezen en/of winnen van repeats en

aan spontane mutaties. De polymorfische regio bevat een “variabel number tandem repeat”

(VNTR) van 24 bp en ligt stroomopwaarts van het gen coderend voor de C-terminale celwand

“attachment”-sequentie (Fig. 1.6). De repeat-regio wordt geamplificeerd en vervolgens

gesequeneerd. De volgorde van de specifieke repeats bepaalt het spa-type.

Het is een snelle, reproduceerbare en in vergelijking met MLST een goedkope methode om

MRSA te typeren (Shopsin et al, 1999). Een ander voordeel is de beschikbaarheid van een

softwarepakket, StaphType®, om de bekomen sequentiechromatogrammen te analyseren.

StaphType® maakt gebruik van een algoritme gebaseerd op het repeat-patroon (“based

upon repeat pattern”, BURP) om clusteranalyse van de spa-typeringsdata uit te voeren.

I. INLEIDING

11

Er bestaat tevens een centrale spa server (http://spaserver.ridom.de) waar de spa typeringsdata

te vinden zijn (Deurenberg & Stobberingh, 2008). Deze databank is één van de grootste

typeringsdatabanken van S. aureus en bestaat momenteel uit meer dan 10000 spa-types.

Figuur 1.6: Een schematisch overzicht van het spa-gen. Het spa-gen codeert voor proteïne A en is in het

overzicht opgedeeld in verschillende blokken. Blok S is een signaalsequentie (S), blokken A tot E zijn

immunoglobuline G bindende regio’s. De regio X stelt het COOH-terminale gedeelte van proteïne A voor en

bestaat uit een XF-blok (de short sequence repeats of SSR) en een XC-blok (een celwand “attachment”

sequentie)(Shopsin et al, 1999; Uhlen et al, 1984).

1.6.3 SCCmec typering

Staphylococcale-cassettechromosoom mec (SCCmec) is een mobiel genetisch element dat

het resistentiegen mecA tegen β-lactam antibiotica draagt. Naast het mecA gen, gelegen in

het mec-gencomplex, draagt de cassette ook cassette chromosome recombinase-genen (ccr-

genen). De ccr-genen staan in voor een plaats specifieke recombinatie waardoor het

genetisch element op specifieke plaatsen in het chromosoom van gevoelige stammen

geïnsereerd kan worden. Deze specifieke plaatsen worden de integratie site sequentie (ISS)

genoemd. De ccr-genen zijn gelegen in het ccr-gencomplex. Naast de twee vernoemde

complexen bevat het SCCmec element ook een J-regio of “joining/junkyard region”. Deze

bevat de niet-essentiële componenten van de cassette (bijvoorbeeld extra antibiotica-

resistentiegenen).

SCCmec elementen zijn zeer divers qua structuur en sequentie, waardoor ze onderverdeeld

kunnen worden in types en subtypes. Zo zijn er drie fylogenetisch verschillende ccr-genen:

ccrA, ccrB en ccrC en zijn er vijf verschillende allotypes geïdentificeerd op basis van allelische

variaties. Bij het mec-gencomplex zijn er vijf klassen: A, B, C1, C2 en D. Er zijn tot nu toe 11

(I-XI) verschillende types en subtypes beschreven in MRSA. De subtypes worden bepaald op

basis van de polymorfismen aanwezig in de J-regio (Ito, 2009; Vanderhaeghen et al, 2010).

Uit onderzoek blijkt dat SCCmec types I, II en III vaak teruggevonden worden in HA-MRSA en

types IV en V in CA-MRSA. Verder blijkt ook dat in LA-MRSA de types IVa en V het meeste

voorkomen. De SCCmec types IV en V dragen minder extra antibiotica resistentiegenen naast

het methicillineresistentiegen in vergelijking met de types I, II en III. De cassette is hierdoor

kleiner en wordt dus makkelijker doorgegeven via horizontale gentransfer en verspreidt CA-

MRSA zich sneller dan HA-MRSA (Grundmann et al, 2006; Nunan & Young, 2007).

Voor de typering wordt de cassette geamplificeerd met primers die op de geconserveerde

sequenties in de ccr en mec regio kunnen binden. Vervolgens worden de amplicons

gescheiden op gel waardoor men een “fingerprint” bekomt. Aan de hand van deze

fingerprint kan het SCCmec type van het isolaat bepaald worden.

I. INLEIDING

12

1.6.4 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) is de gouden standaard om S. aureus te typeren en

wordt onder andere gebruikt om epidemieën te onderzoeken. Hiervoor wordt een

restrictiereactie uitgevoerd op het in agarose ingebed DNA. De resulterende DNA

fragmenten worden gescheiden door middel van agarosegel elektroforese in een elektrisch

veld met een wisselende voltage gradiënt. Doordat het voltage periodiek van richting

verandert, kunnen grote DNA fragmenten tot 1000 Kb gescheiden worden. De DNA

fragmenten moeten namelijk bij elke stroomwisseling heroriënteren om verder door te gel

te bewegen. De tijd nodig om het heroriëntatieproces te vervolledigen is afhankelijk van de

grootte van het DNA fragment: hoe groter, hoe langzamer en moeizamer. Op deze manier

verkrijgt men een “fingerprint” van het bacterieel genoom, dat verder geanalyseerd kan

worden met onder andere Bionumerics®. Met behulp van deze software kunnen onder meer

fylogenetische bomen gemaakt worden.

De nadelen van deze zeer discriminerende methode zijn de hoge kosten en de tijdsrovende

protocols (Deurenberg & Stobberingh, 2008; Herschleb et al, 2007). Door het bestaan van

een gestandaardiseerde methode (HARMONY) kunnen resultaten van verschillende labo’s

vergeleken worden aan de hand van internationale databanken.

Om (methicilline resistente) S. aureus te typeren wordt PFGE met SmaI-restrictie gebruikt.

Doordat MRSA ST398 een methylatie bevat op de SmaI restrictieplaats, kan het enzym niet

knippen en wordt er gesproken van niet-typeerbare MRSA (Bosch et al, 2010). Bij deze

isolaten zullen er andere restrictie-enzymen gebruikt worden zoals BstZI, SacII, ApaI, Cfr9 en

XmaI (Rasschaert et al, 2009).

1.6.5 Multi-Locus Variable numer tandem repeat Analyse (MLVA)

Om de korte termijn evoluties tussen isolaten te bestuderen kan men Multi-Locus Variable

number tandem repeat Analyse (MLVA) gebruiken. Het is een polymerase ketting reactie

(PCR) gebaseerde methode, waarbij variable number tandem repeats (VNTRs)-regio’s van

verschillende individuele genen worden geanalyseerd. De tandem herhalingen kunnen

gebruikt worden om de genetische diversiteit van MRSA te onderzoeken.

De polymorfisme-index kan van elke locus berekend worden en er kunnen zeer specifieke

primers ontwikkeld worden. Door middel van een MLVA, specifiek ontwikkeld voor MRSA

ST398, worden via multiplex PCR de repeat regio’s van vijf genen geamplificeerd. De

amplicons worden samen met een standaardmerker gescheiden op gel of door middel van

capillaire elektroforese. Allelen die één repeat in grootte verschillen kunnen hierdoor

gescheiden worden.

Deze methode blijkt goed te zijn voor het typeren van S. aureus, klinische en dierlijke MRSA

isolaten. MLVA is zeer reproduceerbaar en heeft een hoog discriminerend vermogen. Verder

is het een goedkope en makkelijk interpreteerbare methode (Lindstedt, 2005; Rasschaert et

al, 2009).

I. INLEIDING

13

1.7 Antibiotica-resistentiebepaling

Om na te gaan tegen welke antibiotica de isolaten resistent zijn, wordt onder andere gebruik

gemaakt van Neo-Sensitabs (Rosco diagnostica®). Neo-Sensitabs zijn tabletten die een

variëteit aan anti-microbiële stoffen bevat. De isolaten worden op Mueller Hinton II Agar

uitgeplaat en de tabletten worden vervolgens via een dispenser aangebracht op de

agarplaten. Na incubatie (24 uur bij 37 °C) wordt de zonediameter van de groei-inhibitiezone

rondom de tabletten gemeten. De resultaten worden vergeleken met een interpretatietabel

voor de individuele antibiotica. De isolaten worden op resistentie tegen 16 antibiotica

getest, waarvan enkele uitsluitend in de humane geneeskunde gebruikt worden zoals

chloramfenicol, fucidine, linezolid, mupirocine, quino/dalfopristine en rifampicine. De overig

geteste antibiotica worden onder andere gebruikt in de diergeneeskunde. De meest

gebruikte antibiotica bij veeteelt zijn sulfonamides en trimethoprim (behoort tot de

antibioticumklasse van sulfonamides), penicilline en tetracycline. Tevens worden ook

combinaties van drie antibiotica gebruikt, om kruisresistentie aan te tonen (erythromycine,

lincomycine en tylosine/kanamycine, gentamicine en tobramycine). Deze methode is

gebaseerd op het standaardprotocol van Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).

Men kan ook de minimale inhibitorische concentratie (MIC) bepalen van een antibioticum.

De minimale inhibitorische concentratie is de laagste concentratie van een antibioticum

waarbij de groei van de bacterie wordt geïnhibeerd na één nacht incubatie. Hoe lager de

MIC, hoe beter het antibioticum werkt tegen die bacterie. De MIC kan bepaald worden door

middel van een verdunningsreeks volgens een standaardprotocol van CLSI of van European

Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST).

Tevens kunnen de antibioticaresistentie genen gedetecteerd worden door middel van PCR

met primers tegen geconserveerde regio’s in het gen of door middel van hybridisatie van het

bacterieel DNA met micro-arrays waarop zich sequenties bevinden van resistentiegenen.

II. PROBLEEM- EN DOELSTELLING

14

II. Probleem- en doelstelling

Reeds jarenlang vormt MRSA een probleem in de ziekenhuizen en gemeenschap. De

ziekenhuis en gemeenschapsgebonden MRSA veroorzaken vaak infecties wat “livestock –

associated” MRSA of MRSA ST398 minder doet. Stilaan neemt echter het aantal rapporten

over MRSA ST398 infecties toe, waardoor men de verspreiding naar de maatschappij wilt

vermijden. Een belangrijke bron van MRSA ST398 zijn varkens en mensen die vaak in contact

komen met varkens. In een studie van Cuny et al. (2009) blijkt dat de transmissie van MRSA

ST398 van gekoloniseerde varkensboeren naar de gemeenschap niet frequent voorkomt. Om

toch te vermijden dat MRSA ST398 terecht komt in de gemeenschap via een andere manier,

werd de aanwezigheid van MRSA ST398 doorheen de varkensproductieketen onderzocht.

Deze thesis kadert in een IWT project waarbij het voorkomen van MRSA ST398 onderzocht

wordt doorheen de varkensproductieketen. Zo zullen er stalen genomen worden op

boerderijen, in slachthuizen, supermarkten en bij slagers. Verder zal ook onderzocht worden

hoe in de primaire sector MRSA positieve bedrijven geremedieerd kunnen worden.

Gedurende deze thesis zal het percentage MRSA bepaald worden op varkensvlees

verkrijgbaar in supermarkten en bij slagers. Hiervoor zullen er wekelijks

varkensvleesproducten aangekocht worden bij verschillende slagers en supermarkten.

Volgende vleesstalen zullen geanalyseerd worden: varkensribben, die zich bevinden aan de

binnenkant van het karkas en spek (met zwoerd), dat zich bevindt aan de buitenkant van het

karkas (de huid). Ook varkenspoten of varkensschenkels worden aangekocht, aangezien uit

een voorstudie bleek dat de poten het meeste MRSA gecontamineerde deel waren van het

karkas. Tot slot zullen ook varkensmignonettes (vaak geconsumeerd), varkensoren en

varkensgehakt (omdat dit vlees sterk gemanipuleerd wordt tijdens de verwerking)

onderzocht worden. Er zal eveneens nagegaan worden of de gevonden MRSA isolaten van

humane of dierlijke/ST398 afkomst zijn.

Indien de consument in gevaar is bij consumptie van het varkensvlees, moeten de resultaten

gemeld worden aan het FAVV (Federaal Agentschap voor de veiligheid van de voedselketen).

Echter, in de voedselveiligheidscriteria van het FAVV staat nergens het toegelaten aantal van

MRSA of MSSA op (varkens)vleeswaren vermeld. Er kan tevens naar de

proceshygiënecriteria gekeken worden: wanneer volgens deze criteria de aangegeven

aantallen overschreden worden, komt niet zodanig de volksgezondheid in gevaar, maar

moet de hygiëne aangepast worden in het productieproces. Volgens deze criteria moet het

kve/g van coagulase positieve Staphylococci (zoals S. aureus) op rauw gehakt lager zijn dan

100 kve/g, maar mag bij twee van de minstens vijf onderzochte stalen het aantal maximum

1000 kve/g zijn. Daar er niets vermeld staat in de criteria over de ander onderzochte

vleesstalen, werden de resultaten van alle vleessoorten met bovenstaande criterium

vergeleken. Tevens werden alle resultaten gemeld aan het FAVV.

Vervolgens worden de verwantschappen tussen de verschillende verkregen humane en

diergebonden MRSA isolaten onderzocht door middel van methodes die lange termijn

evoluties detecteren zoals spa-typering, PFGE en SCCmec typering. Korte termijn evoluties

kunnen onderzocht worden door middel van Multiple-Locus Variable number tandem repeat

Analysis (MLVA). Door het uitvoeren van deze typeringsmethoden, kan nagegaan worden of

de stammen van éénzelfde of verschillende contaminatiebron(nen) afkomstig zijn.

II. PROBLEEM- EN DOELSTELLING

15

Ten slotte zullen er antibioticaprofielen opgesteld worden om na te gaan tegen welke

antibiotica de isolaten resistent zijn.

III. RESULTATEN

16

III. Resultaten

3.1 Aflezen van de MRSA en SA-ID platen

Het aantal methicilline resistente/sensitieve Staphylococcus aureus kolonies werd per gram

(voor de mignonettes, het spek en gehakt) of vierkante centimeter (voor de ribben, poten en

oren) geschat.

3.1.1 Rechtstreekse isolaties

Er werden minstens vijf groene kolonies per verdunningsreeks van elk vleesstaal opgepikt

van de SA-ID platen. Daarnaast werd (indien aanwezig) één blauwgroene kolonie van de nul

verdunning op de MRSA-ID platen geselecteerd. Om na te gaan of de stammen MSSA of

MRSA waren, werd een triplex PCR uitgevoerd op de bekomen lysaten. Bij deze PCR werd er

gekeken naar de aanwezigheid van drie genen door specifieke primers te gebruiken tegen

het mecA gen (533 bp), het nuc gen (279 bp) en het 16S rRNA gen (750 bp). Bij MRSA

stammen worden alle genen geamplificeerd. Bij MSSA stammen zijn slechts twee van de drie

genen aanwezig: het nuc en 16S rRNA gen (Fig 3.1). Van de 912 DNA-stalen waren in totaal

6 stalen (0,7%) MSSA-positief en 147 (16,1%) MRSA-positief.

Figuur 3.1: Triplex PCR van de geselecteerde kolonies van de SA en MRSA-ID platen. In laan twee, drie en vier

zijn de verkegen amplicons te zien na triplex van PCR respectievelijk een MRSA stam, een MSSA stam en een

niet S. aureus stam. (L: 100 bp DNA ladder)

Aan de hand van het aflezen van de SA en MRSA-ID platen en de resultaten van de triplex

PCR, werd het aantal MSSA en MRSA kolonie vormende eenheden (kve) per gram of

vierkante centimeter vlees bepaald. In tabel 3.1 wordt het aantal vleesstalen weergegeven

die MSSA-positief (aantal per gram of vierkante centimeter) waren. In totaal was 4% van de

vleesstalen MSSA-positief. Van de 24 mignonettestalen, 24 ribbetjes en 18 gehaktstalen was

telkens één staal MSSA-positief. Er werden naar schatting respectievelijk 100 kve/g,

606 kve/cm² en 142 kve/g teruggevonden. Deze stalen waren allen aangekocht bij slagerij C.

III. RESULTATEN

17

Ten slotte bevatten twee oren, gekocht bij grootwarenhuis A, naar schatting 557 en 34

MSSA kve/cm².

Tabel 3.1: Aantal MSSA kolonie vormende eenheden per gram (mignonette spek en gehakt) of vierkante

centimeter (ribbetjes, poten en oren) rechtstreeks teruggevonden op de verschillende vleesstalen.

(SA +: positief voor S. aureus)

MSSA + MSSA/g

MSSA/cm²

Mignonette [1/24] 100

Spek [0/24] -

Gehakt [1/18] 142

Ribbetjes [1/24] 606

Poten [0/24] -

Oren [2/23] 557

34

In tabel 3.2 wordt het aantal MRSA-positieve vleesstalen weergegeven per grootwarenhuis/

slagerij na rechtstreeks uitplaten van de stalen. Daarnaast wordt de schatting van het aantal

MRSA kolonies per gram of vierkante centimeter getoond. Er werd bij 13 stalen (9%)

rechtstreeks MRSA gevonden. De aantallen waren maximum 1000 kve/g en 8002 kve/cm².

III. RESULTATEN

18

Tabel 3.2. Aantal MRSA per gram (mignonette, spek en gehakt) of vierkante centimeter (ribbetjes, poten en oren) teruggevonden op de verschillende vleesstalen van elk

grootwarenhuis/slagerij. Zes keer werden verschillende vleessoorten aangekocht bij vier verschillende zaken. (NA: niet aanwezig in slagerij, NB: kon niet bepaald worden,

MRSA +: aantal positieve stalen voor MRSA.)

Grootwarenhuis A Grootwarenhuis B Slager C Slager D

MRSA + MRSA/g

MRSA + MRSA/g MRSA + MRSA/g MRSA + MRSA/g

MRSA/cm² MRSA/cm² MRSA/cm² MRSA/cm²

Mignonette [0/6] -

[0/6] -

[1/6] 100

[2/6] 110

1000

Spek [0/6] - [0/6] - [0/6] - [1/6] 20

Gehakt NA - [0/6] - [1/6] 140 [0/6] -

Ribbetjes [0/6] - [0/6] - [1/6] 93 [0/6] -

Poten [0/6] - [1/6] 6 [1/6] 7374 [1/6] 8002

Oren 0/6] -

[2/6]

NB [1/5] 136 [1/6] 541

59

III. RESULTATEN

19

3.1.2 Isolaties na aanrijking

Na aflezen van de MRSA-ID platen van de aangerijkte verdunningsreeksen werd bij

90 vleesstalen (65,7%) MRSA teruggevonden. Van elke vleessoort werd een tabel gemaakt,

waarin per grootwarenhuis/slagerij en per week het minimum aantal MRSA kolonies na

aanrijking wordt weergegeven (tabel 3.3 tot 3.8).

Tabel 3.3: Het aantal MRSA na aanrijking van één gram mignonette, weergegeven per slagerij/week van

staalname.

MRSA/g per tijdstip

Mignonette (n=24) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis A - >10 >10 - - -

Grootwarenhuis B >10000 >10 >10 - - -

Slagerij C - - >10 - >10 >10

Slagerij D >100000 - - - >10 -

Tabel 3.4: Het aantal MRSA na aanrijking van één gram spek, weergegeven per slagerij/week van staalname.

MRSA/g per tijdstip

Spek (n=24) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis A - >10 >10 >10 - >10

Grootwarenhuis B - - >10 - - -

Slagerij C - - >1000 >10 - -

Slagerij D >100 - - - >1000000 -

Tabel 3.5: Het aantal MRSA na aanrijking van één gram gehakt, weergegeven per slagerij/week van

staalname. (In grootwarenhuis A was er geen varkensgehakt verkrijgbaar).

MRSA/g per tijdstip

Gehakt (n=18) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis B >10 >10 - >10 >10 -

Slagerij C - - >10 >10 >10 >10

Slagerij D >1000000 - - - >10 -

Tabel 3.6: Het aantal MRSA na aanrijking aanwezig per vierkante centimeter op ribbetjes, weergegeven per

slagerij/week van staalname.

MRSA/cm² per tijdstip

Ribbetjes (n=24) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis A >11 >11 - >167960 >10 >8

Grootwarenhuis B - - >86 >20 - -

Slagerij C >107 >12 >13 >90 >10 >9

Slagerij D >1000 >14 >16 >13 >8 >7

III. RESULTATEN

20

Tabel 3.7: Het aantal MRSA na aanrijking aanwezig per vierkante centimeter op poten, weergegeven per

slagerij/week van staalname.

MRSA/cm² per tijdstip

Poten (n=22) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis A >7 >7438 >7 >783 - >8

Grootwarenhuis B >9 >7 >7 >6 >8 >6

Slagerij C >8 >83 >838 >8 >8 >8

Slagerij D >889200 >87 >10 >9 - >9

Tabel 3.8: Het aantal MRSA na aanrijking aanwezig per vierkante centimeter op oren, weergegeven per

slagerij/week van staalname. NA: niet aanwezig.

MRSA/g per tijdstip

Oren (n=21) week 1 week 2 week 3 week 4 week 5 week 6

Grootwarenhuis A >5 >5 - >631400 >4 >6

Grootwarenhuis B >6 >6 >567 >592600 >811 >8

Slagerij C >435 >4 >540 >4 >48 NA

Slagerij D >587800 >36 >37560 >5 >4 >46

3.1.3 Overzicht van de MRSA positieve stalen

In totaal werd er rechtstreeks en na aanrijking bij 104 vleesstalen (76%) MRSA gevonden

(tabel 3.9). Alle stalen van oren waren MRSA positief. Daarnaast werd er bij 83%, 86% en

72% van de stalen van ribbetjes, poten en gehakt MRSA geïsoleerd. In mindere mate werd er

MRSA gevonden bij mignonette- en spekstalen (54% en 58%).

Tabel 3.9: Aantal en percentage van de MRSA-positieve (rechtsreeks en/of na aanrijking) vleesstalen.

(n= totaal aantal stalen).

n

Aantal rechtstreeks

MRSA positief (%)

Aantal MRSA positief

na aanrijking (%)

Aantal MRSA-positief

(%)

Mignonette 24 3 (12) 10 (42) 13 (54)

Spek 24 10(4) 13 (54) 14 (58)

Gehakt 18 1 (6) 12 (67) 13 (72)

Ribbetjes 24 1 (4) 19 (79) 20 (83)

Poten 24 3 (12) 18 (75) 21(86)

Oren 23 4 (17) 19 83) 23 (100)

Totaal 137 13 (9) 91 (66) 104 (76)

III. RESULTATEN

21

3.2 MRSA ST398 specifieke PCR Alle MRSA en MSSA stammen (n=153) werden onderworpen aan een MRSA ST398 specifieke

PCR. Hierbij werden er primers gebruikt die een 500 bp lang fragment van het mecA gen en

een 296 bp lang fragment van de sau1hsd1 sequentie amplificeren. Na gelelektroforese

vertonen MRSA ST398 stammen twee bandjes op de agarosegel: beide fragmenten werden

geamplificeerd. Bij MSSA ST398 stammen werd slechts de sau1hsd1 sequentie

geamplificeerd en deze stammen vertoonden bijgevolg het 296 bp op gel. Bij MRSA

(niet ST398) stammen amplificeerde uitsluitend het mecA gen en bij MSSA (niet ST398)

gebeurde geen amplificatie (Fig. 3.2). Van de 147 MRSA isolaten behoorden 143 (97,2%) tot

ST398. De MSSA-isolaten waren ST398-negatief.

Figuur 3.2: MRSA ST398 specifieke PCR. Bij een MRSA ST398 positieve stam werden twee fragmenten

geamplificeerd: mecup (500 bp) en CC398 (296 bp). Bij een MRSA (niet ST398) uitsluitend het mecup gen.

Alleen het CC398 gen werd geamplificeerd bij een MSSA ST398 stam en er gebeurde geen amplificatie bij een

MSSA (niet ST398) stam. (L: 100 bp DNA ladder)

III. RESULTATEN

22

3.3 Moleculaire typering van de stammen

3.3.1 Spa typering

Na selectie werd er van 28 stalen [4 MSSA, 23 MRSA ST398 en 1 MRSA (niet ST398) isolaten]

het spa type bepaald. Er werden zes verschillende spa types teruggevonden: t011, t008,

t034, t2370, t091 en t127 (tabel 3.10). Het type t011 was het meest voorkomende (71%),

met daaropvolgend t008 (11%) en t034 (7%). Spa type t011 kwam voor bij isolaten afkomstig

van alle vleessoorten, aangekocht bij de beide grootwarenhuizen en beide slagers. Type t008

werd bij MSSA-isolaten gevonden, afkomstig van gehakt en oren (beide grootwarenhuizen

en slager C) en type t034 bij isolaten van gehakt en ribbetjes van beide slagers. Types t2370,

t091 en t127 kwamen slechts bij één isolaat voor (4%), geïsoleerd van poten (slager D),

ribbetjes (slager C) en gehakt (slager D).

Tabel 3.10: Aantal en percentage van de zes teruggevonden Spa types.


Om te bepalen welke SCCmec cassette de MRSA isolaten hebben, werd een SCCmec typering

uitgevoerd op de MSSA en MRSA isolaten. Deze typering hield drie PCR reacties in.

Vervolgens werden per isolaat de drie bekomen bandpatronen op agarosegel geanalyseerd

en vergeleken met acht controles. Deze controles waren stammen waarvan de SCCmec

cassettes gekend zijn. De meerderheid van de MRSA isolaten (76,2%) waren drager van

SCCmec cassette type V. Deze isolaten behoorden tot alle soorten vleesstalen, afkomstig van

de vier slagerijen. SCCmec type IVa werd teruggevonden bij 26 MRSA-isolaten (17,7%). Deze

isolaten werden geïsoleerd van alle vleessoorten van beide slagers en enkel van de poten en

oren van de twee grootwarenhuizen. Ten slotte werd SCCmec type IVc teruggevonden bij

één MRSA ST398 isolaat, afkomstig van ribbetjes van slagerij C.

3.3.3 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE)

Een selectie van stalen (n=44) onderging PFGE. Deze selectie bevatte onder andere de vijf

verkregen MSSA stammen. Tevens werd van elke slagerij een vleestype gekozen en werden

alle isolaten verkregen op dit vleestype op de verschillende tijdstippen aan de selectie

toegevoegd. Bij 40 van de 44 stalen werd een “fingerprint” bekomen. De verkregen

“fingerprints” werden in Bionumerics® verwerkt en vergeleken via de Dice coëfficiënt, op

Spa type n(%)

t011 20 (71%)

t008 3 (11%)

t034 2 (7%)

t2370 1 (4%)

t091 1 (4%)

t127 1 (4%)

III. RESULTATEN

23

basis van de aan of afwezigheid van een bandje. Vervolgens werd een clustering door middel

van UPGMA (“Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean”) uitgevoerd, waarbij

een dendrogram bekomen werd (Fig. 3.3). In totaal werden er 18 verschillende pulsotypes

teruggevonden. Tevens werden er verschillende dendrogrammen per

grootwarenhuis/slagerij gemaakt. Bij grootwarenhuis A werden er twee pulsotypes

gevonden en bij grootwarenhuis B zeven types. Op de vleesstalen van de slagers werden

9 en 6 types gevonden (Fig 3.4).

3.3.4 Multi-Locus Variable numer tandem repeat Analyse (MLVA)

Na MLVA typering, werd de gegeneerde data in Bionumerics® verwerkt. De verkregen

bandenpatronen werden omgezet in numerieke codes op basis van de VNTR loci: ClfA

(clumpingfactor A, zie 1.2), ClfB (clumpingfactor B, zie 1.2), SIRU21 (“staphylococcal

interspersed repeat unit” 21) en sdr (SD repeat). Vervolgens werden dendrogrammen

gegenereerd door categorische analyse. Het eerste dendrogram bevat de data van alle

isolaten (zie addendum A.1). Deze clustering vertoonde 153 profielen. In totaal waren er 26

isolaten niet typeerbaar door middel van MLVA. Vervolgens werd een dendrogram gemaakt

van alle MRSA ST398 isolaten (zie addendum A.1). Hierbij werden er 65 profielen gevonden,

waaronder 24 isolaten niet typeerbaar waren. Het dendrogram, verkregen na analyse van de

selectie van isolaten werd onderverdeeld in 21 clusters/profielen (Fig 3.5), waarbij twee

isolaten niet typeerbaar waren door middel van MLVA. Er waren 13 MRSA ST398 profielen,

5 MSSA profielen en 2 MRSA (niet ST398) profielen. Bij één MSSA isolaat kon het aantal

repeats van het sdrCDE gen niet bepaald worden.

III. RESULTATEN

24

Figuur 3.3: Dendrogram van de verkregen fingerprints na PFGE van een selectie van de stalen. Links bovenaan

staat een schaal waarop de similariteit in percentage terug te vinden is. Naast de “fingerprints” staat telkens

het stamnummer, de afkomst [grootwarenhuis(GW)/slager(SL)], vleessoort (M: mignonette, S: spek, G: gehakt,

R: ribbetjes, P: poten, O: oren), week van staalname (T1 tot en met T6), de gecombineerde resultaten van de

triplex en MRSA ST398 PCR, het SCCmec type en indien bepaald het spa type. (GW 1: GW A, GW 2: GW B, SL 1:

SL C, SL 2: SL D, SA: MSSA, NT ST398: niet ST398).

III. RESULTATEN

25

Figuur 3.4: Dendrogram per grootwarenhuis/slager van de verkregen fingerprints na PFGE van een selectie

van de stalen. Links bovenaan staat een schaal waarop de similariteit in percentage terug te vinden is. Naast de

“fingerprints” staat telkens de numerieke codes die overeenkomen met het aantal repeats van gen clfA, clfB,

sdrC, sdrE, SIRU, stamnummer, afkomst [grootwarenhuis(GW)/slager(SL)], vleessoort (M: mignonette, S: spek,

G: gehakt, R: ribbetjes, P: poten, O: oren), week van staalname (T1 tot en met T6), de gecombineerde

resultaten van de triplex en MRSA ST398 PCR, het SCCmec type en indien bepaald het spa type.

(A: grootwarenhuis A, B: grootwarenhuis B, C: slager C, D: slager D, SA:MSSA, NT: niet ST398).

III. RESULTATEN

26

Figuur 3.5: Dendrogram gebaseerd op MLVA typering. Links bovenaan staat een schaal waarop de similariteit

in percentage terug te vinden is. Daarnaast staat telkens de numerieke codes die overeenkomen met aantal

repeats van gen clfA, clfB, sdrC, sdrE, SIRU, stamnummer, herkomst [grootwarenhuis (GW)/slager (SL)],

vleessoort (M: mignonette, S: spek, G: gehakt, R: ribbetjes, P: poten, O: oren), week van staalname (T1 tot en

met T6), de gecombineerde resultaten van de triplex en MRSA ST398 PCR, het SCCmec type en indien bepaald

het spa type. (GW 1: GW A, GW 2: GW B, SL 1: SL C, SL 2: SL D, SA: MSSA, NT: niet ST398).

III. RESULTATEN

27

3.4 Antibiogrammen De geselecteerde isolaten (n=44) werden getest op resistentie tegen 16 verschillende

anitbiotica. Een aantal van deze antibiotica worden uitsluitend in de humane geneeskunde

gebruikt zoals chloramfenicol, fucidine, linezolid, mupirocine, quino/dalfopristine en

rifampicine. De overige antibiotica worden onder andere gebruikt in de diergeneeskunde,

waarvan het meeste sulfonamides/ trimethoprim (behoort tot de antibioticumklasse van

sulfonamides) en tetracyline. Tevens werden combinaties van drie antibiotica gebruikt, om

kruisresistentie aan te tonen (erythromycine, lincomycine en tylosine/ kanamycine,

gentamicine en tobramycine).

Alle isolaten waren gevoelig aan rifampicine, mupirocine, linezolid en sulfonamides.

De meerderheid (≥74%) van de isolaten waren gevoelig aan quinupristine/dalfopristine,

gentamicine, tobramycine, kanamycine, chloramfenicol, erythromycine, fucidine en tylosine.

Ongeveer de helft van de isolaten waren gevoelig aan ciprofloxacine en lincomycine (tabel

3.11). MRSA-isolaten 6845, 6948, 6984, 6989, 7059, 7166, 7492, 7553 en 7554 vertoonden

kruisresistentie aan erythromycine, lincomycine en tylosine. MRSA-isolaten 6848, 6849,

6854, 6990, 7322 en 7661 waren kruisresistent aan kanamycine, gentamicine en

tobramycine.

Tot slot was 68% van de MRSA isolaten resistent aan trimethoprim en 84% aan tetracycline

(tabel 3.11). Vier MSSA isolaten waren gevoelig voor alle antibiotica en één was resistent aan

tetracycline (tabel 3.12). De resistentiepercentages van MSSA, MRSA en MRSA ST398 tegen

de verschillende antibiotica werd uitgezet in staafdiagrammen (figuur 3.6 en 3.7).

Tabel 3.11: Percentages van de resistente, intermediair resistente en sensitieve isolaten weergegeven per

antibioticum.

Antibiotica Resistent Intermediair Sensitief

Quinupristine/dalfopristine 9% 2% 89%

Trimethoprim 68% 2% 30%

Gentamicine 16% - 84%

Tobramycine 16% - 74%

Kanamycine 16% 5% 79%

Erythromycine 23% - 77%

Ciprofloxacine 48% - 52%

Tetracycline 84% - 16%

Rifampicine - - 100%

Mupirocine - - 100%

Chloramfenicol 2% - 98%

Linezolid - - 100%

Fucidine 2% - 98%

Sulfonamides - - 100%

Lincomycine 41% 2% 57%

Tylosine 18% 2% 80%

III. RESULTATEN

28

Tenslotte werden de verschillende antibiotypes bepaald (tabel 3.12). Er werden 23

antibiotica resistentieprofielen gevonden: 2 bij MSSA, 18 bij MRSA ST398 en 3 antibiotypes

bij MRSA (niet ST398) isolaten. Eén antibiotype bij de MSSA isolaten vertoonde resistentie

aan tetracycline en één van de antibiotypes bij de MRSA (niet ST398) isolaten vertoonde

resistentie aan fucidine, een humaan geneesmiddel. Ten slotte wordt in tabel 3.13 de

aanwezigheid van elk antibiotype geanalyseerd per grootwarenhuis/slagerij. De selectie van

isolaten afkomstig van grootwarenhuis A behoorden tot slechts zes antibiotypes in

vergelijking met de isolaten afkomstig van grootwarenhuis B die tot 12 antibiotypes

behoorden. De isolaten van slagerij C en D behoorden respectievelijk tot 9 en 10

antibiotypes. Antibiotypes vier en vijf kwamen voor bij alle geselecteerde isolaten van beide

grootwarenhuizen en beide slagers en antibiotype drie kwam voor bij grootwarenhuis B en

beide slagers (tabel 3.13).

III. RESULTATEN

29

Figuur 3.6: Staafdiagram met de resultaten van de antibiogrammen van de isolaten. Het percentage van de resistente MSSA en/of MRSA isolaten per antibioticum

wordt weergegeven. (CLR: chloramfenicol, CIP: ciprofloxacine, ERYTR: erythromycine, FUCID: fucidine, GEN: gentamicine, KANAM: kanamycine, LINCO: lincomycine, LINEZ:

linezolid, MUPIR: mupirocine, SYN: quinupristine/daflopristine, RIFAM: rifampicine, SULFA: sulfonamides, TET: tetracyline, TOBRA: tobramycine, TRIME: trimethoprim,

TYLOS: tylosine).

III. RESULTATEN

30

Figuur 3.7: Staafdiagram met de resultaten van de antibiogrammen van de MRSA isolaten. Het percentage van de resistente MRSA en MRSA ST398 isolaten per

antibioticum wordt weergegeven. Daarnaast werd ook de resistentie weergegeven van alle MRSA isolaten. (CLR: chloramfenicol, CIP: ciprofloxacine, ERYTR:

erythromycine, FUCID: fucidine, GEN: gentamicine, KANAM: kanamycine, LINCO: lincomycine, LINEZ: linezolid, MUPIR: mupirocine, SYN: quinupristine/daflopristine, RIFAM:

rifampicine, SULFA: sulfonamides, TET: tetracyline, TOBRA: tobramycine, TRIME: trimethoprim, TYLOS: tylosine).

III. RESULTATEN

31

Tabel 3.12: Overzicht van de verkregen antibiotypes voor MSSA en MRSA (ST398/ niet ST398) isolaten. (R: resistent, S: sensitief, %: aantal positieve isolaten in percentage per antibiotype, CLR: chloramfenicol, CIP: ciprofloxacine, ERYTR: erythromycine, FUCID: fucidine, GEN: gentamicine, KANAM: kanamycine, LINCO: lincomycine,

LINEZ: linezolid, MUPIR: mupirocine, SYN: quinupristine/daflopristine, RIFAM: rifampicine, SULFA: sulfonamides, TET: tetracyline, TOBRA: tobramycine, TRIME:

trimethoprim, TYLOS: tylosine).

CLR CIP ERYTR FUCID GEN KANAM LINCO LINEZ MUPIR SYN RIFAM SULFA TET TOBRA TRIME TYLOS % Antibiotype

MSSA (n=5) S S S S S S S S S S S S S S S S 80 1

S S S S S S S S S S S S R S S S 20 2

MRSA ST398 (n=36)

S S S S R R S S S S S S R R R S 17 3

S S S S S S S S S S S S R S R S 14 4

S R S S S S S S S S S S R S R S 11 5

S R R S S S R S S S S S R S R R 8 6

S R S S S S R S S S S S R S R S 8 7

S R S S S S S S S S S S R S S S 6 8

S S S S S S S S S S S S S S S S 6 9

S S R S S S R S S R S S R S R R 3 10

S S R S S S R S S S S S R S S S 3 11

S S S S S S R S S S S S R S R S 3 12

S R S S S S R S S R S S R S R S 3 13

S S S S S S S S S S S S R S S S 3 14

S S R S R S R S S S S S R R R R 3 15

S S R S S S R S S S S S R S R R 3 16

R R S S S S R S S R S S R S R S 3 17

S S S S S S R S S R S S R S S S 3 18

S S R S S S R S S S S S R S S R 3 19

S S S S S S R S S S S S R S S S 3 20

MRSA (niet ST398,

n=3)

S S R R S S R S S S S S S R R S 33 21

S S R S S R R S S S S S R R R R 33 22

S S S S S S S S S S S S S S S S 33 23

III. RESULTATEN

32

Tabel 3.13: Weergave van de aan- of afwezigheid van de verschillende antibiotypes per grootwarenhuis (GW) en slagerij (SL). (NA: geen MSSA of niet ST398 MRSA isolaten gedetecteerd op de vleeswaren afkomstig van het grootwarenhuis of slagerij, +: aanwezig, -: afwezig, %: percentage van de isolaten behorende tot dit type).

Antibiotype GW A GW B SL C SL D %

MSSA (n=5) 1 + NA - NA 80,00

2 + NA + NA 20,00

3 - + + + 16,22

4 + + + + 13,51

5 + + + + 10,81

6 + + - + 8,11

7 - + + - 8,11

8 + + - - 5,41

9 - + - + 5,41

MRSA ST398 (n=36) 10 - + - - 2,70

11 - + - - 2,70

12 - + - - 2,70

13 - + - - 2,70

14 - - + - 2,70

15 - - + - 2,70

16 - - - + 2,70

17 - - - + 2,70

18 - + - - 2,70

19 - - - + 2,70

20 - - + - 2,70

MRSA

(niet ST398, n=3)

21 NA NA - + 33,33

22 NA NA - + 33,33

23 NA NA + - 33,33

IV. DISCUSSIE EN CONCLUSIE

33

IV. Discussie en conclusie

Sinds 2004 is een nieuw type MRSA, namelijk MRSA ST398 gerapporteerd dat bij varkens en

andere voedselproducerende dieren (zoals kippen en koeien) voorkomt. Indien MRSA ST398

ook aanwezig zou zijn op het vlees van deze dieren, kan het via deze weg verspreid worden

doorheen de humane populatie en een direct (door voedselvergiftigingen te veroorzaken) en

indirect (door na kolonisatie antibiotica-resistentiegenen uit te wisselen met andere

bacteriën) probleem vormen voor de volksgezondheid. Om deze hypothese te onderzoeken,

werden in totaal 137 varkensvleesstalen aangekocht bij vier verschillende slagerijen en

onderzocht op de aanwezigheid van MSSA en MRSA (ST398).

4.1 Prevalentie van MSSA en MRSA op varkensvlees Er werd bij vijf vleesstalen (4%) rechtstreeks methicilline sensitieve S. aureus teruggevonden.

Het aantal kve op deze positieve stalen was maximaal 100 kve/g en 606 kve/cm² en

voldeden dus aan de FAVV criteria. Deze stalen waren één mignonettestaal, één gehaktstaal,

één ribbetje en twee oren. Alle stalen, behalve de oren, waren afkomstig van slager C. De

oren waren aangekocht bij grootwarenhuis A. Van Loo et al. (2007) voerden een gelijkaardig

studie uit in Nederland en onderzochten 64 varkensvleesstalen, waarvan 37,5% MSSA-

positief was (van Loo et al, 2007). Dit deed vermoeden dat er waarschijnlijk meer dan vijf

stalen MSSA-positief waren in dit onderzoek en dat de lage waarden te wijten kunnen zijn

aan het moeilijk aflezen van SA-ID platen en de niet geschikte methodologie voor de

vleesmatrix. Nochtans werd het protocol uit de literatuur gehaald (O’brien et al, 2012).

Daarnaast werd het protocol vooral opgesteld voor de selectie van MRSA in plaats van

MSSA.

MRSA werd rechtstreeks geïsoleerd uit 13 stalen (9%). De vleesstalen waren: drie

mignonettestalen, één spekstaal, één gehaktstaal, één ribbetje, drie poten en vier oren.

De teruggevonden MRSA aantallen op deze vleessoorten en één van de drie poten lagen

onder de aangegeven limiet van het FAVV en vormden volgens de wetgeving geen direct

gevaar voor de volksgezondheid. Er werden MRSA aantallen (7374 kve/cm² en 8002

kve/cm²) gevonden bij twee aangekochte poten die het criterium van het FAVV

overschreden. Daar poten weinig gekocht worden en bovendien niet rauw geconsumeerd

worden, vormden deze stalen hoogstwaarschijnlijk geen direct gevaar. Er werd naast de

poten ook vaak MRSA gevonden bij de oren. Deze vleeswaren worden eveneens weinig

gekocht, waardoor het gevaar op besmetting met MRSA zeer gering was. De meerderheid

van de MRSA-positieve stalen waren afkomstig van slagerijen C en D. Dit zou kunnen

betekenen dat in grootwarenhuizen de hygiënemaatregelen strenger zijn. In Nederland

testten van Loo et al. (2007) 64 aangekochte varkensvleesstalen op MRSA (van Loo et al,

2007). Geen van de stalen testten positief voor MRSA.

Na aanrijking van de vleesstalen bleken 90 stalen (65,7%) MRSA-positief te zijn. Vooral de

ribbetjes, poten en oren waren MRSA-positief. Ribbetjes worden vaak geconsumeerd in

vergelijking met poten en oren. Indien het vlees voor het bakken gemanipuleerd wordt, is er

een mogelijke kans op besmetting via kruiscontaminatie. In een Duits onderzoek van Beneke

et al. (2011) werd de aanwezigheid van MRSA in rauwe vleesproducten na aanrijking


34

onderzocht (Beneke et al, 2011). In deze studie werden weinig MRSA-positieve

varkensvleesstalen (2,8%) gevonden. In Nederland werden ook verschillende aangekochte

vleesstalen onderzocht. Van de 309 varkensvleesstalen, waren 33 (10,7%) positief na

aanrijking (de Boer et al, 2009). Deze percentages liggen onder de gevonden waarden in het

huidig onderzoek. Enige verklaring hiervoor is dat in dit onderzoek poten en oren werden

ingesloten daar uit een voorstudie bleek dat de poten het meeste MRSA gecontamineerde

deel van het karkas is. In de studies van Beneke et al. (2011) en de Boer et al. (2009) werd

niet vermeld welke vleessoorten op MRSA onderzocht werden.

Tevens bevatten alle vleesstalen van slagerij D in week één na aanrijking grote aantallen

MRSA. Dit zou verklaard kunnen worden doordat de vleesstalen afkomstig waren van

éénzelfde geïnfecteerd varken of door kruisbesmetting, waardoor MRSA verspreid werd van

de ene naar de andere vleessoort. Tijdens dit onderzoek werd er geen verband

teruggevonden tussen tijdstip van staalname en het aanwezige aantal MRSA per gram of

vierkante centimeter op de verschillende vleessoorten van één bepaalde zaak. Aangezien de

hoge aantallen pas verkregen werden na aanrijking en de proef niet op grote schaal

uitgevoerd werd, kunnen hieromtrent geen besluiten getrokken worden.

4.2 Typeringen van de MSSA en MRSA isolaten Van de 912 stammen, geïsoleerd uit de verschillende vleesstalen, testten 153 positief bij de

triplex PCR. Van deze positieve stammen waren 6 isolaten S. aureus en 147 isolaten MRSA.

Zevenennegentig procent van de gevonden MRSA isolaten behoorden tot type ST398 of het

diergebonden MRSA. Dit zou kunnen betekenen dat de teruggevonden MRSA isolaten,

afkomstig waren van het varken zelf en aanwezig bleven doorheen de gehele productieketen

tot het finale product. Een andere mogelijkheid is dat de karkassen in het slachthuis besmet

werden met een circulerende MRSA ST398 stam uit de slachthuisomgeving of

gecontamineerd slachthuispersoneel. Ook kan er in de slagerij een bron aan MRSA aanwezig

zijn. MRSA ST398 zou zich dus via vlees kunnen verspreiden naar de gemeenschap, maar de

kans blijft klein aangezien de teruggevonden aantallen op het vlees zeer laag waren. Het

hoge ST398 percentage werd eveneens teruggevonden in een studie van de Boer et al.

(2009), waarbij 97% van de MRSA isolaten, ST398 waren (de Boer et al, 2009). De weinige

niet-ST398 MRSA isolaten zijn hoogstwaarschijnlijk van humane oorsprong. Deze kunnen

afkomstig zijn van personen die het vlees bewerkten, zoals personeel uit het slachthuis en de

slagerij.

SCCmec typering werd uitgevoerd op de MSSA en MRSA isolaten, om na te gaan welke

SCCmec cassette deze stammen bevatten. SCCmec is een mobiel genetisch element dat

onder andere het methicilline resistentie gen draagt. Er werden drie soorten SCCmec

cassettes teruggevonden (SCCmec types IVa, IVc en V) waarvan type V predominant was

(77%). Zoals eerder vermeld, komen SCCmec types IVa en V meestal in LA-MRSA voor

(de Neeling et al, 2007; Huijsdens et al, 2006; Rasschaert et al, 2009; van Duijkeren et al,

2008). Dit bevestigt het vermoeden dat de gevonden MRSA isolaten van dierlijke afkomst

waren. De aanwezigheid van SCCmec cassette IVc in MRSA ST398 wordt weinig

gerapporteerd, daar weinig studies type IV subtyperen (Vanderhaeghen et al, 2010). Type

IVc wordt wel vaak teruggevonden in HA-MRSA (Higashiyama et al, 2011; Orendi et al, 2010).

De SCCmec cassette IVc kan afkomstig zijn van een humane MRSA stam en via horizontale

gentransfer doorgegeven zijn aan een MRSA ST398 stam. In het onderzoek van Beneke et al.


35

(2011) werden SCCmec types III en V teruggevonden in de MRSA isolaten, afkomstig van

twee positieve varkensvleestalen (Beneke et al, 2011).

Er werden zes spa types teruggevonden: t008, t127, t011, t034, t2370, en t091. Spa type

t008 kwam in deze thesis uitsluitend voor bij de MSSA isolaten en behoort volgens de spa

server samen met t011 en t127 tot één van de tien werelds meest voorkomende spa types

bij S.aureus. Spa type t011 werd het meeste teruggevonden in deze studie en dan uitsluitend

bij MRSA ST398 isolaten. Dit spa type werd in het verleden reeds geassocieerd met

diergebonden MRSA (Beneke et al, 2011, Rasschaert et al, 2009). In de meeste gevallen

kwam spa type t011 voor met SCCmec cassette V. Deze combinatie (t011-SCCmec type V) is

een vaak voorkomende combinatie bij MRSA ST398 stammen (Beneke et al, 2011). Spa type

t034 is een spa type dat vaak gedetecteerd werd bij MRSA. Spa type t2370 werd tot op

heden weinig teruggevonden in MSSA en MRSA en werd enkel beschreven in België en

Duitsland (http://www.spaserver.ridom.de/). Type t091 is een veel voorkomend type bij MSSA

stammen en werd tijdens deze studie teruggevonden bij één MSSA isolaat. Daar er slechts

28 isolaten getypeerd werden door middel van spa typering, kon er geen verband vast

gesteld worden tussen het spa type en de vleessoort/slagerij.

Na analyse van de PFGE bandpatronen van de selectie van isolaten werden in totaal

18 verschillende pulsotypes teruggevonden. Na het clusteren van de MRSA ST398 isolaten

werden 11 profielen gevonden, waarvan één profiel 17 MRSA ST398 stammen bevatte. Het

merendeel van deze stammen bevatten SCCmec casette V, behalve één isolaat die tot

type IVa behoorde. Verder behoorden de meeste isolaten van dit profiel tot spa type t011,

met als uitzondering één stam die onder spa type t2370 viel. In een ander profiel

vertoonden vier MRSA ST398 stammen met SCCmec cassette IVa 100% gelijkenis. De MSSA

stammen kwamen allen voor in aparte profielen, waarvan twee MSSA (spa type t008)

pulsotypes 80% gelijkenis vertoonden.

Vijf van de zes isolaten van grootwarenhuis A waren MRSA ST398 stammen met SCCmec

cassette V en behoorden tot hetzelfde pulsotype, wat toch een zekere dominantie over de

tijd aantoonde van deze stam in dit grootwarenhuis. Het overige isolaat was een MSSA stam.

Doordat vijf stammen 100% gelijkenis vertoonden, zou dit kunnen betekenen dat het

materiaal in grootwarenhuis A of in het slachthuis waar ze hun vlees aankopen,

gecontamineerd is met dit MRSA ST398 pulsotype. Hetzelfde werd gezien voor de isolaten

van grootwarenhuis B. Bij de slagers werden minder verwantschappen tussen de profielen

van de isolaten gevonden. Dit kan wijzen op de aanwezigheid van meerdere stammen

binnen de slagerij. Slagers krijgen vlees toegeleverd van een vleesverkoper, waardoor hun

vlees niet altijd van hetzelfde slachthuis afkomstig is. Als er in de verschillende slachthuizen,

verschillende MRSA types aanwezig zijn, zou dit de resultaten kunnen verklaren.

Bij het vergelijken van de resultaten van de PFGE en MLVA typering werd vaak gezien dat

stammen die samenclusterden in één pulsotype, drager waren van verschillende MLVA

types. Dit komt doordat MLVA beschouwd wordt als een hoog discriminerende techniek en

doordat de repeat regio’s van genen sneller muteren dan de knipplaatsen van restrictie-

enzymen. Na MLVA typering werden 153 profielen teruggevonden. Weinig isolaten

vertoonden 100% verwantschap met elkaar wat doet vermoeden dat stammen afkomstig

waren van meerdere contaminatiebronnen. Naast de varkens, kunnen ook het slachthuis en

slachthuismedewerkers, transport en transportwagen en de slager en slagerij zelf fungeren

als bron. Tevens werd een dendrogram opgesteld met de data van de MRSA ST398 isolaten.


36

Binnen de meeste MLVA types waren de MRSA ST398 stammen, afkomstig van verschillende

vleesstalen, aangekocht op verschillende tijdstippen bij verschillende slagerijen. Eén

uitzondering was MLVA type (33-56-36-7-3) dat werd teruggevonden op alle vleessoorten

aangekocht in week één bij slager D. Deze MRSA ST398 stammen droegen allen SCCmec

cassette IVa. Dit kan betekenen dat de verschillende vleessoorten afkomstig waren van

éénzelfde geïnfecteerd varken of besmet werden door kruiscontaminatie vanuit dezelfde

contaminatiebron.

4.3 Antibiotica resistentiebepaling

Antibiotica resistentiebepaling toonde aan dat het merendeel van de MRSA ST398 isolaten

resistent waren tegen trimethoprim en tetracycline, antibiotica die vaak gebruikt worden in

de diergeneeskunde. De gevonden resistentie stemt overeen met andere studies (de Neeling

et al, 2007; Denis et al, 2009; Dewaele et al, 2011). Eén van de vier MSSA isolaten was

resistent aan tetracycline. Dit kon bijvoorbeeld een MRSA isolaat geweest zijn dat zijn

SCCmec cassette verloren is door het wegvallen van selectiedruk tegen deze cassette.

Tevens kon het MSSA isolaat zijn dat een tetracycline-resistentiegen verworven heeft door

horizontale gen transfer. Deze evolutie is zorgwekkend, aangezien gewone SA stammen op

die manier resistent kunnen worden aan deze antibiotica en voor problemen kunnen zorgen

in de humane geneeskunde.

Alle isolaten waren gevoelig aan de linezolid, mupirocine, rifampicine en sulfonamides,

waarvan de eerste drie uitsluitend in de humane geneeskunde gebruikt worden. Eén MRSA

(niet ST398) isolaat was resistent aan fucidine, één MRSA ST398 isolaat aan chloramfenicol

en quino/dalfopristine en drie andere MRSA ST398 isolaten aan quino/dalfopristine. Deze

drie antibiotica zijn humane geneesmiddelen. Infecties veroorzaakt door dit soort isolaten,

kunnen problemen vormen in ziekenhuizen waar deze antibiotica gebruikt worden als

geneesmiddel. Eén MRSA ST398 isolaat bleek gevoelig te zijn aan tetracycline, wat doet

vermoeden dat dit isolaat zijn tetracyclineresistentiegen verloren is doorheen de

productieketen doordat de selectiedruk uit de stallen wegvalt. Tevens bleek één MRSA (niet

ST398) isolaat gevoelig te zijn aan alle antibiotica. Dit kan liggen aan de te hoge

concentraties van de NeosensitabsTM

die gebruikt werden, waardoor de resistentie tegen

bepaalde genen bij dit isolaat niet opgemerkt konden worden. Verder onderzoek naar de

aanwezige resistentiegenen of MIC bepaling van deze stam zou nog kunnen uitgevoerd

worden. Eén MRSA (niet ST398) isolaat was resistent aan 7 van de 16 geteste antibiotica,

waaronder tetracycline.

Doordat de SCCmec types IV en V minder antibiotica resistentiegenen dragen dan de andere

types, zijn MRSA ST398 stammen veel gevoeliger aan antibiotica, wat tijdens deze thesis ook

opgemerkt werd. Stammen met SCCmec type IVa bleken vaak resistent aan gentamicine,

kanamycine en tobramycine, wat reeds beschreven werd (Gomez-Sanz et al, 2010,

Verhegghe et al, 2012). Stammen met SCCmec type V waren vaak resistent tegen

ciprofloxacine, erythromycine, lincomycine, quinupristine/dalfopristine en tylosine. Eén stam

met SCCmec type V was tevens resistent aan fucidine.

De enorme variatie aan antibioticaresistentieprofielen draagt opnieuw bij tot het vermoeden

dat de MRSA isolaten een verschillende (maar dierlijke) oorsprong hebben.


37

4.4. Conclusie

Om te vermijden dat MRSA ST398 terecht komt in de gemeenschap via kruiscontaminatie

met varkensvlees, werd de aanwezigheid van MRSA ST398 doorheen de

varkensproductieketen onderzocht. Gedurende deze thesis werd de contaminatiegraad van

MRSA op varkensvlees bepaald, aangekocht bij twee grootwarenhuizen en twee slagers.

Er werd slechts weinig MSSA en MRSA rechtstreeks geïsoleerd uit de verschillende

vleesstalen. De teruggevonden aantallen (kve/g en kve/cm²) voldeden aan de criteria

opgesteld door het FAVV. Opvallend was dat het meeste MRSA gevonden werd bij de

slagers, wat doet vermoeden dat grootwarenhuizen er een strengere hygiëne op nahouden.

Verder onderzoek zal hieromtrent meer uitsluitsel moeten geven. Algemeen gesteld is de

kans op direct besmettingsgevaar via vlees vrij laag, gezien de lage aantallen. Tevens werd

vooral bij poten en oren MRSA gedetecteerd, maar aangezien het weinig consumeren van

deze vleessoorten, blijft het besmettingsgevaar vrij laag. Verder onderzoek is nodig om het

risico van MRSA kolonisatie bij mensen na te gaan na contact met besmet varkensvlees.

Moleculaire typering van de verkregen isolaten heeft aangetoond dat de meeste MRSA

isolaten van dierlijke oorsprong (ST398) waren, wat kan betekenen dat de MRSA isolaten van

het varken zelf afkomstig waren en aanwezig bleven doorheen het volledige

vleesproductieproces. Technieken zoals spa typering en SCCmec typering bevestigden de

dierlijke oorsprong. Typeringsmethoden zoals PFGE en MLVA typering leverden een enorme

variatie aan genotypes op, wat doet vermoeden dat de MRSA isolaten afkomstig zijn van

meerdere contaminatiebronnen. Naast de varkens, kunnen ook het slachthuis en hun

personeel, transportwagens en de slager en slagerij fungeren als bron. Desondanks werd er

bij de grootwarenhuizen isolaten gevonden met hetzelfde pulsotype en enige dominantie

over de tijd. Dit zou kunnen betekenen dat het materiaal van deze grootwarenhuizen of in

het slachthuis waar ze hun vlees aankopen, gecontamineerd is met het gevonden MRSA

ST398 type. Ook werd bij één slager eenzelfde MLVA type teruggevonden op één tijdstip wat

kan betekenen dat de verschillende vleesstalen afkomstig waren van éénzelfde besmette

groep varkens of besmet werden door kruiscontaminatie vanuit dezelfde contaminatiebron

aanwezig in de slagerij.

Naar antibioticaresistentie toe bleken alle isolaten gevoelig aan linezolid, mupirocine,

rifampicine en sulfonamides, waarvan de eerste drie geneesmiddelen zijn voor mensen.

Enkele MRSA isolaten waren resistent tegen geneesmiddelen (fucidine, chloramfenicol en

quino/dalfopristine) die uitsluitend gebruikt worden in de humane geneeskunde, wat op

termijn problemen zou kunnen geven met infecties veroorzaakt door deze isolaten. De

meerderheid van de MRSA ST398 isolaten waren resistent aan tetracycline en trimethoprim,

beide vaak gebruikte antibiotica in de veeteelt.

V. MATERIAAL EN METHODEN

38

V. Materiaal en methoden

5.1 Vleesstalen Wekelijks werden er zes varkensvleesstalen aangekocht bij twee grote winkelketens en twee

kleinere slagerijen. Volgende stalen werden gekocht: varkenspoten- en oren, spek,

varkensgehakt, ribben en mignonettes. Bij één grote winkelketen was er geen varkensgehakt

verkrijgbaar. Tabel 5.1 geeft het aantal verwerkte vleesstalen per winkel/slagerij weer.

Tabel 5.1: Het aantal verwerkte vleesstalen per grootwarenhuis of slagerij. (NA staat voor niet aanwezig)

Grootwarenhuis Slagerij Totaal

A B C D

Mignonette 6 6 6 6 24

Spek 6 6 6 6 24

Gehakt NA 6 6 6 18

Ribbetjes 6 6 6 6 24

Poten 6 6 6 6 24

Oren 6 6 5 6 23

Totaal 30 36 35 36 137

5.2 Het verwerken van de vleesstalen Er werd 25 g van het spek, de mignonettes en het gehakt afgewogen en toegevoegd aan

225 ml Mueller Hinton Broth (MHB) medium (Oxoid, CM0405, Basingstroke, Hampshire,

Engeland, samenstelling zie addendum) aangerijkt met 6,5% NaCl (Merck, 1.06404.100,

Darmstadt, Duitsland). Het zout werd toegevoegd om reeds te selecteren voor onder andere

Staphylococi en tegen zoutsensitieve bacteriën. Staphylococcus aureus stammen zijn

namelijk resistent aan een verhoogde zoutconcentratie. Vervolgens werden deze vleesstalen

één minuut gehomogeniseerd door middel van een “stomacher” (Led Techno, masticator,

IUL). De varkensribben, poten en oren werden opgemeten, gewogen en één op één verdund

in MHB met zout. Deze stalen werden vervolgens gedurende één minuut manueel bewerkt.

Van elk vleesstaal werd een seriële verdunningsreeks van nul tot 10-5

gemaakt in MHB met

6,5% NaCl. Van de nul verdunningen werd 100 µl rechtstreeks op selectieve MRSA-ID en SA-

ID platen (chromID MRSA 43459, S. aureus, 43371, bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankrijk)

geënt. Daarnaast werd 100 µl van de overige verdunningen van de verschillende reeksen op

SA-ID geënt. De verdunningsreeksen werden vervolgens aangerijkt gedurende 18 à 20 uur bij

37 °C en de platen gedurende 48 uur bij 37 °C (Fig. 5.1).


39

Figuur 5.1: Schematische voorstelling van de verwerking van de vleesstalen. (MHB: mueller hinton broth)

40

5.3 Aflezen en uitzuiveren van de SA-ID en MRSA-ID platen 5.3.1 Rechtstreeks uitplaten van de stalen

Na 24 en 48 uur incubatie bij 37 °C werden de SA-ID platen afgelezen en de verschillende

kolonies geteld. S. aureus stammen vertonen een groene kleur op SA-ID. Vijf groene kolonies

werden geselecteerd van één plaat per verdunningsreeks van elk vleesstaal en kregen een

stamnummer. Deze kolonies werden vervolgens geënt op Columbia base blood agar (CBA)

(Oxoid, CM0331, Basingstroke, Hampshire, Engeland, samenstelling zie addendum) met

cefoxitine (3,5 mg/l, Sigma Aldrich, Fluka®, C4786-56, St-Louis, USA) aangezien MRSA

stammen resistent zijn aan cefoxitine. Tevens werden de kolonies uitgestreken op Baird

Parker (BP) medium (Gelose Baird Parker RPF, 44003, Biomérieux, Marcy L’etoile, Frankrijk)

(Fig. 5.2). Het uitplaten op BP medium is om na te gaan of de kolonies al dan niet coagulase

positief zijn. Daarnaast werd elke kolonie ook uitgezuiverd op SA-ID. De CBA en BP platen

werden voor 24/48 uur geïncubeerd bij 37 °C en de SA-ID platen voor 24 uur.

Figuur 5.2: Het selecteren en oppikken van vijf groene kolonies op een SA-ID plaat. De groene kolonies

werden vervolgens overgeënt op een Columbia base agar (CBA), Baird parker (BP) en SA-ID (SA-ID 2) plaat.

Na 24 en 48 uur incubatie werden eveneens de MRSA-ID platen afgelezen. MRSA stammen

hebben een typische blauwgroene kleur op MRSA-ID. Eén typische kolonie van één

vleesstaal kreeg een stamnummer en werd uitgezuiverd op MRSA-ID. De MRSA-ID platen

werden overnacht (verder) geïncubeerd bij 37 °C.

5.3.2 Uitplaten van de stalen na aanrijking

Er werd 100 µl van elke aangerijkte verdunning geënt op MRSA-ID platen en één milliliter

van de nul verdunningen toegevoegd aan negen millimeter Tryptone Soy Broth (TSB) (Oxoid,

CM0129, Basingstroke, Hampshire, Engeland, samenstelling zie addendum) met cefoxitine

(5mg/l) en aztreonam (75 mg/l, Sigma Aldrich, A6848, St-Louis, USA). De antibiotica werden

toegevoegd om te selecteren voor MRSA. De MRSA-ID platen werden afgelezen na 24 en 48

uur incubatie bij 37 °C zoals eerder beschreven. Wanneer de MRSA platen negatief waren

voor een vleesstaal werd er 100 µl van de TSB tubes uitgestreken op een MRSA-ID plaat. Na

24 en 48 uur incubatie werden ook deze MRSA-ID platen afgelezen zoals eerder beschreven.


41

5.3.2 CBA en BP platen

De CBA platen en BP platen werden na 24 en 48 uur incubatie afgelezen. MRSA stammen

vertoonden groei op CBA medium. Tevens kon er soms hemolyse gedetecteerd worden.

Op BP platen hadden coagulase positieve kolonies een zwarte kleur en was er een halo

rondom de kolonies te zien.

5.4 Identificatie van de MRSA isolaten 5.4.1 DNA extractie

Ter voorbereiding van de DNA extractie werd één kolonie van de uitzuiverings- MRSA en SA-

ID platen overgeënt op Tryptone Soya Agar (TSA) platen (Biokar diagnostics, BKo47HA, Zac

de ther, Allone Beauvais, Frankrijk, samenstelling zie addendum). Het DNA van de kolonies

werd geëxtraheerd volgens een aangepaste methode van Strandèn et al. (2003). Hierbij

werd een bacteriële suspensie gemaakt door een tweetal kolonies op te lossen in 45 µl water

en 5 µl lysostaphine (1 mg/ml, Sigma-Aldrich®, L7386, St-Louis, USA). Het enzym lysostaphine

werkt optimaal bij 37 °C en breekt de bacteriële celwand af. Na 10 minuten incubatie bij

37 °C werd 5 µl proteïnase K (2,5 mg/ml, Promega, V3021, Madison, USA) en 150 µl

UltrapureTM

Tris HCl (0,1 M, pH 8, Invitrogen, 15506-017, Carlsbad, USA) toegevoegd en

werden de suspensies 10 minuten geïncubeerd bij 60 ° C om het DNA te precipiteren.

Proteïnase K neutraliseert lysostaphine en Tris HCl stabiliseert de pH en maakt de membraan

kapot. Tenslotte werd het lysaat vijf minuten geïncubeerd bij 100° C om alle enzymen te

deactiveren. Het DNA werd vervolgens bewaard bij -20 °C. De overige bacteriële kolonies op

de TSA platen werd opgelost in Brain/Heart Infusion (BHI) (Oxoid, CM0225, Basingstroke,

Hampshire, Engeland, samenstelling zie addendum) met 15% glycerol (Merck, 8.18709.1000,

Hohenbrunn, Duitsland) en bewaard bij -20 °C.

5.4.2 Triplex PCR

Bij de MRSA specifieke multiplex PCR werden drie genen geamplificeerd (tabel 5.2): het

methicilline resistentie gen mecA (om de methicilline resistentie te bepalen), het nuc gen

(coderend voor een S. aureus specifieke regio van het thermonuclease gen) en een genus

specifieke 16S ribosomaal ribonucleïnezuur sequentie (16S rRNA, als controle) (Maes et al,

2002).

De PCR mix bevat 2,5 µl 10X PCR buffer (Eurogentec), 2 µl MgCl2 (Eurogentec, 25 mM),

0,25 µl deoxyribonucleotide trifosfaat (dNTP) mix (10 mM, GE Healthcare), 0,2 µl Red

Diamond Taq® polymerase (5 U/µl, Eurogentec, Taq-1040-5000), 1 µl van de mecA primers

(10 µM, Eurogentec), 1,5 µl van de nuc primers (10 µM, Eurogentec) en 1,5 µl van de 16S

rRNA primers (10 µM, Eurogentec). Het PCR reactiemengsel werd aangelengd met 10,05 µl

high-performance liquid chromatography (HPLC) water. Aan deze mastermix werd tenslotte

3 µl lysaat toegevoegd.

Als positieve controle werd het DNA van een MRSA stam uit de stock toegevoegd en voor de

negatieve controle werd geen lysaat toegevoegd.


42

Het PCR programma (Applied Biosystems, Geneamp® PCR system 9700) bestond uit

10 minuten denaturatie bij 94 °C. Vervolgens ondergingen de stalen 30 cycli: één minuut bij

94 °C om het DNA te denatureren, één minuut bij 51 °C voor de hybridisatie van de primers,

en twee minuten bij 72 °C voor de extensie van de primer. Ten slotte bestond het

programma nog een finale elongatie van vijf minuten bij 72 °C.

Tabel 5.2: De gebruikte voorwaartse en reverse primers bij de triplex PCR. (MecA: methicilline resistentie gen,

nuc: thermonucleasegen, 16S rRNA: 16S ribosomaal ribonucleïnezuur, F: forward, R: reverse, bp: basenparen)

Gen Primer

Oriëntatie Lengte

amplicon

Primersequentie (5’-3’)

MecA MecA F Forward 533 bp AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC

MecA R Reverse AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC

Nuc Nuc F Forward 279 bp GCGATTGATGGTGATACGGTT

Nuc R Reverse AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC

16S rRNA 16S rRNA F Forward 750 bp GTTATTAGGGAAGAACATATGTG

16S rRNA R Reverse CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC

5.4.3 Agarosegelelektroforese

Acht microliter PCR-product werd gemengd met 2 μl ladingsbuffer (10X, samenstelling voor

20 ml: 6 ml glycerol, 0,025 g broomfenol, 0,4 ml 1M TrisHCl en 13,6 ml H20). De stalen

werden geladen op 1,5% een Seakem LE agarosegel (Seakem® LE agarose, Lonza, 50004,

Rocklandt, ME USA) opgelost in 60 ml UltrapureTM

TAE buffer (0,5X, Invitrogen, 15581-044,

Carlsbad, USA). Daarnaast werd 4 µl van een 100 basenparen DNA ladder (Track it,

Invitrogen) geladen. De gel werd gelopen in een tank (Advance, Mupid®-EX) met TAE buffer

(0,5X) bij een constante spanning van 100 volt over 30 minuten. Ten slotte werd de gel

15 minuten in een ethidiumbromide bad (25 µl ethidiumbromide in 250 ml water, Sigma-

Aldrich, 46067, St-Louis, USA) gekleurd en met UV licht bestraald, waarbij de DNA

fragmenten gevisualiseerd werden aan de hand van fluorescentie van het geïntercaleerde

ethidiumbromide. De gel werd vervolgens digitaal gefotografeerd.

5.4.4 MRSA ST398 specifieke PCR

De CC398 PCR is gebaseerd op de klonale verschillen binnen S. aureus in de sau1hsd1

sequentie, een gencomplex verantwoordelijk voor specifieke restrictiemodificaties15.

De CC398 primers amplificeren een fragment van 296 bp van de sau1hsd1 sequentie. De

mecup primers zijn specifiek voor het mecA gen en dienen om te kunnen differentiëren

tussen MRSA en niet-MRSA isolaten (tabel 5.3) (Stegger et al, 2011).

De PCRmix bestond uit 2,5 µl 10X PCR buffer (Applied biosystems), 0,75 µl van de forward en

reverse mecup primers (10 µM, Eurogentec), 0,75 µl van de forward en reverse CC398

primers (10 µM, Eurogentec), 2,5 µl dNTPs (10 µM, GE healthcare), 1,5 µl MgCl2 (25 mM,

Applied biosystems, N13201), 0,3 µl Taq polymerase (5 u/µl, Applied biosystems, Amplitaq®

DNA polymerase, N13176) en 13,2 µl HPLC water. Tenslotte werd 2 µl lysaat toegevoegd. Als

positieve controle werd het DNA van een MRSA stam uit de stock toegevoegd en voor de

negatieve controle werd geen lysaat toegevoegd.


43

Het PCR programma bestond uit: 12 minuten denaturatie bij 95 °C, 35 cycli van 30 seconden

denaturatie bij 95 °C – 30 seconden hybridisatie bij 61 °C en één minuut extensie bij 72 °C,

10 minuten finale elongatie bij 72 °C.

Tenslotte werden de PCR stalen geladen op gel, zoals beschreven in 4.3.2.

Tabel 5.3: De gebruikte voorwaartse en reverse primers bij de triplex PCR. (F: forward, R: reverse,

Bp: basenparen).

Gen Primer Oriëntatie Lengte

amplicon


MecA Mecup F Forward 500 bp GGGATCATAGCGTCATTATTC

Mecup R Reverse AACGATTGTGACACGATAGCC

Sau1hsd1 CC398 F Forward 296 bp AGGGTTTGAAGGCGAATGGG

CC398 R Reverse CAGTATAAAGAGGTGACATGACCCCT

5.5 Het bestuderen van lange termijn evoluties 5.5.1 Spa typering

Achtentwintig van de bekomen stammen werden opgestuurd naar het CODA waar de spa

typering werd uitgevoerd.


Op alle verkregen isolaten werd SCCmec typering uitgevoerd die bestond uit drie PCR

reacties (Kondo et al, 2007; Milheirico et al, 2007a; Milheirico et al, 2007b; Oliveira &

Lencastre, 2002) Alle reactiemengsels bestonden uit 25 µl Taq PCR mastermix (Qiagen,

1007544). PCR reactie één bevatte 18 primers (25 µM, Eurogentec, tabel 5.4): 0,4 µl van de

primers 1 en 2, 0,8 µl van de primers 3 tot 6 en van de primers 8 tot 15, 2,4 µl van primer 7

en 1,6 µl van de primers 16 en 17. Bij de tweede mix werden 10 primers (25 µM, Eurogentec,

tabel 5.5) gebruikt: 0,4µl van de primers 1 tot 4, 0,8µl van de primers 5 tot 7 en 1,6 µl van de

primers 8 tot 10. De laatste en derde mix bevatte zes primers (25 µM, Eurogentec, tabel 5.6):

2 µl van de primers 1 en 2, 1,6 µl van de primers 3 en 4 en 1,2 µl van de primers 5 en 6.

Elke PCR mix werd tot 45 µl aangelegd met HPLC water. Tenslotte werd aan elk

reactiemengsel 5 µl lysaat toegevoegd. In totaal werden er acht controles toegevoegd: dit

waren stalen die drager zijn van gekende SCCmec cassettes (type I, II, III, IV, IVa, IVb, IVc, IVd

en V) (Fig. 5.3).

Het PCR programma bestond uit: vier minuten denaturatie bij 94 °C, 30 cycli van één minuut

denaturatie bij 94 °C, één minuut hybridisatie bij 51 °C en twee minuten extensie bij 72 °C,

vijf minuten elongatie bij 72 °C. Tenslotte werden de PCR stalen geladen op gel, zoals

beschreven in 5.4.3 (“Agarosegelelektroforese”).


44

Tabel 5.4: De primers van SCCmec PCR reactie één. (F: forward, R: reverse). *Om de SCCmec varianten IA van I

en IIIA van III te onderscheiden, werd de sequenties tussen IS431 en het geïntegegreerde plasmide pUB110

(aanwezig in variant IA) of pT181 (afwezig in variant IIIa) geamplificeerd.

Tabel 5.5: De primers van SCCmec PCR reactie twee. (F: forward, R: reverse).

Primers (25 µMf) Nummer Primersequentie (5’-3’) SCCmec specificiteit

Rif4 F3 1 GTGATTGTTCGAGATATGTGG III, J3 regio

Rif4 R9 2 CGCTTTATCTGTATCTATCGC III, J3 regio

Cif2 F2 3 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG I, J1 regio

Cif2 R2 4 ATTTACCACAAGGACTACCAGC I, J1 regio

MecA P4 5 TCCAGATTACAACTTCACCAGG Interne controle

MecA P7 6 CCACTTCATATCTTGTAACG Interne controle

IS431 P4 7 CAGGTCTCTTCAGATCTACG *

pUB110 R1 8 GAGCCATAAACACCAATAGCC *

KDP F1 9 AATCATCTGCCATTGGTGATGC II, J1 regio

KDP R1 10 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG II, J1 regio

Dcs F2 11 CATCCTATGATAGCTTGGTC I, II en IV, J3 regio

Dcs R1 12 CTAAATCATAGCCATGACCG I, II en IV, J3 regio

Rif5 F10 13 TTCTTAAGTACACGCTGAATCG III, J1 regio

Rif5 R13 14 GTCACAGTAATTCCATCAATGC III, J1 regio

pT181 R1 15 GAAGAATGGGGAAAGCTTCAC *

Meci P2 16 ATCAAGACTTGCATTCAGGC II en III, mec complex

Meci P3 17 GCGGTTTCAATTCACTTGTC II en III mec complex

Primers (25 µM) Nummer Primersequentie (5’-3’) SCCmec specificiteit

J IVa F 1 ATAAGAGATCGAACAGAAGC IVa

J IVa R 2 TGAAGAAATCATGCCTATCG IVa

J IVb F 3 TTGCTCATTTCAGTCTTACC IVb en IVF

J IVb R 4 TTACTTCAGCTGCATTAAGC IVb en IVF

ccrB2 F 5 CGAACGTAATAACATTGTCG II en IV, ccr complex

(positive controle)

J IVc F 6 CCATTGCAAATTTCTCTTCC IVc en IVE

J IVc R 7 ATAGATTCTACTGCAAGTCC IVc en IVE

ccrB2 R 8 TTGGCWATTTTACGATAGCC II en IV, ccr complex

(positive controle)

J IVd F 9 TCTCGACTGTTTGCAATAGG IVd

J IVd R 10 CAATCATCTAGTTGGATACG IVd


45

Tabel 5.6: De primers van SCCmec PCR reactie drie. (F: forward, R: reverse)

Figuur 5.3: Resultaat van SCCmec typering met primerset één (links), twee (midden) en drie (rechts) op de

controles. (L: 100 basenparen ladder)

Primers (25 µM) Nummer Sequentie SCCmec specificiteit

IVb F 1 TCTGGAATTACTTCAGCTGC IVb

IVb R 2 AAACAATATTGCTCTCCCTC IVb

IVc F 3 ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC IVc

IVc R 4 TTGGTATGAGGTATTGCTGG IVc

V F 5 GAACATTGTTACTTAAATGAGCG V

V R 6 TGAAAGTTGTACCCTTGACACC V


46

5.5.3 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) Van de 169 MSSA en MRSA isolaten werden 44 stammen geselecteerd waarop PFGE werd

uitgevoerd (Rasschaert et al, 2009). De selectie bestond uit vijf MSSA isolaten en 39 MRSA

isolaten, geïsoleerd van telkens hetzelfde vleestype aangekocht op verschillende tijdstippen

bij éénzelfde slagerij. Deze MSSA en MRSA stammen werden vanuit de glycerolstock geënt

op TSA platen. Na 24 uur incubatie werden een paar kolonies per stam opgepikt en opgelost

in 3 ml EET buffer (100 mM EDTA: Merck, 31.03.15, Darmstadt, Duitsland; 10 mM EGTA:

Sigma-Aldrich, E8145-506, St-Louis, USA; 10 mM Tris HCl, pH 8 aangelengd tot 500 ml met

HPLC water). Vervolgens werd van elke suspensie de optische densiteit (OD) gemeten bij

610 nm door middel van een spectrofotometer. De concentratie werd aangepast tot een

OD610nm van 0,9 in 1 ml EET buffer. Daarna werd er 15 minuten gecentrifugeerd op 4000

“revolutions per minute” (rpm, Eppendorf, 5147C) bij 4 °C. Het supernatans werd afgenomen

en de pellet geresuspendeerd in 1 ml EET buffer. Daaropvolgend werd 200 µl van de

bacteriële suspensie opgemengd met 200 µl 2% InCert® agarose (Lonza, 50123, Rockland,

ME USA). Hiervan werd 300 µl in een well van de plughouder gepipetteerd. Na het stollen

werden de plugs overgebracht in 1 ml lysebuffer [0,85 ml EET buffer, 0,05 ml lysostaphine (1

mg/ml, Sigma-Aldrich, L7386, St-Louis, USA) en 0,1 ml lysozyme (10 mg/ml, Roche,

10.837.059.001, Mannheim, Duitsland) en gedurende vier uur geïncubeerd bij 37 °C. Na

incubatie werden de plugs overgebacht naar 15 ml tubes gevuld met 2 ml

deproteïnatiebuffer [1,7 ml EET buffer, 0,2 ml proteïnase K (10 mg/ml) en 20%

natriumdodecylsulfaat (SDS, Sigma-Aldrich, L4509-5006, St-Louis, USA)] en overnacht

geïncubeerd bij 50 °C. De dag erna werd de deproteïnatiebuffer weggegoten en 5 ml TE

buffer [(0,05 ml Tris HCl (1 M, pH 8), 0,01 ml EDTA (0,5 M, pH 8) aangelengd tot 5 ml met

HPLC water] toegevoegd. De suspensie werd geïncubeerd in een warmwaterbad van 50 °C

voor een halfuur. Deze laatste wasstap werd zeven keer herhaald. Daarna werd 5 ml TE

buffer aan de plugs toegevoegd en konden ze bewaard worden in de koelkast.

Diezelfde dag of een andere dag kon het restrictiedigest uitgevoerd worden. Daarvoor werd

30 U restrictie-enzym [BstZI (gen van Bacillus stearothermophilus, Promega, R6881, Madison,

USA) voor de stalen en XbaI (gen van Xanthomonas badrii, promega, R6186, Madison, USA)

voor de merker, S. Braenderup, toegevoegd aan 100 µl restrictiebuffer

(1X, Promega, buffer D, R004A met BSA (bovine serum albumin acetylated, 10mg/ml,

Promega, R396D). De plugs werden overgebracht naar deze oplossing en overnacht

geïncubeerd bij de optimale temperatuur voor de restrictie-enzymen: 50 °C voor BstZI en

37 °C voor XbaI.

De dag erna werd de gel gemaakt: 1% Seakem Gold agarose (Lonza, 50150, Rocklandt, ME,

USA) in 160 ml UltrapureTM

TBE buffer (0,5X, Gibco, 15581-044, Grand Island, NY).

Vervolgens werden de plugs overgebracht in de slotjes van de gel. Daarna werd de gel

gelopen in TBE buffer (0,5X) in de ChefMapperTM

(Biorad®) bij 14 °C. Het elektroforese

programma, aangepast aan het restrictie-enzym, staat beschreven in tabel 5.7.

Tabel 5.7: Het Pulsed Field Gel Elektroforese programma voor plugs geknipt met het enzym BstZI.

Enzyme Gradiënt Hoek Looptijd Pulstijd

BstZI 6 V/cm 120 ° 20u18 0,46s – 35,38s


47

Na afloop van het elektroforese programma, werd de gel gekleurd in een ethidiumbromide

bad (40 µl in 400 µl water) gedurende 30 minuten. Tenslotte werd de gel ontkleurd in water

gedurende 30 minuten en onder UV licht digitaal gefotografeerd. De gels werden vervolgens

geanalyseerd in het programma Bionumerics® (versie 6.5, Applied Maths, St-Martens Latem,

België). Een dendrogram werd bekomen na analyse met Unweighted Pair Group Method

with Arithmetic Mean (UPGMA) met de Dice coëfficient (tolerantie: 1%, tolerantie lading:

1,5%, Optimalisatie: 1%).

5.6 Het bestuderen van korte termijn evoluties: Multi-Locus Variable numer tandem repeat Analyse (MLVA)

Bij de MLVA typering werden vier VNTR loci geamplificeerd: ClfA (clumpingfactor A, zie 1.2),

ClfB (clumpingfactor B, zie 1.2), SIRU21 (“staphylococcal interspersed repeat unit” 21) en sdr

(SD repeat) (tabel 5.8). De locus SIRU21 codeert voor spa (Hardy et al, 2004; Rasschaert et al,

2009). De sdr locus bestaat uit drie open reading frames: C, D en E die coderen voor

adhesines.

De MLVA typering bestond uit twee PCR reacties. Beide mixen bevatten 2,5 µl Q oplossing

(Qiagen) en 12,5 µl Type-it Multiplex PCR master mix (Qiagen, 206246). Het eerste

reactiemengsel bevatte 0,12 µl van de voorwaartse en reverse SIRU21 primer (10 µM, tabel

5.8) en 0,22 µl van de voorwaartse en reverse ClfB primer (10 µM, tabel 5.8). De tweede PCR

mix bestond uit 0,22 µl van de voorwaartse en reverse sdrCDE primer (10 µM, tabel 5.8) en

0,35 µl van de voorwaartse en reverse ClfA primer (10 µM, tabel 5.8). Beide reactievolumes

werden aangelengd tot 22 µl met HPLC water. Ten slotte werd aan beide mixen 3 µl lysaat

toegevoegd. Als positieve controle werd het DNA van een MRSA stam uit de stock

toegevoegd en voor de negatieve controle werd geen lysaat toegevoegd.

Het PCR programma bestond uit: 5 minuten denaturatie bij 94 °C, 25 cycli van 30 seconden

denaturatie bij 94 °C – 30 seconden hybridisatie bij 51 °C en één minuut extensie bij 72 °C,

5 minuten finale elongatie bij 72 °C.

De voorwaartse primers waren voorzien van een 5’ fluorescent label (PET, 6-FAM en VIC,

tabel 5.8). De verschillende fluoroforen zullen door laser illuminatie energie aboserberen en

licht emiteren van verschillende golflengtes. De kleur en golflengte van het geëmiteerde licht

is afhankelijk van de labels. Op deze manier kunnen verscheidene PCR producten

tegelijkertijd onderzocht worden. De gelabelde PCR producten en de GenescanTM

1200LIZ®

merker (4379950, Applied Biosystems, Warrington, Verenigd Koninkrijk) ondergingen

fragmentanalyse door middel van capillaire elektroforese met de 3130xl Genetic Analyzer

(Applied Biosystems/ Hitachi, Hitachinaka-shi, Japan). Nadien werden de “variable number of

tandem repeat units” (VNTR) geanalyseerd met Bionumerics® (versie 6.5, Applied Maths, St-

Martens-Latem, België). Aan elke VNTR werd een nummer toegekend. Op deze manier kreeg

elk isolaat een numerieke code. Vervolgens ondergingen deze codes categorische analyse

(tolerantie: 0%) met een dendrogram als resultaat.


48

Tabel 5.8: De gebruikte voorwaartse en reverse primers bij MLVA PCR. (ClfA en B: clumpingfactoren A en B,

SIRU: staphylococcal interspersed repeat unit, sdr: SD repeat, F: forward, R: reverse, bp: basenparen, Y: C, T of

U. PET: rood, 6-FAM: blauw en VIC: groen emissielicht)

Locus Primer

Label Oriëntatie Lengte

amplicon


ClfA ClfA 5’ PET Forward 1000 bp GATTCTGACCCAGGTTCAGA

ClfA Reverse CTGTATCTGGTAATGGTTCTTT

ClfB ClfB 5’ 6-FAM Forward 1100 bp ATGGTGATTCAGCAGTAAATCC

ClfB Reverse CATTATTTGGTGGTGTAACTCTT

SIRU21 SIRU21 5’ PET Forward 300 bp AGCAGTAGTGCCGTTTGCTT

SIRU21 Reverse GCTCAAGCACCAAAAGAGGA

sdrCDE sdrCDE 5’ VIC Forward 200 en

700/800 bp

TTACGGATCATGATGATTTCA

sdrCDE Reverse CAYTACCTGTTTCTGGTAATGCTT


49

5.7 Antibiotica resistentiebepaling Op de 45 geselecteerde MSSA en MRSA isolaten werd de resistentie tegen verscheidene

antibiotica getest. Deze MSSA en MRSA stammen werden vanuit de glycerolstock geënt op

TSA platen. Na 24 uur incubatie bij 37 °C, werden enkele kolonies van de TSA platen opgepikt

en opgelost in 5 ml 0,9% NaCl oplossing. Vervolgens werd de OD gemeten bij 610 nm en de

concentratie van de suspensie aangepast tot een OD610nm van 0,125. Daaropvolgend werd

door middel van een wattenstaafje de bacteriële suspensie uitgestreken op een Mueller

Hinton II agar (MHA II) plaat (Oxoid, CM0337, Basingstroke, Hampshire, Engeland,

samenstelling zie addendum). Na het drogen werden de NeosensitabsTM

(Rosco, Taestrup,

Denenmarken, tabel 5.9) aangebracht op de platen volgens een bepaald patroon

(zie addendum) met behulp van een dispenser (Rosco, ref 8577502, Taestrup,

Denenmarken). Vervolgens werden de platen 24 uur geïncubeerd bij 37 °C. Tenslotte werd

de diameter van de resistentiezone rond de Neo-sensitabs gemeten. Resistentie werd

bepaald aan de hand van grenswaarden van de fabrikant (zie tabel 5.9). Tevens werd een

MRSA negatieve (ATCC25923) en MRSA positieve (stam 4361) stam als interne controle

meegenomen.

Tabel 5.9: Een overzicht van de Neo-sensitabs (en concentraties) gebruikt om de antibiotica resistentie te

bepalen van de MRSA stammen. Afhankelijk van de diameter rondom de sensitab (uitgedrukt in millimeter), is

de stam gevoelig, intermediair gevoelig of resistent voor/tegen het antibioticum.

Antibioticum Sensitief Intermediair Resistent

Quinupristine/dalfopristine 15µg ≥ 19 18-16 ≤ 15

Trimethoprim 5,2µg ≥ 20 19-17 ≤ 16

Gentamicine 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

Tobramycine 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

Kanamycine 100µg ≥ 25 24-21 ≤ 20

Erythromycine 78µg ≥ 26 25-19 ≤ 18

Ciprofloxacine 10µg ≥ 20 19-17 ≤ 16

Tetracycline 80µg ≥ 22 21-19 ≤ 18

Rifampicine 30 µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

Mupirocine 10µg ≥ 14 - ≤ 13

Chloramphenicol 60µg ≥ 25 24-21 ≤ 20

Linezolid 30µg ≥ 21 - ≤ 20

Fucidine 100µg ≥ 28 27-24 ≤ 23

Sulfonamides 240µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

Lincomycine 19µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

Tylosine 150µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

ADDENDUM

50

Addendum

A.1. Resultaten Tabel met de verschillende isolaten, afkomst, vleessoort (M: mignonette, S: spek, G: gehakt, R: ribbetjes, O: oren, P: poten), week van staalname (1 tot en met 6), de

resultaten van de triplex PCR, CC398 PCR, SCCmec typering, Spa typering, PFGE- typering (BstZI 1 tot 18 zijn de verschillende pulsotypes), MLVA (MLVA 1 tot MLVA 21zijn

de verschillende MLVA profielen), antibioticaresistentie. (Blauwgroene stamnummers zijn isolaten die uiteindelijk geen S.aureus bleken te zijn, Rood: resistent, groen:

sensitief, oranje: intermediair resistent, NT: niet ST398, CLR: chloramfenicol, CIP: ciprofloxacine, ERYTR: erythromycine, FUCID: fucidine, GEN: gentamicine, KANAM:

kanamycine, LINCO: lincomycine, LINEZ: linezolid, MUPIR: mupirocine, SYN: quinupristine/daflopristine, RIFAM: rifampicine, SULFA: sulfonamides, TET: tetracyline, TOBRA:

tobramycine, TRIME: trimethoprim, TYLOS: tylosine).

Stamnr Afkomst Vlees Week Triplex CC398 SCC Spa PFGE-selectie

MLVA-selectie CLR CIP ERYTR FUCID GEN KANAM LINCO LINEZ MUPIR SYN RIFAM SULFA TET TOBRA TRIME TYLOS

MV-6751 Slager C M 1 MSSA MSSA gn BstZI 3

MLVA 16 34 30 34 42 22 28 36 32 28 24 34 31 34 21 27 30

MV-6839 Slager C O 1 + ST398 V

MV-6840 Slager C O 1 + ST398 IVa

MV-6841 Slager C O 1 + ST398 IVa

MV-6842 Slager D M 1 + ST398 IVa


MV-6844 Slager D P 1 + ST398 IVa

MV-6845 Slager D P 1 + ST398 V t2370 BstZI 6

MLVA 3 29 31 0 38 23 30 0 31 27 24 34 29 0 22 0 11


MV-6847 Slager D S 1 + ST398 IVa

MV-6848 Slager D G 1 + ST398 IVa t011 BstZI 10

MLVA 9 30 23 32 34 0 14 32 26 26 23 33 28 15 0 0 36

MV-6849 Slager D R 1 + ST398 IVa t011 BstZI 12

MLVA 9 29 21 31 32 21 23 32 28 25 22 30 28 0 20 0 29

MV-6850 Slager C M 1 + ST398 V t011 BstZI 15

MLVA 9 30 24 32 34 0 14 32 28 26 23 31 28 16 0 0 30

MV-6851 Slager C R 1 + ST398 V

MV-6852 Slager C P 1 + ST398 V


MV-6854 Slager D P 1 + ST398 IVa BstZI 10

MLVA 9 28 28 30 34 0 13 30 28 26 23 32 27 15 0 0 28

MV-6855 Slager D O 1 + ST398 IVa

ADDENDUM

51

MV-6892 Grootwarenhuis A O 1 MSSA MSSA gn t008 BstZI 4

MLVA 1 29 26 33 36 23 30 34 28 27 24 35 28 31 22 28 30

MV-6893 Grootwarenhuis A O 1 MSSA MSSA gn t008 BstZI 17

MLVA 20 32 30 32 36 26 30 34 28 25 25 34 34 13 23 26 32

MV-6895 Slager D P 1 + ST398 V

MV-6896 Grootwarenhuis B M 1 + ST398 V

MV-6897 Grootwarenhuis B G 1 + ST398 V

MV-6898 Grootwarenhuis B P 1 + ST398 V t011 BstZI 6

MLVA 8 30 29 32 34 23 29 34 28 27 23 34 27 0 22 0 29

MV-6899 Grootwarenhuis B O 1 + ST398 V t011 BstZI 11

MLVA 5 33 27 13 36 23 30 12 30 30 17 34 29 0 22 30 29

MV-6900 Grootwarenhuis A M 1 + ST398 V

MV-6901 Grootwarenhuis A S 1 + ST398 V t011 BstZI 6

MLVA 5 30 0 30 34 22 28 32 31 25 24 33 29 0 22 30 29

MV-6902 Grootwarenhuis A R 1 + ST398 V

MV-6903 Grootwarenhuis A P 1 + ST398 IVa

MV-6904 Grootwarenhuis A P 1 + ST398 IVa

MV-6905 Grootwarenhuis A O 1 + ST398 IVa



MV-6945 Grootwarenhuis B S 2 + ST398 V



MLVA 5 29 23 32 34 22 28 12 32 27 22 32 28 0 21 0 30


MLVA 5 28 30 0 34 23 29 0 30 28 11 32 28 0 22 0 12



MLVA 5 29 23 32 32 22 29 30 30 26 23 31 28 11 21 0 28


MV-6952 Grootwarenhuis A P 2 + ST398 V

MV-6953 Grootwarenhuis A O 2 + ST398 V


MV-6971 Slager D R 2 - - gn 30 34 34 28 26 34 36 34 23 24 33 38 36 25 13 34

MV-6972 Slager D P 2 - - gn 36 32 36 26 32 40 38 32 36 21 38 33 38 30 36 34

MV-6979 Slager C R 2 MSSA MSSA gn t091 BstZI 1

MLVA 18 30 28 33 38 22 28 32 32 28 24 34 26 34 21 20 28

MV-6981 Slager C G 2 + ST398 V

ADDENDUM

52

MV-6982 Slager C R 2 + ST398 IVc


MV-6984 Slager D R 2 + ST398 V t011 BstZI 6

MLVA 6 26 14 0 38 22 30 0 30 26 21 33 31 0 22 0 12

MV-6985 Slager D P 2 + ST398 IVa



MV-6989 Slager D G 2 + nt ST398 V BstZ 18

MLVA 21 42 35 0 18 32 34 0 42 40 32 50 33 31 12 0 25

MV-6990 Slager C M 2 + ST398 IVa t011 BstZ 14

MLVA 7 28 27 32 34 0 13 32 27 25 23 34 29 15 0 0 29

MV-6991 Slager D S 2 + ST398 V

MV-6994 Grootwarenhuis B M 3 - - gn 35 36 36 28 38 36 30 30 26 25 39 38 38 27 17 34

MV-7057 Grootwarenhuis B M 3 + ST398 V BstZI 9

MLVA 4 30 0 32 32 34 30 11 28 28 23 34 28 0 22 0 30

MV-7058 Grootwarenhuis B S 3 + ST398 V

MV-7059 Grootwarenhuis A S 3 + ST398 V BstZI 6

MLVA 14 29 0 0 28 22 29 0 29 25 22 33 27 0 22 0 11

MV-7060 Grootwarenhuis B R 3 + ST398 V


MLVA 4 29 0 31 34 21 27 12 38 25 23 32 28 0 20 0 28

MV-7062 Grootwarenhuis B O 3 + ST398 V BstZI 6

MLVA 9 28 0 30 34 24 29 0 28 25 15 33 28 0 22 0 29

MV-7074 Slager C R 3 + ST398 V 29 30 34 34 25 29 36 34 22 26 33 28 14 21 20 30

MV-7075 Slager C R 3 - - gn 32 30 32 36 23 28 30 26 23 25 34 30 32 23 23 26

MV-7077 Slager C P 3 - - gn 30 28 30 30 23 27 26 28 25 23 34 28 30 22 22 26







MV-7084 Slager C O 3 - - gn


MV-7087 Slager D M 3 + ST398 V


ADDENDUM

53






MV-7094 Slager D S 3 - - gn

MV-7096 Slager D G 3 (+)? ST398 V

MV-7097 Slager D G 3 (+)? ST398 V

MV-7098 Slager D G 3 (+)? ST398 V 30 29 32 34 22 25 30 28 24 24 32 29 30 22 22 28

MV-7099 Slager D G 3 (+)? ST398 V

MV-7100 Slager D G 3 (+)? ST398 V

MV-7101 Slager D R 3 (+)? ST398 V

MV-7111 Slager D O 3 + ST398 V



MV-7153 Slager D R 3 - - gn 42 20 52 36 28 33 50 40 0 32 44 52 41 17 18 50


MV-7163 Slager C M 3 + ST398 V t011 BstZI 6

MLVA 9 30 0 32 36 22 28 11 28 25 22 31 26 0 20 0 30

MV-7164 Slager C S 3 + ST398 V

MV-7165 Slager C G 3 + nt ST398 IVa BstZI 2

MLVA 17 31 30 32 32 32 28 34 30 25 23 36 34 32 21 20 34

MV-7166 Slager C R 3 + ST398 IVa BstZI 10

MLVA 12 29 25 0 36 0 26 0 29 25 20 34 27 15 0 0 12

MV-7167 Slager C P 3 + ST398 V t011 28 23 30 34 20 27 30 24 26 23 31 25 10,5 20 0 26


MV-7169 Slager D R 3 + ST398 V BstZI 8

MLVA 5



MV-7172 Grootwarenhuis B O 3 + ST398 V

MV-7177 Grootwarenhuis A O 3 - - gn 38 32 42 34 26 30 34 32 0 24 34 27 34 19 22 36


ADDENDUM

54



MLVA 15 30 0 30 34 23 30 30 30 24 23 33 25 0 23 0 28






MV-7291 Grootwarenhuis A M 4 - - gn

MV-7292 Grootwarenhuis A M 4 - - gn 45 18 50 34 30 38 50 38 0 16 45 46 42 19 22 22


MV-7295 Grootwarenhuis A M 4 (+)? ST398 V

MV-7296 Grootwarenhuis A S 4 - - gn 43 20 52 34 30 34 34 32 0 30 44 27 34 20 20 50

MV-7297 Grootwarenhuis A S 4 (+)? ST398 V

MV-7298 Grootwarenhuis A S 4 - - gn



MV-7301 Grootwarenhuis A R 4 - - gn


MV-7317 Grootwarenhuis B R 4 + ST398 V

MV-7318 Grootwarenhuis B P 4 + ST398 V BstZI 6

MLVA 8 28 0 30 30 21 25 30 30 26 23 31 26 0 20 28 27



MV-7322 Grootwarenhuis B O 4 + ST398 IVa t011 BstZI 10

MLVA 9 28 28 32 32 0 12,5 32 32 25 23 32 25 16 0 0 27

MV-7326 Slager C G 4 MSSA MSSA gn t008 BstZI 5

MLVA 2 29 24 30 32 22 27 27 29 25 21 32 32 30 20 25 30

MV-7425 Slager C S 4 + ST398 V

MV-7426 Slager C G 4 + ST398 V

MV-7427 Slager C R 4 + ST398 IVa



ADDENDUM

55

MV-7430 Slager D R 4 + ST398 V t034 BstZI 13

MLVA 19 13 0 32 34 22 28 0 28 29 15 34 28 0 26 0 28



MV-7470 Grootwarenhuis A O 5 MSSA MSSA gn


MV-7491 Grootwarenhuis B P 5 + ST398 V BstZI 6

MLVA 10 27 27 30 32 27 27 0 28 25 14 33 28 0 21 28 27

MV-7492 Grootwarenhuis B O 5 + ST398 V BstZI 6

MLVA 8 27 0 0 28 20 26 0 26 25 20 31 22 0 20 0 0


MLVA 5 27 0 30 34 21 22 25 28 24 23 31 26 0 20 0 27





MV-7546 Slager C M 5 + ST398 V BstZI 6

MLVA 9 28 0 30 32 20 27 31 27 26 27 32 26 0 19 0 26

MV-7547 Slager C G 5 + ST398 IVa




MV-7551 Slager D M 5 + ST398 ?


MV-7553 Slager D G 5 + nt ST398 ? t127 30 30 0 38 22 12 0 36 26 19 34 27 11 11 0 0

MV-7554 Slager D R 5 + ST398 ? t034 28 28 0 32 22 30 0 30 27 19 34 26 16 22 28 0

MV-7555 Slager D O 5 + ST398 ?

MV-7605 Slager C M 6 + ST398 V BstZI 8

MLVZ 11 29 38 28 30 21 27 12 36 26 21 32 27 0 20 29 26


MV-7607 Slager C G 6 + nt ST398 ?


MV-7609 Slager C P 6 + ST398 IVa

MV-7610 Slager D R 6 + ST398 V BstZI 7 MLVA 8

28 0 28 34 21 28 30 24 26 27 33 26 0 21 0 26


ADDENDUM

56



MLVA 9 28 22 30 30 21 26 30 26 24 22 31 24 0 20 0 27



MV-7661 Grootwarenhuis B P 6 + ST398 IVa t011 BstZI 7

MLVA 12 29 23 30 32 0 13 32 26 23 21 30 25 17 0 0 26


MLVA 13 29 0 30 34 22 29 32 29 26 26 32 27 0 21 0 28

ADDENDUM

57

ADDENDUM

58

ADDENDUM

59

Dendrogram gebaseerd op MLVA typering. Links bovenaan staat een schaal waarop de similariteit in

percentage terug te vinden is. Daarnaast staat telkens de numerieke codes die overeenkomen met aantal

repeats van gen clfA, clfB, sdrC, sdrE, SIRU, de resultaten van PFGE bij de selectie van isolaten, stamnummer,

herkomst [grootwarenhuis (GW)/slager (SL)], vleessoort (M: mignonette, S: spek, G: gehakt, R: ribbetjes, P:

poten, O: oren), week van staalname (T1 tot en met T6), de gecombineerde resultaten van de triplex en MRSA

ST398 PCR, het SCCmec type en indien bepaald het spa type. (GW 1: GW A, GW 2: GW B, SL 1: SL C, SL 2: SL D)

ADDENDUM

60

ADDENDUM

61

Dendrogram gebaseerd op MLVA typering van de MRSA ST398 isolaten. Links bovenaan staat een schaal

waarop de similariteit in percentage terug te vinden is. Daarnaast staat telkens de numerieke codes die

overeenkomen met aantal repeats van gen clfA, clfB, sdrC, sdrE, SIRU, de resultaten van PFGE bij de selectie

van isolaten, stamnummer, herkomst [grootwarenhuis (GW)/slager (SL)], vleessoort (M: mignonette, S: spek, G:

gehakt, R: ribbetjes, P: poten, O: oren), week van staalname (T1 tot en met T6), de gecombineerde resultaten

van de triplex en MRSA ST398 PCR, het SCCmec type en indien bepaald het spa type.

(GW 1: GW A, GW 2: GW B, SL 1: SL C, SL 2: SL D)

ADDENDUM

62

A.2 Verwerking vleesstalen 1 Materialen

� Producten

Mueller Hinton Broth (MHB) + 6.5% NaCl

15.75g MHB + 48.75g NaCl + 750 ml water

steriliseren: 15min bij 120°C

Columbia base blood agar (CBA) + cefoxitine (3.5mg/l)

39g CBA + 1000ml water

opkoken tot alles opgelost is


laten afkoelen tot 50-55°C

volume van toegevoegd bloed verwijderen (voor 1l: 50ml bodem verwijderen)

5% schapenbloed toevoegen (50ml per liter)

3.5 ml cefoxitine-oplossing toevoegen

licht schudden (vermijd schuimvorming)

platen gieten en 45min laten drogen

! maar een maand goed, dus goed uitrekenen!

Tryptone Soy Broth (TSB) + cefoxitine (4mg/l) + aztreonam (75mg/l)

30g TSB + 1000ml water


laten afkoelen tot 50-55°C

4 ml cefoxitine-oplossing en 75 ml aztreonam-oplossing toevoegen

verdelen in 15ml falcontubes (9ml per tube)

! maar 1 maand goed, dus met kleinere volumes werken:

6g TSB + 200mlwater

800µl cefoxitine-oplossing

15ml aztreonam-oplossing

Tryptone Soy Agar( TSA) platen

40g TSA + 1000ml water

opkoken tot alles opgelost is


platen gieten en 30 min laten drogen

2 Methode

� Set-up

Vlees halen (gehakt, ribbetjes, oren/poten, mignonette, spek met zwoerd)

Labo (zie ook schema)

25g vlees afsnijden met steriel scalpel (bij ribbetjes en poten: stuk afsnijden en

wegen) en mbv steriele pincet in stomacher zak brengen

225ml Mueller Hinton Broth + 6.5% NaCl toevoegen voor vlees of 1/10 verdunnen

voor ribbetjes en poten

3 minuten stomacheren

1 ml van de suspensie overbrengen in een falcontube met 9 ml Mueller Hinton

Broth + 6.5% NaCl en een seriële verdunning tot 10-5

maken

ADDENDUM

63

Enten verdunningsreeks

op MRSA-ID: 100 µl van de originele verdunning

op SA-ID: 100 µl van alle verdunningen aanbrengen

Incuberen 18-20u bij 37°C

Aflezen + enten ter bevestiging van verdachte kolonies

MRSA-ID: groeneblauwe kolonies = MRSA

Eén verdachte kolonie per plaat enten op MRSA-ID voor uitzuivering

SA-ID: groene kolonies

(best zichtbaar na 48u incubatie)

MSSA bevestigen door kolonie te enten op CBA + cefoxitine

Tellen aantal kolonies

Enten verdunningsreeks

MRSA-ID: 100 µl van alle verdunningen aanbrengen

SA-ID: 100 µl van alle verdunningen aanbrengen indien platen van de dag

ervoor

negatief waren


Aflezen+ enten ter bevestiging van verdachte kolonies

MRSA-ID: groene kolonies = MRSA


Tellen aantal kolonies

SA-ID: groene kolonies

MSSA bevestigen door kolonie te enten op CBA + cefoxitine

CBA+cefoxitine: groei = MRSA, geen groei = MSSA

Van originele verdunning 1ml toevoegen aan TSB + cefoxitine en aztreonam indien

na aanrijking geen MRSA kolonies op MRSA-ID platen

Enten verdunning in TSB + cefoxitine en aztreonam op MRSA-ID


Aflezen+ enten ter bevestiging van verdachte kolonies

MRSA-ID: groene kolonies = MRSA


Eén kolonie enten op TSA voor DNA isolatie en PCR bevestiging

� Controles

Geen, MRSA-ID en SA-ID zijn selectieve bodems

� Interpretatie resultaat

MRSA-ID plaat: groene kolonies van 2 à 3 mm diameter = MRSA

SA-ID plaat: na 48u: groene kolonies= MSSA

CBA + cefoxitine: groei = MRSA, geen groei = MSSA

� Safety part:

o vermelden indien met gevaarlijke producten wordt gewerkt!(o.a. Etbr, fenol)

o indien nodig wijze van afvalverwijdering vermelden

ADDENDUM

64

Na PCR bevestiging de zakjes, falcontubes en platen afdoden.

A.3 DNA extractie • Gebasseerd op Strandèn et al. (2003) • Oplossingen:

- Lysostaphine (Sigma; cat.nr L7386): 1 mg/ml

- Proteïnase K: 2,5 mg/ml in gedestilleerd water

- 0,1 M Tris-HCl (pH 8) • Werkwijze:

- Resuspendeer een kolonie in 45 µl gedestilleerd water + 5 µl lysostaphine (werk op ijs)

- Incubeer 10 min bij 37°C

- + 5 µl proteïnase K + 150 µl Tris-HCl



- Invriezen (max 1 maand houdbaar)

ADDENDUM

65

A.4 Triplex PCR • Gebasseerd op Maes et al. (2002) • PCR mix (25 µl)

* 10x PCR buffer: 2,5 µl

* mecA F (10 µM): 1 µl

* mecA R (10 µM): 1 µl

* nuc F (10 µM): 1 µl

* nuc R (10 µM): 1 µl

* 16S rRNA F S. aureus (10 µM): 1,5 µl

* 16S rRNA R S. aureus (10 µM): 1,5 µl

* dNTP mix (10 mM): 0,25 µl

* MgCl2 (25 mM): 2 µl

* Goldstar polymerase (5u/µl): 0,2 µl

* HPLC water: 10,05 µl

* lysaat : 3 µl

Gen Primer

Oriëntatie Lengte

amplicon


MecA MecA F Forward 533 bp AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC

MecA R Reverse AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC

Nuc Nuc F Forward 279 bp GCGATTGATGGTGATACGGTT

Nuc R Reverse AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC

16S rRNA 16S rRNA F Forward 750 bp GTTATTAGGGAAGAACATATGTG

16S rRNA R Reverse CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC

• PCR programma

10 min 94°C 1x

1 min 94°C

1 min 51°C 30x

2 min 72°C

5 min 72°C 1x

∞ 15°C

• Agarose gelelektroforese -8µl PCR product opmengen met 2 µl ladingsbuffer en laden op 1.5 % Seakem LE in 0.5XTAE - Moleculaire merker: 100 bp (Invitrogen) - Lopen bij 100V gedurende 30 minuten - 15 minuten kleuren in ethidiumbromidebad (25 µl ethidiumbromide in 250 µl water)

ADDENDUM

66

Ampliconlengte MRSA MSSA

MecA 533 bp + +

Nuc 279 bp + -

16S rRNA 750 bp + +

ADDENDUM

67

A.5 CC398 PCR • Gebasseerd op Stegger et al. (2010)

• PCR mix (25µl)

* 10x PCR buffer 2,5 µl

* mecup F (10 µM) 0,75 µl

* mecup R (10 µM) 0,75 µl

* CC398 F (10 µM) 0,75 µl

* CC398 R (10 µM) 0,75 µl

* dNTP mix (10 mM) 2,5 µl

* MgCl2 (25 mM) 1,5 µl

* Taq polymerase (5u/µl) 0,3 µl

* HPLC water 13,2 µl

* lysaat/DNA 2 µl

• PCR programma

12 min 95°C 1x

30 sec 95°C

30 sec 61°C 35x

1 min 72°C

10 min 72°C 1x

∞ 15°C

• Agarose gelelektroforese -8µl PCR product opmengen met 2 µl ladingsbuffer en laden op 1.5 % Seakem LE in 0.5XTAE - Moleculaire merker: 100 bp (Invitrogen) - Lopen bij 100V gedurende 30 minuten - 15 minuten kleuren in ethidiumbromidebad (25 µl ethidiumbromide in 250 µl water)

Ampliconlengte MRSA ST398 MRSA

MecA 500 bp + +

CC398 300 bp + -

ADDENDUM

68

A.6 SCCmec typering • Gebasseerd op Kondo et al. (2007), Milheirico et al. (2007), Oliveira D. en Lencastre H.

(2002) • PCR mix (50 µl)

MIX 1 MIX 2 MIX 3 Voor 1

staal

Voor 1 staal

Voor 1 staal

MM 25µl MM 25µl MM 25µl

H2O 4µl H2O 6.4µl H2O 10.4µl

Rif4 F3 (25µM) 0.4µl IVa F (25µM) 0.4µl IVb F (25µM) 2µl

Rif4 R9 (25µM) 0.4µl IVa R (25µM) 0.4µl IVb R (25µM) 2µl

Cif2 F2 (25µM) 0.8µl IVb F (25µM) 0.4µl IVc F (25µM) 1.6µl

Cif2 R2 (25µM) 0.8µl IVb R (25µM) 0.4µl IVc R (25µM) 1.6µl

MecA P4 (25µM) 0.8µl ccrB2 F (25µM) 0.8µl V F (25µM) 1.2µl

MecA P7 (25µM) 0.8µl IVc F (25µM) 0.8µl V R (25µM) 1.2µl

IS431 P4 (25µM) 0.8µl IVc R (25µM) 0.8µl pUB110 R1

(25µM) 0.8µl

ccrB2 R (25µM) 1.6µl

KDP F1 (25µM) 0.8µl IVd F (25µM) 1.6µl

KDP R1 (25µM) 0.8µl IVd R (25µM) 1.6µl Dcs F2 (25µM) 0.8µl IVg F (25µM) 1.8µl Dcs R1 (25µM) 0.8µl IVg R (25µM) 1.8µl

R1F5 F10 (25µM) 0.8µl IVh F (25µM) 1.8µl R1F5 R13 (25µM) 0.8µl IVh R (25µM) 1.8µl pT181 R1 (25µM) 0.8µl IS431 P4 (25µM) 1.6µl Meci P2 25 µM 1.6µl Meci P3 25 µM 1.6µl

MM: Taq PCR Master Mix kit 1000 units (Qiagen, 201445)

Aan elke mix 5 µl lysaat toevoegen Controles:

� positieve controle: DNA van stammen met gekende SCCmec cassettes (Type I, II, II, IV, IVa, IVb, IVc, IVd en V)

� negatieve controle: 1µl water • PCR programma Thermocycler laten opwarmen. Programma laten lopen tot 94°C, toestel pauzeren en stalen

aanbrengen in het staalblok. Na afsluiten deksel op run duwen

Hold 94°C 4min Cylce 94°C 30sec

53°C 30sec 72°C 1min

for 30 cycles Hold 72°C 4min Hold 15°C forever

• Agarose gelelektroforese

ADDENDUM

69

- 8µl PCR product opmengen met 2 µl ladingsbuffer en laden op 1.5 % Seakem LE in 0.5XTAE - Moleculaire merker: 100 bp (Invitrogen) - Lopen bij 100V gedurende 30 minuten - 15 minuten kleuren in ethidiumbromidebad (25 µl ethidiumbromide in 250 µl water)

De primers van SCCmec PCR reactie 1:



Primers (25 µM) Nummer Primersequentie (5’-3’) SCCmec specificiteit Rif4 F3 1 GTGATTGTTCGAGATATGTGG III, J3 regio Rif4 R9 2 CGCTTTATCTGTATCTATCGC III, J3 regio Cif2 F2 3 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG I, J1 regio Cif2 R2 4 ATTTACCACAAGGACTACCAGC I, J1 regio MecA P4 5 TCCAGATTACAACTTCACCAGG Interne controle MecA P7 6 CCACTTCATATCTTGTAACG Interne controle IS431 P4 7 CAGGTCTCTTCAGATCTACG * pUB110 R1 8 GAGCCATAAACACCAATAGCC * KDP F1 9 AATCATCTGCCATTGGTGATGC II, J1 regio

KDP R1 10 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG II, J1 regio Dcs F2 11 CATCCTATGATAGCTTGGTC I, II en IV, J3 regio Dcs R1 12 CTAAATCATAGCCATGACCG I, II en IV, J3 regio Rif5 F10 13 TTCTTAAGTACACGCTGAATCG III, J1 regio Rif5 R13 14 GTCACAGTAATTCCATCAATGC III, J1 regio pT181 R1 15 GAAGAATGGGGAAAGCTTCAC * Meci P2 16 ATCAAGACTTGCATTCAGGC II en III, mec complex Meci P3 17 GCGGTTTCAATTCACTTGTC II en III mec complex

Primers (25 µM) Nummer Primersequentie (5’-3’) SCCmec specificiteit J IVa F 1 ATAAGAGATCGAACAGAAGC IVa J IVa R 2 TGAAGAAATCATGCCTATCG IVa J IVb F 3 TTGCTCATTTCAGTCTTACC IVb en IVF J IVb R 4 TTACTTCAGCTGCATTAAGC IVb en IVF

ccrB2 F 5 CGAACGTAATAACATTGTCG II en IV, ccr complex

(positive controle) J IVc F 6 CCATTGCAAATTTCTCTTCC IVc en IVE J IVc R 7 ATAGATTCTACTGCAAGTCC IVc en IVE

ccrB2 R 8 TTGGCWATTTTACGATAGCC II en IV, ccr complex

(positive controle) J IVd F 9 TCTCGACTGTTTGCAATAGG IVd J IVd R 10 CAATCATCTAGTTGGATACG IVd

ADDENDUM

70

Resultaat van SCCmec-typering met primerset één (links), twee (midden) en drie (rechts) op de controles. (L: 100 basenparen ladder).

Primers (25 µM) Nummer Sequentie SCCmec specificiteit IVb F 1 TCTGGAATTACTTCAGCTGC IVb IVb R 2 AAACAATATTGCTCTCCCTC IVb IVc F 3 ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC IVc IVc R 4 TTGGTATGAGGTATTGCTGG IVc V F 5 GAACATTGTTACTTAAATGAGCG V V R 6 TGAAAGTTGTACCCTTGACACC V

ADDENDUM

71

A.7 Pulsed Field Gel Elektroforese (PFGE) voor 10 plugs Gebasseerd op Rasschaert et al. (2009)

Day 1

Inoculate S. aureus on TSA plates and incubate at 37°C overnight (O/N).

Day 2

Preparations

Prepare EET buffer (100mM EDTA, 10 mM EGTA, 10 mM Tris HCL, pH 8) as follows:

a. 100 ml of 0.5 M EDTA, pH 8

b. 10 ml of 0.5 M EGTA, pH 8

c. 5 ml of 1 M Tris HCl, pH 8

d. Dilute to 500 ml with sterile UP water

Prepare 2% InCert Agarose in EET Buffer for plugs as follows:

a. Weigh 100 mg of agarose and add 5 ml of EET Buffer

b. Melt agarose in tube in cup of water in microwave. Do not overheat.

Rem. Keep agarose in warm water 50°C until use. If not used all, you can reuse it 2-3 times

(keep at room temperature)

Making of plugs

� Suspend bacterial colonies in 3 ml EET buffer

� Measure OD610 nm (EET buffer is blanc)

� Adjust concentration to OD610 nm 0.9 in 1 ml EET buffer

(for example: if OD is 3.6, then x= (1 x 1.8)/3.6= 0.5 ml of bacterial suspension to 0.5 ml EET buffer)

� Centrifuge at 4°C for for 15 min at 4000 rpm

� Discard supernatans and resuspend pellet in 1 ml EET buffer

� Mix 200 µl of this bacterial Suspension with 200 µl InCert agarose.

� Mix well and bring it in the wells of the plug holder (washed with javel and ethanol)

� Allow plugs to solidify for 15 min. in fridge

Prepare Lysis Buffer (EET buffer, lysostaphine, lysozyme)

8.5 ml of EET buffer

0.5 ml of lysostaphine (stock 1mg/ml)

ADDENDUM

72

1 ml of lysozyme (stock 10 mg/ml)

� Add to small tubes 1 ml of this lysis buffer

� After solidification, bring the plugs in the tubes

� Incubate for 4 hours at 37°C.

During these hours prepare the Deproteinisation Buffer (EET Buffer, Proteinase K, SDS)

can be prepared as follows:

a. 17 ml of EET Buffer

b. 2 ml of Proteinase K solution (10 mg/ml)

c. 1 ml of SDS (20%)

� Add 2 ml of the deproteinisation buffer to the bigger tubes

� Transfer agarose plugs to these tubes

� Incubate overnight in incubator at 50° C

Rem. Incubation time may vary between 2h to 3 days.

Day 3

Washing of plugs

Prepare TE Buffer (10 mM Tris HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8) as follows:

a. 5 ml of 1 M Tris HCl, pH 8

b. 1 ml of 0.5 M EDTA, pH 8

c. Dilute to 500 ml with sterile ultrapure water

� Discard carefully Deproteinisation Buffer

� Add 5 ml of TE Buffer and shake the tubes at room temperature in warm water bath

(50°C) for minimum 30 min

� Pour off TE Buffer and repeat previous step two more times

� The last time, add 5 ml TE Buffer to the plugs. These plugs can be stored in the fridge

ADDENDUM

73

Day 3 or other day

Restriction digestion

� Add 30 U restriction enzym to 100 µl Restriction Buffer

� Incubate in water bath overnight at appropriate temperature

� Do not forget S. Braenderup as marker (XbaI)

Day 4

� Make 2 L 0.5 x TBE

� Prepare 160 ml of a 1% Seakem Gold agarose gel using 0.5 x TBE. Use 150 ml to pour

the gel. Keep the other 10 ml in a warm water bath.

� Prechill the rest of the TBE buffer (1840 ml) in the ChefMapper at 4°C.

� Load the gel, pour the 10 ml agarose over the gel.

� Start the electrophoresis:

o Auto-algoritm

o xK low-xK high,

o calibration 1%

o 0.5 x TBE

o 14°C

o 1% PFGE agarose

o gradient 6.0V/cm

o included angle: 120°

o run time: xx

o switch time: x to x

low - high run time switch time

XmaI 30K-700K 18h 2.63s-63.8s

ApaI 5K-200K 16h 0.22s-17.33s

EagI (BstZI) 10K-400K 20.18h 0.46s-35.38s

SacII 10K-500K 20.18h 0.46s-44.69s

Stain 30 min in 40 ul Etbr in 400 µl Destain 30 min in water

ADDENDUM

74

A.8 Multi-Locus Variable numer tandem repeat Analyse (MLVA) • Gebaseerd op Rasschaert et al. (2009)

• PCR mix (25 µl)

MIX 1 MIX 2 Voor 1 staal (µl) Voor 1 staal

(µl) Q-solution 2,5 Q-solution 2,5 Type-it Multiplex PCR 12,5

Type-it Multiplex PCR 12,5

HPLC-water 6,32 HPLC-water 5,86 SIRU21 F (10µM) 0,12 sdrCDE F (10µM) 0,22 SIRU21 R (10µM) 0,12 sdrCDE R (10µM) 0,22 ClfB F (10µM) 0,22 ClfA F (10µM) 0,35 ClfB R (10µM) 0,22 ClfA R (10µM) 0,35 Totaal: 22 Totaal: 22 Type-it Multiplex PCR mastermix + Q solution (Qiagen, 206246)

PCR mix + 3 µl lysaat

Controles: � positieve controle: steeds hetzelfde positieve staal � negatieve controle: 1 µl water

• PCR programma Thermocycler laten opwarmen. Programma laten lopen tot 94°C, toestel pauzeren en stalen

aanbrengen in het staalblok. Na afsluiten deksel op run duwen

Hold 94°C 5min Cylce 94°C 30sec

58°C 30sec 72°C 1min

for 25 cycles Hold 72°C 5min Hold 15°C forever

• Agarosegel elektroforese

- 8µl PCRstaal opmengen met 2 µl ladingsbuffer en laden op 1.5 % Seakem LE in 0.5XTAE - Moleculaire merker: 100 bp (Invitrogen) - Lopen bij 100V gedurende 30 minuten - 15 minuten kleuren in ethidiumbromidebad (25 µl ethidiumbromide in 250 µl water)

Indien er veel stalen zijn, dan wordt er slechts een elektroforese gedaan om na te gaan of de PCR gelukt is en worden de stalen opgestuurd naar Plant 21 voor fragmentanalyse. Eens de resultaten gekend zijn, kan men ze verwerken via Bionumerics.

ADDENDUM

75

A.9 Antibiogrammen Benodigdheden:

• Dispenser (ref 8577502) • Neo-sensitabs

Ref Antibioticum Sensitief Intermediair Resistent

8571379 quinupristin/dalfopristin 15µg ≥ 19 18-16 ≤ 15

8571710 trimethoprim 5,2µg ≥ 20 19-17 ≤ 16

8570665 gentamicin 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

8571696 tobramycin 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

8570797 kanamycin 100µg ≥ 25 24-21 ≤ 20

8570576 erythromycin 78µg ≥ 26 25-19 ≤ 18

8570420 ciprofloxacin 10µg ≥ 20 19-17 ≤ 16

8571637 tetracyclin 80µg ≥ 22 21-19 ≤ 18

8571459 rifampicin 30 µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

8570983 mupirocin 10µg ≥ 14 - ≤ 13

8570390 chloramphenicol 60µg ≥ 25 24-21 ≤ 20

8570861 linezolid 30µg ≥ 21 - ≤ 20

8570614 fucidin 100µg ≥ 28 27-24 ≤ 23

8571556 sulphonamides 240µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

8570843 lincomycin 19µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

8571726 tylosin 150µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

• Mueller Hinton II Agar platen • Steriele swabs • Flesjes met 5 ml 0.9% NaCl-oplossing

Methode: • Dag 1

1 MRSA kolonie (MRSA-ID) uitstrijken op TSA • Dag 2

Mueller Hinton platen eventueel laten drogen Van TSA enkele kolonies in 0.9% NaCl opsossing suspenderen tot 0.5 McFarland (OD610=0,125) Binnen 15 min een wattenstaafje in de oplossing brengen en op de plaat strijken en de platen minimum 3 en maximum 15 minuten laten drogen Tabs aanbrengen met de dispenser Overnacht incuberen bij 37°C (24u !!!)

• Dag 3 Diameters meten met een lat

ADDENDUM

76

Locatie tabs: ! Lincomycine, erythromycine en tylosine in een driehoek naast elkaar plaatsen (synergisme)

REFERENTIES

77

Referenties

Aarestrup FM, Schwarz S (2006) Antimicrobial resistance in staphylococci and streptococci of animal

origin.

Beneke B, Klees S, Stuhrenberg B, Fetsch A, Kraushaar B, Tenhagen BA (2011) Prevalence of

methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a fresh meat pork production chain. Journal of food

protection 74: 126-129

Bosch T, de Neeling AJ, Schouls LM, van der Zwaluw KW, Kluytmans JA, Grundmann H, Huijsdens XW

(2010) PFGE diversity within the methicillin-resistant Staphylococcus aureus clonal lineage ST398.

BMC microbiology 10: 40

Brock T (2007) Biology of microorganisms

Chambers HF (2001) The changing epidemiology of Staphylococcus aureus? Emerg Infect Dis 7: 178-

182

Chambers HF, Deleo FR (2009) Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the antibiotic era.

Nature reviews Microbiology 7: 629-641

Cuny C, Nathaus R, Layer F, Strommenger B, Altmann D, Witte W (2009) Nasal colonization of

humans with methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) CC398 with and without exposure

to pigs. PloS one 4: e6800

Daum RS, Spellberg B (2012) Progress toward a Staphylococcus aureus vaccine. Clinical infectious

diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 54: 560-567

de Boer E (2008) MRSA in dierlijke producten.

de Boer E, Zwartkruis-Nahuis JT, Wit B, Huijsdens XW, de Neeling AJ, Bosch T, van Oosterom RA, Vila

A, Heuvelink AE (2009) Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in meat.

International journal of food microbiology 134: 52-56

de Neeling AJ, van den Broek MJ, Spalburg EC, van Santen-Verheuvel MG, Dam-Deisz WD, Boshuizen

HC, van de Giessen AW, van Duijkeren E, Huijsdens XW (2007) High prevalence of methicillin resistant

Staphylococcus aureus in pigs. Veterinary microbiology 122: 366-372

Denis O, Suetens C, Hallin M, Catry B, Ramboer I, Dispas M, Willems G, Gordts B, Butaye P, Struelens

MJ (2009) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ST398 in swine farm personnel, Belgium.

Emerg Infect Dis 15: 1098-1101

Deurenberg RH, Stobberingh EE (2008) The evolution of Staphylococcus aureus. Infection, genetics

and evolution : journal of molecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases 8:

747-763

Devriese LA, Van Damme LR, Fameree L (1972) Methicillin (cloxacillin)-resistant Staphylococcus

aureus strains isolated from bovine mastitis cases. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B Journal

of veterinary medicine Series B 19: 598-605

REFERENTIES

78

Dewaele I, Messen W, de Man I, Delputte P, Herman L, Butaye P, Heyndrickx M, Rasschaert G (2011)

Sampling, prevalence and characterization of methicillin-resistant Staphylococcus aureus on two

Belgian pig farms. Veterinary Science Development 1

Enright M, Day N, Davies C, Peacock S, Spratt B (2000) Multilocus Sequence Typing for

Characterization of Methicillin-Resistant and Methicillin Susceptible Clones of Staphylococcus aureus.

Journal of clinical microbiology 38: 1008-1015

Enright MC, Robinson DA, Randle G, Feil EJ, Grundmann H, Spratt BG (2002) The evolutionary history

of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America 99: 7687-7692

Fleming A (1929) on the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to

their use in the isolation of B. influenzae experimental pathology 10: 226-236

Foster T (1996) Medical Microbiology, 4 edn.

Friedrich R, Panizzi P, Fuentes-Prior P, Richter K, Verhamme I, Anderson PJ, Kawabata S, Huber R,

Bode W, Bock PE (2003) Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced

zymogen activation. Nature 425: 535-539

Gibbs SG, Green CF, Tarwater PM, Mota LC, Mena KD, Scarpino PV (2006) Isolation of Antibiotic-

Resistant Bacteria from the Air Plume Downwind of a Swine Confined or Concentrated Animal

Feeding Operation. Environmental Health Perspectives 114: 1032-1037

Gomez-Sanz E, Torres C, Lozano C, Fernandez-Perez R, Aspiroz C, Ruiz-Larrea F, Zarazaga M (2010)

Detection, molecular characterization, and clonal diversity of methicillin-resistant Staphylococcus

aureus CC398 and CC97 in Spanish slaughter pigs of different age groups. Foodborne pathogens and

disease 7: 1269-1277

Graveland H, Duim B, van Duijkeren E, Heederik D, Wagenaar JA (2011) Livestock-associated

methicillin-resistant Staphylococcus aureus in animals and humans. International journal of medical

microbiology : IJMM 301: 630-634

Grundmann H, Aires-de-Sousa M, Boyce J, Tiemersma E (2006) Emergence and resurgence of

meticillin-resistant Staphylococcus aureus as a public-health threat. Lancet 368: 874-885

Haesebrouck F, Vancraeynest D, Hermans K, Catry B, Butaye P, Decostere A (2006)

Methcillineresistente Staphylococcus aureus stammen bij dieren:een gevaar voor de gezondheid van

dier en mens? Vlaams diergeneeskundig tijdschrift 75: 254-261

Hardy KJ, Ussery DW, Oppenheim BA, Hawkey PM (2004) Distribution and characterization of

staphylococcal interspersed repeat units (SIRUs) and potential use for strain differentiation.

Microbiology (Reading, England) 150: 4045-4052

Herschleb J, Ananiev G, Schwartz DC (2007) Pulsed-field gel electrophoresis. Nature protocols 2: 677-

684

Higashiyama M, Ito T, Han X, Nishiyama J, Tanno A, Wada T, Funaoka Y, Yoshida Y, Mikita K, Ogawa T,

Okusa Y, Kaku K, Hatada J, Hiramatsu K, Kawana A (2011) Trial to control an outbreak of Panton-

REFERENTIES

79

Valentine leukocidin-positive methicillin-resistant Staphylococcus aureus at a boarding school in

Japan. American journal of infection control 39: 858-865

http://flashcarddb.com/cardset/140084-antibacs-i-anaerobes-oppor-infections-flashcards

http://mlst.ox.ac.uk

http://www.phila.gov/health/pdfs/CA-MRSA_guidelines.pdf

http://phil.cdc.gov/phil/home.asp

http://spaserver.ridom.de

Huijsdens X, Van Dijke B, Spalburg EC, Van Santen-Verheuvel MG, Heck M, Pluister GN, Voss A,

Wannet WJ, de Neeling AJ (2006) community-acquired MRSA and pig-farming. Annals of clinical

microbiology and antimicrobials 5

Ito T (2009) Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for

reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial agents and chemotherapy 53: 4961-4967

Jessen O, Rosendal K, Bulow P, Faber V, Eriksen KR (1969) Changing staphylococci and staphylococcal

infections. A ten-year study of bacteria and cases of bacteremia. The New England journal of

medicine 281: 627-635

Jevons MP (1961) Celbeninresistant Staphylococcus aureus. British Medical Journal 1: 124-125

Kluytmans JA (2010) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in food products: cause for concern

or case for complacency? Clinical microbiology and infection : the official publication of the European

Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 16: 11-15

Kondo Y, Ito T, Ma XX, Watanabe S, Kreiswirth BN, Etienne J, Hiramatsu K (2007) Combination of

multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification

system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrobial agents and

chemotherapy 51: 264-274

Leonard FC, Markey BK (2008) Meticillin-resistant Staphylococcus aureus in animals: a review.

Veterinary journal (London, England : 1997) 175: 27-36

Lindstedt BA (2005) Multiple-locus variable number tandem repeats analysis for genetic

fingerprinting of pathogenic bacteria. Electrophoresis 26: 2567-2582

Maes N, Magdalena J, Rottiers S, De Gheldre Y, Struelens MJ (2002) Evaluation of a triplex PCR assay

to discriminate Staphylococcus aureus from coagulase-negative Staphylococci and determine

methicillin resistance from blood cultures. Journal of clinical microbiology 40: 1514-1517

Milheirico C, Oliveira DC, de Lencastre H (2007a) Multiplex PCR strategy for subtyping the

staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus:

'SCCmec IV multiplex'. The Journal of antimicrobial chemotherapy 60: 42-48

Milheirico C, Oliveira DC, de Lencastre H (2007b) Update to the multiplex PCR strategy for assignment

of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrobial agents and chemotherapy 51: 3374-

3377

REFERENTIES

80

Nunan C, Young R (2007) MRSA in farm animals and meat, A new threat to human health. The use

and misuse of antibiotics in UK agriculture

Oliveira DC, Lencastre Hd (2002) Multiplex PCR Strategy for Rapid Identification of Structural Types

and Variants of the mec Element in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial agents

and chemotherapy 46: 2155-2161

Orendi JM, Coetzee N, Ellington MJ, Boakes E, Cookson BD, Hardy KJ, Hawkey PM, Kearns AM (2010)

Community and nosocomial transmission of Panton-Valentine leucocidin-positive community-

associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus: implications for healthcare. The Journal of

hospital infection 75: 258-264

O' Brien AM, Hanson BM, Farina SA, Wu JY, Simmering JE, Wardyn SE, Forshey BM, Kulick ME,

Wallinga DB, Smith TC (2012) MRSA in conventional and alternative retail pork products. PLoS ONE

7(1);e30092. doi:10.1371/journal.pone.0030092

Price L, Stegger M, Hasman H (2012) Staphylococcus aureus CC398: host adaptation and emergence

of methicillin resistance in livestock

mBio 3: 305-311

Rammelkamp CH, Maxon T (1942) Resistance of Staphylococcus aureus to the Action of Penicillin.

Proc Soc Exp Biol Med 51: 386-389

Rasschaert G, Vanderhaeghen W, Dewaele I, Janez N, Huijsdens X, Butaye P, Heyndrickx M (2009)

Comparison of fingerprinting methods for typing methicillin-resistant Staphylococcus aureus

sequence type 398. Journal of clinical microbiology 47: 3313-3322

Shopsin B, Gomez M, Montgomery SO, Smith DH, Waddington M, Dodge DE, Bost DA, Riehman M,

Naidich S, Kreiswirth BN (1999) Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for

typing of Staphylococcus aureus strains. Journal of clinical microbiology 37: 3556-3563

Smith T, Moritz E, larson KL, Ferguson D (2010) The environment as a factor in methicillin-resistant

Staphylococcus aureus transmission. Reviews on environmental health 25

121-134

Smith TC, Pearson N (2011) The emergence of Staphylococcus aureus ST398. Vector borne and

zoonotic diseases 11: 327-339

Solomon R, Donnenfeld E (1986) Topical Ophthalmic Antibiotics in the Management of Bacterial

Conjunctivitis and Keratitis.

Stegger M, Lindsay JA, Moodley A, Skov R, Broens EM, Guardabassi L (2011) Rapid PCR detection of

Staphylococcus aureus clonal complex 398 by targeting the restriction-modification system carrying

sau1-hsdS1. Journal of clinical microbiology 49: 732-734

Sulek K (1968) Nobel prize in 1945 for Alexander Fleming, Ernest Boris Chain and Howard Walter

Florey for the discovery of penicillin and its therapeutic effect in infections. Wiadomosci lekarskie

(Warsaw, Poland : 1960) 21: 1388-1390

REFERENTIES

81

T. Ito, Y. Katayama and K. Hiramatsu (1999) Cloning and Nucleotide Sequence Determination of the

Entire mec DNA of Pre-Methicillin-Resistant

Staphylococcus aureus N315. Antimicrobial agents and chemotherapy 43: 1449-1458

Uhlen M, Guss B, Nilsson B, Gatenbeck S, Philipson L, Lindberg M (1984) Complete sequence of the

staphylococcal gene encoding protein A. A gene evolved through multiple duplications. The Journal of

biological chemistry 259: 1695-1702

van Cleef BA, Graveland H, Haenen AP, van de Giessen AW, Heederik D, Wagenaar JA, Kluytmans JA

(2011) Persistence of livestock-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in field workers

after short-term occupational exposure to pigs and veal calves. Journal of clinical microbiology 49:

1030-1033

van Duijkeren E, Houwers DJ, Schoormans A, Broekhuizen-Stins MJ, Ikawaty R, Fluit AC, Wagenaar JA

(2008) Transmission of methicillin-resistant Staphylococcus intermedius between humans and

animals. Veterinary microbiology 128: 213-215

van Loo I, Diederen B, Savelkoul P, Woudenberg J, Roosendaal R, Belkum A, Lemmens-den Toom N,

Verhulst C, van Keulen P, Kluytmans J (2007) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in meat

products, the netherlands. Emerging Infectious Diseases 13: 1753-1755

van Rijen MM, Van Keulen PH, Kluytmans JA (2008) Increase in a Dutch hospital of methicillin-

resistant Staphylococcus aureus related to animal farming. Clinical infectious diseases : an official

publication of the Infectious Diseases Society of America 46: 261-263

Vanderhaeghen W, Hermans K, Haesebrouck F, Butaye P (2010) Methicillin-resistant Staphylococcus

aureus (MRSA) in food production animals. Epidemiology and infection 138: 606-625

Verhegghe M., Pletinckx L.J., Crombé F., Vandersmissen T., Haesebrouck F., Butaye P., Heyndrickx M.

and Rasschaert R. (2012). Methicillin-reistant Staphylococcus aureus (MRSA) ST398 in pig farms and

multispecies farms. submitted

Voss A, Loeffen F, Bakker J, Klaassen C, Wulf M (2005) Methicillin resistant Staphylococcus aureus in

Pig Farming. Emerging Infectious Diseases 11: 1965-1966

Weese JS (2010) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in animals. ILAR journal / National

Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources 51: 233-244

Weese JS, van Duijkeren E (2010) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus

pseudintermedius in veterinary medicine. Veterinary microbiology 140: 418-429

Wulf MW, Tiemersma E, Kluytmans J, Bogaers D, Leenders AC, Jansen MW, Berkhout J, Ruijters E,

Haverkate D, Isken M, Voss A (2008) MRSA carriage in healthcare personnel in contact with farm

animals. The Journal of hospital infection 70: 186-190

Documents

Moleculaire karakterisering van methicilline resistente