Molekularbiologische Aspekte beim

Prostatakarzinom (PCa) - Grundlagen der

Entstehung sowie Möglichkeiten der

Diagnostik und Therapie

Dr. U. FiedlerUrologisches ForschungslaborKlinik und Poliklinik für UrologieDirektor Prof. Dr. M. WirthTU-Dresden

Histologie des Prostatakarzinoms

Regulation des Prostatawachstums

Androgene

Wachstumsfaktoren

stromal-epitheliale Interaktion

Genexpression in der Prostata

ZK

Testosteron (T)

T

Dihydrotesto-steron (DHT)

HRE5-Re-duktase

DHT

EGF, KGF

AR

Epithelzelle

RE Gen

Promotor

TGF-

++ --

Veränderungen der Prostata

Unkontrolliertes Wachstum von Prostata-zellen meist erst ab dem 50. Lebensjahr

Benigne Hyperplasie (BPH)

Prostatakarzinom (PCa)

Inzidenz des PCa

häufigste Tumorerkrankung beim Mannin der westlichen Welt

ca. 250.000 Neuerkrankungen p.a.

steigende Inzidenz mit dem Alter

insignifikantes PCa bei ca. 20-30%aller Männer über 50

PCa - Tumorstadien

Stadium 5-Jahres- Überlebensrate

lokal begrenzt 99,1% (T1/T2)

lokal fortgeschritten 93,6 % (T3/T4)

metastasierend 30,7% (N1, M1)

Molekulare Ursachen der Entstehung eines PCa

familiäre/hereditäre Ursachen

chromosomale Veränderungen(Deletionen, Translokationen, Mutationen)

Methylierung

Differentielle Genexpression

Grundlagen

Familiäres Prostatakarzinom

unter 65 Jahren: 5-10% familiär bedingt

unter 65 Jahren, mind. 4 Betroffene proFamilie: 25-30 % familiäre Ursache

prostate cancer susceptibility loci

1q 24-25 (HPC-1)

1p 36 (PCa, Hirntumoren)

Grundlagen

Chromosomale Verluste beim PCa (CGH, LOH) Grundlagen

16q E-Cadherin5q --Catenin13q RB, BRCA210q PTEN

0

10

20

30

40

50

60

8p 16q 5q 13q 10q 7q

% V

erlu

st

Chromosomale Region

Gluthathion S-Transferase (GST-1)

Androgenrezeptor (AR)

Methylierung beim PCa Grundlagen

Inaktivierung von Genen durch Methylierung vonCpG-reichen Sequenzen im Promotor

GST-1/ARCpG

5‘ regulatorische Sequenz Zielgen

Tumorsuppressorgene

p53

Retinoblastom-Gen

BRCA2

KAI1

Onkogene und Tumorsup-pressorgene beim PCa

Onkogene

ras

c-myc

c-erb-2

bcl-2

Grundlagen

Differtielle Genexpression

Methode: DD-PCR (Differential Display PCR)

Amplifizerung von cDNA-Fragmenten des Tumor- und tumorfreien Gewebes

Tumorfrei TumorTAAA

mRNA

cDNA

PCR

GAAACAAA

CAAAGTTT

Grundlagen

Chromosom 13q13

Lokalisierung zwischen den Tumor-suppressorgenen BRCA2 und Rb-1

Kernlokalisierungssignal

Ähnlichkeit zu Transkriptionsfaktoren

epithelspezifische Expression

Isolierung des putativen Tumorsuppressorgens C13

Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

Grundlagen

Untersuchungen zumVerlust der Heterozygotie

Methode: Untersuchung von Allelverlusten mit Mikrosatellitenmarkern bei Tumor- und tumorfreiem Gewebe

PCR

ACACAC

Grundlagen

ACACACAC

Allel 1

Allel 2

Tumortumorfrei

5 Mikrosatellitenmarker im Bereich 13q13

LOH oder AI: 61 % (13 von 21 Patienten)

Unterstützung der Hypothese, daß C13 ein Tumorsuppressorgenist

Chromosom 13

13RB1

C 13BRCA2

C13-LOH-Analysen Grundlagen

Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

Weitere Gene involviert in die Prostatakarzinogenese

Telomerase

angiogene Wachstumsfaktoren

Gene der Apoptose

CD 44

Grundlagen

Faktoren der Metastasierung

Zell-Adhäsionsmoleküle

E- Cadherin- Catenin

Metalloproteinasen und Inhibitoren

MMPTIMP

Angiogene Faktoren

VEGF und Rezeptoren

Grundlagen

Chromosom 1p22

verminderte Expression im PCa-Gewebe

epithelspezifisch

extrazelluläres Signalprotein, matrixgebunden

Modulator der Zelladhäsion und Zellinteraktion

Isolierung des putativen Tumorsuppressorgens Cyr 61

Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

Grundlagen

Diagnostik beim PCa

Primärdiagnostik:Digitale rektale UntersuchungSerum-PSA Bestimmungtransrektaler UltraschallHistologie der Biopsien

Metastasierung: SkelettszinthigraphieCT Thorax und Abdomen(PET)

Diagnostik

Verbesserte Diagnostik

Verbesserung der Primärdiagnostik bei Serum-PSA 4-10 ng/ml

Verbesserung von Staging und Prognose

sensitiver molekularer Nachweis von PCa-Zellen in

Blut, Biopsien, regionären Lymphknoten

Diagnostik

Nachweis von PCa-Zellen mittels RT-PCR

Diagnostik

Bestimmung der Mengean PCa-Zellen (Staging)

Feststellung der Ex-pression spez. Tumor-marker (Prognose)

Isolierung der Gesamt-RNA

Umschreibung in cDNA

Transkript-spezifische PCR

Aufschluß des Gewebes

Qualitative und quantitative Bestimmung von Transkripten

Prostata spezifisches Antigen (PSA)

Prostata spezifischesMembranantigen (PSM)

Humanes Kallikrein (hK2)

ProstataspezifischeTranskripte

Tumorspezifische Transkripte

Telomerase

c-src

Survivin

Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR)

Somatostatin-Rezeptor Typ 1

Diagnostik

Prostataspezifische mRNA‘s

PSM (Prostata SpezifischesMembranantigen)

PSA (Prostata Spezifisches Antigen)

Serinprotease

Lokalisation: Serum

Größe: 34 kDa

Transkripte: PSA mRNA

Folathydrolase

Lokalisation: Plasmamembran

Größe: 94 kDa

Transkripte: PSM mRNA PSM’ mRNA PSM’’ mRNA

Diagnostik

Qualitativer Nachweis von PSM-Transkripten in Lymphknoten

Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1-3, 5-7: Lymphknoten RNA

8: pos. Kontrolle (LNCaP RNA)

9: neg. Kontrolle

10: 123 bp DNA-Standard

Quantitativer Nachweisvon PSA-Transkripten

Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

4518 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

WasserStandard 10 pgStandard 1 pgStandard 100 fgStandard 10 fg

0.10

1.0

pos. PCa-ZellenPatient 1 LKPatient 2 LK

Anzahl der Zyklen

Flu

ore

szen

z

Diagnostik

Nachweis von PSA-Transkripten in regionären Lymphknoten

n RT-PCR- RT-PCR-PSA + PSM

PCa 54 12 51 32

RCC 3 0 3 2

kein Ca 2 0 0 0

PCa/N+ 17 12 16 15

PCa/N- 37 0 35 37

RT-PCR-PSM‘

Diagnostik

Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

Therapie des PCa

Operation - radikale Prostatektomie

Hormontherapie

Strahlentherapie

Therapie

Molekulare Grundlagen der Hormonresistenz

Androgenrezeptor

Steroidrezeptoren

EGF-Rezeptor

MDR-1 (Multi-Drug Resistenz-Gen)

Therapie

Molekulare Therapie-ansätze für das PCa

Inhibitoren von Wachstumsfaktoren

Anti-Angiogene Faktoren

Gentherapie

Therapie

Signalkaskade desEGF-Rezeptors

EGF

Kinase

Kinase

EGF

ShcGRB2

RasSOS

MEK

MAPK

Mitogenese

Ziel-Genc-fosc-jun

c-src

PLCy

Raf

EGF-Rezeptor

c-myc

Therapie

Immun-Gentherapie

Suizidgentherapie

Inhibierung von Onkogenen

Expression von Tumorsupressorgenen

Gentherapeutische Ansätze beim PCa

Therapie

Antigen expr. APC’s

APC AdenoviralerGentransfer(PSA, PSM)

nach Ficazzola and Taneja, 1998

Immun-Gentherapie mit Antigen Präsentierenden Zellen (APC)

+ GM-CSF, IL-4

Klinische Studien (NIH approved) I

Strategie Verabreichung Autor Vektor/Ther. Gen

Immuntherapie Tumorvaccine Gansbacher Retrovirus: IL-2ex vivo Tumorvaccine Simons Retrovirus: GM-CSF

Tumorvaccine Paulson Liposome: IL-2

Immuntherapie systemisch Chen Vaccine: PSAin vivo systemisch Kufe Vaccine: PSA

systemisch Sanda Vaccine: PSA

intratumoral Simons Adenovirus: PSAintratumoral Belldegrun Liposome: IL-2

nach Ficazzola and Taneja, 1998

5’-Fluorcytosin (5-FC)

5’-Fluorouracil (5-FU)

Ganciclovir- P

Ganciclovir

Ganciclovir- P-P-P

CDCDHSV-tkHSV-tk

zelluläre Enzymezelluläre Enzyme

Suizidgene: Cytosin-Desaminase (CD)

Herpex-Simplex-Thymidin-Kinase (HSV-tk)

Induzierung des Zelltodes Therapie

Herman et al., 1999

Induzierung des Zelltodes durch HSV tk/GCV

CMV Prom. HSV tk

adenoviraler Vektor

intraprostatische Injektion

i. v. GCV

klin. Phase I: 18 Patienten nach Radiotherapie lokales Rezidiv, keine Metastasierung 4 ADV-Konzentrationen

Ergebnis: PCR Nachweis des Vektors im Urin keine Wachstum des ADV in Blut- oder Urinproben 4 Patienten Grad 1-2 Toxizität 1 Patient Grad 3-4 Toxizität 3 Patienten mind. 50 % PSA-Abfall (6-52 Wochen)

Therapie

DNA mRNA

Antisense-Oligonukleotid

X

Protein

Ribosom

Aminosäuren

Translation

Therapie mit Antisense-Oligonukleotiden Therapie

Antisense-Behandlung von PCa-Zellen

Verringerung der

Viabilität von

DU 145-Zellen

nach Antisense-

Telomerase-

Behandlung

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Zeit (Tage)

Via

bili

tät

5 µM AtRT

10 µM AtRT

15 µM AtRT

Kontrolle

15 µM NS

Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

Expression von

Tumorsuppressorgenen

CMV Promotor p53

p 53

Logothetis et al., AUA 1999

klin. Phase I/II: intraprostatische neoadjuvante Therapie17 Patienten mit lokal fortgeschrittenem PCa3 Injektionen (14 Tage Abstand)

Ergebnis: keine Grad 3 und 4 toxischen Effekte 3/14 Patienten: 25% Reduzierung der Tumorgröße

p53-Expression adenoviraler Vektor

Klinische Studien (NIH approved) II

nach Ficazzola and Taneja, 1998

Strategie Verabreichung Autor Vektor/Ther. Gen

Suizidgen intratumoral Kadmon Adenovirus: HSV-tkintratumoral Scardino Adenovirus: HSV-tk intratumoral Hall Adenovirus: HSV-tk

Tumorsuppressor intratumoral Belldegrun Adenovirus: p53intratumoral Logethetis Adenovirus: p53

Anti-Oncogen intratumoral Steiner Retrovirus: Myc-antisense

Das urologische Forschungslabor

Prof. Dr. M. P. Wirth

Dr. Ulrike FiedlerSusanne FüsselUta SchmidtWibke EhlersDr. Andres MelchiorBirgit NoackAscan SchindlerJörg StadeRomy KranzJana HerrmannSilke Tomasetti