8/4/2019 Molecular Evolutionary History of Ancient Aquatic Angiosperms

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P r o c . N a d l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 8 , p p . 1 0 1 1 9 - 1 0 1 2 3 , N o v e m b e r 1 9 9 1E v o l u t i o n

M o l e c u l a r e v o l u t i o n a r y h i s t o r y o f a n c i e n t a q u a t i c a n g i o s p e r m s( r b c L s e q u en c i n g / s y s t e m a t i c s / N y m ph a e a l es / p h y l o g e n y )

DONALD H . L E S , D E N I S E K . G A R V I N , AND C H A R L E S F . WIMPEED e p a r t m e n t o f B i o l o g i c a l S c i e n c e s , U n i v e r s i t y o f W i s c o n s i n , M i l w a u k e e , WI 5 3 2 0 1C o m m u n i c a t e d b y D a v i d L . D i l c h e r , A u g u s t 1 9 , 1 9 9 1 ( r e c e i v e d f o r r e v i e w May 2 9 , 1 9 9 1 )ABSTRACT A q u a t i c p l a n t s a r e n o t o r i o u s l y d i f f i c u l t t os t u d y s y s t e m a t i c a l l y d u e t o c o n v e r g e n t e v o l u t i o n a n d r e d u c -t i o n a r y p r o c e s s e s t h a t r e s u l t i n c o n f u s i n g a r r ay s o f m o r p h o -l o g i c a l f e a t u r e s . P l a n t s y s t e m a t i s t s h a v e f r e q u e n t l y f o c u s e dt h e i r a t t e n t i o n o n t h e " w a t e r l i l i e s , " p u t a t i v e d e s c e n d a n t s o ft h e m o s t a r c h a i c a n g i o s p e r m s . C l a s s i f i c a t i o n o f t h e s e 1 0 p l a n tg e n e r a v a r i e s f r o m r e c o g n i t i o n o f o n e t o t h r e e o r d e r s c o n t a i n i n gt h r e e t o s i x f a m i l i e s . W e h a v e u s e d DNA s e q u e n c e a n a l y s i s a sa m e a n s o f o v e r c o m i n g many p r o b l e m s i n h e r e n t i n m o r p h o -l o g i c a l l y b a s e d s t u d i e s o f t h e g r o u p . P h y l o g e n e t i c a n a l y s e s o fs e q u e n c e d a t a o b t a i n e d f r o m a 1 . 2 - k i l o b a s e p o r t i o n o f t h ec h l o r o p l a s t g e n e r b c L p r o v i d e c o m p e l l i n g e v i d e n c e f o r t h er e c o g n i t i o n o f t h r e e d i s t i n c t l i n e a g e s o f " w a t e r l i l y " p l a n t s .M o l e c u l a r p h y l o g e n i e s i n c l u d i n g w o o d y M a g n o l i i d a e s e q u e n c e sa n d s e q u e n c e s o f t h e s e a q u a t i c p l a n t s d e p i c t C e r a t o p h y U u m a sa n e a r l y d i v e r g i n g g e n u s . O u r r e s u l t s s u p po r t h y po t h es es t h a tm o s t t a x o n o m i c c o n c e p t s o f t h e o r d e r N y m p h a e a l e s r e f l e c tp o l y p h y l e t i c g r o u p s a n d t h a t t h e u n u s u a l g e n u s C e r a t o p h y U u mr e p r e s e n t s d e s c e n d a n t s o f s o m e o f t h e e a r l i e s t a n g i o s p e r m s .P r e c i s e c l u e s t o D a r w i n ' s " a bo m i n a b l e m y s t e r y , " t h e o r i g i no f f l o w e r i n g p l a n t s , h a v e e l u d e d s y s t e m a t i s t s f o r m o r e t h a na c e n t u r y . F o s s i l s d o c u m e n t t h e r a p i d d i v e r s i f i c a t i o n o fa n g i o s p e r m s u b c l a s s e s b y t h e l o w e r C r et a c e o u s ( 1 ) , y e t t h es c a r c i t y o f f l o w e r i n g p l a n t f o s s i l s p r i o r t o t h i s p e r i o d h a si m p e d e d a t t e m p t s t o r e c o n s t r u c t p a t t e r n s o f d i v e r g e n c ea m o n g a n c e s t r a l a n g i o s p e r m l i n e a g e s ( 2 ) . I n s t e a d , s y s t e m -a t i s t s h a v e c o n c e p t u a l i z e d " p r i m i t i v e " a n g i o s p e r m s b y c o m -p a r i n g a n a t o m i c a l , b i o c h e m i c a l , e m b r y o l o g i c a l , a n d m o r p h o -l o g i c a l d a t a d er i v ed f r o m among e x t a n t t a x a . T h i s a p p r o a c hh a s y i e l d e d a n u m b e r o f m o d e r n c l a s s i f i c a t i o n s , e a c h s t r i v i n gt o d e p i c t h i e r a r c h i c a l t a x o n o m i c g r o u p s i n a f a s h i o n t h a tp u t a t i v e l y p a r a l l e l s t h e i r p h y l o g e n y .M o s t s y s t e m a t i s t s a s s i g n e x t a n t f l o w e r i n g p l a n t s t o e i t h e rm o n o c o t s o r d i c o t s , b u t d e b a t e c o n t i n u es o v er w h i c h g r o u pi s m o r e a n c i e n t a n d o v e r w h i c h l i n e a g e w i t h i n e a c h g r o u p i sm o s t p r i m i t i v e . O f p a r t i c u l a r r e l e v a n c e t o q u e s t i o n s o f e a r l ya n g i o s p e r m e v o l u t i o n i s t h e p h y l o g e n e t i c p o s i t i o n o f t h ea q u a t i c o r d e r N y m p h a e a l e s ( w a t e r l i l i e s ) . M o s t a u t h o r s t r e a tt h e w a t e r l i l i e s a s d i c o t s a l t h o u g h s o m e p l a c e t h e m w i t hm o n o c o t s ( 3 ) . R e g a r d l e s s , many c o n t e m p o r a r y t a x o n o m i s t sv i e w t h e N y m p h a e a l e s a s p r i m i t i v e a n g i o s p e r m s s o m e h o wi m p l i c a t e d w i t h m o n o c o t o r i g i n s ( 4 - 6 ) . A t t h e t u r n o f t h ec e n t u r y , S h a f f n e r ( 7 ) a d v o c a t e d t h e r e c o g n i t i o n o f m o r e t h a nt w o m a j o r a n g i o s p e r m g r o u p s , a r g u i n g t h a t t h e w a t e r l i l i e sr e p r e s e n t a co m m o n s t o c k f r o m w h i c h a l l f l o w e r i n g p l a n t so r i g i n a t e d . A l t h o u g h S h a f f n e r ' s p e r s p e c t i v e ( 7 ) w a s n e v e rw i d e l y a d o p t e d , h i s o b s e r v a t i o n s o f m o n o c o t y l e d o n f e a t u r e si n t h e N y m p h a e a l e s w e r e e v e n t u a l l y c o n f i r m e d ( 8 ) . A s y n -t h e s i s o f a v a i l a b l e e v i d e n c e e x p a n d e d t h i s c o n c e p t t o h y -p o t h e s i z e t h a t t h e N y m p h a e a l e s r e p r e s e n t d es c en d a n t s o fa n g i o s p e r m l i n e a g e s e x i s t i n g p r i o r t o t h e d i v e r g e n c e o f m o n o -c o t s a n d d i c o t s ( 9 ) , a n a r r a n g e m e n t s u p p o r t e d b y rRNA

s e q u e n c e a n a l y s i s ( 1 0 ) . T h e g r e a t a g e o f t h e s e a q u a t i c p l a n t sh a s b e e n v e r i f i e d b y f o s s i l s o f t h e g en u s C e r a t o ph y l l u ma m o n g t h e o l d e s t k n o w n r e p r o d u c t i v e a n g i o s p e r m r e m a i n s( 1 1 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s e m p h a s i z e t h e i m p o r t a n c e o f r e c -o n c i l i n g p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s o f t h e N y m p h a e a l e s , a" p i v o t a l " g r o u p i n q u e s t i o n s o f e a r l y a n g i o s p e r m r e l a t i o n -s h i p s . S u c h c l a r i f i c a t i o n s h o u l d e n h a n c e t h e u n d e r s t a n d i n g o fe a r l y a n g i o s p e r m e v o l u t i o n a n d l e a d t o i m p r o v e m e n t s i ne x i s t i n g c l a s s i f i c a t i o n s .D i s a r r a y i n c l a s s i f i c a t i o n s o f t h e N y m p h a e a l e s i m p a i r s t h et e s t i n g o f e v o l u t i o n a r y h y p o t h e s e s . T h e 1 0 g en e r a i n c l u d ed i nt h e b r o a d e s t o r d i n a l c o n c e p t ( B a r c l a y a , B r a s e n i a , C a b o m b a ,C e r a t o p h y l l u m , E u r y a l e , N e l u m b o , N u p h a r , N y m p h a e a ,O n d i n e a , a n d V i c t o r i a ) h a v e b e e n a l i g n e d v a r i o u s l y amongo n e t o t h r e e o r d e r s i n c l u d i n g f r o m t h r e e t o s i x f a m i l i e s ( F i g .1 ) . A l t h o u g h c e r t a i n t e n d e n c i e s e m e r g e f r o m t h i s s y n o p s i s , i ti s d i f f i c u l t t o f u l l y a c c e p t a n y e x i s t i n g c l a s s i f i c a t i o n o f t h eN y m p h a e a l e s . F u r t h e r m o r e , e m p h a t i c a r g u m e n t s b o t h f o r( 1 2 ) a n d a g a i n s t ( 9 ) t h e m o n o p h y l y o f t h e o r d e r i t s e l f m a k e i td i f f i c u l t t o p u r s u e a n y m e a n i n g f u l d i s c u s s i o n o f r e l a t i o n s h i p st o o t h e r a n g i o s p e r m s .H e r e we r e p o r t o n t h e u s e o f r b c L s e q u e n c e d a t a * t oc o n s t r u c t e s t i m a t e s o f p h y l o g e n y f o r a q u a t i c p l a n t g e n e r aa l l i e d p r e v i o u s l y w i t h t h e N y m p h a e a l e s . W e r e l a t e o u r r e s u l t st o p a s t e f f o r t s a i m e d a t d e d u c i n g p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p si n t h i s u n u s u a l g r o u p o f p l a n t s .

MATERIALS A ND M ETHODSA 1 1 8 3 - b a s e - p a i r ( b p ) p o r t i o n o f r b c L w a s s e q u e n c e d f o rB a r c l a y a l o n g i f o l i a , B r a s e n i a s c h r e b e r i , Cabomba c a r o l i n i -a n a , C e r a t o p h y l l u m d e m e r s u m , E u r y a l e f e r o x , Nelumbol u t e a , N e l u m b o n u c i f e r a , N u p h a r v a r i e g a t a , N y m p h a e a o d -o r a t a , a n d V i c t o r i a c r u z i a n a . E u r y a l e p l a n t s w e r e g r o w nf r o m s e e d s d o n a t e d b y L o n g w o o d G a r d e n s ( K e n n e t t S q u a r e ,P A ) ; B a r c l a y a a n d V i c t o r i a p l a n t s w e r e a c q u i r e d f r o m S u -w a n e e L a b o r a t o r i e s ( L a k e C i t y , F L ) ; Cabomba p l a n t s w e r eo b t a i n e d f r o m C a r o l i n a B i o l o g i c a l S u p p l y . R e m a i n i n g p l a n t sw e r e c o l l e c t e d f r o m f i e l d l o c a l i t i e s ( o r f o r N e l u m b o n u c i f e r a ,w e r e i n c u l t i v a t i o n ) i n W i s c o n s i n .T o t a l g e n o m i c DNA w a s i s o l a t e d ( 1 9 ) a n d a 1 . 2 - k i l o b a s ef r a g m e n t o f r b c L w a s a m p l i f i e d ( 2 0 ) u s i n g t h e PCR a n di n t e r n a l p r i m e r s c o r r e s p o n d i n g t o p o s i t i o n s 5 - 2 6 a n d 1 2 1 0 -1 2 3 1 o f t h e c o d i n g r e g i o n . PCR p r o d u c t s w e r e p u r i f i e d b ye l e c t r o e l u t i o n f r o m 1% a g a r o s e g e l s a n d ( C a b o m b a a n dC e r a t o p h y l l u m ) b l u n t - e n d l i g a t e d i n t o t h e b a c t e r i o p h a g e M13v e c t o r m p l 9 ( B e t h es d a R e s ea r c h L a b o r a t o r i e s ) o r ( r e m a i n i n gg e n e r a ) l i g a t e d i n t o M13 P h a g e s c r i p t ( S t r a t a g e n e ) u s i n g No tI r e s t r i c t i o n s i t e s a t t a c h e d t o t h e p r i m e r e n d s . S i n g l e - s t r a n d e dp h a g e DNA w a s s e q u e n c e d ( 2 1 ) u s i n g m o d i f i e d T 7 DNAp o l y m e r a s e ( S e q u e n a s e ; U n i t e d S t a t e s B i o c h e m i c a l ) a n d as e t o f s y n t h e t i c p r i m e r s b a s e d o n t h e r b c L s e q u e n c e o f c o r n( p r o v i d e d b y G . Z u r a w s k i , DNAX). S e q u e n c e s w e r e v e r i f i e df o r s e p a r a t e c l o n e s o f b o t h s t r a n d s o f a m p l i f i e d DNA. T h e* T h e sequences r e p o r t e d i n t h i s paper h a v e b e e n d e p o s i t e d i n t h eGenBank d a t a b as e ( a c c e s s i o n nos . M 7 7 0 2 7 - M 7 7 0 3 6 ) .

1 0 1 1 9

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

8/4/2019 Molecular Evolutionary History of Ancient Aquatic Angiosperms

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ( 1 9 9 1 )N y m p h a c a l e s

N e l u m b o n a l e sN e l u m b o n a l e s C e r a t o p h y l l a l e sN e l u m b o n a l e s R a n a l e s

N e l u m b o C e r a t o p h y l l u m C a b o m b a B r a s e n i aN e l u m b o n a c e a e C e r a t o p h y l l a c e a e C a b o m b a c e a e

_- _ It _ JN e l u m b o n a c e a e C e r a t o p h y l l a c e a e C a b o m b a c e a e_ AJL-_

N e l u m b o n a c e a e C e r a t o p h y l l a c e a e C a b o m b a c e a e_ _O AN e l u m b o n a c e a e C e r a t o p h y l l a c e a e

N e l u m b o n a c e a e C e r a t o p h y l l a c e a e

N y m p h a e a l e sN y m p h a e a l e s

E u r y a l a l e sN u p h a r N y m p h a e a V i c t o r i a E u r y a l e

N y m p h a e a c e a c E u r y a l a c e a cN y m p h a e a c e a e

NymphacaeN y m p h a c a c e a c

N y m p h w A c e a e

( 4 , 1 2 , 1 3 , 1 4 )( 1 5 , 1 6 )( 9 , 1 7 )

R a n a l e s ( 1 8 )O n d i n e a B a r c l a y a g e n e r a

B a r c l a y a c e a e ( 1 8 )B a r c l a y a c e a e ( 4 , 1 7 )

( 1 3 , 1 6 )( 1 4 )( 1 2 )

F I G . 1 . C o n t r a s t i n g c l a s s i f i c a t i o n s ( r e f e r e n c e s a t r i g h t ) o f " w a t e r l i l y " g e n e r a ( c e n t e r ) r e p r e s e n t e d a s o n e t o t h r e e o r d e r s ( u p p e r p o r t i o n o ff i g u r e ) a n d t h r e e t o s i x f a m i l i e s ( l o w e r p o r t i o n o f f i g u r e ) . D i s c o v e r y o f t h e g e n u s O n d i n e a p o s t d a t e s o n e t r e a t m e n t .f e w o b s e r v e d d i s c r e p a n c i e s w e r e r e s o l v e d b y s e q u e n c i n ga d d i t i o n a l c l o n e s .T h e r b c L s e q u e n c e s w e r e c o m p a r e d t o p u b l i s h e d s e -q u e n c e s o f t h e g e n e r a M a g n o l i a , L i r i o d e n d r o n , P e r s e a ( s u b -c l a s s M a g n o l i i d a e ) , a n d t h e g y m n o s p e r m P s e u d o t s u g a ( 2 2 ,2 3 ) . P a r s i m o n y a n a l y s e s w i t h c h a r a c t e r s t a t e c h a n g e sw e i g h t e d e q u a l l y a n d P s e u d o t s u ga s p e c i f i e d a s t h e o u t g r o u pw e r e c a r r i e d o u t u s i n g t h e D N A P A R S p r o g r a m o f P H Y L I PV e r s i o n 3 . 3 ( p r o v i d e d b y J . F e l s e n s t e i n , U n i ve r s i t y o f W a s h -i n g t o n , S e a t t l e ) a n d P A U P V e r s i o n 2 . 4 ( 2 4 ) . M o s t p a r s i m o n i -o u s t r e e s w e r e f o u n d u s i n g t h e " b r a n c h a n d b o u n d " a l g o -r i t h m . A b o o t s t r a p a n a l y s i s o f t h e d a t a w a s c o n d u c t e d u s i n g1 0 0 0 r e p l i c a t e c o m p u t e r r u n s ( 2 0 0 r e p l i c a t e s e a c h f r o m f i v ed i f f e r e n t r a n d o m n u m b e r s e e d s ) w i t h t h e DNABOOT p r o g r a mo f P h y l i p V e r s i o n 3 . 3 ( 2 5 ) . A s t r i c t c o n s e n s u s t r e e o f a l lm o s t - p a r s i m o n i o u s t r e e s w a s c o n s t r u c t e d .A maximum l i k e l i h o o d e s t i m a t i o n ( M L E ) o f t h e p h y l o g e n yw a s m a d e w i t h t h e DNAML p r o g r a m i n P H Y L I P V e r s i o n 3 . 3 t op e r f o r m g l o b a l s e a r c h e s u s i n g e m p i r i c a l l y d e t e r m i n e d b a s ef r e q u e n c i e s a n d a t r a n s i t i o n / t r a n s v e r s i o n r a t i o o f 2 . 0 . Em-p i r i c a l l y d e t er m i n ed w e i g h t s f o r e a c h c o d o n p o s i t i o n w e r eu s e d i n i t i a l l y b u t d i d n o t a f f e c t r e s u l t i n g t o p o l o g i e s a n d w e r el a t e r e l i m i n a t e d t o m i n i m i z e r u n t i m e s . T h e MLE a p p r o a c hw a s o p t i m i z e d b y t e s t i n g l o g - l i k e l i h o o d v a l u e s o b t a i n e d f r o mt h e s e r u n s w i t h t h o s e g e n e r a t e d b y " u s e r t r e e s " r e p r e s e n t i n ga l l t o p o l o g i e s o b t a i n e d b y p a r s i m o n y m e t h o d s . When u s e rt r e e s p r o v i d e d b e t t e r l i k e l i h o o d s , t h e i n p u t o r d er o f g e n e r aw a s r e a r r a n g e d u n t i l t h e l o w e r v a l u e s w e r e d u p l i c a t e d . T h e" j u m b l e " o p t i o n w a s t h e n u s e d w i t h 1 0 d i f f e r e n t r a n d o mn u m b e r s e e d s t o d e t e r m i n e w h e t h e r f u r t h e r m a n i p u l a t i o n o fi n p u t o r d e r w o u l d p r o d u c e l o w e r l o g - l i k e l i h o o d v a l u e s . T h e s e" b e s t " MLE t o p o l o g i e s w e r e i n p u t a s u s e r t r e e s a n d t e s t e df o r s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s ( 2 6 ) .

RESULTS AND DISCUSSIONU n d e r s t a n d a b l y , t r a d i t i o n a l a p p r o a c h e s t h a t a s c e r t a i n p h y -l o g e n y u s i n g c o m p a r a t i ve m o r ph o l o g i c a l d a t a h a v e r e a c h e di n c o n s i s t e n t c o n c l u s i o n s o f e v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i p s b o t hw i t h i n a n d among t h e s e a q u a t i c g e n e r a ( 9 ) . P r o b l e m s p l a g u i n gt h e s y s t e m a t i c s t u d y o f g r o u p s o f s u c h a n c i e n t d i v e r g e n c ea r i s e f r o m t h e l e n g t h o f t i m e o v e r w h i c h e v o l u t i o n a r y c h a n g e sc a n o c c u r . T h e l a p s e o f t i m e s u r p a s s i n g 1 2 0 m i l l i o n y e a r ss i n c e t h e o r i g i n o f t h e a n g i o s p e r m s ( 2 7 ) h a s a l l o w ed f o rc o n s i d e r a b l e m o d i f i c a t i o n o f c h a r a c t e r i s t i c s o r i g i n a l l y e x i s t -i n g i n f l o w e r i n g p l a n t p r o g e n i t o r s . C o n s e q u e n t l y , i t i s d i f f i c u l tt o a s c e r t a i n h o m o l o g i e s among s p u r i o u s p a t t e r n s d u e t oc o n v e r g e n c e , p a r a l l e l i s m , a n d c h a r a c t e r / s t a t e l o s s e s . T h e s ep r o b l e m s a r e p e r h a p s m o s t s e v e r e i n a q u a t i c p l a n t s t h a te x p e r i e n c e r e d u c t i o n i n f e a t u r e s d u r i n g a d a p t a t i o n t o a q u a t i ce n v i r o n m e n t s ( 2 8 ) a n d s h o w w i d e s p r e a d c o n v e r g e n c e a n d

p a r a l l e l i s m f o r t r a i t s l i n k e d t o s u r v i v a l i n w a t e r ( 6 ) . A l t h o u g hm o r p h o l o g y h a s b e e n i n v e s t i g a t e d i n t e n s i v e l y i n t h e Nym-p h a e a l e s ( 2 9 - 3 1 ) , c o n t r a d i c t o r y r e c o m m e n d a t i o n s f o r c l a s s i -f i c a t i o n h a v e b e e n m a d e f r o m p h e n e t i c s t u d i e s ( 9 , 1 5 ) a n dc l a d i s t i c a n a l y s i s ( 1 2 ) o f p r i n c i p a l l y m o r p h o l o g i c a l d a t a .A s e a r c h f o r g r e a t e r c o n s i s t en c y h a s i n s p i r e d t e s t i n g o fw a t e r l i l y r e l a t i o n s h i p s u s i n g c h e m o s y s t e m a t i c a p p r o a c h e s .B e c a u s e h o m o l o g y o f b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r s c a n b e l e s sa m b i g u o u s t h a n f o r m o r p h o l o g i c a l t r a i t s ( 3 2 ) , t h e i r u s e i ns y s t e m a t i c s t u d i e s h a s b e e n a d v o c a t e d . B i o c h e m i c a l s t u d i e so f t h e N y m p h a e a l e s h a v e b e e n i n f o r m a t i v e b u t i n c o n c l u s i v e .C o m p a r a t i v e s e r o l o g y h a s p r o vi d ed c o n v i n c i n g e vi d en c e f o rt h e r e m o v a l o f N e l u m b o f r o m t h e N y m p h a e a l e s a n d i t sr e c o g n i t i o n a s a d i s t i n c t o r d e r ( 3 3 ) . T h i s d i s p o s i t i o n i s s u p -p o r t e d b y t h e c o n t r a s t i n g a l k a l o i d c h em i s t r y o f N e l u m b o a n dm e m b e r s o f t h e N y m p h a e a c e a e ( 3 4 ) . P r o p e r t i e s o f p l a s t o c y -a n i n a n d f e r r e d o x i n a r e v a s t l y d i f f e r e n t i n C e r a t o p h y l l u mc o m p a r e d t o o t h e r p l a n t s ( 3 5 ) . S t a r c h g r a i n s t r u c t u r e i n d i -c a t e s a n a f f i n i t y b e t w e e n w a t e r l i l i e s a n d " t r u e " m o n o c o t y -l e d o n s ( 3 6 ) ; h o w e v e r , t h e p r es e n c e o f e l l a g i c a c i d i n s o m e

N y m p h a e a c e a e c a u t i o n s a g a i n s t t h e i r i n c l u s i o n w i t h i n m o n o -c o t s , w h i c h l a c k t h e c o m p o u n d ( 3 7 ) . W a t e r l i l i e s a l s o l a c kr a p h i d e s c r y s t a l s , w h i c h a r e w i d e l y d i s t r i b u t e d among m o n o -c o t s ( 6 ) . O v e r a l l , c h e m o s y s t e m a t i c s t u d i e s h a v e f a i l e d t or e s o l v e many o f t h e s a m e q u e s t i o n s l e f t u n a n s w e r e d b ym o r p h o l o g i c a l s t u d i e s .M o l e c u l a r s y s t e m a t i c s ( t h e u s e o f n u c l e i c a c i d d a t a f o rp h y l o g e n e t i c s t u d y ) h a s b e e n p r o m o t e d a s a s u p e r i o r t e c h -n i q u e f o r s u r m o u n t i n g p r o b l em s a s s o c i a t e d w i t h t h e e v o l u -t i o n a r y s t u d y o f g r o u p s w h o s e o r i g i n s s p a n l o n g t i m e i n t e r -v a l s ( 3 8 , 3 9 ) . F o r " h i g h - l e v e l " q u e s t i o n s i n p l a n t s y s t e m a t i c s( c o n c e r n i n g s u p r a g e n e r i c r e l a t i o n s h i p s ) , t h e s t u d y o f t h ec h l o r o p l a s t e n c o d e d g e n e r b c L h a s b e e n e n c o u r a g e d b e c a u s eo f i t s a p p r o p r i a t e d e g r e e o f d i v e r g e n c e ( 3 8 , 3 9 ) . L o n g s p e c i e sd i v e r g e n c e t i m e s r e l a t i v e t o g e n e c o a l e s c e n t t i m e s ( 4 0 ) a r et h e o r i z e d t o m i n i m i z e d i s t i n c t i o n s b e t w e e n " g e n e t r e e s " a n d" s p e c i e s t r e e s " ( 4 1 ) .O u r s e q u e n c i n g o f 1 1 8 3 b p o f r b c L ( a p p r o x i m a t e l y 85% o ft h e g e n e ) f o r 1 0 s p e c i e s i n 9 g e n e r a i s s u m m a r i z e d i n F i g . 2 .I n t h i s d a t a s e t , s u b s t i t u t i o n s o c c u r i n 1 2 . 6 % o f t h e t o t a ls e q u e n c e m a i n l y a t t h i r d c o d o n p o s i t i o n s ( 7 4 . 5 % ) a n d l e s s a tf i r s t ( 1 5 . 4 % ) a n d s ec o n d ( 1 0 . 1 % ) c o d o n p o s i t i o n s . P a i r w i s ec o m p a r i s o n s o f t r a n s i t i o n t o t r a n s v e r s i o n r a t i o s v a r i e d f r o m0 . 8 t o 4 . 0 , w i t h a n o v e r a l l a v e r a g e o f 1 . 9 . F o r a l l s e q u e n c e sa n a l y z e d , 2 0 . 9 % o f t h e c h a r a c t e r s w e r e v a r i a b l e a n d 9 . 8 %r e p r e s e n t e d i n f o r m a t i v e s i t e s . B e c a u s e t h e r b c L s e q u e n c e o fb o t h N e l u m b o s p e c i e s d i f f e r e d a t o n l y o n e s i t e , we l i m i t e do u r a n a l y s e s t o o n e o f t h e m ( N e l u m b o l u t e a ) .F o u r e q u a l l y s h o r t e s t t r e e s ( l e n g t h = 3 5 7 ; c o n s i s t e n c yi n d e x = 0 . 7 8 2 ) w e r e f o u n d b y p a r s i m o n y a n a l y s i s . T h et o p o l o g y o f e a c h t r e e was i d e n t i c a l e x c e p t f o r p l a c e m e n t o f

1 0 1 2 0 E v o l u t i o n : L e s e t a l .

8/4/2019 Molecular Evolutionary History of Ancient Aquatic Angiosperms

3/5

E v o l u t i o n : L e s e t a l . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ( 1 9 9 1 ) 1 0 1 2 15 0 1 0 0 1 5 0

C~.AAGTGTCAGCGGTAGTAAATGCTTAATCGCAGACAAAATAACd.CGATCATATCCACGATCACGAGACGTCGATGTCGACTTCGTC8 . 1 . . . G 0 . T..T... . .A.0.A.....A.C........................0.................. C . . G.............N . n . . . G 0 .. . . . . . . .T .. .A .. . . . .A 0 .A.CT..............................T.............G..C..G .. ...........8 . 1 . ..0.........T..T....A.....G.......C.....T......CTT.C...............C......T.....G........A....G..G........C......B . s . ..0.........T..T....A.....G.......C.....T......CTT.C...............C......T.....G........A....G.0.G.......C.....C ~ c . ..G.........T..T....A.....G.......C.....G......CTT.C...............C......T.............A....G.0.G.......C.....E . f . . . G.......... T ...A.....G..... .C.....G......CTT.C...............C......T.....G........A. . . . G G.0.......C.....N . v . . . G . . . . . . . . . T . . T . . . . A....G......C.....T......CTT.C...............C......T.....G........A.....G..G.......C.....N . o . ..G.........T..T....A.....G.......C...0........CTT.C............... C......T.....G........A.....G..G.......C.....V . c . . . G..... ...T..T....A.0...G......C.....T......CTT.C...............C......T.....G........A....G.. ........C.....

2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0C~.TGCACTTGCGTGCTCACTGTCTAAAGCAGTCAACACCTGTGGdGAACAAATCTTTGTACTTGCTTTGAAGTCGTC.CTTCCTCTGG8 . 1 . . .. . T . .. . . . .. . . .. . .. . .. . .......C0 . A .T.T.... . . . . .. . . . .. . . . .. . . . . .. . . .. . .. . . . .N~ .. .n... . ..T.. . . .. . . . .. . . .. C . . . . 0A......... A . . G. . . T .. . . .. . .....0T.T.. . .. . . .. . . . . . .. . . .8 . 1 . T...... .. . .. . .. . . .. ... . . . G 0 . .. .G . .. . . . . . . .. . . . .. . . . .. . .. . . .B . s .T... . ..C....C..... .. C. .. .A.. ..A. .. . . .. . ...T.T.... .. . . . .. . . .. . ..C x . c . . . . . T .............. ............C..G..G.A.....G.0...................G.T.................T.......E S .. . .. ...T.. . . .... . . . . 0 . . .. . G. .. . . . .. . . .. . . .N . v. . . . . . T..........................C.0... . A . . . C . . . . .0....................G...................T......8 ~ ......T............................0...G.. 0.... A................0...................T.......V . c................................. . . G ...................G0...................T.......

4 0 0 4 5 0 5 0 0C~.GATTTTGTCAGTTCACCAGCTGAATAGACCGTCTTTAACTCAdGCGCCTGACAGTAAAAAATACAGAGTGCTTTG.TCCATACAAT8A.1............ ....T..T.........C. G. . . . . . CC. . . . . TCT........C..A..T...............T...........C.......T.........N.n............. ....T..T.......... C . . . . . . . CC. . . . . TCT ........C..A..T...............T...........C.......T.........8 A . 1 . . . . . . . . . . .. .....T..... . . . . . C . G A . . . T . . . .CC.....TCT.........C. .A.T.1...A............T..........C.......T. A........B.s.C..........C.....T .........G..C.GA . . . . T . . . CC.....TCT.........C..A..T....A............T...........C.............C...C.c.C......A.....C.....T....CT. . . . G ...C . G A . . . . T . . . CC.....TCT .........C..A..T....A............T...........C.......T........EJ.f............ . . . . . T . . . . . . . . G . . . C . G A . . . . T . . . CC.....TCT.........C..A..T....A............T..........C.......T.........N.v............. .....T. ..... .. . C . G A . . . . T . . . .CC.....TCT...... .C..A. .T....A............T...........C.......T........8 . o ............ .....T. ..... .. . C . G A . . . . T . . . .CC.....TCT........C..A. .T....A............T..........C.......T.........V.c............. .....T.0...... . . . C . G A . . . . T . . . .CC.....TCT. ..... .C..A. .T....A............T...........C.......T.......

5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0C~.GGTACGTAACAGTGGGTTTAAGCAGGTGCTATTCAGAGTAACdGATCACATAGGTGGGCGTCTTTTTCGACATAA.CCGCGACGTA8 . 1 . . . . . .. . .. . . . C. . . . . . . T...... . . ...T....A...CA....... . . . . A . .......N8 . . . .. ..... C ..T.......... .....A...C...... . CC..........8A.1.......A.0...0.G.........C..T........................G...............T.....C.....T.0..........A....B . s...... . A.........C.. 0 . . ...C.T.....................0...GG.............T.....C.....T............A....C . c ........A..A........A.0...G...T....................A.....G.. .........T....T.....C.....T.............A....E . f . ..... A....0.0.....C.T..................A.0.....................T.....CA.....T.0..........A....N . v........A..0....0.....C...C.T........................G.............0.T.....C.....TC....0.......A....8. o0.T... . .T. A....0.0.....C... T ................A..........0.............T.....C.....TC....0.......A....V . c . ...... A.......0.....C... T ................A.0.....................T.....CA.....T..0..... . T . . . A . . . .

7 5 0 8 0 0 8 5 0C~.ACAGAATCTATCATGGGAAGGAGATAGAAGCGA GCGGGGdTTCACTAGAGCATTAGGGATATCGAATCTGCCTATCGGCAGTTCT8A.1................A.....T ..... . .C ..T ...TJ...... .A ..G ...........C..............A.....0...........T....C....N . n ....................... ... CT . C . . . . . T T . . . . . . . . . A . . . . . . . . . . . . .0.C.A...0.T....A...G8 . 1 . ..T..................C.......C..0..1.0 . G . . . . C . 0 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . A . C . . . . .C. A . . . . . . . 0. . . . . ...........C....8 . s . .T..............A....C.A......... ...C. . G C . . . . C . 0 . . . . G . . . .A...........A........A. . . . . . . 0. . . . . ...........C....C . c . .T..............A . . . . . C T . . . . . . . . . . A . . A . C . . G C ...C.0....G......C..........A........A. . . . . . . 0 G . . . .T.............C....E . f . .T..............A ....C.......C.....0.TG.G... .C.0....G...............A.C..... . A . . . . . . .0 ..... ...........C....N . v . . .T..............A..........C.C.....G.C.G.. . .C.0....G...............A.C..... . A.......G................C....N . o . . .T..................C.......C.....G.TC.G.....C.0....G...............A.C..... . A . . . . . . . 0. . . . . ...........C....V . c . ..T..............A..... . . . . . . C . . . . . 0 . T G . G . . . . C . 0 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . A . . . . . . . C . . A . . . . . . . 0. . . . . ...........C....

9 0 0 9 5 0 1 0 0 0Cd.TCCTCCGGATCTCGTTGTGCAAAACTGAAATTGGATGGAGATAGAGCGAGGTAATATTGACTGAGTACGAGAACAAAtCTGGTTTG8A.1........T.............................. . . . T .0 . . . G . . . . . . T . . . . . . . . . . . .A........T . . . . . G . . . A . . . . A . . C . . C . . . C . . . . .N.n.......T.............................. . . .T.0 . . . G . . . . . . T . . . . . . . . . . . A........I.0. A .A . . . . . A . . C . . C . . . C . . . . .8A.1......................G.....00. T . . . . . . . C . . . . T . 0 . .G .0 G . . . . . 0 . 0 . 0 . 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . G . C . . . . . C . . . . .B.s.......................G........T....C....C... . T . 0 . . G . ......G.......0 . 0............00 G.....0 G . C . . . . . C . . . . .C.C.......................G........T....C....C... .T.0.. .0. 0.....G.0G...............0....... . . . . . C . . . . . C . . . . .E.f........................G..... . . .T .. .C .. . .C .. . .T.0.. .0. 0...... 0 G . . . . . . . . . . . . ...0....... . . . . . C . . . . . C . . . . .N . v............................T.....I. . . .C... .T. 0 . 0 . G . G . . . . . . G . . G ..............0........ . . . . .C . . . . .C . . . . .8 . o 0 ...........................T.....I....C... . T . 0 . . .0. 0...... 0 G . . . . . . . . . . . . ..0..........G.C.....C.....V.C........................G O . . . . . . T . . . . C . . . . C . . . . T . 0 . . . 0 . G 0 . . . . . . . G . . . . . . . . . . . . ..0........ . . . . .C . . . . .C . . . . .

1 0 5 0 1 1 0 0 1 1 5 0 1 2 0 0C~.TTTAGGTATTTGAAGCGATGCGATATCCCAATGTTTTCAGGTCGCGACTAGGTTCTTTGAAGCGCCGCGGTTTGGTATCTCAATCG8A.1..C....................................A....T.....C.. .................1..................... . .N . n ....C...................................A.. . .T... . .C.G.0........C............................... . .8A.1..C.....................0. ............A......T.....C..G .........C..........C.....T..A.......0 . . . G . . . . . .B.s...C...............T....... ...........A........T...C..G ....C.C....c.........C......A.0..............C~c...C...............G.......0...........A.....T.T1 . . T . . . . C. G.0....C.....C..........C......A.0..............E.f. . C.0.............G..................A........T..T.... C. G.0..T......C..........C.......A.0..............N . v y . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0. ............A......T.....C.G.0........C..........C......A.0..............8 . o0 . . . C . . . . . . . . . . . . . . . G . . . . . . .0 . . . . . . . . . . . A . . . . . ...T...C.G 0 . . . . . . . . C . . . . . . . . . . C . . . . . . . A . . 0 . . . . .........V.c...C...............G.......0...........A......... T . . . . C. G.0..T.C....c.........C.......A.0..............F I G . 2 . An 1 1 8 3 - b p r e g i o n o f r b c L c o m p a r i n g C e r a t o p h y l l u m d e m e r s u m ( C . d . ) t o N e l u m b o I u t e a ( N . l . ) , N e l u m b o n u c i f e r a ( N . n . ) , B a r c l a y al o n g i f o b l i a ( B . l . ) , B r a s e n i a s c h r e b e r i ( B . s . ) , C a b o m b a c a r o l i n i a n a ( C . c . ) , E u r y a l e f e r o x ( E . f . ) , N u p h a r v a r i e g a t a ( N . y . ) , N y m p h a e a o d o r a t a( N . o . ) , a n d V i c t o r i a c r u z i a n a ( V . c . ) .

B a r c l a y a a n d N u p h a r . I n e v e r y c a s e , C e r a t o p h y l l u m w a s o n e c o n s i s t i n g o f t h e t h r e e g e n e r a r e p r e s e n t i n g M a g n o l i a l e sb a s a l t o t h e o t h e r g e n e r a o f M a g n o l i i d a e , f o l l o w e d b y ( M a g n o l i a , L i r i o d e n d r o n ) a n d L a u r a l e s ( P e r s e a ) a n d t h eN e l u m b o , w h i c h o c c u p i e d a n i s o l a t e d p o s i t i o n . A b o v e t h e s e o t h e r i n c l u d i n g a l l r e m a i n i n g g e n e r a ( B a r c l a y a , B r a s e n i a ,g e n e r a , a d i c h o t o m y s e p a r a t e d t w o m o n o p h y l e t i c g r o u p s , C a b o m b a , E u r y a l e , N u p h a r , N y m p h a e a , a n d V i c t o r i a ) . A

8/4/2019 Molecular Evolutionary History of Ancient Aquatic Angiosperms

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ( 1 9 9 1 )C a b o m b aB r a s e n i aN u p h a rB a r c l a y aN y m p h a e aV i c t o r i aE u r y a leMagnoliaL i r i o d e n d r o nP e r s e aN e l u m b oC e r a t o p h y l l u mP s e u d o t s u g a

F I G . 3 . S t r i c t c o ns e ns u s t r e e o f f o u r e q u a l l y s h o r t e s t t r e e s f o u n db y p a r s i m o n y a n a l y s i s o f r b c L d a t a i n " w a t e r l i l y " genera a n d w o o d yM a g n o l i i d a e r o o t e d u s i n g a gymnosperm o u t g r o u p .s t r i c t c o n se n s u s t r e e ( F i g . 3 ) d e p i c t e d c o n s i s t e n t s i s t e r g r o u p so f [ P e r s e a ( M a g n o l i a , L i r i o d e n d r o n ) ] , ( C a b o m b a , B r a s e n i a ) ,a n d [ N y m p h a e a ( V i c t o r i a , E u r y a l e ) ] . I n t h r e e c l a d o g r a m s ,N u p h a r a n d B a r c l a y a i n t e r c h a n g e o r s h a r e t h e p o s i t i o n b a s a lt o a b r a n c h i n c l u d i n g N y m p h a e a , V i c t o r i a , a n d E u r y a l e . I nt h e f o u r t h c l a d o g r a m , N u p h a r wasa s i s t e r g r o u p t o Cabombaa n d B r a s e n i a , a n d B a r c l a y a was t h e s i s t e r g r o u p t o t h e s i xr e m a i n i n g " w a t e r l i l y " genera. A m a j o r i t y - r u l e c o n s e n s u st r e e o f t h e 1 0 0 0 b o o t s t r a p r e p l i c a t e s a n d s u g g e s t e d c o n f i -d e n c e i n t e r v a l s f o r n o d e s o f t h e t r e e ar e s h o w n i n F i g . 4 .T h e f o u r t r e e t o p o l o g i e s g e n e r a t e d b y p a r s i m o n y m e t h o d swere i d e n t i c a l t o t h o s e o f f o u r " b e s t " maximum l i k e l i h o o dt r e e s w i t h t h e l o w e s t o b s e r v e d l o g - l i k e l i h o o d v a l u e s ( F i g . 5 ) .T h e b e s t l o g - l i k e l i h o o d v a l u e s r a n g e d f r o m - 3 5 6 9 . 6 1 t o- 3 5 7 1 . 6 6 b u t d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y .Ou r a n a l y s i s o f r b c L sequence d a t a w a r r a n t s t h a t t h eb r o a d e s t c o n c e p t o f t h e o r d e r N y m p h a e a l e s s u g g e s t e d b yT h o r n e ( 1 3 ) , C r o n q u i s t ( 4 ) , a n d Tamura ( 1 4 ) s h o u l d b ea b a n d o n e d b e c a u s e i n c l u s i o n o f e i t h e r C e r a t o p h y l l u m orNelumbo w i t h t h e w a t e r l i l i e s r e p r e s e n t s a p o l y p h y l e t i cgroup. F o r c i n g t h e t o p o l o g y o f o ur p a r s i m o n y a n a l y s i s t oc r e a t e o n e m o n o p h y l e t i c g r o u p o f C e r a t o p h y l l u m , N e l u m b o ,a n d t h e w a t e r l i l i e s a d d s a n a d d i t i o n a l 9 s t e p s t o t h e t r e e a n di n c r e a s e s t o 4 3 s t e p s t h e b r a n c h l e n g t h s e p a r a t i n g t h e s e twogenera f r o m t h e w a t e r l i l i e s . T h e r e f o r e , we c o n c l u d e t h a t t r u ew a t e r l i l i e s are a w e l l - d e f i n e d c l a d e t h a t i n c l u d e s B a r c l a y a ,B r a s e n i a , C a b o m b a , E u r y a l e , N u p h a r , N y m p h a e a , a n d V i c -t o r i a . T h i s a r r a n g e m e n t i s c o n s i s t e n t w i t h o p i n i o n s o f T a k h -t a j a n ( 1 7 ) a n d L e s ( 9 ) who r e c o g n i z e t h e s e genera ( a l o n g w i t hO n d i n e a - n o t s u r v e y e d h e r e ) t o c o m p r i s e t h e o r d e r Nym-p h a e a l e s . C l a s s i f i c a t i o n s i n c l u d i n g e i t h e r N e l u m b o n a c e a e( 4 2 ) o r C e r a t o p h y l l a c e a e ( 1 5 , 1 6 , 1 8 ) i n t h e N y m p h a e a l e s ar enow d i s p u t e d b y o u r r b c L p h y l o g e n i e s , b y rRNA p h y l o g e n i e s( 1 0 ) , a n d b y r e c e n t m o r p h o l o g i c a l l y b a s e d c l a d i s t i c a n a l y s e s( 4 3 ) . The l a c k o f c l o s e r e l a t i o n s h i p among t h e s e genera agreesw i t h p h e n e t i c a n a l y s e s ( 9 ) i n d i c a t i n g t h a t t h e N y m p h a e a l e ssensu l a t o e m b o d i e s t h r e e l i n e a g e s : N y m p h a e a l e s , Nelum-b o n a l e s , a n d C e r a t o p h y l l a l e s .

F I G . 4 . M a j o r i t y - r u l e b o o t s t r a p c o n s e n s u s t r e e f r o m p a r s i m o n ya n a l y s i s o f genera i n F i g . 3 . S h o r t v e r t i c a l b a r s r e p r e s e n t s u b s t i t u -t i o n s s u p p o r t i n g p o r t i o n s o f t h e t o p o l o g y . P e r c e n t a g e s g i v e c o n f i -d e n c e i n t e r v a l s f o r n o d e s b a s e d u p o n 1 0 0 0 b o o t s t r a p s a m p l e s .B r a n c h l e n g t h s ar e p r o p o r t i o n a l t o t h e n u m b e r o f i n f e r r e d n u c l e o t i d es u b s t i t u t i o n s .

C a b o m b aB r a s e n i a- N u p h a rN y m p h a e aV i c t o r i a*ryaleM a g n o l i a B a r c l a y aL i r i o d e n d r o nI e r s e a- N e l u m b oC e r a t o p h y l l u m P s e u d o t s u g a

F I G . 5 . O n e o f " b e s t " m a x i m u m - l i k e l i h o o d t o p o l o g i e s ( s h o w i n gr e l a t i v e b r a n c h l e n g t h s ) a g r e e s w i t h p a r s i m o n y a n a l y s i s o f g e n e r aa n a l y z e d i n F i g . 4 . No s i g n i f i c a n t l y b e t t e r t r e e c o u l d b e f o u n d u s i n gt h i s a l g o r i t h m . * , B r a n c h e s w h o s e l e n g t h s a r e n o t s i g n i f i c a n t l yp o s i t i v e .T h e q u e s t i o n o f a n a p p r o p r i a t e f a m i l i a l c l a s s i f i c a t i o n f o rt h e s e a q u a t i c g e n e r a ( F i g . 1 ) c a n a l s o b e l a r g e l y r e s o l v e d b yr b c L d a t a . W e a d v o c a t e c o n t i n u e d r e c o g n i t i o n o f t h e N e l u m -b o n a c e a e a n d C e r a t o p h y l l a c e a e a s d i s t i n c t f a m i l i e s , r e m o t ep h y l o g e n e t i c a l l y f r o m t r u e w a t e r l i l i e s . T h i s a r r a n g e m e n t i ss u p p o r t e d b y m o s t c o n t e m p o r a r y c l a s s i f i c a t i o n s ( F i g . 1 ) . T h es u g g e s t i o n t o i n c l u d e C a b o m b a a n d B r a s e n i a i n t h e C e r a t o -p h y l l a c e a e ( 1 2 ) , h o w e v e r , i s u n a c c e p t a b l e . S e q u e n c e d a t af r o m r b c L s u p p o r t r e c o g n i t i o n o f t h e f a m i l y C a b o m b a c e a e( C a b o m b a a n d B r a s e n i a ) , w h i c h c o n s i s t e n t l y a p p e a r s a s am o n o p h y l e t i c g r o u p w i t h i n t h e N y m p h a e a l e s . E x c e p t f o r I t o( 1 2 ) a n d T a m u r a ( 1 4 ) , t h i s d i s p o s i t i o n r e f l e c t s t h e o pi n i o n o fo t h e r c o n t e m p o r a r y t a x o n o m i s t s ( F i g . 1 ) . T h e r e c o g n i t i o n o fa m o n o t y p i c f a m i l y B a r c l a y a c e a e ( 4 , 1 7 , 1 8 ) i s n o t s u p p o r t e db y r b c L d a t a . T h e a s s o c i a t i o n o f B a r c l a y a w i t h N u p h a r ,N y m p h a e a , V i c t o r i a , a n d E u r y a l e i n o u r a n a l y s e s i n d i c a t e s ac l o s e r e l a t i o n s h i p a m o n g t h e s e g e n e r a . O u r a n a l y s e s p r o v i d es i m i l a r a r g u m e n t s a g a i n s t N a k a i ' s s e g r e g a t i o n ( 4 2 ) o f N u -p h a c e a e ( N u p h a r ) f r o m t h e N y m p h a e a c e a e . L i ' s c o n c e p t ( 1 8 )o f N y m p h a e a c e a e ( N y m p h a e a , N u p h a r ) i s a l s o r e j e c t e dg i v e n t h a t r b c L d a t a p l a c e N y m p h a e a c l o s e r p h y l o g e n e t i c a l l yt o V i c t o r i a a n d E u r y a l e t h a n t o N u p h a r ( F i g s . 3 - 5 ) . M o s tc o n t e m p o r a r y a u t h o r s ( F i g . 1 ) r e c o g n i z e V i c t o r i a a n d E u r y -a l e a s m e m b e r s o f t h e N y m p h a e a c e a e . P h y l o g e n e t i c a n a l y s i so f r b c L d a t a s u p p o r t s t h e r e c o g n i t i o n o f t w o f a m i l i e s i n t h eN y m p h a e a l e s , C a b o m b a c e a e ( C a b o m ba , B r a s e n i a ) a n dN y m p h a e a c e a e ( B a r c l a y a , E u r y a l e , N u p h a r , N y m p h a e a ,a n d V i c t o r i a ) , b u t p r o v i d e s i n s u f f i c i e n t g r o u n d s f o r f u r t h e rt a x o n o m i c s u b d i v i s i o n .A h i g h d e g r e e o f s e q u e n c e s i m i l a r i t y ( 9 9 . 9 o ) e x i s t s i n t h e1 1 8 3 - b p r e g i o n o f r b c L s e q u e n c e d i n N e l u m b o l u t e a a n dN e l u m b o n u c i f e r a , t h e t w o e x t a n t s p e c i e s o f t h e N e l u m b o n -a c e a e . T h e s e s p e c i e s a r e e x t r e m e l y s i m i l a r m o r p h o l o g i c a l l y ,w i t h n o t a b l e d i f f e r e n c e s o c c u r r i n g o n l y i n t h e i r p e t a l c o l o ra n d f r u i t s h a p e s ( 4 4 ) . H i g h r b c L s e q u e n c e s i m i l a r i t y i sc o n s i s t e n t w i t h t h e c o m p l e t e s e r o l o g i c a l i d e n t i t y o b s e r v e d f o rt h e s e s p e c i e s ( 3 3 ) . A l t h o u g h N e l u m b o l u t e a ( N o r t h A m e r i c a )a n d N e l u m b o n u c i f e r a ( A s i a a n d A u s t r a l i a ) a r e p r e s e n t l yd i s j u n c t , f o s s i l e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a t t h e i r g e o g r a p h i c i s o -l a t i o n may h a v e o c c u r r e d a s r e c e n t l y a s t h e e a r l y P l e i s t o c e n e( 4 5 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s v e r i f y e x p e c t e d c o r r e s p o n d e n c ea m o n g r e c e n t d i v e r g e n c e t i m e , s l i g h t m o r p h o l o g i c a l d i f f e r -e n t i a t i o n , s e r o l o g i c a l i d e n t i t y , a n d l o w l e v e l o f n u c l e o t i d ed i v e r g e n c e i n t h e s e s p e c i e s .I n s u m m a r y , t h e s t u d y o f r b c L d i v e r g e n c e i n a n c i e n ta q u a t i c p l a n t s h a s p r o v i d e d i m p o r t a n t i n s i g h t s . T h e h y p o t h -e s i s ( b a s e d o n a m o r p h o l o g i c a l r e d u c t i o n s e r i e s ) t h a t t h eC e r a t o p h y l l a c e a e r e p r e s e n t a h i g h l y s p e c i a l i z e d o f f s h o o t o ft h e N y m p h a e a l e s ( 4 ) i s r e j e c t e d b y r b c L p h y l o g e n i e s . I n -s t e a d , t h e r b c L p h y l o g e n y i s c o n s i s t e n t w i t h a h y p o t h e s i s o fr e l a t i o n s h i p s b a s e d u p o n a c o m p r e h e n s i v e s t u d y o f n o n m o -l e c u l a r d a t a ( 9 ) . S u c h c o n c o r d a n c e l e n d s i n c r e a s e d c o n f i -d e n c e i n t h e c a p a b i l i t y o f r b c L s e q u e n c e s t o t e s t p h y l o g e n e t i ch y p o t h e s e s i n v o l v i n g a n c i e n t a n g i o s p e r m s . E r r o n e o u s c o n -

1 0 1 2 2 E v o l u t i o n : L e s e t a l .

8/4/2019 Molecular Evolutionary History of Ancient Aquatic Angiosperms

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 8 ( 1 9 9 1 ) 1 0 1 2 3c e p t s o f r e l a t i o n s h i p s i n t h e N y m p h a e a l e s h a v e b e e n d u el a r g e l y t o c o n v e r g e n t e v o l u t i o n ( e . g . , d i s s e c t e d f o l i a g e i nC e r a t o p h y l l u m a n d Cabomba o r f l o a t i n g l e a v e s i n N e l u m b oa n d t r u e w a t e r l i l i e s ) . By o v e r c o m i n g i n t r i n s i c d i f f i c u l t i e s o fi n t e r p r e t i n g c o n v er g en t m o r ph o l o g i c a l e v o l u t i o n , DNA s e -q u e n c e a n a l y s i s i s p r o v i n g t o b e o f g r e a t u t i l i t y i n t h e s t u d yo f a q u a t i c p l a n t p h y l o g e n i e s .C o r r e l a t i o n o f h i g h r b c L h o m o l o g y w i t h o t h e r m ea s u r e s o fe v o l u t i o n a r y d i v e r g e n c e s u p p o r t s i n f e r e n c e s o f r e c e n t d i v e r -g e n c e b e t w e e n t h e t w o s u r v i v i n g N e l u m b o s p e c i e s .A n al y s i s o f r b c L d a t a p r o v i de s a d d i t i o n a l e v i d e n c e t h a t t h emodem a q u a t i c C e r a t o p h y l l a l e s r e p r e s e n t d e s c e n d a n t s o fs o m e v e r y e a r l y f l o w e r i n g p l a n t s ( 9 ) . I n o u r p h y l o g e n e t i ca n a l y s e s , t h e C e r a t o p h y l l a l e s p r e c e d e t h e w o o d y M a g n o l i -i d a e ( e . g . , M a g n o l i a l e s ) , w h i c h h a v e l o n g b e e n a s s u m e d t or e p r e s e n t t h e " b a s a l " a n g i o s p e r m l i n e a g e ( 4 , 4 3 ) , a n d t h eN y m ph a e a l es , w h i c h h a v e a l s o b e e n i m p l i c a t e d a s a n c e s t r a la n g i o s p e r m s ( 9 , 1 0 ) . N a t u r a l l y , t h e f u l l r e s o l u t i o n o f p h y l o -g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s a m o n g e a r l y a n g i o s p e r m l i n e a g e s u l t i -m at e l y a w ai t s g l o b a l a n a l y s e s t h a t i n c l u d e a l a r g e n u m b e r o fa d d i t i o n a l a n g i o s p e r m s e q u e n c e s f r o m r b c L a n d o t h e r g e n e s .S e q u e n c i n g a d d i t i o n a l r b c L g e n e s i n g e n e r a w i t h i n t h e d i c o ts u b c l a s s M a g n o l i i d a e a n d m e m b e r s o f t h e p r i m i t i v e a q u a t i cm o n o c o t s u b c l a s s A l i s m a t i d a e s h o u l d p r o v i d e f u r t h e r d a t ap e r t i n e n t t o r e s o l v i n g t h i s c r i t i c a l q u e s t i o n . A p r e l i m i n a r yr e s u l t m a i n t a i n s t h e s a m e maximum l i k e l i h o o d t o p o l o g y o ft h e s e a q u a t i c g e n e r a a s a d d i t i o n a l g e n e r a f r o m M a g n o l i i d a ea n d A l i s m a t i d a e a r e a d d e d t o o u r a n a l y s i s .A r e t h e a n g i o s p e r m s o f a n a q u a t i c a n c e s t r y ? A l t h o u g he v i d e n c e i s m o u n t i n g t h a t i m p l i c a t e s a q u a t i c p l a n t s a s d e -s c e n d a n t s o f e a r l y f l o w e r i n g p l a n t s , i t i s h i g h l y u n l i k e l y t h a tt h e g r o u p e v o l v e d f r o m a q u a t i c a n c e s t o r s . A q u a t i c p l a n t st y p i c a l l y e x h i b i t s t a s i s a n d e x t r e m e l y l o n g s p e c i e s d u r a t i o n s( 4 6 , 4 7 ) . T h e i r a b i l i t y t o s u r v i v e o v e r l o n g t i m e p e r i o d s h a sp r o b a b l y b i a s e d t h e s a m p l e o f s u r v i v i n g a r c h a i c a n g i o s p e r m st o o v e r l y r e p r e s e n t h y d r o p h y t e s .We t h a n k N . H a r r i m a n , E . S c h n e i d e r , D . B r y n e , a n d M r . P . N u t t ,f o r p l a n t m a t e r i a l , T . S c h u c k f o r c a r e o f p l a n t s , a n d S . D u n c a n f o rc o m p u t e r a s s i s t a n c e . T h i s p r o j e c t w a s s u p p o r t e d b y N a t i o n a l S c i -e n c e F o u n d at i o n G r a n t B S R - 8 8 1 7 9 9 2 .

1 . R a v e n , P . & A x l e r o d , D . I . ( 1 9 7 4 ) A n n . M o . B o t . G a r d . 6 1 ,5 3 9 - 6 7 3 .2 . A x l e r o d , D . 1 . ( 1 9 5 2 ) E v o l u t i o n 6 , 2 9 - 6 0 .3 . H a i n e s , R . W. & L y e , K . A . ( 1 9 7 5 ) B o t . J . L i n n . S o c . 7 0 ,2 5 5 - 2 6 5 .4 . C r o n q u i s t , A . ( 1 9 8 8 ) T h e E v o l u t i o n a n d C l a s s i f i c a t i o n o f F l o w -e r i n g P l a n t s (New Y o r k B o t a n i c a l G a r d e n , B r o n x , N Y ) .5 . T a k h t a j a n , A . L . ( 1 9 8 0 ) B o t . R e v . 4 6 , 2 2 5 - 3 5 9 .6 . D a h l g r e n , R . M. T . & R a s m u s s e n , F . N . ( 1 9 8 3 ) E v o l . B i o l . 1 6 ,2 5 5 - 3 9 5 .7 . S c h a f f n e r , J . H . ( 1 9 0 4 ) O h i o N a t . 4 , 8 3 - 9 2 .8 . D a h l g r e n , R . M . T . , C l i f f o r d , H . T . & Y e o , P . F . ( 1 9 8 5 ) T h eF a m i l i e s o f M o n o c o t y l e d o n s ( S p r i n g e r , B e r l i n ) .9 . L e s , D . H . ( 1 9 8 8 ) T a x o n 3 7 , 3 2 6 - 3 4 5 .1 0 . H a m b y , K . & Z i m m e r , E . A . ( 1 9 9 1 ) i n M o l e c u l a r S y s t e m a t i c s

o f P l a n t s , e d s . S o l t i s , P . , S o l t i s , D . & D o y l e , J . J . ( C h a p m a n &H a l l , L o n d o n ) , p p . 5 0 - 9 1 .1 1 . D i l c h e r , D . L . ( 1 9 8 9 ) Am . J . B o t . 7 6 , 1 6 2 ( a b s t r . ) .1 2 . I t o , M . ( 1 9 8 7 ) B o t . M a g . 1 0 0 , 1 7 - 3 5 .1 3 . T h o r n e , R . F . ( 1 9 7 6 ) E v o l . B i o l . 9 , 3 5 - 1 0 6 .1 4 . T a m u r a , M . ( 1 9 8 2 ) A c t a P h y t o t a x o n . G e o b o t . 3 3 , 3 3 6 - 3 4 5 .1 5 . B u k o w i e c k i , H . , F u r m a n o w a , M . & O l e d z k a , H . ( 1 9 7 2 ) A c t aP o l . P h a r m . 2 9 , 3 1 9 - 3 2 7 .1 6 . D a h l g r e n , R . M . T . ( 1 9 8 0 ) B o t . J . L i n n . S o c . 8 0 , 9 1 - 1 2 4 .1 7 . T a k h t a j a n , A . ( 1 9 8 7 ) S y s t e m a M a g n o l i o p h y t o r u m ( L e n i n o p o l i ) .1 8 . L i , H . ( 1 9 5 5 ) Am . M i d l . N a t . 5 4 , 3 3 - 4 1 .1 9 . D o y l e , J . J . & D o y l e , J . L . ( 1 9 8 7 ) P h y t o c h e m . B u l l . 1 9 , 1 1 - 1 5 .2 0 . S a i k i , R . , G e l f u n d , D . , S t o f f e l , S . , S c h a r f , S . , H i g u c h i , R . ,H o r n , G . , M u l l i s , K . & E r l i c h , H . ( 1 9 8 8 ) S c i e n c e 2 3 9 , 4 8 7 - 4 9 1 .2 1 . S a n g e r , F . , N i c k l e n , S . & C o u l s o n , A . R . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 7 4 , 5 4 6 3 - 5 4 6 7 .2 2 . G o l e n b e r g , E . M . , G i a n a s s i , D . E . , C l e g g , M . T . , S m i l e y ,C . J . , D u r b i n , M . , H e n d e r s o n , D . & Z u r a w s k i , G . ( 1 9 9 0 )N a t u r e ( L o n d o n ) 3 4 4 , 6 5 6 - 6 5 8 .2 3 . H i p k i n s , V . , T s a i , C . H . & S t r a u s s , S . H . ( 1 9 9 0 ) P l a n t M o l .B i o l . 1 5 , 5 0 5 - 5 0 7 .2 4 . S w o f f o r d , D . L . ( 1 9 8 5 ) PAUP: P h y l o g e n e t i c A n a l y s i s U s i n gP a r s i m o n y , V e r s i o n 24 ( I l l i n o i s N a t . H i s t . S u r v . , C h a m p a i g n ) .2 5 . F e l s e n s t e i n , J . ( 1 9 8 5 ) E v o l u t i o n 3 9 , 7 8 3 - 7 9 1 .2 6 . K i s h i n o , H . & H a s e g a w a , M. ( 1 9 8 9 ) J . M o l . E v o l . 2 9 , 1 7 0 - 1 7 9 .2 7 . B e c k , C . B . ( 1 9 8 0 ) O r i g i n a n d E a r l y E v o l u t i o n o f A n g i o s p e r m s( C o l u m b i a U n i v . P r e s s , New Y o r k ) .2 8 . S c u l t h o r p e , C . D . ( 1 9 6 7 ) B i o l o g y o f A q u a t i c V a s c u l a r P l a n t s( E d w a r d A r n o l d , L o n d o n ) .2 9 . O s b o r n , J . M . & S c h n e i d e r , E . L . ( 1 9 8 8 ) A n n . M o . B o t . G a r d .7 5 , 7 7 8 - 7 9 4 .3 0 . I t o , M . ( 1 9 8 6 ) B o t . M a g . 9 9 , 1 6 9 - 1 8 4 .3 1 . K h a n n a , P . ( 1 9 6 5 ) A u s t . J . B o t . 1 3 , 3 7 9 - 3 8 7 .3 2 . Y o u n g , D . A . & S i e g l e r , D . S . ( 1 9 8 1 ) P h y t o c h e m i s t r y a n dA n g i o s p e r m P h y l o g e n y ( P r a e g e r , New Y o r k ) .3 3 . S i m o n , J . P . ( 1 9 7 0 ) A l i s o 7 , 2 4 3 - 2 6 1 .3 4 . G i b b s , R . D . ( 1 9 7 4 ) C h e m o t a x o n o m y o f F l o w e r i n g P l a n t s( M c G i l l - Q u e e n ' s U n i v . P r e s s , M o n t r e a l ) .3 5 . O g a n e z o v a , E . P . & N a l b a n d y a n , R . M . ( 1 9 7 6 ) B i o k h i m i y a( M o s c o w ) 4 1 , 7 9 4 - 8 0 0 .3 6 . C z a j a , A . T . ( 1 9 7 8 ) T a x o n 2 7 , 4 6 3 - 4 7 0 .3 7 . D a h l g r e n , R . ( 1 9 7 7 ) P l a n t S y s t . E v o l . ( S u p p . ) 1 , 2 5 3 - 2 8 3 .3 8 . R i t l a n d , K . & C l e g g , M . T . ( 1 9 8 7 ) Am. N a t . 1 3 0 , S 7 4 - S 1 0 0 .3 9 . Z u r a w s k i , G . & C l e g g , M . T . ( 1 9 8 7 ) A n n u . R e v . P l a n t P h y s i o l .3 8 , 3 9 1 - 4 1 8 .4 0 . W e i r , B . S . ( 1 9 9 0 ) G e n e t i c D a t a A n a l y s i s ( S i n a u e r , S u n d e r l a n d ,M A ) .4 1 . T a t e n o , Y . , N e i , M. & T a j i m a , F . ( 1 9 8 2 ) J . M o l . E v o l . 1 8 ,3 8 7 - 4 0 4 .4 2 . N a k a i , T . ( 1 9 4 3 ) O r d i n e s , F a m i l i a e , T r i b i , G e n e r a , S e c t i o n e s ,S p e c i e s , V a r i e t a t e s , F o r m a e e t C o m b i n a t i o n e s Novae a P r o f .N a k a i - T a k e n o s c h i n A d h u c u t N o v i s E d i t a ( I m p e r i a l U n i v e r s i t y ,T o k y o ) .4 3 . D o n o g h u e , M . J . & D o y l e , J . A . ( 1 9 8 9 ) i n T h e H i e r a r c h y o fL i f e , e d s . F e r n h o l m , B . , B r e m e r , K . & J o r n v a l l , H . ( E l s e v i e r ,A m s t e r d a m ) , p p . 1 8 1 - 1 9 3 .4 4 . C o o k , C . D . K . ( 1 9 7 0 ) W a t e r P l a n t s o f t h e W o r l d ( J u n k , T h eH a g u e , T h e N e t h e r l a n d s ) .4 5 . G o o d , R . ( 1 9 6 4 ) T h e G e o g r a p h y o f F l o w e r i n g P l a n t s ( W i l e y ,New Y o r k ) .4 6 . L e s , D . H . ( 1 9 8 8 ) A n n . Mo. B o t . G a r d . 7 5 , 8 1 9 - 8 3 5 .4 7 . H e r e n d e e n , P . S . , L e s , D . H . & D i l c h e r , D . L . ( 1 9 9 0 ) Am. J .B o t . 7 7 , 7 - 1 6 .

E v o l u t i o n : L e s e t a l .