Sistemi za kontrolu kvaliteta proteina –

molekularni šaperoni i proteazom

Kako protein nakon sinteze postaje

funkcionalan? • Proces ekspresije gena nije završen prevođenjem

informacije sadržane u iRNK u redosled ak polipeptidnog lanca.

• Nekovalntne interakcije i kovalentne modifikacije su odgovorne za “sazrevanje” funkcionalnog proteina.

Kako protein nakon sinteze postaje

funkcionalan?

• Većina promena koje mora da pretrpi

novosintetisani polipeptid je uslovljena

nekovalentnim interakcijama:

– uvijanje u jedinstvenu

trodimenzionalnu konformaciju.

– vezivanje kofaktora neophodnih za

aktivnost.

– neretko, protein-protein interakcija

kojom ostvaruje svoju funkciju.

Kako protein nakon sinteze postaje

funkcionalan?

• Mnogi proteini moraju da pretrpe i post-translacione kovalentne modifikacije na tačno određenim ak.

• Najčešće kovalentne modifikacije su glikozilacija i fosforilacija, mada je poznato preko 100 različitih tipova kovalentnih modifikacija.

• Informacija neophodna za sve nabrojane korake maturacije funkcionalnog proteina sadržana je u redosladu ak polipeptidnog lanca koji se sintetiše na ribozomima.

Prostorno uvijanje proteina

je jedno od nerešenih pitanja

nauke

Ko-translaciono prostorno uvijanje

polipeptida • Proces prostornog uvijanja rastućeg polipeptida odvija

se uporedo sa njegovom sintezom.

• U trenutku kada se novosintetisani polipeptid oslobađa od ribozoma on stiče najveći deo svoje konformacije, ali ona nije finalna.

Ko-translaciono prostorno uvijanje

polipeptida • Tokom evolucije, sekvenca proteina nije bila selektovana

samo za konformaciju koju može da stekne već i za sposobnost brzog prostornog uvijanja u trenutku dok rastući polipeptid izlazi iz ribozoma.

• Levinathal paradox

Formiranje trodimenzionalne

strukture odvija se kroz dve faze

Formiranje trodimenzionalne

strukture odvija se kroz dve faze • Brza faza - Polipeptid stiče grubu tercijalnu strukturu još

tokom izlaska iz ribozoma.

• Za sintezu polipeptida prosečne veličine potrebno je nekoliko minuta, a u roku od nekoliko sekundi stiče kompaktnu strukturu koja sadrži većinu finalne sekundarne strukture ( helikse i ploče) uređene na način koji je grubo sličan finalnoj tercijalnoj konformaciji.

Izlivena globula

• Nastala otvorena i fleksibilna

struktura polipeptida naziva

se izlivena (eng. molten)

globula.

• U odnosu na finalnu

trodimenzionalnu strukturu

izlivena globula je otvorena i

manje uređena.

Formiranje trodimenzionalne

strukture odvija se kroz dve faze

• Izlivena globula je početna tačka za

relativno spor proces prostornog

podešavanja što za rezultat ima sticanje

finalne trodimenzionalne konformacije

proteina.

• Fino podešavanje bočnih ostataka ak

čime protein stiče finalnu prostornu

konformaciju predstavlja sporu fazu

formiranja trodimentionalne strukture

proteina.

Kontrola kvaliteta proteina

• Protein koji ima izložen hidrofobni region znatne veličine na svojoj površini je obično abnormalan.

• Hidrofobni regioni formiraju intermedijere - proteinske agregate – štetne za ćeliju.

Kontrola kvaliteta proteina

• Ćelija je razvila mehanizme za kontrolu kvalitata proteina koji prepoznaju i otklanjaju proteine sa izloženim hidrofobnim regionima.

• Više od 30% novosintetisanih polipeptidnih lanaca biva selektovano za brzu razgradnju kao rezultat delovanja sistema za kontrolu kvaliteta proteina.

Ćelijski mehanizmi za kontrolu

kvaliteta proteina • Neki proteini spontano stiču

pravilnu trodimenzionalnu konformaciju.

• Prostorno uvijanje mnogih proteina je efikasnije uz pomoć specijalne klase proteina nazvanih molekularni šaperoni.

• Kada pokušaji ponovnog uvijanja proteina ne uspeju nepravilno uvijeni proteini se potpuno razgrađuju u proteazomu.

Uloga molekularnih šaperona

a. Pomažu proteinima da se prostorno uviju.

b. Tokom procesa prostornog uvijanja štite proteine od protein protein interakcije sa drugim proteinima.

c. Odmotavaju proteinske agregate

d. Odmotavaju proteine koji su nepavilno uvijeni pre procesa njihove degradacije.

e. Transport proteina

f. Druge uloge

Molekularni šaperoni

• Proteini toplotnog šoka (hsp) čiji se nivo sinteze drastično povećava nakon kratkog izlaganja ćelije povišenim temperaturama (42C).

• Eukariotske ćelije poseduju dve glavne familije molekularnih šaperona koje pomažu proteinima da se prostorno uviju

• Hsp60 i hsp70

• Razlikuju se po mehanizmu delovanja i vremenskom periodu (u životu proteina) kada deluju.

Proteini hsp60 i hsp70

• Zajedničke osobine:

• Pokazuju afinitet za izložene hidrofobne

nizove pogrešno uvijenih proteina.

• Hidrolizuju ATP.

• Funkciju pomaganja proteinskog foldinga

ostvaruju sa malim setom asociranih

proteina (partner proteini).

Proteini hsp70

• Deluju rano u životu proteina i prepoznaju niz od

približno 7 hidrofobnih ak na površini proteina.

• Za ciljni protein se prvo vezuje pomoćni protein Hsp40, a

zatim monomer Hsp70 u kompleksu sa ATP-om (Hsp70-

ATP).

• Protein Hsp70 ima ATP-aznu aktivnost i vrši hidrolizu

ATP-a u ADP, podležući konformacionoj promeni koja

mu omogućava da se čvršće veže za ciljni protein.

• Faktor za razmenu nukleotida, protein GrpE, uklanja

nastali ADP, što uzrokuje da protein Hsp40 prvo napusti

formirani kompleks, a zatim disocira i Hsp70.

• Ponovljeni ciklusi vezivanja i oslobađanja proteina

Hsp40 i kompleksa Hsp70-ATP pružaju šansu ciljnom

polipeptidu da ponovo „proba“ da zauzme ispravnu

konformaciju.

Proteini hsp60

• Proteini hsp60 formiraju velike oligomerne strukture u

čiju izolovanu unutrašnjost ulazi ciljni protein. Poznati su

i kao šaperonini, a njihovi pomoćni proteini kao ko-

šaperonini.

Proteini hsp60

• Deluju kasnije u životu proteina i takođe prepoznaje

hidrofobne regione ak na površini proteina.

• Proteini ove familije formiraju oligomernu strukturu u

obliku bureta, koja u trenutku kada obavlja svoju funkciju

stupa u interakciju sa pomoćnim proteinom, čija je

struktura u obliku kape.

•

• Struktura bureta je izgrađena od 14 monomernih

jedinica proteina GroEL.

• Centralna šupljina bureta je na sredini, preko C-krajeva

monomernih jedinica GroEL, podeljena na dve

simetrične šupljine.

• Strukturu kape formira sedam monomernih jedinica

pomoćnog proteina GroES (Hsp10).

Proteini hsp60

• U svakom ciklusu samo jedna polovina simetričnog

bureta, odnosno jedan prsten, stupa u interakciju sa

ciljnim proteinom.

• Prsten koji je aktivan i asociran sa kapom označava se

kao proksimalni, dok se onaj koji je u tom trenutku

neaktivan označava kao distalni.

Razgradnja proteina

• Kada je protein određen za degradaciju, nema povratka što obezbedjuje da nema ni parcijalno degradovanih proteina koji bi mogli interferirati sa biološkim procesima.

• U ćeliji postoje dva glavna puta destrukcije proteina:

a) Razgradnja proteazama u lizozomima.

b) Proteoliza ubikvitin-proteaznim putem.

Proteazom – mašinerija za degradaciju

proteina

• Krajnja mašinerija za razgradnju proteina u eukariotskim ćelijama je proteazom.

• Proteazomi su ATP zavisni proteinski kompleks lokalizovani i u citoplazmi i u jedru.

• Proteazom se sastoji iz 20S centralnog šupljeg cilindra (jezgra proteazoma) čija su oba kraja asocirana sa 19S kapama.

Proteazom – mašinerija za degradaciju

proteina

• Struktura 20S centralnog šupljeg cilindra je visoko

konzervirana od kvasca do čoveka i sastoji se od 4

međusobno naslojena prstena.

• Svaki prsten je sačinjen od 7 subjedinica koje se dele

u dve grupe: α subjedinice koje čine spoljašnja dva

prstena i β subjedinice unutrašnja dva prstena.

Proteazom – mašinerija za degradaciju

proteina

• Neke od subjedinica proteozoma su proteaze čija se aktivna mesta nalaze na površini unutrašnje šupljine 20S cilindra, tako da je funkcija 20S cilindra razgradnja polipeptida.

• Za razliku od tipičnih proteaza, proteazom omogućava da gotovo svaka peptidna veza bude raskinuta, posedujući multiple proteolitičke aktivnosti u jednoj proteolitičkoj odaji.

Proteazom – mašinerija za razgradnju

proteina

• 19S kape selektivno vezuje proteine markirane za razgradnju i funkcionišu kao regulatorne kapije na ulazu u unutrašnjost cilindra.

• ATP-azne subjedinice kape odmotavaju proteine koji treba da se razgrade i ubacuju ih u jezgro proteazoma.

Proteini se obeležavaju za

razgradnju

• Sa nekoliko izuzetaka, proteazom deluje na proteine koji

su obeleženi za razgradnju preko kovalentno vezanog

većeg broja kopija malog proteina (76 ak) koji se naziva

ubikvitin.

• Da bi se konjugovao sa ciljnim proteinom, ubikvitin prvo

mora biti aktiviran.

Proteini se obeležavaju za

razgradnju

• Ubikvitin se aktivira za konjugaciju sa ciljnim proteinima

preko vezivanja za ATP-zavisni proteina E1, koji se

naziva ubikvitin aktivirajući enzim.

Proteini se obeležavaju za

razgradnju

• Aktivirani ubikvitin se zatim prebacuje sa (cisteinskog

ostatka) proteina E1 na (cisteinski ostatak) proteina E2,

koji se naziva ubikvitin-konjugujući enzim.

Proteini se obeležavaju za

razgradnju

• Protein E2 nalazi se u kompleksu sa

jednim od članova familije proteina E3.

• Funkcionalni kompleks E2-E3 naziva

se ubikvitin ligaza.

• Ubikvitin ligaza odgovorna je za

prepoznavanje i obeležavanje ciljnog

proteina poliubikvitinskim lancem.

•

Proteini se obeležavaju za

razgradnju

• Jednom kada je proteinski substrat mono-ubikvitiran,

poliubikvitinski lanac se formira kroz iste ubikvitin

konjugacione kaskade, pri čemu je karboksilna grupa

ubikvitina kovalentno vezana za Lys reziduu ubikvitina

koji je već konjugovan za proteinski substrat.

• Multiubikvitinski lanac na ciljnom proteinu je ono što

prepoznaju kape proteazoma.

Ubikvitin aktivirajući enzim E1 ili UBA

• Jedan enzim E1 je odgovoran za aktivaciju ubikvitina.

• Kod kvasaca je samo jedan funkcionalni enzim UBA,

UBA1.

• Delecija gena UBA1 kod kvasca je letalna.

Ubikvitin konjugujući enzim E2 ili UBC

• Svi enzimi E2 (a njih je na desetine, najmanje 13 E2

kod kvasca, a oko 30 kod sisara) sadrže konzervirano

oko 130 ak dugačko katalitičko jezgro, domen UBC.

Ubikvitin ligaze E3

• E3 ligaze odnosno kompleksi ligaza prepoznaju

specifične motive substrata i katalizuju transfer ubikvitina

na proteinski substrat.

• U ćelijama sisara postoji nekoliko stotina različitih proteina E3, koji formiraju komplekse sa specifičnim proteinima E2.

Ubikvitin-proteazomski sistem

• Ubikvitin-proteozomski sistem sastoji se od mnogo

različitih proteolitičkih puteva, koji imaju protein E1 na

početku i proteazom na kraju puta, a razlikuju se u E2-

E3 ubikvitin ligazama i pomoćnim faktorima.

• Različite ubikvitin-ligaze prepoznaju različite signale za

razgradnju i time deluju na različite proteine.

Uloge ubikvitin-proteozomski

sistem • Prepoznaju i eliminišu proteine koji

imaju pogrešnu trodimenzionalnu strukturu ili druge abnormalnosti.

• Postoje i proteini koji se sve vreme brzo degradaju. To su kratkoživeći proteini čija se kontrola funkcije ostvaruje preko regulacije njihove razgradnje.

• Uslovno kratkoživeći proteini su proteini koji su metabolički stabilni pod određenim uslovima, dok su pod drugim uslovima nestabilni.

Kontrola regulisane razgradnje

proteina • U ćeliji postoji čitav niz mehanizama kojima se kontroliše

regulisana razgradanja proteina,

• Dva opšta puta indukovane degradacije proteina:

• Aktivacija kompleksa ubikvitin ligaze (E2-E3).

• Aktivacija signala za razgradnju.

Regulisana razgradnja proteina preko

aktivacije ubikvitin ligaze

• Aktivacija E2-E3 kompleksa ostvaruje se:

– Fosforilacijom specifičnog ak ostatka.

– Alosteričkom aktivacijom vezivanjem nekog malog molekula (liganda) ili dodavanjem proteinske subjedinice.

Regulisana razgradnja proteina preko

aktivacije signala za razgradnju

• Načini aktivacije signala za degradaciju su različiti:

• Fosforilacijom se otkriva “sakriven” signal za degradaciju.

• Regulisanom disocijacijom proteinske subjedinice.

• Kidanjem određene peptidne veze, čime se formira novi N-kraj kojeg specifičan protein E3 prepoznaje kao destabilišući N-kraj (signal za razgradnju).

Kontrola proteina preko regulacije

njihove razgradnje

• Proteazom, procesivna

mašinerija za degradaciju

proteina je odgovoran za

različite unutarćelijske

aktivnosti:

• Uklanjanja pogrešno savijenih

proteina;

• Regulacije ćelijskog ciklusa

razgradnjom ciklina;

• U stečenom imunskom

odgovoru obradom peptida

antigena, itd.