Moleküler biyoloji

MOLEKÜLER BİYOLOJİ TEKNİKLERİ II

UYGULAMA KİTABI

MBG603

MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK BÖLÜMÜ

Dr. Neslihan Ergen

2

GENEL KULLANIM İÇİN HAZIRLANMASI GEREKEN STOK SOLÜSYONLAR

RNase-free steril distile su (DEPC-treated water) : 2 litre

Her 100 ml su için 0.1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) eklenir ve çeker ocak altında

gece boyu karıştırılarak tamamen çözünmesi sağlanır. Daha sonra otoklavlanarak DEPC’nin

deaktive edilmesi gerekmektedir.

% 70 EtOH (v/v) : 100 ml

70 ml absulut etanole 30 ml steril RNase-free distile su eklenerek hazırlanır.

% 75 EtOH (v/v) : 100 ml

75 ml absulut etanole 25 ml steril RNase-free distile su eklenerek hazırlanır.

% 10 SDS (w/v) : 100 ml

10 gr SDS 80 ml distile su içerisinde gece boyu karıştırarak çözülür.

Hacim yine distile su kullanılarak 100 ml’ye tamamlanır.

Oda sıcaklığında saklanmalıdır.

0.5 M Tris (pH 6.8) : 100 ml

6 gr Tris bazı 60 ml distile su içerisinde çözündükten sonra 6 N HCl kullanılarak pH’sı

6.8’e ayarlanır. Hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlandıktan sonra otoklav ile steril edilerek

saklanır.

0.5 M Tris (pH 7.5) : 100 ml

6 gr Tris bazı 60 ml distile su içerisinde çözündükten sonra 6 N HCl kullanılarak pH’sı

7.5’e ayarlanır. Hacim distile su ile 100 ml’ye tamamlandıktan sonra otoklav ile steril edilerek

saklanır.

1.5 M Tris (pH 8.8) : 100 ml

27.23 gr Tris bazı 80 ml distile su içerisinde çözündükten sonra 6 N HCl kullanılarak

pH’sı 8.8’e ayarlanır. Hacim distile su ile 150 ml’ye tamamlandıktan sonra otoklav ile steril

edilerek saklanır.

3

% 0.5 (w/v) Bromofenol mavisi : 10 ml

0.05 gr bromofenol mavisi 10 ml su içerisinde çözdürülür. Çözünmeyen parçacıkların

kalması durumunda filtreden geçirilerek oda sıcaklığında saklanır.

20X MOPS tamponu : 100 ml

0.4 M MOPS (8.73 gr)

0.1 M NaAc (1.36 gr)

20 mM EDTA (0.74 gr)

Yukarıda verilen gramajlar 80 ml distile su içerisinde çözüldükten sonra 5 M NaOH

kullanılarak pH 7.0’a ayarlanır. pH ayarlamasından sonra hacim 100 ml’ye tamamlanır.

Otoklav ile steril edildikten sonra ışık almayacak şekilde karanlık bir ortamda saklanır.

RNA MOPS jel yükleme tamponu : 1 ml

% 50 gliserol

1X MOPS tamponu (20X MOPS tamponundan seyreltilerek)

% 1 bromofenol mavisi (bromophenol blue)

Hücre lizis tamponu : 10 ml

150 mM NaCl

%1 NP-40

50 mM Tris-HCl

Yukarıda verilen kompozisyon distile su içerisinde çözündükten sonra pH 8.0’a

ayarlanır. Lizis tamponu -20°C’de saklanır ve kullanmadan önce içerisine 1 mM PMSF

(phenylmethanesulphonylfluoride) ve proteaz inhibitör kokteyli eklenir.

1 mM PMSF metanol içerisinde çözerek taze olarak hazırlanır ve kullanılır.

Proteaz inhibitör kokteylinin hazırlanması için her bir tablet 1 ml steril PBS veya

distile su içerisinde çözündükten sonra -20°C’de saklanır. Kullanılacak olan her 1 ml lizis

tamponu için 50µl kokteyl eklenmesi gerekmektedir.

4

Toplam protein izolasyon tamponu : 10 ml

56 mM Na2CO3

56 mM DDT

% 2 SDS

% 12 Sucrose

2 mM EDTA

Yukarıda verilen kompozisyon 6 ml distile su içerisinde çözündükten sonra SDS

eklenmesi yapılır ve çözünmesi sağlanır. Hacim distile su kullanılarak 10 ml’ye tamamlanır

ve ışık almayacak şekilde saklanır.

SDS protein indirgeme tamponu : 10 ml

3.55 ml distile su

1.25 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8

2.5 ml gliserol

2 ml % 10 (w/v) SDS

0.2 ml % 0.5 (w/v) bromofenol mavisi

Karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında saklanır. Kullanılmadan önce 950 µl indirgeme

tamponuna 50 µl β-mercaptoethanol eklenmesi gerekmektedir.

10X SDS-PAGE yürütme tamponu : 500 ml

15.2 gr Tris bazı

72 gr glisin

5 gr SDS

Yukarıda verilen gramajlar 300 ml distile su içerisinde çözündükten sonra hacim 500

ml’ye tamamlanır. Hazırlanan tamponun 4°C’de saklanması gerekmektedir. Bu sırada bir

çökme olursa kullanmadan önce oda sıcaklığına ısıtılması gerekmektedir.

% 10 (w/v) APS (ammonium persulfate) : 10 ml

1 gr APS 10 ml distile su içerisinde çözdürülerek hazırlanır. APS’nın taze kullanılması

gerektiği için -20°C’de saklanması ve kullanılmadan önce çözdürülmesi gerekmektedir.

5

Coomassie boyama solüsyonu : 500 ml

% 0.2 (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250 % 45 (v/v) etanol ve % 10 (v/v) asetik

asit içerisinde çözdürülür. Çözünmeyen parçacıkların kalması durumunda filtreden geçirilerek

oda sıcaklığında saklanır.

10X TBST (Tris buffered saline with Tween 20) : 500 ml

20 mM Tris-HCl, pH 7.5

150 mM NaCl

% 0.05 (v/v) Tween-20

Western blotlama transfer tamponu : 100 ml

48 mM Tris bazı

39 mM glisin

% 20 metanol

% 0.0375 (w/v) SDS

Western blotlama membrana aktarım sonrası boyama solüsyonu : 100 ml

% 0.1 Ponceau red

Steril distile su içerisinde hazırlanarak, ışıktan korunacak şekilde saklanır.

6

PROTOKOL: Bitkilerden Trizol Kullanılarak RNA İzolasyonu

Materyal

Bitki yaprakları

Çözelti ve Tamponlar

a. Trizol Reagent (Invitrogen)

b. Kloroform

c. % 75 EtOH (v/v)

d. İzopropanol

e. Distile su (RNase-free)

Araç ve Gereçler

Sıvı azot

Havan

2.0 ml steril mikrofüj tüpleri


Soğutmalı santrifüj

Pipet ve steril pipet uçları

Tüp karıştırıcı (vorteks)

Su banyosu (55°C)

Uygulama

1. 0.3 gram bitki dokusu sıvı azot yardımıyla toz haline getirilir ve 1.7 ml Trizol Reagent

eklenerek homojenize edilir.

2. 1 ml homojenize edilmiş örnek 2 ml mikrofüj tüpüne aktarılır. Bu aşamada kesik uç

kullanılması gerekebilir.

Tüm örnekler hazırlanana kadar mikrofüj tüpüne aktarılmış olan örnekler buzda

tutulmalıdır.

3. Örneğe 400 µl kloroform eklenir ve elde sallanarak karıştırılır.

4. Oda sıcaklığında 7 dakika bekletilen örnekler daha sonra maksimum hızda 4°C’de 15

dakika santrifüj edilirler.

5. 1.5 ml eppendorf tüpe aktarılan üst faza 500 µl izopropanol eklenir ve oda sıcaklığında 10

dakika bekletilir.

6. Maksimum hızda 4°C’de 10 dakika santrifüj edilen örneklerdeki üst faz RNA peletini

oynatmadan dikkatlice dökülür.

7

7. Örneklere 1 ml % 75’lik EtOH eklenir ve 9,000 rpm’de 4°C’de 5 dakika süre ile santrifüj

edilir.

8. Etanol RNA peletini oynatmadan dikkatlice dökülür.

Bu aşamada kalan etanolun ortamdan uzaklaştırılması için mikropipet kullanılabilir.

9. Pelet oda sıcaklığında 10 dakika, etanol kokusu gidene kadar, kurutulur.

Aşırı kurutmak RNA peletinin çözünmesini engelleyeceğinden kurutma süresine dikkat

edilmesi gereklidir.

10. Oluşan pelete 30-50 µl RNase-free distile su eklendikten sonra çözünmesini sağlamak için

55°C’de 1 saat bekletilir.

11. İzole edilen RNA örnekleri uzun süreli saklamalarda -80°C’de muhafaza edilmelidirler.

Ancak kısa süreli saklamak amaçlı -20°C de tutulabilir.

8

PROTOKOL: Memelilerden TriPure Kullanılarak RNA İzolasyonu

Materyal

Hücre kültüründen elde edilen tek tabakalı memeli hücreleri (Bir grup hücreye ilaç

uygulaması yapılmışken, diğer bir grup normal koşullarda büyütülmüştür.)

Hücrelere ilaç uygulanması:

İlaç stok konsantrasyonu: 10 mM

Uygulama için gereken konsantrasyona indirgenen ilaç, büyütme ortamı ile

seyreltilerek hazırlanır. Kuyularda büyütülen memeli hücrelerinden büyütme ortamı çekilip

atılır. Daha sonra ilaçlı büyütme ortamı ekili hücrelerin üzerine eklenerek, ilaç uygulama

süresi kadar (24 saat) büyütmeye devam edilir.


a. TriPure Isolation Reagent (Roche Applied Sciences)

b. Kloroform

c. % 70 EtOH (v/v)

d. Etanol

e. Distile su (RNase-free)

f. 1X PBS

Araç ve Gereçler





Su banyosu (55°C)

Uygulama

1. 6 kuyulu petrilere ekilmiş ve % 90’dan fazla yaygınlığa ulaştığı mikroskop ile saptanmış

olan memeli hücreleri 2 kez soğuk 1 ml 1X PBS tamponu ile yıkanır. Hücrelerin yıkanması

besiyeri içeriğinin tamamen uzaklaştırılması açısından önemlidir. Ancak yüzeye yapışan

hücrelerin yıkama esnasından kaldırılmaması için uygulama özenli bir şekilde yapılmalıdır.

2. Hücrelere 1 ml soğuk 1X PBS eklenmesinin ardından kazıyıcı yardımı ile tüm hücre

materyali kaldırılır ve 1.5 ml steril mikrofüj tüpüne aktarılır. En son kalan hücre topluluğunu

aktarmak için 0.5 ml soğuk 1X PBS 6 kuyucuklu hücre petrisine konur ve kazıyıcı yardımıyla

son hücreler de alınarak aynı 1.5 ml mikrofüj tüpünde tüm materyal toplanır.

9

3. Hücreler maksimum hızda daha önce soğutulmuş santrifüjde 4°C’de 30 saniye süre ile

çökertilir. Üst sıvı dikkatli bir şekilde yeni bir steril mikrofüj tüpüne aktarılır.

4. Örneklere 250 µl TriPure Reagent eklenir ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletilir.

5. Örneklere 50 µl kloroform eklenir ve 15 saniye süre ile karıştırılır.

6. Oda sıcaklığında 15 dakika bekletilen örnekler daha sonra maksimum hızda 4°C’de 15

dakika santrifüj edilirler.

7. Üst faz yeni bir mikrofüj tüpüne aktarılır ve üzerine 125 µl etanol eklenir. Mikrofüj tüp alt

üst edilerek karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika bekletilir.

8. Maksimum hızda 4°C’de 10 dakika santrifüj edilen örneklerdeki üst faz RNA peletini

oynatmadan dikkatlice dökülür.

9. Örneklere 250 µl % 70’lik EtOH eklenir ve 8,000 rpm’de 4°C’de 5 dakika süre ile santrifüj

edilir.

10. Etanol RNA peletini oynatmadan dikkatlice dökülür.

Bu aşamada kalan etanolun ortamdan uzaklaştırılması için mikropipet kullanılabilir.

11. Pelet oda sıcaklığında 10 dakika, etanol kokusu gidene kadar, kurutulur.

Aşırı kurutmak RNA peletinin çözünmesini engelleyeceğinden kurutma süresine dikkat

edilmesi gereklidir.

12. Oluşan pelete 30-50 µl RNase-free distile su eklendikten sonra çözünmesini sağlamak için

55°C’de 1 saat bekletilir.

13. İzole edilen RNA örnekleri uzun süreli saklamalarda -80°C’de muhafaza edilmelidirler.

Ancak kısa süreli saklamak amaçlı -20°C de tutulabilir.

10

PROTOKOL: Spektrofotometre ile RNA Miktarının Hesaplanması

Materyal

İzolasyonu gerçekleştirilen bitki ve memeli RNA örnekleri

Araç ve Gereçler

Kuartz spektrofotometri küvetleri

Spektrofotometre


1.5 ml mikrofüj tüpleri

Uygulama

1. 1.5 ml’lik iki mikrofüj tüpü K (Kör, Blank) ve Ö (Örnek) şeklinde işaretlenir.

2. Örneği içeren tüpün içerisine öncelikle 98 µl distile su, daha sonra da 2 µl RNA izolatı

konularak pipet yardımıyla karıştırılır. Bu aşamada 1:50 seyreltme yapılmış olur.

3. Kör tüp sadece 100 µl distile su içermektedir.

4. Spektrofotometrede nükleik asitler için ölçüm yapılan 3 numaralı dosya açılır ve yapılan

seyreltme ve doğrulama faktörleri gibi ayarlamalar yapılır.

Kullanılan spektrofotometreye göre bu aşamanın değişeceği unutulmamalıdır.

5. Referans değerler K kodlu tüpten elde edilen ölçüm ile sıfırlanır. Bu aşamada

gerçekleştirilen solüsyondan ileri gelecek olan spektrofotometrik algılamaların

sıfırlanmasıdır. Bu şekilde örnekten yapılacak ölçümlerin sadece örnek içerisinde çözülmüş

molekülleri tespit etmesi sağlanır.

6. Ö kodlu tüpün ölçüm değerleri (260 nm, 280 nm ve saflık değerleri) laboratuar defterine

aktarılır. Alet tarafından ölçülen RNA miktarı ng/µl olarak deftere alınır.

Proteinler 280 nm’de absorbsiyon gösterdikleri için OD 260/OD 280 değeri

hesaplanır. Eğer bu değer 1.8-2.0 arasında ise elde edilen nükleik asitlerin temiz olduğu

varsayılır.

RNA konsantrasyonu (µg/ml) = (OD260 x Seyreltme katsayısı x 40 µg/ml) / 1000

Not: Absorbansın ‘1’ değeri 1 cm3’lük küvette 50 µg/ml miktarında çift zincirli DNA’yı, 33

µg/ml tek zincirli oligonükleotidleri ve 40 µg/ml ise tek zincirli RNA’yı temsil etmektedir.

11

Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor Hazırlanması

Spektrofotometri ile ölçülen 260 nm ve 280 nm değerleri kullanılarak izole edilen

RNA örneklerinin konsantrasyonlarının ve saflık derecelerinin hesaplanması, karşılaştırılması

ve sonuçların deneysel uygulama aşamaları açısından değerlendirilmesi.

12

PROTOKOL: RNA’dan iScript cDNA Synthesis Kiti (Bio-Rad) ile cDNA Sentezi ve

Spektrofotometre ile cDNA Miktarının Hesaplanması

Materyal

İlaç uygulanmış ve kontrol memeli hücrelerinden izole edilen RNA örnekleri


iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad)

Araç ve Gereçler



Su banyosu (45°C, 42°C, 85°C)


Tüp karıştırıcı (Vorteks)

Kuartz spektrofotometri küvetleri

Spektrofotometre


Uygulama

1. RT reaksiyon karışımı aşağıdaki içeriğe göre toplamda 20 µl olacak şekilde hazırlanır;

4 µl 5X iScript Reaction Mix

1 µl iScript Reverse Transcriptase

1 µl RNA örneği

14 µl Nuclease-free su

2. Hazırlanan karışım voktekslenir ve hacmin tüpün dibinde birikmesini sağlamak amacıyla

kısa süre santrifüj edilir.

3. Hazırlanan RT reaksiyon karışımı aşağıdaki sıcaklık ve sürelerde bekletilerek cDNA

sentezi gerçekleştirilir.

25°C 5 dakika

42°C 30 dakika

85°C 5 dakika

4. Spektrofotometre ile sentezlenen tek zincirli cDNA’nın kantifikasyonu yapılır. cDNA’ya

çevrilen RNA örneklerinin -20°C’de saklanması gerekmektedir.

cDNA konsantrasyonu (µg/ml) = (OD260 x Seyreltme katsayısı x 33 µg/ml) / 1000

13

Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor Hazırlama

cDNA konsantrasyonlarının hesaplanması. Reaksiyona konulan RNA miktarına göre

cDNA amplifikasyon miktarının değerlendirilmesi. Sentezlenen cDNA’nın neden

spektrofotometre ile hesaplandığının ve bir jel elektroforez yöntemi ile değerlendirilmediğinin

yorumlanması.

14

PROTOKOL: İzole Edilen RNA’ların MOPS Jel Elektroforez Yöntemi ile Gösterimi

Materyal

İzolasyonu gerçekleştirilen bitki ve memeli RNA örnekleri


a. 20X MOPS tamponu

b. RNA MOPS jel yükleme tamponu

c. MOPS jel yürütme tamponu

25 ml 20X MOPS ve 13.5 ml formaldehit 400 ml steril distile suya eklenir ve

hacim 500 ml’ye tamamlanır.

d. Formaldehit

e. Agaroz

f. Distile su (RNase-free)

g. Etidyum bromür

Araç ve Gereçler


Jel elektroforez sistemi

Güç kaynağı

UV-translüminatör


Mikrodalga fırın

Su banyosu (65°C)

Uygulama

1. 50 ml MOPS agaroz jeli hazırlamak için 0.7 gram agaroz 39 ml RNase-free distile su

içerisine konulur. Mikrodalga fırında taşmamasına özen gösterilerek agaroz tamamen eriyene

kadar kaynatılır. Daha sonra oda ısısında veya musluk altında elle dokunulabilir sıcaklığa

erişene kadar soğutulur ve içerisine 2.5 ml 20X MOPS ve 8.5 ml formaldehit eklenir.

Kabarcıkların oluşmamasına dikkat ederek karıştırılır.

MOPS ve formaldehit eklenmesi zaten soğutulmuş olan agaroz jel çözeltisinin daha

fazla soğumasına neden olacağı için, dökme işleminin agaroz tamamen jel haline

dönüşmeden hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekmektedir.

15

2. Jel tarakları elektroforez tankında uygun yerlere yerleştirilir ve 3-5 mm kalınlığında bir jel

dökülür. Eğer hava kabarcığı oluşmuş ise pipet ucu veya kağıt peçete yardımıyla ortamdan

uzaklaştırılmalıdır.

3. Tamamen donduktan sonra taraklar kuyucukların bozulmamasına özen gösterilerek

çıkartılır ve jel, içerisinde MOPS jel yürütme tamponu bulunan tanka aktarılır. Tampon

çözeltisinin hazırlanan jelden 1 mm daha yüksek olması yeterlidir.

4. İzole edilen RNA örneklerinin yüklenmesi için aşağıdaki şekilde hazırlanması

gerekmektedir;

3.3 µl formaldehit

1 µl 20X MOPS tamponu

2 µl RNA MOPS jel yükleme tamponu

1µl EtBr

X µl RNA örneği (2 µg olacak hacme göre hesaplanır)

Y µl RNase-free distile su (20 µl’ye tamamlanacak şekilde hesaplanır)

1.5 ml mikrofüj tüp içerisinde hazırlanan örnekler 65°C’de 10 dakika tutulduktan

sonra hızla buza aktarılırlar. Örnekler tamamen soğuduktan sonra jel üzerindeki kuyucuklara

dikkatlice yüklenir. İlk kuyuya RNA standartı (RiboRuler RNA Ladder High Range,

Fermentas) yüklenir.

5. Elektrotların doğru olarak yerleştirildiğinden emin olduktan sonra voltaj 1-5 V/cm olacak

şekilde hesaplanır (cm pozitif ve negatif elektrot arasındaki uzaklıktır). Mini jellerde ise 10-

100 ng DNA 30-60 dakika içerisinde 5-20 V/cm olacak şekilde yürütülebilmektedir.

6. Yükleme tamponunun görülebilir boyaları jelin 2/3’üne ulaştığında yürütme durdurulur.

7. Jel transiluminatörde UV ışığı altında gözlemlenir.


İzole edilen toplam RNA örneklerinin jel görüntüleri ile spektrofotometrik analiz

sonucu hesaplanan konsantrasyonlarının karşılaştırılarak yorumlanması. Memeli ve bitkiden

izole edilen RNA örneklerinin konsantrasyon farklarının ve görüntülenen bantların

yorumlanması. Sonuçların deneysel uygulama aşamaları açısından değerlendirilmesi.

16

PROTOKOL: qRT-PCR ile PUMA Geninin Anlatımının Kantifikasyonu

Materyal

İlaç uygulanmış ve uygulanmamış (kontrol) memeli hücrelerinden elde edilen cDNA

örnekleri


a. SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad)

b. PUMA primerleri (Hedef gen)

c. GADPH primerleri (Referans, kontrol gen)

Araç ve Gereçler



Mini Opticon Thermal Cycler (Bio-Rad)

Uygulama

1. Kantifikasyonun yapılabilmesi için kullanılacak olan Pfaffl metodu için gereken değerlerin

elde edilebilmesi amacıyla qRT-PCR reaksiyonlarının aşağıdaki olasılıklar için hazırlanması

gerekmektedir. Aynı şekilde standart sapmanın hesaplanması amacıyla her bir olasılıktan iki

adet PCR gerçekleştirileceği için toplamda 12 reaksiyon hazırlanması gerekmektedir.

100 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Standart)


500 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Standart/Referans)

500 ng kontrol cDNA PUMA primerleri (Hedef)

500 ng ilaç uygulanmış cDNA GADPH primerleri (Referans)

500 ng ilaç uygulanmış cDNA PUMA primerleri (Hedef)

2. 0.2 ml’lik PCR tüpleri içerisinde 25 µl PCR karışımı hazırlanır.

X µl steril distile su (25 µl’ye tamamlayacak hacimde)

12,5 µl 5X SYBR Green PCR Master Mix

0.25 µM Primerler

Y µl cDNA (Gerekli olan ng’ı ayarlayacak hacimde)

17

3. Örnekler polimeraz zincir reaksiyonu ile Mini Opticon Thermal Cycler’da çoğaltılır.

Amplifikasyon döngüsü;

Başlangıç denatürasyon 95°C 15 dakika

40 siklus

Denatürasyon 94°C 1 dakika

Bağlanma 54°C 1 dakika

Uzama 72°C 1 dakika

4. Sonuçlar değerlendirilerek, Pfaffl metodu ile kantifikasyon gerçekleştirilecektir. Bu amaçla

öncelikle aşağıdaki üç PCR için elde edilen değerlerden cDNA konsantrasyonuna göre CT

değeri grafiği çizilerek, R2 değeri hesaplanacaktır. Bu aşamada standart sapmaların (SD)

değerlendirilmesinin unutulmaması gerekmektedir.

Verimli bir amplifikasyon için R2 değerinin 1’e yakın olması gerekmektedir.




5. Aşağıda verilen PCR örnekleri için ∆∆CT denklemlerine göre kontrol grubunda ve ilaç

uygulama sonrası PUMA geninin transkript miktarı hesaplanacaktır.

R = 2-[(CT

ilaç uygulanmış-CT

ilaç uygulanmamış)PUMA

– (CT

ilaç uygulanmış-CT

ilaç uygulanmamış)GADPH

]

R = 2-[∆CT

hedef gen- ∆CT

referans gen]

R = 2-∆∆CT

500 ng kontrol cDNA GADPH primerleri (Referans)

500 ng ilaç uygulanmış cDNA GADPH primerleri (Referans)

500 ng kontrol cDNA PUMA primerleri (Hedef)

500 ng ilaç uygulanmış cDNA PUMA primerleri (Hedef)

18

Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor

Gerçekleştirilen PCR’ın veriminin (yani tekrarlanabilirliğinin) yorumlanması (R2 değeri göz

önünde bulundurularak). Kantifikasyon sonuçlarının hesaplanması, standart sapmaların (SD)

değerlendirilmesi. İlaç kullanımı sonucunda, PUMA geninin transkripsiyonunda gerçekleşen

değişimin yorumlanması.

Referans makaleler :

- Comparison of relative mRNA quantification models and the impact of RNA integrity in

quantitative real-time RT-PCR, S. Fleige, V. Walf, S. Huch, C. Prgomet, J. Sehm and

M. W. Pfaffl , Biotechnology Letters, 2006, 28(19), 1601-1613

- A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR, M.W. Pfaffl,

Nucleic Acids Research, 2001, 29(9), e45

19

PROTOKOL: Memeli Hücrelerinden Protein İzolasyonu

Materyal

Hücre kültüründen elde edilen tek tabakalı memeli hücreleri (Bir grup hücreye ilaç

uygulaması yapılmışken, diğer bir grup hücre normal koşullarda büyütülmüştür.)

Hücrelere ilaç uygulanması:

İlaç stok konsantrasyonu: 10 mM

Uygulama için gereken konsantrasyona indirgenen ilaç stoğu büyütme ortamı ile

seyreltilerek hazırlanır. Kuyularda büyütülen memeli hücrelerinden büyütme ortamı çekilip

atılır. Daha sonra ilaçlı büyütme ortamı ekili hücrelerin üzerine eklenerek, ilaç uygulama

süresi kadar (24 saat) büyütmeye devam edilir.


a. Hücre lizis tamponu

b. 1X PBS

Araç ve Gereçler




Uygulama

1. 6 kuyulu petrilere ekilmiş ve % 90’dan fazla yaygınlığa ulaştığı mikroskop ile saptanmış

olan memeli hücreleri 2 kez soğuk 1 ml 1X PBS tamponu ile yıkanır. Hücrelerin yıkanması

besiyeri içeriğinin tamamen uzaklaştırılması açısından önemlidir. Ancak yüzeye yapışan

hücrelerin yıkama esnasından kaldırılmaması için uygulama özenli bir şekilde yapılmalıdır.

2. Hücrelere 1 ml soğuk 1X PBS eklenmesinin ardından kazıyıcı yardımı ile tüm hücre

materyali kaldırılır ve 1.5 ml steril mikrofüj tüpüne aktarılır. En son kalan hücre topluluğunu

aktarmak için 0.5 ml soğuk 1X PBS 6 kuyucuklu hücre petrisine konur ve kazıyıcı yardımıyla

son hücreler de alınarak aynı 1.5 ml mikrofüj tüpünde tüm materyal toplanır.

3. Hücreler maksimum hızda daha önce soğutulmuş santrifüjde 4°C’de 30 saniye süre ile

çökertilir. Üst sıvı hücre peletine zarar vermeyecek şekilde atıldıktan sonra, pelet üzerine 1 ml

hücre lizis tamponu konulur ve buzda 40 dakika bekletilir.

4. Maksimum hızda 4°C’de 15 dakika santrifüj edildikten sonra elde edilen üst sıvı 1.5 ml’lik

steril mikrofüj tüpüne aktarılır ve örnekler -20°C’de saklanır.

20

PROTOKOL: Bitkilerden Toplam Protein İzolasyonu

Materyal

Bitki yaprakları


Toplam protein izolasyon tamponu

Araç ve Gereçler

Sıvı azot

Havan




Su banyosu (70°C)

Uygulama

1. 0.1 gram bitki dokusu sıvı azot yardımıyla toz haline getirilir ve 500 µl toplam protein

izolasyon tamponu eklenerek homojenize edilir.

2. Homojenize edilmiş örnek 1.5 ml mikrofüj tüpüne aktarılır. Bu aşamada kesik uç

kullanılması gerekebilir.

3. Örnekler 15 dakika 70°C’de bekletildikten sonra maksimum hızda 4°C’de 10 dakika

santrifüj edilirler.

4. Üst sıvı 1.5 ml’lik steril bir mikrofüj tüpüne aktarılır ve örnekler -20°C’de saklanır.

21

PROTOKOL: İzole Edilen Proteinlerin Bradford Yöntemi ile Kantifikasyonu

Materyal

İzolasyonu gerçekleştirilen bitki ve memeli protein örnekleri


a. Bradford solüsyonu (Bio-Rad Protein Assay)

b. BSA (10 mg/ml stok)

Araç ve Gereçler



Spektrofotometri küvetleri

Spektrofotometre


Uygulama

1. Bradford solüsyonu distile su kullanılarak 1:5 oranında seyreltilir. Bu aşamada vorteks

yardımıyla iyice karıştırılması gerekmektedir.

2. 10 mg/ml BSA stok solüsyonu standart eğriyi çizmeye yetecek miktarda son

konsantrasyonu 1 µg/µl olacak şekilde distile su ile seyreltilir. Hazırlanan BSA’nın iyice

karıştırıldığından emin olunmalıdır.

3. Standart eğrinin çizilmesi amacıyla :

a. 800 µl Bradford solüsyonu spektrofotometri küvetlerine konulur. Bu aşamada

spektrofotometrinin sıfırlanması amacıyla kullanılacak olan Kör (Blank) örnekler de

hazırlanır.

b. Küvetlere sırasıyla 2 µg, 4 µg, 8 µg, 12 µg ve 18 µg olacak hacimde BSA eklenir.

Karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında 5 dakika bekletilir. Standart sapmanın (SD)

hesaplanması amacıyla her bir µg değerinden iki adet bağımsız ölçüm yapılması

gerekmektedir.

c. Spektrofotometrede 595 dalga boyunda ölçüm yapılır (OD595).

4. Örneklerin protein konsantrasyonunu hesaplayabilmek için:

a. 800 µl Bradford solüsyonu spektrofotometri küvetlerine konulur. Bu aşamada

spektrofotometrinin sıfırlanması amacıyla kullanılacak olan Kör (Blank) örnekler de

hazırlanır.

22

b. Küvetlere öncelikle 5µl örnek eklenir. Karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında 5

dakika bekletilir. Standart sapmanın (SD) hesaplanması amacıyla her bir µl değerinden iki

adet bağımsız ölçüm yapılması gerekmektedir.

c. Spektrofotometrede 595 dalga boyunda ölçüm yapılır (OD595).

Ölçüm sonucu elde edilen değer standart eğrinin çizilmesi için ölçülen değer

aralığında ise yeni bir ölçüm yapılmasına gerek yoktur. Ancak BSA ölçümünde elde edilen

aralığın dışında kadar değerler için, ölçüm daha az veya daha fazla protein örnek hacmi

kullanılarak tekrarlanır.


BSA sonuçları kullanılarak standart eğrinin çizilmesi, R2 değerinin hesaplanması ve

standart sapmaların yorumlanması. Örneklerden elde edilen protein miktarlarının standart eğri

kullanılarak hesaplanması ve yapılan iki ölçüm arasındaki farklılıklara bağlı olarak standart

sapmaların hesaplanarak yorumlanması. Farklı hücre türlerinden ve farklı yöntemler

kullanılarak elde edilen proteinlerin miktar açısından karşılaştırılarak yorumlanması. Memeli

hücrelerinde ilaç kullanımı sonucunda elde edilen protein miktarında bir değişiklik gözlenip

gözlenmediğinin kontrolü ve yorumlanması.

23

PROTOKOL: İzole Edilen Proteinlerin SDS-PAGE Jel Elektroforez ile Yürütülmesi ve

Coomassie Boyama

Materyal

İzolasyonu gerçekleştirilen bitki ve memeli protein örnekleri


a. SDS protein indirgeme tamponu

b. % 10 (w/v) SDS

c. Akrilamit:Bis-akrilamit çözeltisi (37.5:1)

d. TEMED

e. 10X SDS-PAGE yürütme tamponu

f. Coomassie boyama solüsyonu

g. Coomassie boyama yıkama solüsyonu

% 45 (v/v) etanol ve % 10 (v/v) asetik asit steril distile su ile karıştırılarak

hacmi 500 ml’ye tamamlanır.

h. % 10 (w/v) APS

i. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (Ayırma jel tamponu)

j. 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (Yükleme jel tamponu)

Araç ve Gereçler

Poliakrilamit jel elektroforez sistemi

Güç kaynağı

Translüminatör


Su banyosu (95°C)

Uygulama

1. Ayırma jeli için 50 ml % 12’lik akrilamit jel karışımı hazırlanır.

20 ml Akrilamit:bis-akrilamit çözeltisi

12.5 ml Ayırma jel tamponu

0.5 ml % 10 (w/v) SDS

17 ml distile su

2. 500 µl % 10 (w/v) APS ve 25 µl TEMED eklenir ve yavaşça karıştırılır. Jel içeriye hava

kabarcığı sıkışmamasına özen göstererek yavaşça kasete dökülür. Üzerine yükleme jeli de

24

döküleceği için jel kaseti tamamen doldurulmamalı, üst kısmında tarakların uzunluğunun

yaklaşık 1 cm altına denk gelecek şekilde boşluk bırakarak dökülmelidir.

3. Üst yüzeye yaklaşık 2 mm yüksekliğe gelecek kadar izopropanol dökülür ve jel oda

sıcaklığında donmaya bırakılır.

4. Ayırma jeli polimerize olduktan sonra kaset eğilerek izopropanol dökülür. Ayırma jelinin

üst tarafı distile su ile dikkatlice yıkanarak alkol kalıntılarından temizlenir ve peçete

yardımıyla dikkatlice kurutulur.

5. Yükleme jeli için 20 ml % 4’lük akrilamit jel karışımı hazırlanır.

2.6 ml Akrilamit:bis-akrilamit çözeltisi

5 ml Yükleme jel tamponu

0.2 ml % 10 (w/v) SDS

12.2 ml distile su


kabarcığı sıkışmamasına özen göstererek yavaşça kasete dökülür ve jel tarakları dikkatlice

yerleştirilir.

7. Yükleme jeli yarım saat süreyle oda sıcaklığında dondurulduktan sonra 1X SDS-PAGE

yürütme tamponu ile doldurulmuş olan tanka yerleştirilir. Taraklar dikkatli bir şekilde çıkarılır

ve oluşan kuyucukların içi mikropipet yardımıyla yıkanır.

8. Protein örnekleri hazırlanırken 30 µg protein içerecek hacime 1’e 1 oranında SDS protein

indirgeme tamponu eklenir, pipetleme ile karıştırılır ve 95°C’de 5 dakika kaynatıldıktan sonra

buzda soğuyana kadar bekletilir.

9. İlk kuyuya protein standartı (Full-range Rainbow, Amersham) yüklenir.

10. Hazırlanan protein örnekleri yeterince soğuduktan sonra jel üzerindeki kuyucuklara

dikkatlice yüklenir.

11. Jel yürütmesi örnekler yükleme jelini geçene kadar 100 V’da, geçtikten sonra ise 200

V’da gerçekleştirilir.

12. Yürütme tamamlandıktan sonra jel kaseti dikkatlice açılır ve ayırma jeli, yükleme jelinden

ayrılarak Coomassie boyama solüsyonuna aktarılır ve gece boyu 3D orbital çeviricide

bekletilir.

13. Ayırma jeli boyama solüsyonundan çıkartılıp, yıkama solüsyonuna aktarılır ve arka

plandaki renk açılana ve protein bantları ayırt edilene kadar yıkama solüsyonu yenilenerek 3D

orbital çeviricide yıkamaya devam edilir.

14. Jel transiluminatörde beyaz ışık altında gözlemlenir.

25


Bitki örneklerinden ve memeli hücrelerinden elde edilen protein izolatlarının jel

görüntüsünün izolasyon yöntemi ve hücre türü açısından karşılaştırılması. Bradford

sonuçlarına göre gerçekleştirilen yükleme miktarları ile jel görüntülerinin karşılaştırılması ve

yorumlanması.

26

PROTOKOL: Memeli Hücrelerinden İzole Edilen Protein Örnekleri ile Western

Blotlama (PUMA Proteini)

Materyal

İzolasyonu gerçekleştirilen memeli protein örnekleri


a. SDS protein indirgeme tamponu

b. % 10 (w/v) SDS

c. Akrilamit:Bis-akrilamit çözeltisi (37.5:1)

d. TEMED

e. 10X SDS-PAGE yürütme tamponu

f. % 10 (w/v) APS

g. 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (Ayırma jel tamponu)

h. 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (Yükleme jel tamponu)

i. 10X TBST

j. Western blotlama transfer tamponu

k. Western blotlama membrana aktarım sonrası boyama solüsyonu (Ponceau red)

l. Bloklama tamponu

1X TBST içerisinde çözünmüş % 5 yağsız süt tozu

m. Birincil antikor solüsyonu

1X TBST içerisinde çözünmüş % 5 yağsız süt tozuna 1:2000 oranında PUMA

antikoru eklenir.

n. İkincil antikor solüsyonu

1X TBST içerisinde çözünmüş % 5 yağsız süt tozuna 1:10000 oranında anti-

rabbit sekonder antikoru eklenir.

Araç ve Gereçler

Poliakrilamit jel elektroforez sistemi

Güç kaynağı


Su banyosu (95°C)

27

Uygulama

1. Ayırma jeli için 50 ml % 12’lik akrilamit jel karışımı hazırlanır.

20 ml Akrilamit:bis-akrilamit çözeltisi

12.5 ml Ayırma jel tamponu

0.5 ml % 10 (w/v) SDS

17 ml distile su


kabarcığı sıkışmamasına özen göstererek yavaşça kasete dökülür. Üzerine yükleme jeli de

döküleceği için jel kaseti tamamen doldurulmamalı, üst kısmında tarakların uzunluğunun

yaklaşık 1 cm altına denk gelecek şekilde boşluk bırakarak dökülmelidir.

3. Üst yüzeye yaklaşık 2 mm yüksekliğe gelecek kadar izopropanol dökülür ve jel oda

sıcaklığında donmaya bırakılır.

4. Ayırma jeli polimerize olduktan sonra kaset eğilerek izopropanol dökülür. Ayırma jelinin

üst tarafı distile su ile dikkatlice yıkanarak alkol kalıntılarından temizlenir ve peçete

yardımıyla dikkatlice kurutulur.

5. Yükleme jeli için 20 ml % 4’lük akrilamit jel karışımı hazırlanır.

2.6 ml Akrilamit:bis-akrilamit çözeltisi

5 ml Yükleme jel tamponu

0.2 ml % 10 (w/v) SDS

12.2 ml distile su


kabarcığı sıkışmamasına özen göstererek yavaşça kasete dökülür ve jel tarakları dikkatlice

yerleştirilir.

7. Yükleme jeli yarım saat süreyle oda sıcaklığında dondurulduktan sonra 1X SDS-PAGE

yürütme tamponu ile doldurulmuş olan tanka yerleştirilir. Taraklar dikkatli bir şekilde çıkarılır

ve oluşan kuyucukların içi pipet yardımıyla yıkanır.

8. Protein örnekleri hazırlanırken 30 µg protein içerecek hacime 1’e 1 oranında SDS protein

indirgeme tamponu eklenir, pipetleme ile karıştırılır ve 95°C’de 5 dakika kaynatıldıktan sonra

buzda soğuyana kadar bekletilir.

9. İlk kuyuya protein standartı (Full-range Rainbow, Amersham) yüklenir.

10. Hazırlanan protein örnekleri yeterince soğuduktan sonra jel üzerindeki kuyucuklara

dikkatlice yüklenir.

11. Jel yürütmesi örnekler yükleme jelini geçene kadar 100 V’da, geçtikten sonra ise 200

V’da gerçekleştirilir.

28

12. Yürütme tamamlandıktan sonra jel kaseti dikkatlice açılır ve ayırma jeli, yükleme jelinden

ayrılır.

13. Western blotlama ıslak emdirim (wet blotting) metodu ile PVDF membrana aktarılarak

gerçekleştirilecektir. Buna göre aktarım 75 mV’da 1 saat 15 dakika süresince veya 25 mV’da

gece boyu gerçekleştirilir. Gece boyu aktarım sırasında sistemin soğukta tutulması önemlidir.

Blotlama sonrası proteinlerin membrana aktarıldığından emin olmak amacıyla, PVDF

membranı Western blotlama membrana aktarım sonrası boyama solüsyonu (Ponceau

red) ile yarım saat oda sıcaklığında 3D orbital çeviricide boyanır. Daha sonra su ile

yıkanarak resmi veya fotokopisi çekilebilir.

14. Blotlama sonrası PVDF membran bloklama tamponu içerisinde oda sıcaklığında 2 saat

süreyle 3D orbital çeviricide bekletilir.

15. Membranın süt tozundan arındırılması için 5’er dakikalık 3 adet 1X TBST yıkama

gerçekleştirilir.

16. Membran daha sonra birincil antikor solüsyonuna aktarılır ve 2 saat süreyle oda

sıcaklığında 3D orbital çeviricide bekletilir.

17. Membran 5’er dakikalık 3 adet 1X TBST yıkama sonrası ikincil antikor solüsyonuna

aktarılır ve 2 saat oda sıcaklığında 3D orbital çeviricide bekletilir.

18. Membran 15’er dakikalık 2 adet 1X TBST yıkama sonrası oda sıcaklığına getirilmiş

kemiluminisans madde ile bir dakika süresince bekletilir.

19. Membran streç filme sarılarak, ışık geçirmez kasetlerde karanlık odaya götürülür ve

üzerine film yerleştirilir.

20. Belirli sürelerde bekletilen filmler geliştirici ve sabitleyici film (Kodak X-OMAT)

çözeltileri ile istenilen görüntü elde edilinceye kadar yıkanırlar. Filmler en son soğuk suda

yıkanarak kurumaya bırakılır.

Sonuçların Değerlendirilmesi ve Rapor Hazırlama

Membrana aktarım sonrası gerçekleştirilen Ponceau red boyaması ile elde edilen sonuçların

değerlendirilmesi ve yorumlanması. İlaç kullanımı sonucunda, PUMA proteininin translasyon

ve birikiminde gerçekleşen değişimin ve elde edilen Western blotlama sonuçlarının qRT-

PCR’da hesaplanan transkript değişimi sonuçları ile karşılaştırılarak yorumlanması.

29

RAPOR FORMATI

1. Başlık sayfası

Dersin adı

Deneyin adı

Tarih

Raporu hazırlayan kişinin adı (Tam olarak yazılmalı ve okul numarası belirtilmelidir)

2. Amaç

Deneyin yapılma amacını açıkça ortaya koymalıdır. “Bu çalışma neden

yapılmıştır?” sorusuna cevap verecek nitelikte olmalıdır.

3. Materyal ve Metod

Deney sırasında kullanılan materyal ve metod mevcut protokollerde kullanılandan

farklı olmayacaktır. Bu nedenle bu kısım protokollerden destek alınarak

hazırlanabilir. Ancak raporda beklenen detayları ile verilen protokolün,

laboratuarda uygulanan şekilde güncellenerek yazılması ve özellikle deneyde

kullanılan materyallerin, örneğin çözelti ve tamponların, kullanım amaçlarının

belirtilmesi gerekmektedir.

4. Sonuçlar

Bu bölümde deney sonuçları herhangi bir yorum yapılmadan verilmelidir.

Sonuçlar tablo, çizim, grafik, fotoğraf ve bunun gibi şekillerde verilebilir. Bütün

tabloların, grafiklerin, çizimlerin açıklayıcı isimleri olmalı, sembol veya

kısaltmalar belirtilmelidir. Çizimler, tablolar, grafikler ayrı ayrı numaralandırılmalı

ve her numara mutlaka rapor içinde belirtilmelidir.

5. Tartışma

Bu bölüm sonuçları yeniden içermemeli, sadece verileri yorumlamalıdır. Bu kısım

protokollerde mevcut bulunan “sonuçların değerlendirilmesi” başlığı altında

istenilen kriterlere dayandırılmalıdır. Deney tekniği ile ilgili sonuçlarınızı

etkileyen faktörler de bu bölümde yer almalıdır. Bir önceki bölümde verilen

sonuçların detaylı bir tartışmasının yapılması beklenmektedir.

6. Referanslar

Documents

Moleküler biyoloji