MOLEKULINĖS GENETIKOS PRATYBOS · ruošiamieji darbai susideda iš keleto etapų: 1. Medžiagos rinkimo strategijos sukūrimas. 2. Medžiagos paėmimas. 3. Medžiagos transportavimas

EUROPOS SĄJUNGA

Europos socialinis fondas

KURKIME ATEITĮ DRAUGE!

PROJEKTAS „MAGISTRANTŪROS IR DOKTORANTŪROS STUDIJŲ

MODULIŲ KŪRIMAS IR PROGRAMŲ ATNAUJINIMAS STRATEGINĖSE BIOMOKSLŲ SRITYSE“

SONATA JARMALAITĖ, VIOLETA KLEIZAITĖ, KĘSTUTIS SUŽIEDĖLIS, DONATAS ŽVINGILA

MOLEKULINĖS GENETIKOS PRATYBOS

UDK 577(075.8) Mo-69

Apsvarstė ir rekomendavo Vilniaus Universiteto Gamtos mokslų fakulteto taryba (2008 m. kovo 5 d., protokolas Nr. 4). Recenzavo: dr. Violeta Jonušienė Leidinį finansuoja Europos Sąjungos struktūrinių fondų paramos 2.5 priemonės projektas „Magistrantūros ir doktorantūros studijų modulių kūrimas ir programų atnaujinimas strateginėse moderniųjų biomokslų srityse“. Sutarties Nr. ESF/2004/2.5.0-03-430/BPD-199/ParS-12500-602, SFMIS Nr. BPD2004-ESF-2.5.0-03-05/0095). Projektą remia Lietuvos Respublika. Projektą iš dalies finansuoja Europos Sąjunga. Metodinė knyga skirta Vilniaus universiteto magistrantūros studijų programos „Genetika“ (62101B105) studentams. LEIDINYS PLATINAMAS NEMOKAMAI

© S. Jarmalaitė, V. Kleizaitė, K. Sužiedėlis, D. Žvingila, 2008

© Vilniaus universitetas, 2008 ISBN 978-9955-25-512-3

TURINYS

MOLEKULINĖS GENETIKOS PRATYBOS | 3

Turinys 1. Pirmas laboratorinis darbas...................................................................................4

1.1. DNR išskyrimas iš augalo audinių įvairiais metodais .............................................................4 1.1.1. DNR išskyrimo iš augalo audinių ypatybės .......................................................4 1.1.2. Augalo ląstelių suardymas..................................................................................7 1.1.3. DNR valymas nuo priemaišų.............................................................................9 1.1.4. DNR išskyrimas naudojant genominės DNR išskyrimo

rinkinį (Fermentas)........................................................................................... 12 1.1.5. Genominės DNR išskyrimas modifikuotu CTAB metodu iš įvairių

augalo organų ................................................................................................... 14 1.1.6. DNR pavyzdžių užterštumo pašalinėmis sekomis problema .......................... 17 1.1.7. Augalo DNR užterštumo endofitinio grybo DNR tikrinimas ........................ 19

2. Antras laboratorinis darbas ................................................................................. 21 2.1. RAPD-PGR panaudojimas augalų genomo tyrimuose....................................................... 21

2.1.1. RAPD metodo esmė........................................................................................ 21 2.1.2. RAPD metodo privalumai ............................................................................... 23 2.1.3. RAPD analizės trūkumai ................................................................................. 23 2.1.4. RAPD-PGR optimizacija................................................................................. 24 2.1.5. Pradmens ir matricos sąveika........................................................................... 24

2.2. RAPD-PGR analizės metodika ............................................................................................... 26 2.2.1. RAPD-PGR produktų atskyrimas agarozės gelyje ir rezultatų

dokumentavimas .............................................................................................. 27 2.3. Individų giminiškumo nustatymas pagal RAPD fenotipus naudojant

kompiuterinę programą TREECON v. 1.3b....................................................................... 30 3. Trečias laboratorinis darbas ................................................................................ 37

3.1. GDH (glutamato dehidrogenazės) polimorfizmas ir jo palyginimas augaluose: pašarinių pupų Vicia faba L. veislėje ‘Nida’, miežių veislėje ‘Auksiniai3’ ir baltažiedyje vairenyje Arabidopsis thaliana (L.) Heynh......................................................... 37

3.1.1. Įvadas. Teorinė dalis ........................................................................................ 37 3.1.2. Glutamato dehidrogenazė augaluose ............................................................... 44 3.1.3. Eksperimentinė dalis........................................................................................ 45

4. Ketvirtas laboratorinis darbas .............................................................................. 51 4.1. DNR metilinimas: mechanizmas, reikšmė ............................................................................ 51 4.2. DNR metilinimo tyrimo metodai ........................................................................................... 52 4.3. DNR modifikavimas bisulfitu ................................................................................................. 53 4.4. Metilinimui jautri polimerazės grandininė reakcija .............................................................. 55 4.5. Bisulfitinė sekoskaita ................................................................................................................. 57 4.6. DNR grandinės konformacijos polimorfizmų analizė ........................................................ 59 4.7. Genų raiškos įvertinimas „tikrojo laiko“ PGR..................................................................... 60

5. Penktas laboratorinis darbas ...................................................................................... 63 5.1. Genomų palyginimas DNR gardelių metodu....................................................................... 63 5.2. Lyginamoji genomų hibridizacija ............................................................................................ 64 5.3. DNR mikrogardelių technologija............................................................................................ 66 5.4. DNR mikrogardelių technologijos taikymo etapai .............................................................. 67 5.5. DNR mikrogardelės ruošimas ................................................................................................. 69 5.6. Genomų palyginimas naudojant DNR mikrogardelių technologiją ................................. 69

4 |

1. Pirmas laboratorinis darbas

1.1. DNR išskyrimas iš augalo audinių įvairiais metodais

1.1.1. DNR išskyrimo iš augalo audinių ypatybės

Augalai dėl savo gyvenimo būdo ir gebėjimo įsitvirtinti įvairiose ekologinėse nišose pasižymi didžiule įvairove. Tai atsispindi ir jų cheminėje sandaroje. Net giminingų rūšių atstovai, gyvuojantys skirtingose ekologinėse nišose, gali sintetinti gana įvairius metaboli-tų kiekius. Tuo labiausiai pasižymi antriniai metabolitai, kurie betarpiškai susiję su augalo išgyvenimo strategija: apsauga nuo kenkėjų, vidurūšine konkurencija, gyvenimo ciklo ypatybėmis ir kt. Tačiau ir pirminių metabolitų kiekis augale gali labai kisti jo individua-lios raidos eigoje. Pirminiai metabolitai augale susidaro Krebso ciklo metu – tai riebalai, baltymai, įvairios organinės ir nukleorūgštys, angliavandeniai. Tačiau augalo ląstelėse vi-sada yra ir antrinių metabolitų: alkaloidų, eterinių aliejų, glikozidų, gliukozinolatų, flavo-noidų, lignino ir kt. Beje, pirminių metabolitų randama visose augalų rūšyse, o antriniai – įvairiose rūšyse skiriasi. Ypač svarbią vietą tarp antrinių metabolitų užima fenoliniai jun-giniai: ligninas, taninai, antocianinai ir kt. (Taiz & Zeiger, 2002). Antrinių metabolitų kie-kis augale priklauso nuo daugelio veiksnių: augalo rūšies, genotipo, amžiaus, ontogenezės stadijos, ekologinių ypatybių ir kt. Visa tai drauge ir lemia, jog netgi giminingų rūšių auga-lų DNR išskyrimui tas pats metodas gali netikti. Mokslininkai, tiriantys augalų DNR, susiduria su keletu sunkumų. Svarbiausi iš jų yra:

1) Fermentinių reakcijų slopinimas (pvz., PGR, restrikcijos, atvirkštinės transkripci-jos).

2) Koncentracijos nustatymo spektrofotometru netikslumai (1.1 pav.), frakciona-vimo greičio pokyčiai agarozės gelyje (1.2 pav.).

3) Didelis preparato klampumas. 4) DNR suirimas.

Ąžuolo DNR

bangos ilgis (nm)

suge

rtis

1,60

0,00

Dellaporta

DNeasy

CTAB

220 260 280 320

Pušies DNR

bangos ilgis (nm)

suge

rtis

1,60

0,00

DNeasy Dellaporta

CTAB

220 260 280 320

1.1 pav. DNR kokybės įtaka koncentracijos nustatymui spektrofotometru. Esant švariai DNR, sugertis piką pasiekia, kai bangos ilgis yra 260 nm. Polisacharidai ir antriniai metaboli-tai gali iškreipti prietaiso parodymus – bus netiksliai nustatyta DNR koncentracija ir prepara-to švarumas. Paveiksle parodytas trijų metodų, naudotų skirti DNR, nevienodas tinkamumas. Ryškiausi DNR sugerties pikai gaunami naudojant DNeasy augalo DNR išskyrimo rinkinį http://www1.qiagen.com/literature/brochures/plant_nap/1014067_BROS_DNYP_INT.pdf

PIRMAS LABORATORINIS DARBAS


A

B

1.2 pav. DNR kokybės įtaka jos judėjimui agarozės gelyje: A – prastą DNR kokybę rodo ne-vienoda išskirtos DNR koncentracija, didelis kai kuriuose preparatuose DNR suirimo laips-nis bei nevienoda išskirtos DNR koncentracija; B – gera DNR kokybė. http://www1.qiagen.com/literature/brochures/plant_nap/1014067_BROS_DNYP_INT.pdf Darbo su augaline medžiaga etapai Išskirtos DNR kokybė ir kiekybė labai priklauso nuo surinktos medžiagos kokybės.

Pastaroji gali nukentėti dėl netinkamo paėmimo, transportavimo bei laikymo. Taigi pa-ruošiamieji darbai susideda iš keleto etapų:

1. Medžiagos rinkimo strategijos sukūrimas. 2. Medžiagos paėmimas. 3. Medžiagos transportavimas. 4. Saugojimas. 5. DNR išskyrimo metodo parinkimas. Prieš renkant medžiagą DNR išskyrimui, reikia numatyti, kur ji bus renkama, kiek ir

kokio audinio mėginių bus imama, kokiais būdais bus palaikoma surinktų audinių home-ostazė (termosai su ledu, skystasis azotas, silikagelis ir kt.), ar DNR bus skiriama iškart, ar kurį laiką saugoma, kaip surinkti mėginiai bus žymimi ir kt.

Geriausia DNR skirti iš šviežiai surinktų augalo audinių. DNR išskyrimui patartina naudoti šviežius, ką tik nuskintus lapus. Tačiau kiti audiniai taip pat gali būti naudojami, jeigu to reikalauja darbo tikslas arba nėra galimybės pasirinkti. Sunkumų kyla tada, kai reikia surinktus mėginius transportuoti į laboratoriją iš atokesnių vietovių. Tokia kelionė gali trukti nuo keleto valandų iki mėnesio ir daugiau. Išbandyta nemažai metodų, kaip tokiu atveju užkonservuoti augalo audinius ir išlaikyti ląstelėse maksimaliai nepakitusią DNR. Ilgai buvo manoma, jog lapų ar kitų augalo organų cheminis apdirbimas (etanoliu, formaldehidu, glicerinu ir kt.) transportuojant juos dideliais atstumais, nėra patikimas DNR išsaugojimo juose būdas. Tačiau tyrėjams jau pavyko parinkti tokiam saugojimui tinkamas sąlygas. Pavyzdžiui, Flournoy ir kt. (1996) sugebėjo išlaikyti špinatų, brokolių ir kitų augalų lapus etanolyje apie 11 mėnesių ir iš tokių audinių išskirti geros kokybės

6 |

DNR. Skiriant DNR iš tokiu būdu išlaikytos medžiagos, į ekstrakcijos buferį papildomai buvo įpilama pronazė E. Autorių nuomone, šis fermentas užkerta kelią netirpių DNR ir denatūruotų baltymų kompleksų susidarymui. Be šio metodinio patobulinimo valymo metu kartu su baltymais ir ląstelių fragmentais buvo prarandama ir DNR. Galbūt, ši prie-žastis nulėmė tai, kad ankstesni mėginimai panaudoti etilo spiritą, kaip surinktos augali-nės medžiagos konservantą, buvo nesėkmingi. Kai kurių augalų rūšių mėginius DNR išskyrimui galima transportuoti paprasčiausiai juos išdžiovinus. Tokiu atveju rekomen-duojama džiovinti augalo lapus gerai vėdinamoje patalpoje, sudėjus juos į popierinius maišelius arba tarp popieriaus lapų (Weising ir kt., 1995). Augalo audinių išdžiovintų sili-kagelyje, transportavimas naudojamas gana plačiai. Tačiau šis būdas, kai kurių autorių nuomone, imituoja senėjimo procesą augaluose. Todėl, bėgant laikui, tokių preparatų kokybė blogėja (Savolainen ir kt., 1995). Tačiau šis metodas labai tinkamas gležniems augalams, pavyzdžiui, dumbliams transportuoti.

Kai kurie augalo audiniai, pavyzdžiui, sėklos yra labiau tinkami transportuoti ir sau-goti iki DNR išskyrimo (Kang ir kt., 1998; Krishna & Jawali, 1997). Vis dėlto DNR išsky-rimas iš lapų yra paprastesnis.

Paimtas augalo dalis (pavyzdžiui, nuskintus lapus) transportavimo metu reikia laikyti ne aukštesnėje kaip 4 °C temperatūroje. Audinius patartina laikyti ant ledo, prieš tai su-vyniotus į popierių ir sudėtus į plastikinius maišelius. Jokiu būdu nepatartina audinius užšaldyti, jeigu DNR bus skiriama tą pačią dieną arba per keletą dienų. Šiuo atveju auga-linę medžiagą rekomenduojama laikyti sandariuose plastikiniuose maišeliuose šaldytuve 4 °C temperatūroje. Jeigu DNR skyrimas vyks vėliau nei po keleto dienų, tai surinktus augalo lapus reikia užšaldyti ir laikyti – 80 °C temperatūroje. Neturint tokių galimybių, surinktą medžiagą galima laikyti –20 °C temperatūroje. Tačiau šiuo atveju nukentės DNR išeiga ir kokybė. Labai patogus audinių saugojimo būdas – liofilizacija, kuri paranki tuo, kad taip paruoštų audinių smulkinimui nereikia skystojo azoto, taip pat nereikia baimintis užšaldytų audinių atšilimo paruošiamuoju etapu (pavyzdžiui, sveriant). Užšaldyto audinio atšilimas prieš homogenizaciją, ne specialiame ekstrakcijos buferyje, gresia greitu DNR suskaldymu. Tačiau liofilizacijai reikalinga speciali gana brangi įranga. Išdžiovintą augalinę medžiagą patogu saugoti ir transportuoti. Yra sukurti metodai, leidžiantys išskirti DNR iš tokių audinių (Aras ir kt., 2003; Weising ir kt., 2005). Tačiau ne visoms augalų rūšims šie metodai tinka.

Dar viena svarbi problema, su kuria susiduriama paruošiamuoju etapu, augalo audi-nių kokybė. Būtina rinkti tik sveikus ir jaunus augalo audinius. Jeigu yra galimybė, augali-nės medžiagos rinkimą reikia planuoti ankstyvą pavasarį, kai lapai jauni. Šiuo atveju su-mažinama užkrėtimo patogenais galimybė, gaunama didesnė DNR išeiga. Deja, ne visada sveikai atrodantys augalo audiniai iš tikrųjų yra sveiki. Pavyzdžiui, Zhang ir kt. (1997), tirdami išoriškai sveikus bambuko lapus, juose aptiko grybų rDNR. Švarią DNR pavyko gauti tik nuvalius lapų paviršių etanoliu 95 proc. ir NaOCl 5 proc. tirpalu. Tyrimai rodo, jog vadinamieji endofitiniai grybai gali nesukelti, bent jau kurį laiką, audinio pokyčių (pvz., lapo). Šiuo atveju kiekvieną išskirtos DNR preparatą būtina individualiai patikrinti naudojant universalius rDNR pradmenis (Saar ir kt., 2001).

Dėl augalų įvairių rūšių audinių cheminės sudėties skirtumų beveik neįmanoma naudoti vieną universalų DNR išskyrimo metodą (Weising ir kt., 1995). Pagrindinės pro-



blemos, su kuriomis susiduria mokslininkai, norėdami išskirti iš augalų didelio molekuli-nio svorio ir aukštos kokybės DNR, yra šios:

1. Dalinis arba visiškas DNR suskaldymas. 2. DNR užteršimas valymui naudotais reagentais (druskomis, fenoliu, chloroformu,

etanoliu ir kt.). 3. Polisacharidų priemaišų sukeltas DNR preparatų klampumas. 4. DNR cheminės struktūros ir spalvos pokyčiai, sukelti biocheminių reakcijų, įvy-

kusių skiriant DNR. Pastaroji problema yra sudėtingiausia. Ją sukelia polifenolių, flavonoidų ir kitų antri-

nių metabolitų priemaišos. Tokia DNR netinka nei polimerazinei grandininei reakcijai (PGR), nei skaldymui restrikcijos endonukleazėmis.

DNR išskyrimo metodai skiriasi daugeliu savybių: audinių suardymo technika, liza-vimo ir ekstrahavimo buferio sudėtimi, DNR valymo etapais. Pagrindiniai metodai, daž-niausiai naudojami šiam tikslui, yra CTAB metodas (Murray & Thompson, 1980; Doyle & Doyle, 1990) ir kalio acetato – SDS metodas (Dellaporta ir kt., 1983). Norint gauti didelį kiekį aukštos kokybės DNR, naudojamas centrifugavimo CsCl gradiente metodas. Šiuo metu DNR išskyrimui vis plačiau naudojami specialūs rinkiniai (QIAGEN-DNeasy, NucleoSpin Plant, Genomic DNA isolation kit (Fermentas) ir kt.). Šie metodai patogūs, tačiau nėra universalūs.

Daugeliui DNR išskyrimo metodų būdingi keletas etapų: 1) Audinio susmulkinimas ir ląstelių sienelių suardymas. 2) Ląstelių membranų suardymas ir DNR ekstrakcija. 3) DNR valymas.

1.1.2. Augalo ląstelių suardymas

Norint gauti gerą DNR išeigą, būtina visiškai suardyti audinio ląstelių sieneles ir membranas. Dažniausiai naudojami būdai yra šie:

1. Smulkinimas skystajame azote naudojant grūstuvėlį ir piestą (1.3 pav.). Tai pats populiariausias metodas. Negalima leisti augalinei medžiagai atitirpti šio proceso metu!

1.3 pav. Augalinės medžiagos smulkinimas naudojant grūstuvėlį ir piestą

8 |

2. Smulkinimas mažuose indeliuose (pvz., stikline lazdele). Jeigu smulkinami kai kurių augalų, pavyzdžiui, javų, jauni audiniai, galima apsieiti ir be skystojo azoto. Audiniai smulkinami tiesiogiai ekstrakcijos buferyje;

3. Smulkinimas naudojant specialią arba savadarbę įrangą (pvz., malūnėlius, kava-males ir pan.) (1.4 pav.).

1.4 pav. Homogenizatorius „MM 300“ gali susmulkinti 192 mėginius per 2–4 min http://www1.qiagen.com/literature/brochures/plant_nap/1014067_BROS_DNYP_INT.pdf Membranos suardomos sudėjus susmulkintą audinį į ekstrakcijos tirpalą. Tokiame

tirpale yra detergentų (CTAB, SDS, sarkozilas ar kt.), kurie ne tik suardo ląstelių memb-ranas, bet ir denatūruoja baltymus, atskiria juos nuo DNR. Tam dažniausiai naudojamas katijoninis detergentas CTAB (cetiltrimetilamonio bromidas), kuris ištirpina membranas ir sudaro kompleksą su DNR. Jo koncentracija ekstrakcijos buferyje paprastai būnai apie 2 proc. Ekstrakcijos buferis užtikrina reikiamą pH. Dažniausiai tam naudojama TRIS-HCl buferinė sistema. Tirpale palaikomas pH 8–9 slopina nukleazių veiklą. Ją taip pat slopina chelatus sudarantis junginys EDTA (etilendiamintetraactorūgštis). Ji sudaro kompleksus su dvivalenčių metalų jonais, tarp jų ir tais, kurie svarbūs kaip nukleazių ko-faktoriai. EDTA dažniausiai dedama į visus DNR skyrimo buferius.

Tirpale esančios didelės druskų koncentracijos (> 1 M NaCl) atskiria baltymus, stip-riai susijusius su DNR (pavyzdžiui, histonus), neleidžia iškristi polisacharidų nuosėdoms DNR nusodinimo etilo spiritu metu. Todėl po centrifugavimo supernatante likę polisa-charidai yra pašalinami iš DNR preparato.

β-merkaptoetanolis, askorbo rūgštis, ditiotreitolas veikia kaip antioksidantai ir nau-dojami apsaugoti DNR nuo polifenolių poveikio.

Dėl detergentų bei didelės koncentracijos druskų, esančių tirpale, poveikio baltymai atsiskiria nuo DNR. Ištirpusios baltymų molekulės pašalinamos naudojant fenolį, fenolį-chloroformą bei chloroformą-izoamilo alkoholį (24:1) pagalba. Veikiami šių organinių junginių baltymai denatūruojami ir pašalinami iš lizės tirpalo centrifuguojant. DNR išlieka vandeninėje fazėje, o denatūruoti baltymai – tarpinėje ir organinio tirpiklio fazėje. Taikant Dellaporta ir kt. (1983) metodą, baltymai ir polisacharidai pašalinami vienu metu juos nusodinant žemoje temperatūroje esant didelei kalio acetato ir SDS koncentracijai. Susi-darantis kalio dodecilsulfatas yra netirpus ir nusėda, o DNR išlieka tirpale.



RNR dažnai išsiskiria su DNR ir kartais gali slopinti PGR. Dažniausiai RNR pašali-nama paveikus DNR tirpalą ribonukleaze. Kartais RNR nusodinimui naudojama didelė LiCl koncentracija.

1.1.3. DNR valymas nuo priemaišų

Augalai gamina daug ir labai įvairių organinių junginių, neturinčių didelės įtakos jų raidai ir augimui. Augaluose susidaro ypač daug medžiagų, turinčių fenolo grupę. Jos vadinamos fenoliniais junginiais. Augaluose žinoma labai daug jų rūšių (apie 10 000). Nuo antrinių metabolitų kiekio priklauso išskiriamos DNR kokybė. Fenoliniai junginiai lengvai oksiduojasi DNR išskyrimo metu. Susidarę oksidacijos produktai vadinami chi-nonais, yra labai stiprūs oksidatoriai, kurie sukelia pokyčius DNR ir baltymų molekulėse. Dėl šių junginių poveikio išskiriama DNR paruduoja ir tampa netinkama daugelyje fer-mentinių reakcijų.

Polifenolių ir jų oksidacijos produktų poveikis slopinamas įvairiais būdais: 1. Naudojami polifenolių adsorbentai (pavyzdžiui, jaučio serumo albuminas, polivi-

nilpirolidonas). Į ekstrakcijos tirpalą jų dedama 1–6 proc. 2. Polifenolių oksidacija slopinama antioksidantais (β-merkaptoetanolis, askorbo

rūgštis, ditiotreitolis ir kt.). 3. DNR skiriama didesniame ekstrakcijos buferio tūryje, bet iš mažesnio augalinės

medžiagos kiekio. Šiuo atveju polifenoliai praskiedžiami ir jų poveikis tampa ne toks ža-lingas.

4. Kai kurie mokslininkai rekomenduoja DNR išskyrimui naudoti etioliuotus lapus, nes tokiame lapo audinyje mažiau fenolinių junginių nei žaliame (Dabo ir kt., 1993).

Kita DNR išskyrimą sunkinančių cheminių junginių grupė – polisacharidai. Jie didi-na DNR tirpalo klampumą, slopina Taq polimerazės bei restriktazių veiklą. Weising ir kt. (2005) nurodo keletą būdų, kaip atsikratyti polisacharidų arba sumažinti jų kiekį.

1. Daug polisacharidų nusodinama tuomet, kai DNR išskyrimo buferyje yra didelės CTAB koncentracijos.

2. Sutrumpinus šildymo laiką CTAB tirpale iki 15 min. bei nusodinant DNR kam-bario temperatūroje, didžiąją dalį polisacharidų galima pašalinti su supernatantu.

3. Ekstrahuojant DNR eteriu, įsotintu vandens, ir esant 1,25 M NaCl koncentracijai, didžioji dalis polisacharidų lieka drebučių pavidalo tarpinėje fazėje.

4. Dažnai pasinaudojama nevienodu DNR ir polisacharidų tirpumu druskos-etanolio tirpaluose. Esant didelei druskų koncentracijai, nusodinant DNR dviem etanolio tūriais, polisacharidai išlieka tirpale ir pašalinami su supernatantu. Šis būdas taikomas dažniausiai. Kitas būdas – polisacharidų nusodinimas 0,35 tūrio etanolio, esant nedidelei druskos koncentracijai (pavyzdžiui, 0,25 M NaCl). Šiuo atveju DNR išlieka tirpale (su-pernatante).

5. Taip pat rekomenduojama išskirti DNR iš audinių, surinktų pavasarį, kai polisa-charidų, polifenolių ir kitų metabolitų kiekis mažesnis. Be to, DNR rekomenduojama išskirti anksti rytą.

Išskirtos DNR kokybę galima pagerinti elektroforeze agarozės gelyje arba centrifu-guojant CsCl gradiente. Šie būdai dėl didelių laiko ir reagetų sąnaudų šiuo metu nedažnai naudojami, nors taip išskirta DNR būna geros kokybės (1.1 lentelė).

10 |

1.1 lentelė. Keleto metodų tinkamumo augalo DNR skyrimui palyginimas http://www1.qiagen.com/literature/brochures/plant_nap/1014067_BROS_DNYP_INT.pdf

DNeasy Plant kit CTAB Dellaporta CsCl gradientas Medžiaga Augalo ląstelės ir

audiniai Augalo ląstelės ir audiniai

Augalo ląstelės ir audiniai

Augalo audiniai

Tinka daugeliui rūšių Taip Taip* Ne* Taip DNR kokybė Aukšta Vidutinė Prasta Aukšta Reikalingas nusodinimas alkoholiu

Ne Taip Taip Taip

24 mėginių paruošimo laikas

<1 h‡ 2-4 h 2-4 h 12 h (8 pavyzdžiai)

Rezultatų atsikartojimas Geras Įvairus Įvairus Geras DNR laikymo trukmė Ilga Ilga Neilga Ilga Tinkamumas reakcijoms Puikus Vidutinis Prastas Puikus

Be to, egzistuoja ir automatizuotos DNR išskyrimo iš įvairių audinių sistemos. Pa-

prastai jos taikomos DNR iš gyvūninės kilmės audinio išskirti (pvz., DYNAL ASA, Nor-vegija; AGOWA, Vokietija; QIAGEN GmbH, Vokietija; BILATEC AG,Vokietija; RO-CHE Diagnostics, Šveicarija; PROMEGA Corporation, JAV; SCIL Diagnostic GmbH, Vokietija). Norint tokias sistemas pritaikyti augalo DNR išskyrimui būtina išspręsti ląste-lių sienelių suardymo problemą. Tai pasiekiama naudojant karbohidrazių, kurios skaldo augalo ląstelės sienelės polisacharidus, mišinius. Pavyzdžiui, tokių fermentų mišinys gau-namas iš Trichoderma longibrachiatum (Manen ir kt., 2005) (1.5 pav.).

1.5 pav. Fermentinis augalo ląstelių sienelių suardymas naudojant fermentų mišinį iš Tricho-derma longibrachiatum (Manen ir kt., 2005). Hidrolizuojami įvairių rūšių augalų audiniai

Literatūra 1. Aras SS, Duran A, Yenilmez G. Isolation of DNA for RAPD analysis from dry leaf ma-

terial of some Hesperis L. specimens. Plant Mol Biol Rep 2003;21(4):461a-461f. 2. Dabo SM, Mitchell ED, Melcher U. (1993) A method for the isolation of nuclear DNA

from catton (Gossypium) leaves. Anal Biochem 1993;210(1):34-8.



3. Doyle JJ, Doyle JL. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 1990;12(1):13–5. 4. Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB. A plant DNA minipreparation: version II. Plant Mol

Biol Rep 1983;1(1):19-21. 5. Kang HW, Cho YG, Yoon UH, Eun MY. A rapid DNA extraction method for RFLP

and PCR analysis from a single dry seed. Plant Mol Biol Rep 1998;16(1):90. 6. Krishna TG, Jawali N. DNA isolation from single or half seeds suitable for random

amplified polymorphic DNA analyses. Anal Biochem 1997;250(1):125-7. 7. Manen JF, Sinitsyna O, Aeschbach L, Markov AV, Sinitsyn A. A fully automatable en-

zymatic method for DNA extraction from plant tissues. BMC Plant Biol 2005;5:23. doi: 10.1186/1471-2229-5-23.

8. Murray MG, Thompson WF. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res 1980;8(19):4321-5.

9. Weising K, Nybom H, Wolff K, Kahl G. DNA fingerprinting in Plants: Principles, Methods and Applications. Boca Raton: Taylor & Francis Group; 2005. p. 21-73.

10. Weising K, Nybom H, Wolff K, Meyer W. DNA fingerprinting in plants and fungi. Bo-ca Raton: CRC Press; 1995. p. 114-31.

1.1.4. DNR išskyrimas naudojant genominės DNR išskyrimo rinkinį („Fermentas“)

Darbo tikslas Išskirti genominę DNR iš įvairių rūšių augalų lapų, naudojant universalų genominės

DNR išskyrimo rinkinį („Fermentas“). Nustatyti genomo dydžio įtaką DNR išeigai. Įver-tinti metodo universalumą.

Tiriamoji medžiaga: sudaigintų heksaploidinių kviečių lapai, sudaigintų diploidinių miežių lapai, pupų skilčialapiai, pušies spygliai (kiekviena grupė darbui ima skirtingų rūšių ir skirtingų augalų lapus).

Prietaisai ir priemonės Mikrocentrifuga „Eppendorf 5415D“. Vandens termostatas. Svarstyklės. Purtyklė. Grūstuvėliai. Automatinės pipetės. Sterilūs antgaliai automatinėms pipetėms. Sterilūs 1,5 ml mėgintuvėliai. Stoveliai mėgintuvėliams. Vienkartinės latekso pirštinės.

Tirpalai ir reagentai Genominės DNR išskyrimo rinkinys („Fermentas“): lizės tirpalas, 10 X precipitaci-

jos tirpalas (jeigu iškritusios nuosėdos, prieš naudojimą 3–5 min. pašildyti) ir 1,2 M NaCl. Skystasis azotas. Sterilus TE buferis: TRIS 10 mM, EDTA 1 mM. Chloroformas (chloroformas: izoamilo spiritas (24:1)). Etilo alkoholis: 70 proc. ir 95 proc.

12 |

Sterilus dejonizuotas H2O.

Darbo eiga • Pasverti 50–100 mg augalo lapų, sudėti juos į piestą ir užpilti skystuoju azotu

(kiekviena grupė analizuoja keturis skirtingų rūšių mėginius). Sušalusius lapus sutrinti grūstuvėliu iki miltelių, dar neatitirpusius sudėti į 1,5 ml talpos mėgintu-vėlį, kuriame įpilta 200 µl TE buferio.

• Įpilti 400 µl lizės tirpalo. Mėginį vartant sumaišyti ir inkubuoti vandens termos-tate 5 min. + 65ºC temperatūroje.

• Po inkubacijos nedelsiant pridėti 600 µl chloroformo. Mėginį vartant sumaišyti ir centrifuguoti mikrocentrifugoje 4 min. 10000 aps./min.

• Kol mėginys centrifuguojamas, kitame 1,5 ml talpos mėgintuvėlyje paruošti nu-sodinimo tirpalą: 720 µl sterilaus dejonizuoto H2O sumaišyti su 80 µl 10 X pre-cipitacijos tirpalo.

• Nucentrifuguoto mėginio viršutinę vandeninę fazę, kurioje yra DNR, supilti į mėgintuvėlį su paruoštu nusodinimo tirpalu. Vartant mėginį sumaišyti. Mėginį centrifuguoti 4 min. 10000 aps./min.

• Supernatantą visiškai pašalinti, o DNR nuosėdas užpilti 100 µl NaCl ir gerai iš-tirpinti (purtant purtykle).

• Ištirpus nuosėdoms, į mėginį įpilti 300 µl šalto etilo alkoholio 95 proc. Mėginį sumaišyti vartant (iškrinta DNR nuosėdos). Kad DNR visiškai nusėstų, mėgin-tuvėlį 20 min. laikyti šaldytuve -20ºC temperatūroje.

• Atšaldytą mėginį centrifuguoti 4 min. 10000 aps./min. Tada etilo alkoholį atsar-giai nupilti, o nusėdusią DNR praplauti 200 µl 70 proc. etilo alkoholiu. Centri-fuguoti 5 min. 10000 aps./min. Etilo alkoholį atsargiai visiškai pašalinti, o nuo-sėdas išdžiovinti.

• Išskirtą DNR ištirpinti 100 µl sterilaus dejonizuoto vandens. Ant mėgintuvėlio užrašyti reikiamą informaciją (mėginio kodą, DNR išskyrimo datą ir t. t.). Mėgi-nius laikyti šaldytuve + 4 ºC temperatūroje. Ilgesnį laiką nenaudojamą DNR saugoti –20 ºC temperatūroje. Išskirtoje DNR esančias RNR priemaišas galima pašalinti naudojant ribonukleozę A (skyrius 1.1.5).



Literatūra Genomic DNA purification kit #K0512 manual. Fermentas. 1-8. http://www.fermentas.com/profiles/kits/pdf/genomicpurkit0512.pdf

1.1.5. Genominės DNR išskyrimas modifikuotu CTAB metodu iš įvairių augalo organų

Darbo tikslas Išskirti genominę DNR iš skirtingų rūšių augalų (pavyzdžiui, miežių, pupų, pušies)

lapų ir šaknų modifikuotu CTAB metodu. Įvertinti metodo universalumą.

Tiriamoji medžiaga Miežių lapai ir šaknelės (10 skirtingų augalų), pupų skilčialapiai ir šaknelės (10 skir-

tingų augalų), pušies spygliai ir šaknys (10 skirtingų augalų).

Prietaisai ir priemonės Mikrocentrifuga „Eppendorf 5415D“. Eppendorf termostatas-purtyklė. Svarstyklės. Purtyklė. Grūstuvėliai ir piestos. Automatinės pipetės. Sterilūs antgaliai automatinėms pipetėms. Sterilūs 1,5 ml ir 2 ml mėgintuvėliai. Stoveliai mėgintuvėliams. Vienkartinės latekso pirštinės. Skalpeliai. Matavimo cilindrai 25 ir 50 ml. Plastikiniai špateliai.

Tirpalai ir reagentai 0,5M EDTA, pH 8,0. 1M TRIS pH 8,0. CTAB 10 proc. 5M NaCl. β-merkaptoetanolis. PVP-40 (polivinilpirolidonas -40000 MWT). Skystasis azotas. Chloroformas (chloroformas : izoamilo spiritas (24:1, v/v)). Etilo alkoholis: 70 proc. ir 95 proc. Ribonukleazė A 10 mg/ml. 3M natrio acetatas (pH 5,2). Distiliuotas H2O. Sterilus dejonizuotas H2O.

14 |

Darbo eiga • Paruošti ekstrakcijos buferį (jis turi būti šviežias). Darbas atliekamas įjungus

trauką! Ekstrakcijos buferio sudėtis (10-čiai pavyzdžių): EDTA 0,4 ml TRIS 1 ml NaCl 2,75 ml CTAB 2 ml β-merkaptoetanolis 0,002 ml PVP-40 100 mg Dejonizuotas H2O 3,848 ml

• Kiekviena grupė išskiria DNR iš 30 mėginių. • Pasverti 80-100 mg augalo audinio (lapų ar šaknų), sudėti juos į grūstuvėlį ir už-

pilti skystuoju azotu. • Sušalusius lapus ar šaknis sutrinti iki miltelių ir dar neatitirpusius sudėti į 2 ml

talpos mėgintuvėlį su 0,8 ml iš anksto paruošto ekstrakcijos buferio. Mėginį ge-rai sumaišyti vartant (ne mažiau 10 kartų). Maišyti purtykle nerekomenduojama, nes nuo to nukenčia DNR kokybė∗.

• Inkubuoti termostate 25 min. + 60º C temperatūroje. Po inkubacijos atvėsinti iki kambario temperatūros.

• Į atvėsintą mėginį įpilti 1 ml chloroformo (dirbti esant įjungtai traukai), sumaišy-ti ir centrifuguoti mikrocentrifugoje 3 min. 10000 aps./min.

• Nucentrifuguoto mėginio viršutinę vandeninę fazę (iki 380 ml), kurioje yra DNR, supilti į naują 2 ml talpos mėgintuvėlį. Įpilti 0,5 tūrio 5 M NaCl ir gerai sumaišyti. Tada įpilti 2 tūrius šalto etilo alkoholio 95 proc. Mėginį sumaišyti var-tant ir laikyti 20 min. + 4ºC temperatūroje.

• Atšaldytą mėginį su nusėdusia DNR centrifuguoti 5 min. 10000 aps./min. Tada supernatantą atsargiai pašalinti, o nusėdusią DNR ištirpinti 300 µl sterilaus dejo-nizuoto vandens (18,3 Ω).

• Į mėginį įpilti 3 µl ribonukleazės A ir inkubuoti vandens termostate 30 min. + 37°C temperatūroje.

• Po inkubacijos į kiekvieną mėginį įpilti 300 ml chloroformo, išmaišyti purtant mėgintuvėlius ir centrifuguoti 2 min. 10000 aps./min.

• Viršutinę vandeninę fazę atsargiai supilti į naują 1,5 ml mėgintuvėlį. Įpilti 0,1 tū-rio natrio acetato (3M) ir 2,5 tūrio šalto (-20°) etilo alkoholio 95 proc. Mėginį sumaišyti vartant ir laikyti 30 min. -20°C temperatūroje, kad iškristų DNR.

• Atšaldytą mėginį centrifuguoti 5 min. 10000 aps./min. kambario temperatūroje. Atsargiai pašalinti supernatantą, o DNR praplauti 200 µl etilo alkoholio 70 proc. Centrifuguoti 5 min. 10000 aps./min.

• Pipete atsargiai pašalinti etilo alkoholio likučius. Po to DNR išdžiovinti (laikant mėgintuvėlius steriliame bokse). Etilo alkoholio likučiai slopina PGR!

• Išdžiovintą DNR ištirpinti 100 µl sterilaus dejonizuoto (18,3 Ω) vandens. Nu-statyti jos koncentraciją ir švarumą (žr. toliau). Ant mėgintuvėlio užrašyti rei-



kiamą informaciją (mėginio kodą, DNR išskyrimo datą, koncentraciją). Mėginius laikyti šaldytuve + 4ºC temperatūroje. Ilgesnį laiką nenaudojamą DNR saugoti - 20ºC temperatūroje.

∗ DNR chemiškai labai inertiška. Nepaisant šitos savybės, ji gana trapi fiziškai. Dėl hidrodinaminių jėgų, atsirandančių maišant, purtant, imant mėginius pipete, DNR molekulės trūkinėja. Todėl gau-ti didelio molekulinio svorio DNR gana sudėtinga. Retai pavyksta gauti DNR fragmentus dides-nius nei 100–150 kb. Mūsų aptariamas metodas leidžia išskirti DNR molekules, kurių dydis apie 20–40 kb. Tokios kokybės DNR tinka PGR analizei bei hibridizacijai pagal Southern‘ą.

Rezultatų aprašymas DNR išskyrimo rezultatai pateikiami nuotraukose, kuriose matomos išskirtos DNR

elektroforezinis vaizdas. Kiekybiniai darbo rezultatai apibendrinami pasinaudojant lentele.

Lentelė. DNR skyrimo iš įvairios augalinės medžiagos rezultatai

Tirta rūšis

Organas, iš kurio išskirta

DNR

DNR koncen-tracija,

(μg/ml); vi-durkis

DNR kiekis (μg), išskir-

tas iš 1 g audinio; vidurkis

DNR koncentra-cija, vidurkis

(μg/ml)1 ± SD

DNR kiekis (vidurkis)2

± SD Pastabos3

1, 2 – vidurkis apskaičiuojamas naudojant visų grupių gautus rezultatus; 3 – šioje lentelės skiltyje aprašomos DNR išskirtos iš konkrečios augalo rūšies pre-

parato ypatybės (klampumas, spalva, A260/A280).

Literatūra 1. Doyle JJ, Doyle JL. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf

tissue. Phytochem Bull 1987;19(1):11-5. 2. Doyle JJ, Doyle JL. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 1990;12(1):13–5. 3. Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning. A laboratory manual. 3rd ed. Vol. 1. Cold

Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Lab Press; 2001. 4. Murray MG, Thompson WF. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.

Nucleic Acids Res 1980;8(19):4321-5.

1.1.6. DNR pavyzdžių užterštumo pašalinėmis sekomis problema

Naudojant PGR, galima pagausinti specifines DNR sekas turint net labai mažus ge-nominės DNR kiekius. Atliekant šią procedūrą, dažnai kyla sunkumų parenkant optimalų temperatūros režimą, reagentų koncentracijas, pradmenų sekas ir kt. Tačiau svarbiausia problema, su kuria susiduriama naudojant labai trumpus (pvz., RAPD) pradmenis arba pradmenis, pritaikytus labai konservatyvioms sekoms, yra matricinės DNR užterštumas

16 |

pašaline DNR. Šios problemos neįmanoma išspręsti PGR sąlygų optimizacija. Tyrimai rodo, kad gaubtasėklių augalų genominės DNR preparatai gana dažnai būna užteršti gry-bų DNR (Saar ir kt., 2001).

Grybai labai paplitę gamtoje. Jie ypač dažni ant autotrofinių organizmų, su kuriais sudaro mutualistinius, antagonistinius ar simbiontinius ryšius. Daugelis metodų, naudo-jamų DNR išskyrimui iš augalo audinių, gali išskirti ir tam tikrą kiekį grybo DNR, jeigu pastarasis įaugęs į augalo audinius. Dėl šios priežasties kai kurie mokslo darbai nebuvo paskelbti, nes laiku neatsižvelgta į minėtą problemą (Blaney, 1995).

Kai kuriais atvejais grybų sporos ir grybienos fragmentai nuo augalo audinių pavir-šiaus gali būti pašalinti naudojant įvairias sterilinimo metodikas (Petrini, 1986; Schultz ir kt., 1993). Zhang ir kt. (1997) nustatė, kad paviršiaus sterilinimas gali išspręsti užkrėtimo epifitiniais grybais problemą. Tačiau kai kurie šių grybų turi ir endofitinę dalį, kurios ne-įmanoma pašalinti naudojant įprastą sterilinimo metodiką. Pavyzdžiui, įrodytas Alternaria alternata (Fr.) Keissler ir Cladosporium cladoaporioides (Fr.) de Vries endofitinių populiacijų susidarymas Phasolus (Fabaceae) audiniuose, nors šie grybai laikomi tipiškais epifitais.

1866 m. De Bary organizmus, gyvenančius augalo audiniuose, pavadino endofitais. Pats terminas „endofitai“, kaip nurodo Petrini (1986), yra pernelyg platus, nes apima platų organizmų spektą, pradedant lapų patogenais ir baigiant šaknų mikorizės simbion-tais. Visgi dauguma autorių tuo terminu vadina tik tuos grybus, kurie sukelia besimptomę infekciją vidiniuose augalo audiniuose. Tokie grybai atrasti daugiau kaip 300 augalų rūšių antžeminės dalies organuose. Ištirti augalai priklausė įvairiems taksonams: plikasėkliams, gaubtasėkliams, paparčiams ir samanoms (Petrini, 1992). Aprašyti endofitiniai grybai daugiausia buvo Ascomycetes klasės atstovai. Tačiau, visai realu, kad tokie augalo ir grybo santykiai būdingi daugiau 90 proc. augalų rūšių.

Geriausiai ištirti žolinių augalų endofitai (Clay, 1988; Clay, 1990), nes jais pirmiausia buvo susidomėta. Daug šių augalų rūšių užkrėstos endofitiniais grybais. Kai kurios rūšys yra atsparios šiems grybams, kitų užkrėsti visi augalai, dar kitoms rūšims būdingas vidu-rūšinis polimorfizmas: vieni individai populiacijoje gali būti atsparūs, o kiti – infekuoti. Užkrato apimtis labai priklauso nuo metų laiko ir klimato sąlygų (Clay, 1990). Kai kuriose augalų rūšyse grybo užkratas persiduoda iš motininio augalo palikuonims, į bręstantį sėk-lapradį ar sėklą įaugus endofitinio grybo hifams.

Reiškinys labai įdomus biologiniu požiūriu. Tyrimai, atlikti vidutinio klimato sąly-gomis, parodė, kad infekuoti augalai yra stipresni, toksiškesni žolėdžiams (vabzdžiams, žinduoliams) ir labiau atsparūs sausrai, palyginti su neužkrėstais augalais (Rice ir kt., 1990; Cay ir kt., 1993). Be to, kaip rodo naujesni tyrimai, endofitai labai svarbūs augalų bioįvai-rovės susidarymui, nes vekia šeimininko biologinį tinkamumą (Clay & Holah, 1999).

White ir kt. (1990) sukūrė PGR pradmenis, kuriuos naudojant galima pagausinti grybų vidinio transkribuojamo tarpiklio (angl., internal transcribed spacer – ITS) sritį, esančią tarp branduolio rRNR genų. Vėliau nustatyta, kad tie patys pradmenys tinka ir gaubtasėk-lių augalų ITS tyrimams, be to, pradėti naudoti filogenetinėje analizėje. Tačiau ši genomo sritis gali būti panaudota nustatant ir augalo DNR užterštumą pašaline (grybo) DNR. ITS sritis ir ją supantys genomo DNR rajonai pavaizduoti 1.6 paveiksle.



IGS

NTS

3' 5'

18S 26S5.8S18S ITS-1 ITS-2ETS ETS

ITS5m ITS3

ITS2 ITS4Transkripcija

Kartotinis vienetas

1.6 pav. rDNR transkripcijos pasikartojančio vieneto struktūra. Genai pažymėti juodais sta-čiakampiais. ETS – išorinis transkribuojamas tarpiklis; IGS – tarpgeninis tarpiklis. ITS – vi-dinis transkribuojamas tarpiklis; NTS – netranskribuojamas tarpiklis. Mažos rodyklės žymi apytikslę oligonukleotidinių pradmenų prisijungimo prie matricos vietą (Saar ir kt., 2001) RAPD analizė labai jautri pašalinės DNR užkratui, nes joje naudojami trumpi atsi-

tiktinės sekos pradmenys. Jeigu dvi ar daugiau rūšių užkrėsta ta pačia grybo forma, tai gauti rezultatai gali rodyti didesnį rūšių genetinį gimingumą nei jis yra iš tikrųjų.

Apie svetimos DNR buvimą augalo DNR preparatuose galima spręsti iš papildomo DNR fragmento atsiradimo ITS-2 srities pagausinimo reakcijoje (1.7 pav.).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Tier 1

506 396 344

4b 7b 9b 8b 9c

1 2a

1.7 pav. Įvairių Dahlia (Asteraceae) rūšių augalų branduolio DNR ITS2 rajono pagausinimo PGR metodu produktai. Rodyklėmis parodyti DNR fragmentai, pagausinti nuo grybo DNR (Saar ir kt., 2001) Grybų ITS-2 rajonas paprastai yra trumpesnis nei gaubtasėklių augalų, todėl papil-

domas, lengvesnis DNR fragmentas yra matomas aplifikacijos produktų elektroforegra-moje. Šis metodas yra gana universalus ir vienu metu galima patikrinti net skirtingų gaub-tasėklių augalų šeimų atstovų DNR užterštumą (1.8 pav.).

18 |

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

506396344

1.8 pav. Įvairių šeimų gaubtasėklių augalų genominės DNR preparatų švarumo tikrinimas. Ascomycota atstovų DNR parodyta rodyklėmis su žvaigždutėmis. Jų taksonominė priklauso-mybė nustatyta atlikus nurodytų fragmentų sekoskaitą (Saar ir kt., 2001). 1 – Acorus gramineus; 2 – Daucus carota; 3 – Asclepias tuberosa; 4 – Dahlia variabilis; 5 – Helianthus grosserratus; 6 – Gle-choma hederaceae; 7 – Teucrium occidentale; 8 – Forsythia x intermedia; 9 – Prunus virginiana; 10 – Typha latifolia; 11 – Celtis occidentalis

Literatūra 1. Blaney C. Fungi in the family tree. BioScience 1995;45(11):746. 2. Clay K. Fungal endophytes of grasses: a defensive mutualism between plants and fungi.

Ecology 1988;69(1):10-6. 3. Clay K. Fungal endophytes of grasses. Annu Rev Ecol Syst 1990;21:275-97. 4. Clay K, Holah J. Fungal endophyte symbiosis and plant diversity in successional fields.

Science 1999;285(5434):1742-4. 5. Clay K, Marks S, Cheplink GP. Effects of insect herbivory and fungal endophyte infec-

tion on competitive interactions among grasses. Ecology 1993;74(6):1767-77. 6. O‘Donnell J, Dickinson CH. Pathogenicity of Alternaria and Cladosporium isolates on

Phaseolus. Trans Br Mycol Soc 1980;74(pt 2):335-42. 7. Petrini O. Taxonomy of endophytic fungi of arial plant tissues. In: Fokkema NJ, Heuvel

JV, editors. Microbiology of the phyllosphere. New York: Cambridge University Press; 1986. p. 175-87.

8. Petrini O. Fungal endophytes of tree leaves. In: Andrews JH, Hirano SS, editors. Micro-bial ecology of leaves. New York: Springer-Verlag; 1992. p. 179-97.

9. Rice JS, Pinkerton BW, Stringer WC, Undersander DJ. Seed production in tall fescue as affected by fungal endophyte. Crop Sci 1990;30:1303-5.

10. Schultz B, Wanke U, Draeger S, Aust H-J. Endophytes from herbaceous plants and shrubs: effectiveness of surface sterilization methods. Mycol Res 1993;97(12):1447-50.

11. Saar DE, Polans NO, Sǿrensen PD, Duvall MR. Angiosperm DNA contamination by endophytic fungi: detection and methods of avoidance. Plant Mol Biol Rep 2001;19(3):249-60.

12. White TJ, Burns T, Lee S, Taylor J. Amplification of direct sequencing of fungal ribo-somal RNA genes for phylogenetics. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, editors. PCR Protocols: a guide to methods and applications. San Diego, CA: Academic Press, Inc; 1990. p. 315-22.



13. Zhang W, Wendel JF, Clark LG. Bamboozled again! Inadvertent isolation of fungal rDNA sequences from bamboos (Poaceae: Bambusoideae). Mol Phylogenet Evol 1997;8(2):205-17.

1.1.7. Augalo DNR užterštumo endofitinio grybo DNR tikrinimas

Darbo tikslas Įvertinti, ar augalų DNR mėginiai nėra užkrėsti grybų DNR: a) patikrinti vidurūšinį Hordeum vulgaris skirtingų veislių DNR užterštumą endofiti-

niais grybais; b) įvertinti skirtingų rūšių augalų genominės DNR užterštumą endofitiniais grybais.

Prietaisai ir priemonės Termocikleris. Maišyklė. Mikrocentrifuga. Laminarinis boksas. Automatinės pipetės. Sterilūs antgaliai automatinėms pipetėms. Sterilūs 0,5 ml mėgintuvėliai. Stoveliai mėgintuvėliams. Vienkartinės latekso pirštinės.

Tirpalai ir reagentai 10 X PGR buferis (100 mM Tris-HCl, pH 8,8; 500 mM KCl; 0,8 proc. Nonidet

P40) („Fermentas“). dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) mišinys: 2 mM kiekvieno. MgCl2 25mM. Oligonukleotidiniai pradmenys (1 optinis vienetas): ITS3 (5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’); ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’). DNR matrica: 50 ng/µl. Termostabili Taq polimerazė (5 u/μl). Dejonizuotas H2O.

Darbo eiga Laminariniame bokse beveik steriliomis sąlygomis paruošti 0,5 ml talpos sterilius

vienkartinius mėgintuvėlius su DNR pagausinimo reakcijos mišiniu (25 μl vienai reakci-jai), kurį sudaro:

10 X PGR buferis 2,5 μl MgCl2 3,0 μl dNTP 2,5 μl Pradmuo ITS3 1,0 μl Pradmuo ITS4 1,0 μl Taq DNR polimerazė 0,2 μl DNR 2,0 μl Dejonizuotas H2O 12,8 μl

20 |

Galutinis reakcijų skaičius priklausys nuo analizuojamų mėginių kiekio. Pavyzdžiui, norint patikrinti penkis DNR mėginius, kiekvieno PGR komponento kiekį reikia padau-ginti iš penkių ir paruošti bendrą mišinį. Jis gerai sumaišomas maišykle. Šiuo atveju DNR pilama į kiekvieną mėgintuvėlį atskirai, prieš tai įpylus po 23 μl iš paruošto mišinio.

PGR režimas 1. Pirminė DNR denatūracija 95°C 3 min. 2. Pradmenų prisijungimas 50°C 1 min. 3. DNR sintezė 72°C 1 min. 4. DNR denatūracija 95°C 1 min. 5. Pradmenų prisijungimas 50°C 1 min. 6. DNR sintezė 72°C 1 min. 7. Baigiamoji DNR sintezė 72°C 6 min. 4↔6 etapai kartojami 29 kartus (29 ciklai). Atlikti PGR produktų analizę agarozės 1 proc. gelyje.

Literatūra 1. Farr DJ, Hills GF, Chamuris GP, Rossman AY. Fungi on plants and plant products in

the United States. St. Paul, Minnesota: APS Press; 1989. 2. Saar DE, Polans NO, Sǿrensen PD, Duvall MR. Angiosperm DNA contamination by

endophytic fungi: detection and methods of avoidance. Plant Mol Biol Rep 2001;19(3):249-60.

ANTRAS LABORATORINIS DARBAS


2. Antras laboratorinis darbas

2.1. RAPD-PGR panaudojimas augalų genomo tyrimams

2.1.1. RAPD metodo esmė

Atsitiktinai pagausintos polimorfinės DNR (angl. RAPD – Random amplified po-lymorphic DNA) metodas sukurtas 1990 m. Williams ir kolegų. Kaip ir kiti panašūs me-todai (DAF, AP-PCR), RAPD yra PGR reakcijos modifikacija. Jo esmė – DNR pagausi-nimas naudojant atsitiktinės sekos trumpus oligonukleotidinius pradmenimis (Williams ir kt., 1990). Jie gali būti 9-11 bazių ilgio. Dažniausiai standartinėje RAPD-PGR reakcijoje pradmenys būna sudaryti iš 10 nukleotidų. Juose G+C dalis siekia 60–70 proc. (Péretz ir kt., 1998). Kadangi naudojami atsitiktinės sekos pradmenys ir tas pats oligonukleotidas tarnauja kaip tiesioginis ir atvirkštinis pradmuo, pagausinami anoniminiai DNR lokusai. Pradmenų jungimosi vietos atsitiktinai išsibarsčiusios tiriamojo mėginio genome. Tinka-mai parinkus pradmenis, galima pagausinti lokusus, būdingus tik tam tikrai rūšiai, popu-liacijai ar net individui. Reakcijos metu gauti produktai analizuojami agarozės gelyje (2.1 pav.). Šis metodas labai patogus tiriant genetiniu požiūriu mažai ištirtas rūšis.

Kad DNR lokusas būtų pagausintas, RAPD-PGR metu prie DNR prisijungę prad-menys turi būti tinkamai orientuoti ir nutolę tam tikru atstumu. Jeigu šios sąlygos tenki-namos, pradmenų apribotas DNR fragmentas bus pagausintas eksponentiškai.

RAPD juostų polimorfiškumo priežastys gana įvairios: 1. DNR fragmento įsiterpimas tarp pradmenų prisijungimo prie DNR matricos

vietų gali juos pernelyg nutolinti vieną nuo kito ir Taq polimerazė nebus pajėgi užbaigti DNR sintezę nuo vieno pradmens iki kito, todėl atitinkamas PGR pro-duktas nesusidarys.

2. Nedidelio DNR fragmento įsiterpimas ar iškritimas svarbus PGR produkto dy-džio pokyčiui.

3. Vienos iš prisijungimo vietų delecija gali sukelti PGR produkto išnykimą arba didesnio produkto susidarymą.

4. Mutacijos vieno ar abiejų pradmenų prisijungimo vietose taip pat gali sąlygoti produkto išnykimą arba jo dydžio pokyčius.

Žinant pradmens seką bei darant prielaidą, kad jo prijungimas prie DNR matricos įmanomas tik esant 100 proc. homologijai, teoriškai galima paskaičiuoti, kiek PGR pro-duktų (RAPD juostų) tikėtis tam tikro dydžio genome. Williams ir kt. (1993) pasiūlė tokią šio skaičiavimo formulę:

b = (2000 × 4-2n) × C,

čia b – laukiamų PGR produktų konkrečiam pradmeniui skaičius; n – pradmens ilgis nukleotidais; C – haploidinio genomo dydis bazių poromis. Pavyzdžiui, kukurūzuose (ge-nomo dydis 6 × 106 kb), galima tikėtis maždaug 11 fragmentų, jeigu naudojamas 10 nt pradmuo ir homologija prijungimo vietoje siekia 100 proc. Tuo tarpu kepimo mielėse su tuo pačiu pradmeniu galėtų susidaryti tik 0,029 fragmento (mielių genomo dydis 1,6 × 104 kb). Abiem atvejais daroma prielaida, jog konkretus oligonukleotidas abiejuose genomuose

22 |

aptinkamas vienodu dažniu. Tačiau tyrimų duomenys rodo, kad PGR produktų skaičius dažniausiai nepriklauso nuo genomo sudėtingumo. Pavyzdžiui, augaluose, turinčiuose didelį genomą (pvz., svogūnai, pušys), neaptinkama žymiai daugiau RAPD juostų nei augaluose, kurių genomas nedidelis (pvz., vairenis). RAPD fragmentų skaičius, tenkantis vienam pradmeniui, dažniausiai nepriklauso ir nuo ploidiškumo. Tokios koreliacijos nebuvimą, naudojant RAPD metodą, galima paaiškinti netiksliu pradmens ir DNR matricos nukleoti-dų susiporavimu bei pradmenų konkurencija. Netikslus nukleotidų susiporavimas įmano-mas, esant švelnioms reakcijos sąlygoms, kai prijungimo temperatūra + 35-45°C.

A

B

CTaq polimerazė

Genominė DNR

Atsitiktinės sekos pradmuo

Deoksinukleozid- trifosfatai ir buferis

Polimerazinė grandininė reakcija

Elektroforezė

A B C

A B C

360 bp

260 bp

520 bp

260 bp360 bp520 bp

2.1 pav. RAPD-PGR metodo esmė. RAPD-PGR atlikti yra reikalinga organizmų genominė DNR (A, B, C), vienas atsitiktinės nukleotidų sekos pradmuo, temperatūrai atspari DNR po-limerazė ir reakcijos buferis. Pradmuo prisijungia prie komplementarių sekų denatūruotoje šabloninėje DNR. Jeigu pradmenys prisijungia priešingomis kryptimis ir tinkamu atstumu vienas nuo kito, tarp jų esantis fragmentas pagausinamas. Reakcijos produktai atskiriami aga-rozės gelyje ir nudažomi etidžio bromidu. Skirtingi organizmai gali duoti įvairius pagausintų DNR fragmentų spektrus (pagal Weising ir kt., 1995)



2.1.2. RAPD metodo privalumai

RAPD-PGR ir jai giminiški metodai turi nemažai privalumų palyginus su standarti-nėmis, hibridizacija pagrįstomis, molekulinių žymenų sistemomis. Suprantama, šie priva-lumai išryškėja tik tam tikrose konkrečiose situacijose, todėl jokiu būdu negalima teigti, kad RAPD metodas visais atžvilgiais geresnis, pavyzdžiui už RFIP (angl. restriction fragment length polymorphism, RFLP). RAPD analizė gali būti atliekama neturint jokios informacijos apie tiriamo organizmo genomą. Todėl metodą galima taikyti mažai genetiškai ištirtoms rūšims, pavyzdžiui, nustatyti jų populiacijų genetinę struktūrą bei DNR polimorfizmo lygį jose. RAPD analizei atlikti pakanka nedidelių DNR kiekių (5–100 ng reakcijai), todėl individo genotipas gali būti nustatytas jo nesunaikinant. Tai labai patogu molekulinėje selekcijoje, kai būtina įvertinti palikuonių genotipus ir atrinkti reikiamus tolesniam pa-dauginimui. Metodas greitas ir palyginti pigus, jam nereikia brangios įrangos bei didelio įdirbio ruošiant pradmenis ar zondus. Todėl, naudojant šį metodą, per trumpą laiką gali-ma išanalizuoti didelį mėginių skaičių. RAPD analizę galima automatizuoti, sukurti robo-tai-analizatoriai. Atlikus amplifikacijos sąlygų optimizavimą, metodas yra patikimas. Dar vienas RAPD žymenų privalumas – didelis jų polimorfizmas ir tolygus pasiskirstymas genome. Pavyzdžiui, minisatelitai ir kai kurie kiti žymenys dažniau aptinkami tik tam tik-rose genomo vietose, todėl jų taikymas gali būti ribotas. RAPD analizė yra gana jautrus būdas nustatyti įvairių tipų DNR pažaidas (pavyzdžiui, DNR aduktus), taip pat mutacijas (taškines mutacijas, stambias aberacijas).

2.1.3. RAPD analizės trūkumai

Kai kurie tyrimai rodo, kad RAPD-PGR metu gali susidaryti netikri amplifikacijos produktai mėginyje, neturinčiame DNR (Mullis, 1991). Yra publikacijų, kuriose kritikuo-jamas šiuo metodu gautų rezultatų nepakankamas atsikartojamumas (Ellsworth ir kt., 1993; Khandka ir kt., 1997). Taip pat nustatyta, kad ne visi RAPD žymenys paveldimi pagal Mendelio dėsnius (Scott ir kt., 1992; Ayliffe ir kt., 1994). Šiuos trūkumus gali lemti „švelnios“ reakcijos sąlygos (žema pradmenų prisijungimo prie DNR matricos tempera-tūra). Daugelis aprašytų netikslumų, matyt, susiję su artefaktais, DNR užteršimu ir muta-cijomis genominėje DNR (Scott ir kt., 1992; Riedy ir kt., 1992).

Jeigu RAPD spektrai neatsikartoja, tyrėjai tai dažniausiai laiko artefaktais ir nesigilina į tokio neatsikartojamumo priežastis. Naudojant metodą genealoginėje analizėje, pastebė-ta, kad kartais palikuonių RAPD spektruose atsiranda tėvams nebūdingų DNR fragmen-tai (Scott ir kt., 1992; Riedy ir kt., 1992; Ayliffe ir kt., 1994). Nustatyta, kad hibridinės (heterodupleksinės) DNR molekulės gali susidaryti dėl alelinių DNR fragmentų susijun-gimo. Tai, matyt, viena svarbiausių artefaktų atsiradimo priežasčių (Ayliffe ir kt., 1994). Tačiau įvairiuose darbuose nurodomas tokių artefaktų kiekis labai skiriasi. Vis dėlto į šį trūkumą reikia atsižvelgti, ypač kai reikia dirbti su labai polimorfiškų rūšių DNR. Juolab, kad RAPD žymenų paveldėjimas yra dominuojančio pobūdžio ir neįmanoma atskirti heterozigotų nuo homozigotų.

Lyginant įvairių individų RAPD spektrus daroma prielaida, kad vienodo ar panašaus dydžio DNR fragmentai yra homologiški. Ji ne visada gali būti teisinga. Be to, nereikėtų pamiršti, kad šiuo metodu gaunami duomenys yra kokybiniai, bet ne kiekybiniai.

24 |

2.1.4. RAPD-PGR optimizacija

RAPD analizės kokybei ir rezultatų patikimumui labai svarbūs DNR švarumas ir koncentracija. Blogos kokybės DNR nulemia neatsikartojančių juostų susidarymą. Jeigu analizuojamų mėginių DNR koncentracijos labai skiriasi, gaunami RAPD spektrai taip pat gali šiek tiek skirtis. Amplifikacijai įtakos turi ir kiti parametrai: magnio jonų, dNTP, Taq polimerazės koncentracija. Todėl, prieš pradedant eksperimentą, tai reikia įvertinti ir pasirinkti optimalias koncentracijas. Nepaisant RAPD metodo kritikos, yra nemažai mokslininkų, kurie teigia, kad metodas yra patikimas (Hedrick, 1992; Atienzar & Jha, 2006). Per metus naudojant šį metodą vidutiniškai paskelbiama 600–800 darbų. Tačiau nekelia abejonių ir tai, kad metodas labai jautrus reakcijos sąlygoms. Pavyzdžiui, aprašyti atvejai, kai RAPD spektrai skyrėsi, jeigu buvo naudojami skirtingi termocikleriai ar skir-tingos kilmės temperatūrai atsparios DNR polimerazės (Meunier & Grimont, 1993; Schierwater & Ender, 1993). Taigi rezultatai, gauti skirtingose laboratorijose, gali būti lyginami tik tuomet, jeigu RAPD-PGR atliekama vienodomis sąlygomis. Pavyzdžiui, atli-kus 15 Yersinia kamienų, pasižyminčių RAPD žymenų polimorfizmu, RAPD analizės rezultatų atsikartojamumą tiek toje pačioje, tiek skirtingose laboratorijose nustatyta, kad rezultatai patikimai atsikartoja atlikus RAPD metodikos optimizaciją (Blixt ir kt., 2003). Labai vertingu RAPD metodas laikomas ir kituose darbuose (Perry ir kt., 2003; Guclu ir kt., 2004; Atienzar & Jha, 2006). Tačiau būtina parinkti tokias reakcijos sąlygas, kad būtų gaunami atsikartojantys RAPD spektrai.

2.1.5. Pradmens ir matricos sąveika

Caetano-Anolles ir kt. (1992) tyrė, kaip priklauso pradmens ir matricos sąveika nuo pradmens ilgio ir „išsigimimo“ laipsnio RAPD reakcijos metu. Jie nustatė, kad aštuoni nukleotidai nuo pradmens 3' galo yra svarbiausi amplifikacijai. Jeigu jie vienodi pradme-nyse, sudarytuose iš aštuonių, devynių ir dešimt nukleotidų, tai amplifikacijos spektrai, gauti naudojant tokius pradmenis atskirose reakcijose, buvo identiški arba labai panašūs. Jeigu identiškų nukleotidų skaičius pradmenyse būdavo nuo penkių iki aštuonių, tai skir-tumai tarp amplifikacijos spektrų buvo dideli. Be to, mažėjant pradmenų ilgiui, mažėjo PGR produktų skaičius (Caetano-Anolles, 2001).

Dėl gana neaukštos pradmenų jungimosi temperatūros galima gauti didelį skaičių RAPD juostų, tačiau tokios palyginti švelnios reakcijos sąlygos gali sukelti netikrą ampli-fikaciją. Todėl kai kurie autoriai siūlo gerokai padidinti šią temperatūrą ir (arba) naudoti DMSO. Šis tirpiklis gana teigiamai veikia reakcijos rezultatų atsikartojamumą, nes mažina netikros amplifikacijos be matricos galimybę (Kidd ir kt., 1995). Deja, DMSO slopina ir PGR esant DNR matricai, todėl ne visiems tyrėjams pavyksta jį pritaikyti.

Tinkamai parinkus pradmenis ir reakcijos sąlygas, RAPD-PGR galima atlikti + 50°C temperatūroje ir gauti gerus rezultatus (Atienzar ir kt., 2000). Taigi daug „griežtesnėmis“ reakcijos sąlygomis išsprendžiama rezultatų atsikartojamumo problema. Panašūs rezulta-tai gauti ir kitų autorių, nors RAPD metodo kūrėjai ir teigė, kad aukštesnėje nei + 40°C temperatūroje su daugeliu išbandytų 10nt ilgio pradmenų amplifikacijos produktų nepa-vyko gauti (Williams ir kt., 1990).



Literatūra 1. Ayliffe MA, Lawrence GJ, Ellis JG, Pryor AJ. Heteroduplex molecules formed between

allelic sequences cause nonparental RAPD bands. Nucleic Acids Res 1994;22(9):1632-6. 2. Atienzar F, Evenden A, Jha A, Savva D, Depledge M. Optimized RAPD analysis gene-

rates high-quality genomic DNA profiles at high annealing temperature. Biotechniques 2000;28(1):52-4.

3. Atienzar FA, Jha AN. The random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay and re-lated techniques applied to genotoxicity and carcinogenesis studies: a critical review. Mu-tat Res 2006;613(2-3):73-102.

4. Blixt Y, Knutsson R, Borch E, Radstrom P. Interlaboratory random amplified poly-morphic DNA typing of Yersinia enterocolitica and Y. enterocolitica-like bacteria. Int J Food Microbiol 2003;83(1):15-26.

5. Caetano-Anollés G. Plant genotyping using arbitrarily amplified DNA. In: Henry RJ, editor. Plant genotyping. The DNA fingerprinting in plants. Wallingford, U.K.: CABI Publishing; 2001. p. 29-46.

6. Caetano-Anollés G, Bassam BJ, Gresshoff PM. Primer-template interactions during DNA amplificaton fingerprinting with single arbitrary oligonucleotides. Mol Gen Genet 1992;235(2-3):157-65.

7. Ellsworth DL, Rittenhouse KD, Honeycutt RL. Artifactual variation in randomly ampli-fied polymorphic DNA banding patterns. Biotechniques 1993;14(2):214-7.

8. Guclu F, Aldem OS, Guler L. Differential identification of catle Sarcocystis spp. by ran-dom amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR). Rev Med Vet 2004;155:440-4.

9. Hedrick P. Population genetics: shooting the RAPDs. Nature 1992;355(7179):679-80. 10. Khandka DK, Tuna M, Tal M, Nejidat A, Golan-Goldhirsh A. Variability in the

pattern of random amplified polymorphic DNA. Electrophoresis 1997;18(15):2852-6.

11. Kidd KK, Ruano G. Optimizing PCR. In: McPherson MJ, Hames BD, Taylor GR, edi-tors. PCR 2 a practical approach. New York: Oxford University Press; 1995. p. 1-22.

12. Meunier JR, Grimont PAD. Factors affecting reproducibility of random amplified po-lymorphic DNA fingerprinting. Res Microbiol 1993;144(5):373-9.

13. Mullis KB. The polymerase chain reaction in an anemic mode: how to avoid cold olygo-deoxyribonuclear fusion. PCR Methods Appl 1991;1(1):1-4.

14. Perry AL, Worthington T, Hilton AC, Lambert PA, Stirling AJ, Elliott TS. Analysis of clinical isolates of Propionibacterium acnes by optimised RAPD. FEMS Micro-biol Lett 2003;228(1):51-5.

15. Raboum C, Comes AM, Bretagnolle V, Humbert J-F, Periquet G, Bigot Y. Featu-res of DNA fragments obtained by random amplified polymorphic DNA (RAPD) assay. Mol Ecol 1999;8(3):493-503.

16. Riedy MF, Hamilton WJ, Aquadro CF. Excess of nonparental bands in offspring from known primate pedigrees assayed using RAPD PCR. Nucleic Acids Res 1992;20(4):918.

17. Schierwater B, Ender A. Different thermostable DNA polymerases may amplify diffe-rent RAPD products. Nucleic Acids Res 1993;21(19):4647-8.

18. Scott MP, Haymes KM, Williams SM. Parentage analysis using RAPD PCR. Nucleic Acids Res 1992;20(20):5493.

19. Weising K, Nybom H, Wolff K, Meyer W. DNA fingerprinting in plants and fungi. Bo-ca Raton: CRC Press; 1995. p. 114-31.

26 |

20. Weising K, Nybom H, Wolff K, Kahl G. DNA fingerprinting in plants: principles, met-hods, and applications. 2nd ed. Boca Raton: CRS Press, Taylor & Francis Group; 2005. p. 2-40.

21. Williams JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res 1990;18(22):6531-5.

2.2. RAPD-PGR analizės metodika

Darbo tikslas Nustatyti tiriamų augalų RAPD fenotipus bei jų tarpusavio giminingumą. Įvertinti

vidurūšinį ir tarprūšinį polimorfizmą.

Tyrimų medžiaga. Skirtingų genotipų miežių, kviečių ir pupų DNR, išskirtos anks-tesniųjų laboratorinių darbų metu.

Prietaisai ir priemonės Termocikleris „Eppendorf“. Mikrocentrifūga „Eppendorf 5424“. Laminarinis boksas. Maišyklė. Automatinės pipetės (0,5–10 μl,2–20 μl, 20–200 μl). Sterilūs antgaliai automatinėms pipetėms. Sterilūs 0,5 ml Eppendorf tipo mėgintuvėliai skirti PGR. Stoveliai mėgintuvėliams. Vienkartinės latekso pirštinės.

Tirpalai ir reagentai 10 X Taq buferis (100mM Tris-HCl, pH 8,8; 500 mM KCl; 0,8 proc. Nonidet P40)

(„Fermentas“); dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) mišinys: 2 mM kiekvieno. MgCl2 25 mM. Oligonukleotidiniai pradmenys (1 optinis vienetas) iš Roth A rinkinio: Roth A-01- 5’ CAGGCCCTTC 3’; Roth A-02 - 5’ TGCCGAGCT 3’; Roth A-03 - 5’ AGTCAGCCAC 3’; RothA-04 – 5' AATCGGGCTG 3' ir kt.; Pavyzdžiai su augalų genomine DNR (25 ng/ µl); Termostabili Taq polimerazė (5 u/μl); Dejonizuotas H2O.

Darbo eiga Laminariniame bokse beveik steriliomis sąlygomis paruošti reikiamą kiekį mišinio

taip, kad kiekvieno DNR mėginio RAPD-PGR reakcija bus vykdoma 25 μl tūryje. RAPD-PGR sudėtis vienai reakcijai pateikiama lentelėje.



10 X Taq buferis 2,5 μl 25mM MgCl2 3,0 μl 2mM dNTP 2,5 μl Pradmuo (1 o.v.) 1,0 μl Taq DNR polimerazė 0,2 μl DNR∗ 2,0 μl Dejonizuotas H2O 13,8 μl ∗ skirtingų augalų DNR mėginiai į kiekvieną mėgintuvėlį pilami atskirai. Kadangi bus atliekama 30–50 PGR reakcijų su tuo pačiu pradmeniu, bendro mišinio sudėtis apskaičiuojama lentelės duomenis pa-dauginus iš DNR mėginių skaičiaus. Paruoštą mišinį gerai sumaišyti, trumpai nucentrifuguoti ir supils-tyti po 23 μl į 0,5 ml mėgintuvėlius. DNR mėginiai (po 2 μl, 50 ng) įpilami į kiekvieną mėgintuvėlį at-skirai. Prieš amplifikaciją šie mėginiai trumpai nucentrifuguojami.

RAPD-PGR atliekama termocikleryje pagal specialią programą. 1. Pirminė DNR denatūracija 94°C 5 min. 2. DNR denatūracija 94°C 1 min. 3. Pradmenų prilipimas 35°C 1 min. 4. DNR sintezė 72°C 2 min. 5. Baigiamoji DNR sintezė 72°C 5 min. 2↔4 žingsniai kartojami 40 ciklų.

• Po reakcijos mėgintuvėlius su PGR produktais laikyti šaldytuve (+ 4° tempera-tūroje) iki kitos analizės.

2.2.1. RAPD-PGR produktų atskyrimas agarozės gelyje ir rezultatų dokumentavimas

Darbo tikslas Įvertinti RAPD-PGR rezultatus agarozės 1,5 proc. gelyje elektroforezės būdu, do-

kumentuoti rezultatus bei nustatyti pagausintų DNR fragmentų dydį.

Prietaisai ir priemonės Mikrocentrifuga „Eppendorf 5424“. Svarstyklės. Elektroforezės aparatas. Nuolatinės srovės šaltinis. Mikrobangų krosnelė. „BioDocAnalyse“ gelių dokumentavimo sistema. Automatinės pipetės. Sterilūs antgaliai automatinėms pipetėms. Stoveliai mėgintuvėliams. Vienkartinės latekso pirštinės.

Tirpalai ir reagentai 10×TBE (890 mM Tris, 890 mM boro rūgštis, 20 mM EDTA) ir 1× TBE buferis.

1000 ml 10×TBE paruošti imama: 108 g Tris bazės, 55 g boro rūgšties, 40 ml 0,5 EDTA, pH 8,0.

28 |

Agarozė TopVisionTM. Etidžio bromido tirpalas (5 mg/ml). DNR užnešimo į agarozės gelį buferis (6×) (60 proc. glicerolis, 50 mM EDTA,

bromfenolio mėlis 0,25 proc.). DNR fragmentų dydžio standartas 0,1 μg/μl (GeneRuler™ 100bp DNA Ladder

Plus). Distiliuotas H2O. Darbo eiga • Paruošti 200 ml agarozės 1,5 proc. gelio: Agarozė 3 g TBE (10X) buferis 20 ml Distiliuotas H2O Iki 200 ml Pasverti 3 g agarozės, užpilti 20 ml 10×TBE buferio, pripilti distiliuoto H2O iki 200

ml ir sumaišyti. Mikrobangų krosnelėje pavirinti 2-3 min., keletą kartų pamaišyti iki visiš-kai išsilydys agarozė. Gelį atvėsinti apytiksliai iki 60°C temperatūros, po to įpilti 20 µl etidžio bromido tirpalo. Paruoštą agarozės tirpalą supilti į elektroforezės aparato gelio užpylimo rėmelį su šukomis ir laukti, kol gelis visiškai sustings.

RAPD-PGR mėginius išimti iš šaldytuvo ir paruošti elektroforezei. Į kiekvieną mėgintuvėlį su 25 µl PGR mišinio įpilti 5 µl (6X) DNR užnešimo bufe-

rio su bromfenolio mėliu. Mėginį sumaišyti. Sustingus agarozei, atsargiai ištraukti šukas iš gelio. Į šukų padarytus šulinėlius įpilti

paruoštus RAPD-PGR mėginius. Pageidautina, palikti kraštinius šulinėlius DNR frag-mentų dydžio standartui. Gelį su mėginiais atsargiai užpilti 1 × TBE buferiu, kad apsem-tų. Greta tiriamų mėginių į vieną ar abu kraštinius šulinėlius įpilti 4 µl DNR fragmentų dydžio standarto tirpalo (GeneRuler™ 100bp DNA Ladder Plus).

Elektroforezę vykdyti esant 4 V/cm režimui (120V įtampa, atstumas tarp elektro-dų – 30 cm) iki bromfenolio dažo linija pasieks gelio kraštą arba antrą šulinėlių eilę. Fos-foro rūgšties liekana suteikia DNR molekulėms neigiamą krūvį, todėl elektriniame lauke jos juda nuo katodo (neigiamo srovės šaltinio elektrodo) anodo (teigiamo elektrodo) link.

RAPD-PGR rezultatų dokumentavimas

Pasibaigus elektroforezei ir išjungus srovės šaltinį, agarozės gelis atsargiai išimamas iš kameros ir pernešamas ant transiliuminatoriaus. Jis yra viena iš gelių dokumentavimo sistemos − „BioDocAnalyse“ sistemos sudedamųjų dalių. Naudojant šią sistemą, galima fotografuoti ir analizuoti elektroforezės vaizdus.

Gelį reikia fotografuoti UV šviesoje. Nuotraukas su gautais rezultatais reikia išsau-goti kompiuteryje *.BD1 ir *.TIF formatais.

Nustatyti pagausintų DNR fragmentų dydį bazių poromis (bp) pagal DNR dydžio standartą GeneRuler™ 100bp DNA Ladder Plus, kuris duoda 14 skirtingo dydžio DNR fragmentų (bp):

3000, 2000, 1500, 1200, 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100.



Elektroforezės metu per tą patį laiką vienodą atstumą nukeliavę DNR fragmentai laikomi identiškais ir vadinami RAPD juostomis (RAPD aleliais, RAPD fragmentais). Kiekvieno atskiro DNR pavyzdžio RAPD juostų rinkinys vadinamas RAPD fenotipu.

Fragmentų dydžio nustatymą galima atlikti vizualiai lyginant DNR fragmentų dydžio standarto juostas su gautais RAPD-PGR produktais arba naudojant specialias programas. 2.2 paveiksle parodytas pagausintų RAPD-PGR metodu DNR fragmentų dydžio nusta-tymo darbalaukis.

2.2 pav. „BioDocAnalyse“ programos (Biometra, Vokietija), skirtos makromolekulių dydžio nustatymui ir elektroforezės rezultatų analizei darbalaukis. Nustatytas pagausintų RAPD-PGR metodu DNR fragmentų dydis, panaudojant DNR dydžio standartus Gene Ruler 100 bp DNA Ladder ir Gene Ruler 1 kb DNA Ladder („Fermentas“)

Literatūra: 1. Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. Vol. 3. New York:

Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. 2. MBI Fermentas. Molecular biology catalog & product application gide. 2006-2007. Avai-

lable at: http://www.fermentas.com/

30 |

2.3. Individų giminiškumo nustatymas pagal RAPD fenotipus naudojant kompiuterinę programą „TREECON v. 1.3b“

Tikslas Nustatyti genetinius atstumus tarp tirtų individų bei jų genetinį giminiškumą kom-

piuterine programa „TREECON“, pritaikyta „Windows“ aplinkai.

Užduotis Išanalizuoti RAPD-PGR rezultatų duomenis, apskaičiuoti genetinius atstumus tarp

tirtų individų, nubraižyti jų tarpusavio giminiškumo medį.

Darbo eiga • Surašyti kiekvieno tirto individo RAPD fenotipus į dvireikšmių požymių lentelę

ir paruošti bylą. Vienodo dydžio DNR fragmentų buvimas ar nebuvimas pagau-sinimo produktų spektruose žymimas atitinkamai:„1“ ir „0“. Po DNR pagausi-nimo kiekviename RAPD spektre matomas gana didelis juostų (DNR fragmen-tų) skaičius. Tačiau tolesnei analizei į dvinarių požymių lentelę imamos tik DNR juostos, atsikartojančios mažiausiai dvejuose nepriklausomuose eksperimentuo-se. Neaiškios, neatsikartojančios, blogai atsiskyrusios DNR juostos neanalizuo-jamos. Nerekomenduojama į lentelę traukti RAPD juostas, kurios mažesnės nei 0,25 kbp ir didesnės nei 2,5–3 kbp.

• Duomenis surašyti Notepad lange taip, kaip parodyta žemiau, ir bylą išsaugoti kompiuteryje, pavyzdžiui, pavadinimu A pavyzdys. seq

53 1 pavyzdys 11011101001011111011001010110011110101001010101011110 2 pavyzdys 11110101010110111011110011110111111001110010101111110 3 pavyzdys 11110101001111111011100110110011111101100111100111110 4 pavyzdys 11111001011011111011100011110111111101010111101011110 5 pavyzdys 11010101011111111011101011110011011001101010101110010 6 pavyzdys 11110101000011011011000111110011100001010000111011110 7 pavyzdys 11010101001010111011010110110011001001000001101111010 8 pavyzdys 11011101000011011111110011101111101101101100101011110 9 pavyzdys 11010101011010111011100111110011101001110100001111111 10 pavyzdys 11110101011010111011100011111111001001111110101111010 11 pavyzdys 11110101010011011010011011110111111001010101101111110 12 pavyzdys 11110001101011110111010110100111011001100010111011111 13 pavyzdys 11010011000011111011101010110111111101111111100011010 14 pavyzdys 11010101010011111111010011111111001001101010101011010



15 pavyzdys 11011101001111111011110110101111010001100110101011010 16 pavyzdys 11111101011011111011010011101011011001100111101011110 17 pavyzdys 11110101000011111011101011110011110001110010101010010 18 pavyzdys 11010011011011111011110011110111011011001010101011110 19 pavyzdys 11111101011011111011010010110111011011100110101111010 20 pavyzdys 1111110101-011111000010011101111111101100011101011110

Pastaba. Skaičius „53“ byloje atitinka nustatytų RAPD lokusų skaičių; X pavyzdys – individo kodas.

• „TREECON for Windows“ lange spausti Distance estimation mygtuką, o tada Start distance estimation.

Pasirinkti anksčiau išsaugotą bylą su RAPD duomenimis dvireikšmių požymių lente-lėje A pavyzdys. seq.

• Atsidaro Seguence type lentelė, kurioje reikia nurodyti RFLP/AFLP/RAPD data ir spausti OK.

32 |

• Atsidarius langui Select Sequence, reikia pasirinkti individus, kuriuos norite analizuoti. Šiuo atveju spausti Select All ir OK (bus palyginti visų 20 individų RAPD fenotipai).

• Atsidarius langui Options, spausti Nei and Li (1979); Bootstrap analysis ir OK. Šiuo atveju genetiniai atstumai tarp analizuojamų individų bus apskaičiuo-jami pagal Nei ir Li formulę. Kad vyktų butstrepų analizė, reikia Bootstrap lan-ge pasirinkti imčių skaičių. Tarkime, mes pasirenkame 100. Spaudžiame mygtuką OK. Lange Job Status pasirodžius Finished, paspausti OK.



• Norint nubraižyti analizuojamų individų giminiškumo medį pagal apskaičiuotus genetinius atstumus, pagrindiniame TREECON for Windows lange pasirinkti Infer tree topology ir Start inferring tree topology. Atsiradus Options lan-gui, spausti Clustering bei Bootstrap analysis ir OK.

34 |

• Pasirinkti klasterinės analizės metodą UPGMA arba WPGMA ir spausti OK. Dažniau naudojamas UPGMA, todėl pasirenkame jį. Job Status lange atsiradus užrašui Finished, spausti OK.

• Pagrindiniame TREECON for Windows lange pasirinkti Draw phylogenetic tree. Atsidarius Tree Drawing Program, pagrindiniame meniu pasirinkti File, tada Open ir (new) tree. Atsidariusiame Treecon lange matomas tirtų individų giminiškumo medis, gautas klasterių analizės metodu.

• Gautą medį galima apipavidalinti, naudojant įvairius įrankius, esančius meniu. Toliau rekomenduojama prie giminiškumo medžio pridėti genetinių atstumų skalę spaudžiant mygtuką Show ir Distance scale bei pasirinkus šrifto tipą ir skaitmenų dydį.

• Norint sužinoti butstrepų reikšmes bei juos pavaizduoti medyje, galima spausti mygtuką Show, po to bootstrep analysis arba Treecon įrankių juostos atitin-kamą ikoną.



• Atsidarius langui Bootstrap values, pasirinkti, kaip ir nuo kokio dydžio but-strepų reikšmes rodyti ant giminiškumo medžio šakų. Pasirenkame, pavyzdžiui, rodyti realias reikšmes nuo 20 ir spaudžiame OK.

• Paspaudus mygtuką OK, ant medžio šakų užrašomos butstrepų reikšmės, kurios ne mažesnės nei 20. Patikimomis laikomos tos giminiškumo medžio šakos, ku-rių butstrepų reikšmės didesnės arba lygios 60 proc. Mūsų pavyzdyje gauta di-džiausia butstrepų reikšmė yra tik 57 proc. (57 iš 100 imčių). Atliekant tyrimus, rekomenduojama imčių skaičių padidinti iki 1000.

36 |

• Norint sužinoti apskaičiuotų genetinių atstumų pagal Nei and Li (1979) skaiti-nes reikšmes, reikia eiti į „Windows“ operacinės sistemos Start meniu ir pasi-rinkus komandą Search paieškos lange įrašyti mat.out. Kompiuteris automatiš-kai suras bylą mat.out su vėliausiai atliktais genetinių atstumų skaičiavimo rezul-tatais.

Tree construction 20 0 0 2 0 (20f8.3) 24.638 0.000 16.216 14.667 15.493 21.212 23.077 22.222 15.493 12.329 13.889 23.944 22.222 17.143 21.127 17.808 14.706 16.667 15.068 16.667 18.841 16.216 0.000 14.667 18.310 24.242 20.000 25.000 18.310 20.548 22.222 23.944 16.667 28.571 18.310 17.808 20.588 25.000 17.808 21.127 17.143 14.667 14.667 0.000 22.222 22.388 27.273 20.548 19.444 16.216 15.068 25.000 15.068 23.944 22.222 13.514 18.841 15.068 16.216 13.889 18.182 15.493 18.310 22.222 0.000 30.159 22.581 27.536 20.588 14.286 24.638 29.412 21.739 16.418 20.588 20.000 13.846 15.942 17.143 26.471 21.311 21.212 24.242 22.388 30.159 0.000 22.807 25.000 20.635 26.154 18.750 26.984 31.250 25.806 30.159 26.154 16.667 28.125 29.231 28.125 23.333 23.077 20.000 27.273 22.581 22.807 0.000 30.159 19.355 21.875 23.810 25.806 30.159 21.311 22.581 21.875 28.814 23.810 18.750 29.032 22.388 22.222 25.000 20.548 27.536 25.000 30.159 0.000 24.638 21.127 22.857 27.536 22.857 14.706 18.841 18.310 27.273 22.857 23.944 17.143 27.273 15.493 18.310 19.444 20.588 20.635 19.355 24.638 0.000 14.286 21.739 29.412 27.536 25.373 26.471 22.857 23.077 24.638 22.857 29.412 26.471 12.329 20.548 16.216 14.286 26.154 21.875 21.127 14.286 0.000 21.127 28.571 21.127 13.043 20.000 16.667 19.403 18.310 13.889 22.857 25.373 13.889 22.222 15.068 24.638 18.750 23.810 22.857 21.739 21.127 0.000 30.435 22.857 23.529 30.435 18.310 21.212 22.857 18.310 17.143 27.273 23.944 23.944 25.000 29.412 26.984 25.806 27.536 29.412 28.571 30.435 0.000 30.435 22.388 20.588 20.000 29.231 21.739 20.000 23.529 19.403 22.222 16.667 15.068 21.739 31.250 30.159 22.857 27.536 21.127 22.857 30.435 0.000 23.529 24.638 26.761 18.182 20.000 23.944 25.714 23.077 17.143 28.571 23.944 16.418 25.806 21.311 14.706 25.373 13.043 23.529 22.388 23.529 0.000 19.403 15.942 21.875 14.706 15.942 17.647 21.212 21.127 18.310 22.222 20.588 30.159 22.581 18.841 26.471 20.000 30.435 20.588 24.638 19.403 0.000 14.286 23.077 21.739 14.286 20.588 20.588 17.808 17.808 13.514 20.000 26.154 21.875 18.310 22.857 16.667 18.310 20.000 26.761 15.942 14.286 0.000 22.388 18.310 11.111 8.571 17.460 14.706 20.588 18.841 13.846 16.667 28.814 27.273 23.077 19.403 21.212 29.231 18.182 21.875 23.077 22.388 0.000 24.242 22.388 24.242 19.403 16.667 25.000 15.068 15.942 28.125 23.810 22.857 24.638 18.310 22.857 21.739 20.000 14.706 21.739 18.310 24.242 0.000 15.493 21.739 20.588 15.068 17.808 16.216 17.143 29.231 18.750 23.944 22.857 13.889 18.310 20.000 23.944 15.942 14.286 11.111 22.388 15.493 0.000 17.143 21.212 16.667 21.127 13.889 26.471 28.125 29.032 17.143 29.412 22.857 17.143 23.529 25.714 17.647 20.588 8.571 24.242 21.739 17.143 0.000

• Norint šioje lentelėje rasti genetinius atstumus tarp konkrečių individų, reikia at-siminti, kad individų išdėstymo tvarka stulpeliuose (iš viršaus žemyn) prasideda nuo 2-ojo pavyzdžio, o eilutėse (iš kairės į dešinę) nuo 1-ojo pavyzdžio. Pateik-tas skaitines reikšmes reikia padalyti iš 100, norint gauti tikrus atstumus tarp konkrečių individų. Pavyzdžiui, genetinis atstumas tarp 1-ojo ir 2-ojo pavyzdžio lygus 24, 638: 100 = 0,24638 arba 24,6 proc.

Literatūra 1. Van de Peer Y, De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the

construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environ-ment. Comput Appl Biosci 1994;10(5):569-70.

2. Salemi M, Vandamme AM, editors. The phylogenetic handbook. A practical approach to DNA and protein phylogeny. Cambridge: Cambridge University Press; 2003. p. 115-8; 203-51.

TREČIAS LABORATORINIS DARBAS


Trečias laboratorinis darbas

3.1. GDH (glutamato dehidrogenazės) polimorfizmas ir jo palyginimas augaluose: pašarinių pupų Vicia faba L. veislėje ‘Nida’, miežių veislėje ‘Auksiniai3’ ir baltažiedyje vairenyje Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

3.1.1. Įvadas. Teorinė dalis

1966 m. įrodytas biocheminis polimorfizmas gamtinėse populiacijose (Harris, 1966; Lewontin, 1966). Šiuo metu polimorfizmas traktuojamas griežtai genetiniu požiūriu. Nors konservatyvių homologinių baltymų aminorūgščių seka išlieka evoliucijos eigoje nepakitusi, daugelis baltymų (ypač fermentų) yra polimorfiški. Pagal Tarptautinės bio-chemikų sąjungos Fermentų nomenklatūros komisijos (IUPAC-IUB, 1976) rekomenda-cijas visi baltymai, turintys tą patį substratinį specifiškumą ir išskirti iš tos pačios rūšies individų, vadinami dauginėmis molekulinėmis fermento formomis (DMFF). „Izofermen-tų“ arba „izozimų“ terminas vartojamas tik genetiškai apspręstoms DMFF, esančioms tame pačiame organizme, pasižyminčioms panašiu arba tokiu pačiu substratiniu specifiš-kumu, bet besiskiriančioms kiekybiškai katalizinėmis ir kinetinėmis savybėmis (afinišku-mu substratui, reakcijos greičiu, fermento indukcija arba represija ir t. t.). DMFF atsira-dimo priežastys pateiktos lentelėje.

Grupė DMFF įvairovės priežastys Pavyzdys 1. Genetiškai nepriklausomi proteinai MDH mitochondrijose ar citoplazmoje 2. Dviejų ar daugiau nekovalentiškai susijungusių polipeptidi-

nių grandinių kombinacija – heteropolimerai (hibridai) LDH hibridinės formos

3. Genetiniai variantai – alelofermentai (alelozimai, alozimai) Žmogaus G-6-P dehidrogenazė 4. Proteinai, susijungę su kitomis grupėmis Fosforilazė b, glikogeno sintazė a 5. Proteinai, kilę iš vienos polipeptidinės grandinės Chimotripsinų šeima, kilusi iš chimot-

ripsinogeno 6. Polimerai, kilę iš vieno subvieneto GDH, mol.svoris 1000000–250000 7. Konformaciniai įvairių formų skirtumai Visi alosteriniai fermentų pokyčiai

Pirmos ir trečios grupės baltymų įvairovės priežastis – genetiškai determinuoti skir-

tumai pirminėje struktūroje. Izofermentų atsiradimą gamtoje lėmė genetinės ir epigene-tinės priežastys.

Biocheminio polimorfizmo genetinė determinacija

(a) Keli genetiniai

lokusai

DNR: lokusas A lokusas B Transkripcija ir transliacija Subvienetai: A B

(b) Daug alelių viename lokuse (polialelizmas)

tėvinė alelis 1 DNR motininė alelis 2 Subvienetai A1 A2

38 |

Daugelį fermentų koduoja keli genai (a), kurių kiekvienas kontroliuoja atskiro sub-vieneto susidarymą. Keli lokusai, apsprendžiantys atitinkamo fermento izoformas, teoriš-kai evoliucijoje galėjo atsirasti divergencijos keliu, t. y. įvykus geno-pirmtako, koduojan-čio atitinkamą polipeptidinę grandinę, duplikacijai (I) ar amplifikacijai (II), vėliau vyko šių genų mutacinė ar rekombinacinė divergencija (III):

Duplikacija

MutacijaGenas - Pirmtakas

Amplifikacija

I

II

X

III

h√

Polipeptidai

a á

AA

AB

BB

Izofermentai A B

Pavyzdžiui, augalų katalazės – CAT (EC 1.11.1. ) genų divergenciją evoliucijoje ga-lima paaiškinti lyginant jų egzoninę-introninę struktūrą (3.1 pav.). Katalazės genas – pirmtakas sudarytas iš 8 egzonų ir 7 intronų. Manoma, kad, atsiskyrus vienskilčiams ir dviskilčiams, vyko nuosekli geno – pirmtako duplikacija intronų netekimo keliu ir dėl to atsirado trys katalazės izofermentų genai.

Vieno fermento kelių genetinių lokusų ekspresija reguliuojama nepriklausomai, todėl vienose ląstelėse gali vykti vieno subvieneto, kitose – kito sintezė. Kelių genetinių lokusų kontroliuojamas biocheminis polimorfizmas yra izofermentinio profilio kitimo įvairiuose audiniuose, taip pat tame pačiame audinyje ontogenezės eigoje, augimo ir vystymosi metu prielaida (3.6 pav.). Nors kelių genetinių lokusų produktų struktūra žymiai skiriasi (pasi-keičia atskiros aminorūgštys, vyksta delecijos, insercijos ir t. t.), kiekvienas subvienetas pasižymi dideliu struktūros konservatyvumu per visą evoliucijos procesą, tačiau nuo ge-no-pirmtako sudvigubėjimo momento kiekvienas subvienetas pradėjo keistis ir davė pra-džią divergencijai.

Acquaah (Acquaah, 1992) išskiria keturis genetinius biocheminio polimorfizmo su-sidarymo mechanizmus-schemas:

a) multilokusų sistema I: skirtingi genai koduoja nepriklausomus proteinus, pasi-žyminčius tuo pačiu fermentiniu aktyvumu. Šie genai yra branduolyje, tačiau jų koduojami produktai aptinkami įvairiose ląstelės vietose;

b) multilokusų sistema II: šis mechanizmas panašus į pirmąjį, išskyrus tai, kad šių genų koduojami fermentai yra polimeriniai ir jų subvienetus apsprendžia daugiau nei vienas lokusas;

c) multilokusinė-polimerinė sistema: šiuo atveju keleto lokusų koduojami fermen-tai – tai keletas polimerų, pasižyminčių ta pačia subvienetine struktūra;

d) aloziminė sistema: tai alelinių genų koduojami izofermentai, kurie paveldimi pa-gal Mendelio dėsnius (Weeden 1983).

Daugelio augalų fermentus taip pat kontroliuoja keli genetiniai lokusai. Pavyzdžiui, augalų katalazės izofermentų susidarymą kontroliuoja nedidelė genų šeima. Azijoje augi-



namuose ryžiuose Oryza sativa aptikti trys katalazės genai (CatA, CatB, CatC), kurie yra ir kituose aukštesniuosiuose augaluose (pvz., kukurūzuose) (3.2 pav.).

Vairenio, pupų ir bulvių atsiskyrimas

Ankštinių augalų ir vairenio/ pupų/bulvių atsiskyrimas Ryžių ir miežių atsiskyrimas

dviskilčių ir vienaskilčių atsiskyrimas

1 2 3 4 5 6 7

genas

genas

-6

3--2,5,6

-3,4

-4

3.1 pav. Tikėtinas augalų katalazės geno divergencijos kelias evoliucijoje. Egzonai pažymėti raidėmis A – H, intronai – skaičiais nuo 1 iki 7. Rombai linijų susikirtimo taškuose rodo momentus, kai įvyko geno duplikacija. Skaičiai su minuso ženklu kvadratuose rodo skaičių intronų, kuriuos prarado genai divergencijos metu (ss.abr.affrc.go.jp./.../GeneticResourses2/0403)

CAT-2

CAT-3

CAT-1

3.2 pav. Kukurūzų gemalo katalazės izofermentai (Guan ir Scandalios, 1995) Kviečiuose identifikuota 11 peroksidazės (EC 1.1.1.17) izofermentų, kuriuos kontro-

liuoja keletas lokusų , cukranendrės veislėse – iki 12 izofermentų (3.3 pav.). Malato dehidro-genazės – MDH (EC 1.1.1.3.7) izofermentus kukurūzų diegamakštėje koduoja penki struk-tūriniai genai ir vienas genas, kuris modifikuoja mitochondrinės MDH elektroforezinį jud-rumą ir t. t. Vyšnioje Prunus avium L. aptiktas daugelio fermentų polimorfizmas (3.4 pav.).

Brazilijoje augančios dažinės urlijos (Bixa orellana L.) 6-fosfogliukozės dehidrogena-zės (6-PGDH) izofermentus koduoja 3, superoksido dismutazės (SOD) – 3, o diaforazės (DIA) – 2 lokusai (3.5 pav.).

40 |

P12 P11 P10 P9

P8P7P6P5P4P3 P2P1

3.3 pav. Peroksidazės (P) izofermentai įvairiose cukranendrės veislėse (Manjunatha ir kt., 2003)

3.4 pav. Kai kurių fermentų polimorfizmas vyšnioje (Prunus avium L.). IDH – izocitrato de-hidrogenazė, 6PG – fosfogliukozės dehidrogenazė, ACO – akonitazė, GOT – glutamato ok-salo transaminazė, PGI – fosfogliukozės izomerazė, MDH – malato dehidrogenazė, AP – alanino aminopeptidazė, SKD – šikimato dehidrogenazė, PPO – polifenolio oksidazė, PGM – fosfogliukomutazė (Kownatzki, 2002)



(a) (b)

(d) (c)

Rf

Rf

Rf

Rf

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 G M ME IDH ACP L P AD SK

0,8 0,60,40,2 0

1 2 3

0,4 0,3 0,2 0,1 0

0,50,40,30,2 0,1 0

1 2 3 4 5

Sod -1

Sod -3

fenocipai

fenocipai fenocipai

Dia-1 Dia- 2

6Pgdh-1 6Pgh-2

6Pgh-3

3.5 pav. Dažinės urlijos (Bixa orellana L.) izofermentų diagramos: a) – monomorfiniai izo-fermentai: G (glutamato dehidrogenazė), M (malato dehidrogenazė), IDH (izocitrato dehid-rogenazė), ACP (acetilo fosfotazė), L (leucino amino peptidazė), P (peroksidazė), AD (alko-holio dehidrogenazė), SK (šikimato dehidrogenazė); b) – SOD; c) - 6-PGDH; (d) – DIA (Bodrigues ir kt., 2005)

SOD CAT

- CAT 2

- CAT 3

- CAT 1

- CAT 2

- CAT 1

- CAT 2

- CAT 3

- CAT 1

ALEU PERE KOL SC10-

+ CuZnSOD-1 (Chl)

CuZnSOD-2 (Cit)

MnSOD-3 (Mit)

CuZnSOD-4/4A (Cit)

CuZnSOD-5 (Cit)

3.6 pav. Kukurūzų superoksido dismutazės (SOD) ir katalazės (CAT) polimorfizmo priklau-somumas nuo organų ir audinių (endosperme – E, koleoptilėje – KOL, aleurono grūdeliuo-se – ALEU, peroksisomose – PER) (Scandalios, 2005) Daugelio baltymų polimorfizmą apsprendžia polialelizmas. Naujų alelių, lemiančių

genetinio kintamumo išplitimą, šaltinis – spontaninis mutacinis procesas. Tam tikros rūšies individe polialeliai negali užtikrinti didelės fermentų formos įvairovės, bet alelių skaičius visame rūšies genofonde pakankamai didelis, dėl to baltymų subvienetų variabi-lumas taip pat didelis. Jei lokusas aktyvus, tai abu aleliai koduoja atitinkamą fermento subvienetą. Dažniausiai abu aleliai veikia kodominantiškai. Šiuo atveju homozigotiniuose individuose vyks vieno tipo subvienetų sintezė, o heterozigotiniuose – dviejų. Tokių sub-

42 |

vienetų struktūros skirtumai nedideli: polipeptidai skiriasi atskiromis aminorūgštimis. Polialelinių izofermentų variantų paieškoms augaluose labai svarbūs buvo Allard ir jo mokinių darbai (Allard ir kt., 1978). Pavyzdžiui, buvo nustatyta, kad kukurūzų esterazės - EST (EC 3.1) lokusas Est1 turi 7 alelius, iš kurių trys būdingi Šiaurės Amerikos kukurūzų linijoms, du – Meksikos ir du – Kolumbijos (Schwartz, 1967), alkoholio dehidrogena-zės – ADH (EC 1.1.1.1) lokusas Adh-4 alelius ir t. t.

1

gdh2

GDH1 GDH2

2 3 4 5 6 7

1234567

GDH

Kukurūzai Natyvus

gelis

gdh1

W M

Augalų GDH izofermentai

Glutamatas + NAD+ + H2O 2-oksoglutaratas + NH3 + NADH + H+

Kukurūzų GDH – heksameras, kurį koduoja du lokusai gdh1 ir gdh2. Elektroforegramoje po substratinio dažymo išryškėję 7 GDH izofermentai.

3.7 pav. Kukurūzų GDH izofermentų genetinė determinacija (Magalhaes ir kt., 1990) Pagrindiniai epigenetiniai mechanizmai, sąlygojantys biocheminio polimorfizmo at-

siradimą: po – transliacinės duplikacijos; po – transliacinės delecijos; po – transliaciniai konformaciniai pokyčiai. Izofermentų rinkiniai Daugelis fermentų yra oligomerai. Jei ląstelėje yra dviejų ir daugiau tipų genetiškai

determinuotų fermentų subvienetų, jie gali atsitiktinai susijungti, sudarydami atitinkamą izofermentų rinkinį, t. y. izofermentų skaičius priklausys nuo oligomero struktūros. Daž-niausiai pasitaiko dimerai, tetrametrai ir heksamerai, pvz., jei ląstelėje yra dviejų tipų sub-vienetai, galintys jungtis į dimerą, tai mažiausiai vienas izofermentas bus hibridinis – ku-kurūzų ADH – dimeras, kurio izofermentiniame spektre yra du homodimerai ir vienas heterodimeras:



3 Adh2/Adh2 homodimeras

2 Adh1/Adh2 heterodimeras

1 Adh1/Adh1 homodimeras

Hibridiniai izofermentai (heterooligomerai) pagal fizines ir chemines savybes užima tarpinę padėtį tarp homooligomerų. Esant daugiau kaip dviem subvienetų tipams, izo-fermentų skaičius bus didesnis (3.7 pav.). Tetramerinė fermento struktūra ir atsitiktinė subvienetų hibridizacija sąlygotų 15 izofermentų, iš kurių 12 būtų hibridiniai. Vaizdas būtų dar sudėtingesnis vykstant intrageninei ir intergeninei komplementacijai. Jei alelinių ir nealelinių genų produktai atsitiktinai hibridizuojasi in vivo, galimas izofermentų skaičius (i) apskaičiuojamas pagal formulę:

( )( )

S+n-1i =

n! S-1 !;

n – subvienetų skaičius fermento molekulėje, S – subvienetų tipų skaičius Izofermentų rinkinių sudėtingumą riboja tai, kad ne visi lokusai ląstelėje funkcionuoja

vienu metu. Kiekybiškai, t.y. pagal fermentų aktyvumą, izofermentų spektras priklausys nuo sintetinamų subvienetų santykio. Dažniausiai pasitaiko binominis pasiskirstymas – (p +q)n, p – vieno tipo subvienetų dalis, q – kito tipo subvienetų dalis, n – subvienetų skaičius mo-lekulėje. Esant tokiam izofermentų aktyvumo pasiskirstymui, daroma išvada, kad yra vie-noda genetinių lokusų arba alelių ekspresija , o subvienetai atsitiktinai hibridizuojasi.

Elektroforezinis judrumas Tiriant izofermentus elektroforeziniais metodais, analizuojami tik tie aleliai, kurie są-

lygoja izofermentus besiskiriančius elektroforeziniu judrumu. Daugiau nei 30 proc. muta-cijų (taškinių, nonsens) neaptinkama.

Santykinis judrumas – Rf = f/b x 100 (3.8 pav. B), Absoliutus judrumas – Ra = f/l x 100, f – tiriamos frakcijos nueitas kelias, b – bromfenolio nueitas kelias, l- gelio ilgis (nuo

starto iki gelio apatinės ribos). Proteinų molekulių mišinys, veikiamas elektros lauko (3.9 pav.) , juda gelyje (poliak-

rilamido, krakmolo ir kt.). Molekulių atskyrimas vyksta dėl: formos, dydžio, krūvio (3.8 pav. A).

A B

pagal: 1. krūvį

2. dydį

3. krūvį + dydį

4. krūvį/dydį

A B C D anodas +

-katodas

kontrolė NaCl C M P V C M P V

Rf

0,13 0,18 0,21 0,25 0,27 0,28 0,29 0,31 0,35

0,39 3.8 pav. A – baltymų judėjimo bei atskyrimo elektros lauke schema; B – baltažiedžio vairenio GDH izofermentų santykinis judrumas (Rf) po poveikio įvairiomis NaCl koncentracijomis

44 |

srovės šaltinis

-

+

pavyzdyskoncentruojantis

gelis

atskiriantysis gelis

Tris (+) Glicinas (-) buferis

Tris (+) Cl (-) buferis

3.9 pav. Elektroforezės apibendrinta schema

3.1.2. Glutamato dehidrogenazė augaluose

Glutamato dehidrogenazė (GDH) – vienas iš fermentų, katalizuojančių amonio jo-nų (NH4+) įsijungimą į organinius junginius redukcinio amininimo reakcijose:

oksalo acetatasCukrūs5 genai

3 genai

4 genai

2 genai

Aspartatas Asparaginas

3 genaiAS

AsAT

GOGAT

GS

2 genai

GDH

GDH

Glutamatas

Glutamatas

Glutamatas

2-oksoglutaratas

Glutaminas

2-oksoglutaratas

NH4+

NH4+

NH4+

GlutamatasNH4+ + α-ketoglutaratas

NADPH + H+

NADH + H+ NAD+

NADP+

2-oksoglutaratas

Ši reakcija yra pagrindinis α-aminogrupės donoras susidarant aminorūgštims bei pu-

rinams. Toliau vykstant kitų aminorūgščių sintezei, glutamato aminogrupė pernešama transamininimo keliu. Šis azoto apykaitos kelias glaudžiai sieja angliavandenių apykaitą su aminorūgščių ir baltymų apykaita. Šiuo metu kaupiasi vis daugiau įrodymų apie GDH vaidmenį abiotinio streso metu (Skopelitis ir kt., 2006). Yra žinomos šios GDH formos:

NAD(P)H – specifinė – GDH2 (EC 1.4.1.2) (Botton ir kt., 1983); NAD(P)+/NAD(P)H – GDH3 (EC 1.4.1.3) (Maulik ir kt., 1986); NAD(P)+ – specifinė - GDH4 (EC 1.4.1.4) (Dunkan ir kt., 1992). Visos GDH formos pasižymi polimorfizmu, kuris priklauso nuo augalo organų ir

audinių, kuriuose lokalizuotas šis fermentas (Loulakakis ir kt. 1996). Be to, GDH pasi-žymi biocheminiu polimorfizmu ir nediferencijuotoje ląstelių kultūroje – kaliuje (Kleizai-tė, 1991). 1973 m. Hartman netgi išskyrė du organospecifinius GDH izofermentų rinki-nius: GDH I lokalizuota sėklose, o dygimo metu – sėklaskiltėse ir jaunuose daiguose;



GDH II būdinga šaknims ir seniems daigams. Tiriant atskirų GDH formų savybes, jų akty-vumo reguliavimą in vivo įvairiais azoto šaltiniais (3.10 pav.), nustatyta, kad kiekviena jų at-lieka tik jai būdingas funkcijas, pvz., tabako mitochondrijose, kur vyksta aktyvūs deamini-nimo procesai, dalyvauja NAD(P)H – GDH, o chloroplastuose katalizuojama amininimo reakcija, kurioje aktyvesnė NAD(P+) – GDH, šaknyse aktyvesnė GDH 1 izoforma ir t. t. (Skopelitis ir kt., 2006, Fontaine ir kt., 2006)

Azoto šaltinio įtaka vynuogių stiebų kaliaus GDH izofermentams: a) 20 mM KNO3, b) 20 mM KNO3+10 mM NH4Cl, c) 10 mM NH4Cl, d) 10 mM glutaminas, e) 10 mM glutamatas

1 2

3 4

5 6

7

a b c d e

3.10 pav. Vynuogių stiebų kaliaus GDH polimorfizmas (Loulakakis ir Roubelakis-Angelakis, 1991) GDH klasifikuojama į atskiras šeimas priklausomai nuo polipeptidinės grandinės il-

gio ir subvienetų skaičiaus (Minambres ir kt., 2000). GDH2 yra dimeras (van Laere, 1988), tetrameras (Meredith ir kt., 1978) arba heksameras (Chavez ir kt., 1991); GDH3 – heksameras (Moyano ir kt., 1992), GDH4 – tetrameras (Hudson ir kt., 1993) arba hek-sameras (Park ir kt., 1998). (3.7 pav.)

3.1.3. Eksperimentinė dalis

Darbo tikslas Išskirti GDH iš pupų, miežių bei baltažiedžio vairenio lapų ir išfrakcionuoti po-

liakrilamido gelyje (PAAG). Darbo objektas, augalų auginimas Baltažiedis vairenis (Arabidopsis thaliana L. Heynh), pašarinės pupos (Vicia faba L.),

veislė ‘Nida’, miežių veislė ‘Auksiniai3‘. Visi augalai daiginami šiltnamyje, temperatūra – nuo + 200C iki + 250C, apšvietimas – 5–15 tūkst. lx 14–16 val. per parą. Augalai augina-mi smėlio ir lapinės žemės mišinyje (2:1), gausiai laistomi. Fermentas išskiriamas iš pupų daigo dviejų viršutinių lapų, iš miežių daigo viršutinio lapo ir baltažiedžio vairenio lapų, pasiekusių rozetės stadiją.

Pagrindinė įranga 1. Maitinimo šaltinis, kuris generuoja pastovią srovę elektroforezės metu. 2. Vertikalios elektroforezės aparatas, kurį sudaro:

− platininiai elektrodai; − kameros elektrodiniam buferiui; − rėmeliai nešėjui, kurių kiekvieną sudaro korpusas ir du stiklai, įvairių ilgių ir

storių gumelės − standartinės „šukutės“ mėginių užnešimo vietoms suformuoti gelyje;

46 |

− šaldymo sistema/šalta (+ 4oC) patalpa. Medžiagos A. Poliakrilamido (PAA) geliui gaminti : akrilamidas – AKA, N,N‘-metilen-bis-

akrilamidas – bis-AKA, Tris–(hidroksimetil)-aminometanas – Tris, N,N,N‘,N‘-tetrametilendiaminas – TEMED, amonio persulfatas – AP

Tinkamiausias GDH biocheminiam polimorfizmui tirti yra vidutinio poringumo 6,5 proc., 1,5 mm storio gelis, kuris atskiria 104–106 molekulinės masės baltymus.

1. AKA 6,5 proc. tirpalas: 26 g akrilamido, 0,8 g bis-AKA, distiliuotas vanduo iki 100 ml. Tirpalas laikomas tamsoje, + 4oC temperatūroje apie 1 mėn.

2. 48 ml 1N HCl; 36,6 g Tris; 0,46 ml TEMED; distiliuotas vanduo iki 100 ml, pH 8,9.

3. 0,14 g amonio persulfato (AP). Vandeninis AP tirpalas neatsparus, dėl to jį bū-tina gaminti kas savaitę.

B. Elektrodinio buferio (pH – 8,3) sudėtis: 6,0 g Tris; 28,8 g glicinas; distiliuotas vanduo iki 1000 ml.

Kai buferio pH 8,3, Tris pasižymi gera buferine talpa, Cl jonai juda greičiausiai, gli-cinato – lėčiau (3.9 pav.).

Buferis laikomas + 4oC temperatūroje. Prieš naudojimą buferis skiedžiamas 10 kartų. C. 40 proc. sacharozės tirpalas. D. bromfenolio mėlis (BMF) – 1 mg/100 ml. E. 0,05 M Tris-HCl buferis, pH-7,0. F. 0,001 M ditiotreitolis.

Darbo eiga Ekstraktų paruošimas Augalų lapai (1g) homogenizuojami atšaldytame 0,05M Tris-HCl (1 ml), pH 7,0 bufe-

ryje (E) su 0,001 M ditiotreitoliu (F) ir ~1mg kvarcinio smėlio. Po homogenizacijos eks-traktas su sacharoze(~1 mg) centrifuguojamas 10 min. 10000 aps./min. greičiu, + 4oC temperatūroje. Supernatantas (grubus ekstraktas) naudojamas natyvioje gel- elektroforezėje.

PAAG ir elektroforezės aparato paruošimas Paruošiami rėmeliai geliui polimerizuoti (3.11 pav.): erdvė geliui formuojama tarp

stiklų dedant 1,5 mm storio atskyriklius ir atitinkamo storio gumines tarpines, stiklai gerai įtvirtinami korpuse, užsandarinami visi nereikalingi plyšiai.



pavyzdysBuffer

Buffer

dideli baltymai

maži baltymai

koncentruojantis gelis

stiklinės plokštelės

stiklų atskyriklis

3.11 pav. Rėmeliai užpildyti geliu, įstatyti į kameras, kurios užpildytos Tris-glicino buferiu (schema). Tirpalai (A – 1, 2, 3) polimerizacijai atšildomi iki kambario temperatūros; prieš su-

maišant tirpalus, būtina dar kartą nustatyti tirpalo A-2 pH. Jis būtinai turi būti 8,9.

Eil. Nr. Gelio komponentai pH Atskirų dalių santykis 100 ml tirpalo

1. A - 2 8,9 1 2. A - 1 2 3. A - 3 4 4. Distiliuotas vanduo 1

Akrilamido ir bis-akrilamido polimerizacijos reakcija

AKA bis-AKA

CH2=CH CH2=CH -CH2-CH-CH2 - CH-CH2-CH- | | | | | C=O→ C=O C=O C=O C=O + | | | | | NH NH2 NH2 NH NH2 | | CH2 CH2 | | NH NH2 NH2 NH | | | | C=O C=O C=O C=O | | | | CH2 = CH -CH2- CH-CH2-CH2-CH-CH2-CH

TEMED i = S2O8- + (CH3)2-N-CH-CH2-N(CH3)2, i – reakcijos iniciatorius (amonio arba kalio persulfatas), katalizatorius – TEMED,

bis-AKA – „susiuva“ AKA tiesinius polimerus.

Paruoštus rėmelius, atsargiai užpildyti geliu, įkišti šulinėlių formavimo „šukutes“ (1,5 mm storio). Svarbu, kad šulinėlių formavimo metu neatsirastų oro burbuliukų ties „šuku-tėmis“. Įstatyti paruoštus rėmelius į elektroforezės aparatą (3.12 pav.). Polimerizacija trunka nuo 20 iki 30 min.

48 |

3.12 pav. Paruoštų rėmelių, užpildytų geliu, įstatymas į elektroforezės aparatą PAA gelio polimerizacijos pabaiga vizualiai matoma, nes gerai matyti susiformavę

takeliai. Sandariai įstačius rėmelius į elektroforezės kameras, atsargiai ištraukiamos šukutės,

kameros užpildomos elektrodiniu buferiu B, kuris skiedžiamas 10 kartų. Prieš skiedimą būtina dar kartą patikrinti buferio – pH 8,3. GDH elektroforezė vyksta be koncen-truojančiojo gelio, nes praktika rodo, kad vaizdas po elektroforezės nesikeičia naudo-jant vien tik skiriamąjį gelį. Prijungiami elektrodai: migracija vyks nuo katodo link anodo (3.9, 3.11, 3.12 pav.). 30 min. vyksta preelektroforezė esant 200 V įtampai. Preelektrofo-rezės metu išstumiamas AP, kuris gali veikti fermentus. Pasibaigus preelektroforezei, dar kartą reikia patikrinti, kad takeliuose nebūtų oro burbulų ir į takelius įterpti po 20 – 25 μl supernatanto, kurio tankį padidina sacharozė (C). Būtina kruopščiai žymėti protokolų sąsiuvinyje, kokio augalo ekstraktą įterpiame į atitinkamą takelį. Judantis frontas dažomas BFM (D), kurio keletą lašų įlašiname į elektrodinį buferį. Elektroforezės metu BFM koncentruojasi ir juda siauros juostos pavidalo. Tai lyderinis dažas, kurio migracijos greitis didesnis nei frakcionuojamų sistemų. Vėl įjungiama elektros srovė, pusę valandos apie 20 mA (dvylikos takelių geliui), po to – 40 mA.

Po BFM išėjimo iš gelio elektroforezę reikia vykdyti dar apie 1,5 val.

Izofermentų lokalizacija gelyje po elektroforezės

Dehidrogenazių dažymas. Po elektroforezės izofermentų lokalizacija nustatoma specifinio dažymo metu. Kiekybiniam ir kokybiniam dehidrogenazių įvertinimui naudo-jamos tetrazolio druskos. Tetrazolio druska (TNM) redukuojasi prijungdama elektronus ir išryškėja vandenyje netirpstantis formazanas, kurio nuosėdos ir rodo fermento lokali-zaciją:

E + S ES E + P PMS NAD+ NADH NAD+ TNM Formazanas

E – fermentas, S – Na-glutamatas – substratas, P – α-ketoglutaratas, PMS – fena-zinmetasulfatas



Po elektroforezės elektrodinis buferis iš kamerų išpilamas, iš rėmelio ištraukiamos tarpinės ir atskyrikliai. Stiklai su geliu merkiami į indą su distiliuotu vandeniu, kur atski-riamas gelis nuo stiklų leidžiant vandens srovelę į tarpą tarp stiklo ir gelio. Procedūrą būtina atlikti vandenyje, nes tuomet nepažeidžiamas gelis. Gelis dedamas į dažymui skirtą vonelę ir užpilamas dažais:

GDH dažų komponentai 100 ml tirpalo Jų koncentracija, M Kiekis tirpale, ml NAD 60 mg 0,01 8,14 (nikotinamidadenindinukleotidas) NBT 30 mg 0,01 3,66 (nitrotetrazolio mėlis) PMS 2 mg 0,01 0,64 (N-metilfenazinmetasulfatas) PO43- pH 7,0 25 mg 0,5 26 Na-glutamatas 16,9 mg 0,5 5 Distiliuotas vanduo iki 100 ml 60

Substrato – Naglutamato – paruošimas: Na - glutamatas 16,9 g; 0,5 M fosfatinis buferis 100 ml, būtina sąlyga – pH 7,0. GDH ryškinimas pateikiamas pagal Schaw (Schaw, 1969) (3.13 pav.). Dažymo truk-

mė – apie 30 min. Po dažymo gelis išimamas iš dažų, perplaunamas distiliuotu vandeniu ir įmerkiamas į fiksacijos tirpalą – acto rūgštį 7 proc.

glutamo r.

GDH

ketoglutaratas

PMS

formazanas (mėlynas)

NBT (geltonas)

NAD(P)

NAD(P)H N+H+4

GDH1 GDH1/2

GDH2

3.13 pav. GDH izofermentų lokalizacijos vaizdas po gelio dažymo pagal Schaw Darbo rezultatai Po elektroforezės, remiantis vaizdu gelyje, būtina: 1. Palyginti visų trijų tirtų augalų GDH izofermentų spektrus ir įvertinti jų poli-

morfizmo skirtumus; 2. Išmatuoti ir palyginti polimorfinių augalų izofermentų judrumą gelyje.

Literatūra: 1. Acquaah G. 1992. Practical Protein Electrophoresis for Genetic Research. Dioscorides

Press, Portland, OR. 2. Allard RW, Kahler AL, Weir BS. The effects of selections on esteraze allozymes in bar-

ley population. Genetics 1972, 72: 489-503.

50 |

3. Coruzzi GM. Primary N-assimilation into Amino Acids in Arabidopsis. The Arabidopsis Book . 2003: 30.

4. Duncan PA, White BA, Mackie RI. Purification and properties of NADP-dependent glutamate dehydrogenase from Ruminococcus flavefaciens FD-1. Appl Environ Microbiol 1992, 58:4032-4037.

5. Fontaine J-X, Saladino F, Agrimonti C, Bedu M, Tercé-Laforgue T, Tetu T, Hirel B, Restivo FM, Dubois F. Control of the synthesis and subcellular targeting of the two GDH genes products in leaves and stems of Nicotiana plumbaginifolia and Arabidopsis tha-liana. Plant Cell Physiol 2006, 47: 410-418

6. Guan L, Scandalios J. Developmentally related responses of maize catalase genes to sa-lycilic acid. Proc Natl Sci. 1995, 92:5930-5934.

7. Hamrick JL, Godt MJ. Allozyme diversity in cultivated crops. Crop Science 1997, 37 (1): 26-30

8. Kleizaitė V, Žukas K. Organospecific prophiles of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh gluta-matdehydrogenase. Eksperimentinė biologija 1991, 1:26-27

9. Kownatzki D. Asexuelle und sexuelle reproduktion bei der Vögelkirsche (Prunus avium L.). Dissertation. 2002:1-122.

10. Loulakakis KA, Roubelakis-Angelakis KA. Plant NAD(H)-Glutamate Dehydrogenase Consists of Two Subunit Polypeptides and Their Participation in the Seven Isoenzymes Occurs in an Ordered Ratio. Plant Physiol. 1991, 97(1): 104–111.

11. Loulakakis KA, Roubelakis-Angelakis K. The seven NAD(H)-glutamate dehydrogenase isoenzymes exhibit similar anabolic and catabolic activities. Physiol Plant 1996, 96: 29–35

12. Magalhaes IR., Ju GC, Rich PJ, Rhodes D. Kinetics of 15NH4+ assimilation in Zea mays: preliminary studies with a GDH1 null mutant. Plant Pysiol. 1990, 94:647-656.

13. Manjunatha BR, Virupakshi S, Naik GR. Peroxidase isozyme polymorphism in popular sugarcane cultivars. Current Science 2003, 85 (9): 1347-1349.

14. Minambres B, Olivera ER, Jensen RA, Luengo JM. A new class of glutamate dehydro-genases (GDH). Biochemical and genetic characterization of the first member, the AMP-requiring NAD-specific GDH of Streptomyces clavuligerus. J Biol Chem 2000, 275:39529-39542

15. Moyano E, Cardenas J, Munoz-Blanco J. Purification and properties of three NAD(P)+ isozymes of L-glutamate dehydrogenase of Chlamydomonas reinhardtii. Biochim Biophys Acta 1992, 1119:63-68.

16. Park JH, Schofield PJ, Edwards MR. Giardia intestinalis : characterization of a NADP-dependent glutamate dehydrogenase. Exp Parasitol 1998, 88:131-138.

17. Rodrigues JF, de Carvalho P, Robinson IP, Alfenas AC. Isozymic variability in a Brazil-ian collection of annatto(Bixa orellana L.) Pesq. agropec. bras., Brasília. 2005, 40 (7): 653-660

18. Scanadalios JG. Oxidative stress: molecular perception and transduction of signals trig-gering antioxidant gene defenses. Brazilian J Med Biol Res. 2005, 38(7):9995.

19. Schaw CR. Isozymes: classification, frequency and significance. Int Rev Cytol 1969, 25:297-332.

20. Schwartz D. E1 esteraze isozymes of maize. On the nature of the gene-controlled varia-tion. Proc. Nat. Acad. Sci. 1967, 58: 568-575.

21. Skopelitis DS, Paranychianakis NV, Paschalidis KA, Pliakonis ED, Delis ID, Yakouma-kis DI, Kouvarakis A, Papadakis AK, Stephanou EG, Roubelakis-Angelakis KA . Abio-tic stress generates ROS that signal expression of anionic glutamate dehydrogenases to form glutamate for proline synthesis in tobacco and grapevine. Plant Cell 2006, 18: 2767-2781.

KETVIRTAS LABORATORINIS DARBAS


Ketvirtas laboratorinis darbas

4.1. DNR metilinimas: mechanizmas ir reikšmė

DNR metilinimas – vienas iš epigenetinių reiškinių, valdančių genų raišką. Žinduolių DNR metilinamas tik citozinas, einantis prieš guaniną (CpG dinukleotidas). Metilo grupė (CH3) jungiama prie anglies molekulės 5 pozicijoje, o metilo donoru ląstelėje tarnauja S-adenozilmetioninas (4.1 pav). Reakciją vykdo fermentai DNR metiltransferazės (Dnmt). Žmogaus genome nuo 70 iki 80 proc. visų CpG dinukleotidų yra metilinti, tačiau DNR metilinimas nėra atsitiktinis procesas. Apie 1 kb ilgio sekos, turtingos CpG dinukletidų, aptinkamos daugelio svarbių genų promotoriuose ar pirmajame egzone, niekada nemetili-namos. Šios sekos vadinamos CpG salomis. CpG salos sudaro tik 1 proc. genomo, bet jose telpa apie pusė visų nemetilintų CpG dinukleotidų. CpG saloms būdingas aktyvus chromatinas. Tačiau daugelis CpG dinukleotidų aptinkami ne CpG salose, bet laisvai pa-sklidę po visą genomą. Šie CpG dažniausiai yra metilinti ir susiję su neaktyviu chromatinu. Nustatyta, kad dauguma metilintų CpG kaupiasi judriuose genomo elementuose ir pasikar-tojančiose sekose. Spėjama, kad šiose zonose DNR metilinimas atlieka apsauginę funkciją.

2NHH

O

3

21

45

6

2NH3CH

O

3

21

45

6

SAM

DNMT

3SAM - CH

Citozinas 5 - Metilcitozinas

4.1 pav. DNR metilinimo reakcija DNR metilinimas yra mechanizmas, kuriam veikiant informacija apie genų raišką

perduodama iš ląstelės į ląstelę, joms dalijantis. DNR metilinimas ypač svarbus pradiniais organizmo vystymosi etapais. Ląstelėms diferencijuojantis nereikalingų genų promotoriai metilinami ir šių genų raiška nuslopinama, baltymas nesintezuojamas. Galimas ir grįžta-masis procesas. Ląstelei reikalingi genai gali būti demetilinami ir jų raiška atnaujinama. Kita svarbi DNR metilinimo funkcija yra nepageidaujamų genomo sekų inaktyvinimas. Judrūs genomo elementai, virusinių sekų intarpai, pasikartojančios sekos sudaro apie 40 proc. žmogaus genomo. Tyrimai rodo, kad DNR metilinimas yra esminis mechanizmas, slopinantis šių nepageidaujamų sekų veiklą.

DNR metilinimas dalyvauja genų imprintingo ir X chromosomos inaktyvinimo mo-ters ląstelėse valdyme. Abiem atvejais genų raiška vyksta tik nuo vieno alelio. Skirtingą alelių raišką reguliuoja DNR metilinimas reguliacinėse genų sekose, vadinamose DMR (angl. differentialy methylated region). Neaktyvaus alelio DMR metilinamas, todėl geno raiška nuo jo nevyksta. Kitas alelis lieka nemetilintas ir nuo jo sintezuojama iRNR. Inaktyvinant X chromosomą ir kai kuriuos imprintingo būdu reguliuojamus genus, didelę reikšmę turi kitas epigenetinis reiškinys – nekoduojanti RNR, kuri padengia neaktyviąją X chromo-somą ar geno lokusą.

52 |

Naujausi tyrimai parodė, kad daugelio ligų patogenezę lemia ne tik genetiniai, bet ir epigenetiniai veiksniai. Svarbių reguliacinių genų promotorių DNR metilinimo analizė tapo neatsiejama vėžio ir kitų žmogaus ligų tyrimų dalimi. DNR metilinimas gali būti tiriamas kokybiniais ir kiekybiniais metodais, o DNR metilinimo įtaka genų raiškai verti-nama tiriant iRNR sintezės kiekybinius pokyčius („tikrojo laiko“ PGR) arba kiekybiškai vertinant baltymų sintezę.

4.2. DNR metilinimo tyrimo metodai

DNR metilinimo tyrimo metodai pirmiausia skirstomi į vertinančius bendrąjį metil-citozino kiekį genome ir tiriančius specifinių DNR sekų (dažniausiai promotorių) metili-nimą. Be to, šie metodai gali būti kokybiniai arba kiekybiniai. Bendrajam metilcitozino kiekiui genome nustatyti naudojami efektyviosios chromatografijos metodai, kurie remia-si DNR hidrolize iki bazių, jų frakcionavimu ir metilcitozino kiekybiniu įvertinimu. Tokių metodų pavyzdžiai yra efektyvioji skysčių chromatografija, efektyviosios skysčių chroma-tografijos ir masės spektrometrijos derinys, efektyviosios kapiliarinės elektroforezės me-todas. Bendrasis metilcitozino kiekis gali būti nustatomas fermentiniais-cheminiais meto-dais. Vienas iš jų metilo grupės akceptoriaus analizė (angl. methyl-acceptor assay), pagrįsta tričiu žymėtos metilo grupės perkėlimu ant nemetilinto citozino CpG sekose naudojant bakterijų DNR metiltransferazę. Taip pat naudojamas fluorescencinis DNR žymėjimas chloracetaldehidu, pagrįstas chloracetaldehido kiekybine reakcija sudaryti fluorescenci-nius etenocitozino ir etenoadenino aduktus. Sukurtas ir hibridizacijos in situ metodas, kuriame naudojami metilcitozinui specifiniai polikloniniai ar monokloniniai antikūnai.

Metodai, kurie naudojami tirti specifines metilintas DNR sekas, skirstomi į bisulfi-tinius ir nebisulfitinius. Nebisulfitiniu metodu tiriant DNR sekų metilinimą, naudoja-mos restrikcijos endonukleazės, kerpančios DNR tam tikroje sekoje, priklausomai nuo DNR metilinimo būklės. Plačiausiai šiuo metu naudojami bisulfitiniai DNR metilinimo tyrimo metodai. Šių metodų svarniausias etapas – poveikis natrio bisulfitu. Natrio bisulfi-tas denatūruotoje DNR molekulėje nemetilintą citoziną paverčia uracilu. Metilintas cito-zinas lieka atsparus cheminei modifikacijai. Būtent bisulfitinė modifikacija sukuria skir-tumus tarp metilintų ir nemetilintų DNR sekų, kurios toliau analizuojamos įvairiais gene-tinės analizės būdais: sekoskaita, restrikcijos analize (angl. combined bisulfite restriction analysi, COBRA), metilinimui jautria vieno nukleotido ilginimo reakcija (angl. methylation sensitive single nucleotide primer extension, MS-SNuPE), metilinimui jautria DNR grandinės konfor-macijos analize (angl. methylation-sensitive single-strand conformation analysis, MS-SSCA).

Žinomų sekų DNR metilinimo analizei dažniausiai naudojamas metodas yra metili-nimui jautri polimerazės grandininė reakcija (angl. methylation sensitive PGR, MSP) ir jos modifikacijos: pusiau lizdinė, lizdinė, in situ hibridizacija, kiekybinė PGR. MSP meto-do populiarumą lėmė didelis metodo jautrumas. Analizei pakanka nedidelio DNR kiekio, o viena metilinta DNR aptinkama tarp tūkstančio nemetilintų DNR molekulių. Be to, metodas yra nesudėtingas, jam nereikia ypatingos įrangos ar įgūdžių.



1 etapas. DNR modifikavimas bisulfitu

Nemetilinta DNR Metilinta DNR

2 etapas. Metilinimui jautri PGR

1

2

3

4

U pradmenys ir nemetilinta DNR

M pradmenys ir nemetilinta DNR

U pradmenys ir metilinta DNR

M pradmenys ir metilinta DNR

3 etapas. Elektroferezė PAA gelyjeMėginys

MSP produktas

4.2 pav. Metilinimui jautrios polimerazės grandininės reakcijos (MSP) metodo darbo sche-ma. Pirmiausia visa tiriamoji genominė DNR mofikuojama bisulfitu, vėliau vykdoma PGR reakcija metilintai (M) ir nemetilintai (U) tiriamojo geno sekai taikant atrankius pradmenis. Reakcijos produktai vertinami atlikus elektroforezę poliakrilamido (PAA) gelyje Naudojant naujas technologijas DNR metilinimo pokyčiai gali būti analizuojami

daugelyje CpG salų vienu metu. Sukurti epigenominės analizės metodai, tokie kaip, CpG salų mikrogardelių analizė (angl. microarray), genomo restrikcinis skenavimas (angl. restric-tion landmark genomic scanning), pasirinktinio praimavimo PGR (angl. methyl arbitrary primed PGR) ir kiti.

4.3. DNR modifikavimas bisulfitu

DNR modifikavimas natrio bisulfitu yra esminis etapas, ruošiant DNR epigenetinei analizei. Pateikiamas bisulfitinio modifikavimo protokolas, parengtas pagal Clarck ir kt., 1994 ir Millar ir kt., 2002. Tyrimui gali būti naudojama DNR, išskirta iš šaldytų arba for-malinu fiksuotų, parafine impregnuotų audinių.

Būtina įranga ir priemonės: vakuuminis siurblys, stalinė mikrocentrifuga, stalinė purtyklė, pH metras.

Naudojami reagentai ir priemonės: DNR išskyrimo iš audinių ar skysčių rinki-nys, 3M NaOH, 10M NaOH, 10mM hidrochinonas, 2,3M Na metabisulfitas (pH 5), izopropanolis 80 proc., 70°C temperatūros sterilus vanduo, 5M amonio acetatas, gliko-genas, etanolis 96 ir 70 proc., DNR valymo kolonėlės Wizard DNA Clean-up sistema (Promega), benukleazinis vanduo.

54 |

Vienkartinės priemonės: mikromėgintuvėliai, antgaliai automatinėms pipetėms, vienkartinės pirštinės.

Darbo tikslas: paruošti navikinių audinių DNR metilinimo analizei. Darbo eiga Tiriamojo audinio DNR išskiriama naudojant komercinius rinkinius arba organinius

tirpiklius (fenolo-chloroformo metodas). Apie 1 µg DNR denatūruojama su 3M NaOH, inkubuojant termobloke 15 min. 37ºC temperatūroje. Toliau DNR veikiama 10 mM hid-rochinono ir 2,3 M 5pH Na metabisulfito mišiniu. DNR modifikavimui kiekvieną kartą naudojami naujai paruošti reagentai, tirpinant medžiagas, vengiama sąveikos su deguoni-mi. Mėgintuvėlis švelniai supurtomas ir centrifuguojamas. Siekiant išvengti garavimo ir mėginių oksidacijos, mėgintuvėlio paviršius padengiamas 2–3 lašais mineralinio aliejaus. Termobloke mėgintuvėliai inkubuojami 16-19 val. 50º temperatūroje. Optimali inkuba-vimo trukmė – 16 val., taip gaunama didžiausia modifikuotos DNR koncentracija. Ilges-nė inkubacijos trukmė ir aukštesnė temperatūra sukelia didesnį DNR skilimą.

Modifikuotos DNR nudruskinimui naudojamos specialios DNR valymo kolonėlės Wizard DNA Clean-up System (Promega). Nuo modifikuotos DNR mėginio greitu užšal-dymu (10 min 20ºC temperatūroje) pašalinamas mineralinio aliejaus sluoksnis. Visas mė-ginio kiekis sumaišomas su 1 ml DNA valymo buferio (DNA wizard cleanup, Promega) ir patalpinamas į valymo kolonėles vakuumo sistemoje (4.3 pav.). Per 1–2 min. esant 100–150 Hg mm slėgiui išvalyta DNR susikaupia kolonėlese, kurios dar praplaunamos 2 ml izopropanolio 80 proc. Kolonėlės perkeliamos į mikromėgintuvėlį be dangtelio ir centrifuguojama 2 min. 10000 aps./min. visiškam izopropanolio pašalinimui. Kolonėlės perkeliamos į naujus mėgintuvėlius. Į kolonėlės centrą lašinama 40 µl + 60–70ºC tempe-ratūros sterilaus vandens, palaukiama 1 min. po to centrifuguojama 1 min. 10000 aps./min. Kolonėlės išimamos, ištirpusi DNR lieka mėgintuvėliuose. Galutinei DNR modifikacijai DNR inkubuojama 15 min. + 37ºC temperatūroje su 4,5 µl 3M NaOH. Tirpalas neutralizuojamas 28 µl 10M amonio acetato. DNR išskiriama iš mišinio. Siekiant efektyviau išskirti DNR, pridedama 1µl glikogeno.

DNR precipituojama 200 µl etanolio 96 proc. inkubuojant 3–4 val. -20ºC tempera-tūroje. Mėginiai centrifuguojami 25 min. 13000 aps./min., pašalinamas supernatantas, DNR lieka mėgintuvėlio dugne. Užpilama 100 µl etanolio 70 proc., supurtoma, centrifu-guojama, 30 min. laikoma – 20ºC temperatūroje. Vėl centrifuguojama 25 min. 12000 aps./min., pašalinamas supernatantas, turi matytis DNR siūlas. Etanolio likučiai išgari-nami laikant atvirus mėgintuvėlius + 37–45ºC temperatūroje 15–20 min. Po to DNR ištirpinama 40 µl sterilaus vandens, gerai supurtoma ir centrifuguojama.



4.3 pav. Bisulfitu modifikuotos DNR nudruskinimas naudojant DNR valymo kolonėles Wi-zard DNA Clean-up System (Promega).

4.4. Metilinimui jautri polimerazės grandininė reakcija

Metilinimui jautri polimerazės grandininė reakcija, arba MSP – vienas populiariausių DNR metilinimo analizės metodų. Metodo jautrumas labai didelis, jis geba aptikti vieną metilintą DNR seką tarp tūkstančio nemetilintų sekų. Dėl metodo jautrumo dirbant ten-ka labai saugotis taršos.

Būtina įranga ir priemonės: termocikleris, stalinė mikrocentrifuga, stalinė purtyk-lė, automatinės pipetės, dėžutės ir stovai mikromėgintuvėliams, vertikalios elektroforezės sistema su srovės šaltiniu, gelių analizės ir dokumentavimo sistema.

Naudojami reagentai: Ampli Taq Gold DNR polimerazė, dNTP mišinys (100 mM), bisulfitu modifikuota DNR, pradmenys metilintai ir nemetilintai DNR sekai, benukleazinis vanduo, akrilamidas ir N,N‘-metilbisakrilamidas, TAE 1x buferis, amo-nio persulfatas 10 proc., TEMED (N,N,N,N‘-tetrametiletilendiaminas).


Darbo tikslas: MSP metodu nustatyti pasirinkto geno promotoriaus sekų metilini-mo būseną.

Darbo eiga Laminare, laikantis bendrųjų saugos reikalavimų, renkamas PGR mišinys. Bisulfitu

modifikuota DNR analizuojama atliekant tiriamos sekos pagausinimą dviejų tipų prad-menų poromis metilintai (M pradmenys) ir nemetilintai (U pradmenys) tiriamo geno

56 |

promotoriaus DNR sekai. PGR atliekama kiekvienam DNR mėginiui dviejuose mėgintu-vėliuose, kurie skiriasi tik pradmenimis, o kiti reakcijos komponentai tie patys. Reakcijos mišinio sudėtis ir kiekiai pateikiami 1 lentelėje. PGR ciklų charakteristikos: pradinis DNR denatūravimas + 95°C temperatūroje – 8 min.; 35–36 kartus: denatūravimas + 95°C temperatūroje – 45 sek., pradmenų prijungimas specifinėje temperatūroje 45 sek., gran-dinės ilginimas + 72°C temperatūroje – 45 sek; baigiamasis grandinės ilginimas + 72°C temperatūroje – 8 min.

4.1 lentelė. Metilinimui jautrios polimerazės grandininės reakcijos mišinio reagentai bei jų kiekiai

PGR reakcijos mišinys vienam DNR mėginiui

Komponentai Reakcijos tūris 25 µl Galutinė koncentracija mėgintuvėlyje

1. 10xPGR Buferis 2,5 µl 1x 2. 25 mM MgCl2 2,5 µl 2,5 mM 3. dNTP mišinys 2,5 µl 0,4 mM 4. Polimerazė AmpliTaq Gold

0,25 µl 1,25 U

5. Pradmenys (50 µM) 0,5 µl + 0,5 µl 1 μM+1 μM 6. DMSO 0,25 µl 10 µl/ml 7. Sterilus vanduo 14 µl - 8. Modifikuota DNR 2 µl 40 µg/ml iki modifikavimo

MSP reakcijai naudojami pradmenys turi atitikti kelis reikalavimus. Pradmenys turi bū-

ti komplementarūs CpG sekoms geno promotoriuje ar netoli jo. 3’ prasminių ir antipras-minių pradmenų gale turi būti 2–3 CpG poros. Pradmenys metilintai sekai turi turėti 3–5 nukleotidus, kuriais skiriasi M ir U pradmenys. U pradmenyse visi C yra pakeisti T prasmi-nėse sekose ir G į A antiprasminėse sekose. M pradmenyse C į T (arba G į A) nesikeičia tik ten, kur C (arba G) yra greta G (arba C). Dėl šių skirtumų nemetilintos DNR PGR produk-tą bus gauti tik su U pradmenimis, o metilintos – tik su M pradmenimis.

DNR metilinimo tyrimuose labai svarbu, kad mažai tarpusavyje besiskiriantys M ir U MSP pradmenys pasižymėtų dideliu specifiškumu metilintai arba nemetilintai sekai. Be to, MSP pradmenys neturėtų jungtis prie nemodifikuotos normalios DNR sekos, kuri skiriasi C kiekiu. Ir priešingai, pradmenys normaliai geno sekai (WT pradmenys) neturėtų jungtis prie bisulfitu modifikuotos sekos. Jei tokia reakcija vyksta, reiškia, kad bisulfitinė modifika-cija nevisiškai įvyko. Bisulfitinio virsmo kokybė tikrinama atliekant reakciją su pradmenimis WT DNR. MSP M ir U pradmenų atrankumas tikrinamas atliekant reakciją su nemodifi-kuota DNR bei naudojant in vitro metilintą DNR ir vėžinių ląstelių linijų DNR kaip teigia-ma kontrolę, o leukocitų DNR kaip neigiamą kontrolę. Taršos kontrolė atliekama kiekvie-no tyrimo metu, į reakciją vietoje DNR pilamas atitinkamas benukleazinio vandens kiekis.

PGR reakcijos produktai analizuojami poliakrilamido 7,5 proc. gelyje atliekant verti-kalią elektroforezę. Gelis ruošiamas iš 10 ml 7,5 proc. PAA (6,9 g akrilamido, 0,33 g N,N’- metilbisakrilamido, 100 ml 1x TAE buferio, 30 µl 10 proc. amonio persulfato ir 15 µl TEMED (N,N,N,N’-tetrametiletilendiaminas). Gelis formuojamas rėmelyje tarp dviejų stiklo plokščių. Į tarpą tarp jų pipete pilama gelio, įstatomos šukutės šulinėliams gelyje formuoti ir paliekama polimerizuotis 30–40 min. Praėjus polimerizacijos laikui, šukutės



išimamos, šulinėliai praplaunami darbiniu buferiu. Elektroforezė vykdoma 1 x TAE bu-feryje. Rėmelis su geliu įdedamas į elektroforezės aparatą, kameros užpildomos buferiu. Į gelio šulinėlius užnešama: 1 µl ilgio žymens ir po 12 µl PGR pagausinto tiriamojo mėgi-nio, sumaišyto su 20 µl pagrindinio dažo. Frakcionavimas vykdomas 50 min. 100V elek-tros lauke. PGR produktai gelyje išryškinami 35 µl etidžio bromido ir 100 ml vandens tirpale, analizuojami po UV lempa. Mėginys yra metilintas, jei produktas nustatomas re-akcijose su M ir U pradmenimis. Nustačius produktą tik U reakcijoje, toks mėginys lai-komas nemetilintu.

p16

RARβ

KL DLD1 R13 R29 R61 R67 M U M U M U M U M U M U

KL T24 R1 R24 R48 R78M U M U M U M U M U M U

4. 4 pav. MSP produkto analizė polikrilamido gelyje. M – reakcija su pradmenimis metilintai geno sekai, U – reakcija su pradmenimis nemetilintai geno sekai. Analizuojami genai p16 ir RARβ. KL – sveikų asmenų leukocitai (nemetilinta kontrolė), vėžio ląstelių linijos T24 ir DLD1 (metilinta kontrolė), R – plaučių karcinomos mėginiai (R1, R13, R67 – DNR nemeti-linta, R24, 48, 78, 29, 61 – dalinai metilinta, todėl reakcija vyksta su M ir U pradmenimis)

4.5. Bisulfitinė sekoskaita

Norint tiksliai įvertinti tiriamos CpG salos metilinimo profilį, ši seka analizuojama sekoskaitos būdu. Kaip ir MSP analizės metu, pirmiausia DNR modifikuojama bisulfitu. Epigenetiniai pokyčiai paverčiami genetiniais ir nuskaitomi genetiniu analizatoriumi. Mo-difikuota DNR gali būti klonuojama ir tik tada nuskaitoma kiekvienos DNR molekulės seka. Šiuo metodu įvertinama kiekvieno CG dinukleotido svarba geno raiškai. Atliekant platesnį mėginių tyrimą, dažniausiai naudojama tiesioginė sekoskaita, kai visos modifi-kuoto mėginio DNR molekulės analizuojamos vienu metu. Nemetilintos sekose CG di-nukleotiduose C verčiamas T, o metilintuose CG dažnai matomas mišrus fenotipas, nes mėginyje būna metilintų ir nemetilintų DNR molekulių.

Būtina įranga: genetinis analizatorius, termocikleris, stalinė mikrocentrifuga, stalinė purtyklė, horizontali elektroforezės sistema su srovės šaltiniu, gelių analizės ir dokumen-tavimo sistema.

Naudojami reagentai ir priemonės: optinė 96 šulinėlių plokštelė ir septa, Avant kapiliarų blokas 4x36 cm genetiniam analizatoriui, automatinės pipetės, BIG DYE termi-nator v 3.1 rinkinys sekvenavimui, POP-7 polimeras, dejonizuotas formamidas, Ampli Taq Gold DNR polimerazė, dNTP mišinys (100 mM), pradmenys, pagausinantys tiria-mąją seką, benukleazinis vanduo, 0,5 M EDTA, etanolio 70 ir 100 proc.

Vienkartės priemonės: mikromėgintuvėliai, antgaliai automatinėms pipetėms, vienkartinės pirštinės.

Darbo tikslas: tiksliai nustatyti metilintų citozinų padėtį tiriamojo geno promoto-riaus sekoje.

58 |

Darbo eiga Modifikuota DNR pagausinama parinkus tinkamiausias sąlygas kiekvienos sekos ty-

rimams. Bisulfitinės sekoskaitos pradmenų sekose neturi būti CG dinukleotidų, kad vie-nodai būtų pagausinamos metilintos ir nemetilintos sekos. Reakcijai naudojamas 2 µl GeneAmp 10 x PGR buferis, 3,2 µl 25 mM MgCl2, 1 µl 4 mM dNTP mišinys, 0,1 µl 5 vnt./µl AmpliTaqGold polimerazės, po 0,5µl 20 µM prasminio ir antiprasminio pradme-nų, 10,7 µl H2O, 2 µl 100 μg/ml DNR. Bendras reakcijos tūris vienam mėginiui yra 20 µl. PGR reakcija vykdoma: + 95°C temperatūroje – 10 min., 35 ciklai: + 95°C temperatūroje – 30 sek., pradmenų jungimo temperatūra – 30 sek., + 74°C temperatūroje – 1 min.; + 74°C temperatūroje – 10 min. PGR produktas analizuojamas agarozės 1,5 proc. arba nedenatūruojančiame poliakrilamido 7,5 proc. gelyje. Tolesniems etapams atrenkami tik sėkmingai pagausinti PGR produktai.

PGR produktas (DNR konc. ~ 500 μg/ml) skiedžiamas 200 kartų. Ruošiamas miši-nys sekoskaitos PGR reakcijai. Mišinį sudaro 8µl BigDye terminator v3.1 Ready Reaction mix, 1,6 µl 2 pmol prasminio arba antiprasminio pradmens, 5,8 µl H2O ir 5 µl PGR produkto. Bendras reakcijos tūris vienam mėginiui yra 20 µl. Sekoskaitos PGR reakcija vykdoma optimaliomis sąlygomis: + 96°C temperatūroje – 1 min., +96°C temperatūroje – 10 sek., 50°C temperatūroje – 5 sek., + 60°C temperatūroje – 4 min. PGR ciklai kartojami 25 kartus.

Pagausinta DNR išvaloma nuo neįjungtų žymėtų nukleotidų, kurie trukdo sekoskai-tos reakcijai. Į pagausintą DNR pridedama 1,25 µl 0,5 M EDTA ir 60 µl etanolio 100 proc., sumaišoma. Mėginiai inkubuojami kambario temperatūroje 15 min, centrifu-guojami 30 min. 13000 aps./min. + 4°C temperatūroje. Supernatantas pašalinamas. Įpi-lama 60 µl etanolio 70 proc., centrifuguojama 30 min. 13000 aps./min. + 4°C temperatū-roje, supernatantas pašalinamas. DNR džiovinama + 37°C temperatūroje.

Sekoskaitai paruošti DNR mėginiai ištirpinami 12 µl formamido tirpale ir pernešami į plokštelę, kurioje vėliau analizuojami 3130 genetiniu analizatoriumi (Applied Biosystems). Atskyrimo terpei naudojamas 3130 POP-7 polimeras (Applied Biosystems), 1 x EDTA bu-feris. Elektroforezė vykdoma 30 min. 15 kV elektros lauke. Analizuojamoje sekoje C virtimas T aptinkamas automatiškai naudojant SeqScape programą. Tiesioginės bisulfiti-nės sekoskaitos tikslumas didėja naudojant klonuoto produkto sekoskaitą.

A B

4.5 pav. Bisulfitinio sekvenavimo genetiniu analizatoriumi rezultatų pavyzdys: A – sekve-nuotas klonuotas produktas; B – tiesioginis bisulfitinis sekvenavimas. Viršuje – nemetininta seka, apačioje – metilinta. Mišrus genotipas (C ir T) analizatoriaus vertinamas kaip YG (pagal www.appliedbiosystems.com)



4.6. DNR grandinės konformacijos polimorfizmų analizė

DNR grandinės konformacijos polimorfizmų analizė (angl. sigle strand conformation po-lymorphism analysis, SSCP) yra vienas paprasčiausių ir greičiausių automatizuotų DNR se-kos pokyčių analizės metodų. Net vienos azotinės bazės pokytis sąlygoja DNR molekulės konformacijos pokyčius, dėl kurios nedenatūruojančiomis sąlygomis DNR molekulės įgauna nevienodą elektroforezinį judrumą. Po bisulfitinės modifikacijos, taikant SSCP, gali būti analizuojami ir DNR metilinimo pakitimai, t. y. citozino virtimas metilcitozinu. MS-SSCP metodu DNR metilinimo pokyčiai, įvertinami kaip DNR molekulės konfor-macijos ir judrumo pokyčiai elektroforegramoje, besiskiriantys nuo laukinio tipo sekos (kontrolinė DNR).

Būtina įranga: genetinis analizatorius, termocikleris, termomikseris, stalinė mikro-centrifuga, stalinė purtyklė, vertikalios elektroforezės sistema su srovės šaltiniu, gelių analizės ir dokumentavimo sistema.

Naudojami reagentai ir priemonės: optinė 96 šulinėlių plokštelė ir septa, Avant kapiliarų blokas 4x36 cm genetiniam analizatoriui, automatinės pipetės, Ampli Taq Gold DNR polimerazė, dNTP mišinys (100 mM), fluorescencine žyme žymėti pradmenys (prasminiai su FAM 5’galo žyme, antiprasminiai su HEX 5’galo žyme), benukleazinis vanduo, CAP polimeras, GeneScan 500 LIZ arba ROX dydžio standartas, dejonizuotas formamidas.


Darbo tikslas: automatizuotu SSCP metodu nustatyti tiriamojo geno promotoriaus sekų metilinimo būseną.

Darbo eiga Bisulfitu modifikuota DNR pagausinama naudojant pradmenis, atrankius tiriamojo

geno promotoriaus sekai. Kaip ir bisulfitinės sekoskaitos, MS-SSCP pradmenys savo sekose neturi turėti CG dinukleotidų, kad vienodai būtų pagausinamos metilintos ir ne-metilintos sekos. Be to, MS-SSCP prasminių ir antiprasminių pradmenų 5’ galai žymimi skirtingais fluorescuojančiais dažais (pvz., 6-karboksifluoresceinu (6-FAM) ir 4,7,2’,4’,5’,7’-heksachloro-6-karboksifluoresceinu (HEX)).

Optimalios PGR sąlygos: 95°C temperatūroje – 10 min; 40 ciklų: + 95°C tempera-tūroje – 30 sek., specifinė pradmenų jungimo temperatūra – 30 sek., + 74°C temperatū-roje – 1 min; + 74°C temperatūroje – 10 min. Po amplifikacijos produktas analizuojamas agarozės 2 proc. gelyje norint įvertinti pagausinto DNR fragmento kokybę ir kiekybę. Mėginiai, kurių amplifikuoti nepavyko, tolesnei SSCP analizei nenaudojami. Priklausomai nuo amplifikacijos efektyvumo, DNR mėginiai skiedžiami vandeniu 1:10 santykiu. Ruo-šiamas SSCP analizės mišinys: 0,5 µl PGR produkto, 0,5 µl GeneScan-500 LIZ arba ROX ilgio standarto (Applied Biosystems) ir 15 µl HiDi formamido. DNR 3 min. denatū-ruojama + 95°C temperatūroje. Vėliau, norint išvengti denatūruotų DNR grandinių suli-pimo, dedami ant ledo ir laikomi 2 min. Mišinys pernešamas į plokštelę, kurioje analizuo-jami 3130 genetiniu analizatoriumi (Applied Biosystems). Atskyrimo terpei naudojamas CAP polimeras, turintis glicerolio 10 proc. ir 1 x EDTA buferio. Elektroforezė vykdoma

60 |

43 min. 15 kV elektros lauke 30°C temperatūroje. Rezultatai analizuojami GeneMapper® programa.

4.6 pav. Metilinimui jautrios SSCP analizės pavyzdys. Genetinio analizatoriaus elektroforeg-ramoje analizuojamas RASSF1A geno promotoriaus metilinimas: KL – sveikų donorų leuko-citų DNR, KM – in vitro metilinta DNR, T35, T39, T42, T52 – plaučių karcinomos DNR (rodyklės žymi pikus, rodančius DNR sekos metilinimą T35 ir T39 mėginiuose)

4.7. Genų raiškos įvertinimas „tikrojo laiko“ PGR

„Tikrojo laiko“ PGR (TL-PGR, angl. real-time PCR) – tai metodas, kuriuo galima stebėti PGR reakcijos vyksmą ir kiekybiškai įvertinti tiriamąją medžiagą. TL-PGR meto-das daug kur taikomas, tačiau pagrindinis jo privalumas yra tai, kad šiuo metodu gali būti aptinkami maži RNR ir DNR kiekiai ir kiekybiškai įvertinami netgi ir nedideli genų raiš-kos svyravimai. TL-PGR gali būti nustatomas DNR, kDNR (kopijinė DNR), RNR kie-kis. TL-PGR metodo pagrindas – fluorescencijos signalų intensyvumo fiksavimas, vyks-tant PGR. PGR produkto kiekybiniam žymėjimui naudojami tiesioginiai ir netiesioginiai metodai. SYBR Green yra fluorescuojanti molekulė, besijungianti su dvigrandine DNR. SYBR Green jungiasi su bet kokiu PGR produktu nepriklausomai nuo specifiškumo. Tie-sioginei produkto analizei naudojami atrankūs TL-PGR zondai (molekuniniai švyturiai, (angl. molecular beacons) ar TaqMan zondai). TaqMan zondai – tai tiriamajai sekai atrankūs oligonukleotidai, turintys fluoroforą 5’ gale ir fluorescenciją gesinantį (angl. quencher) dažą 3’ gale. PGR metu Taq DNA polimerazės 5'→3' egzonukleazinis aktyvas kerpa zondą ir atskiria fluoroforą nuo gesiklio. Fluorescencinis signalas stiprėja kiekvieno PGR ciklo metu. Kai signalo stiprėjimas pereina į eksponentinę fazę, šis taškas vadinamas slenksti-niu TL-PGR ciklu ir žymimas Ct (angl. cycle thereshold). Slenkstinis ciklas naudojamas kie-kybiškai vertinant tiriamąją medžiagą. Kadangi šis dydis priklauso nuo pradinio DNR ar RNR kopijų skaičius, tyrimui naudojamas vidinis standartas. Vidiniu standartu TL-PGR tarnauja geno, kurio raiška nekinta įvairiuose audiniuose (pvz., β-aktino), RNR ar DNR.



Būtina įranga: „Tikrojo laiko“ PGR aparatas, termocikleris, termomikseris, stalinė mikrocentrifuga, stalinė purtyklė, vertikalios elektroforezės sistema su srovės šaltiniu, gelių analizės ir dokumentavimo sistema.

Naudojami reagentai ir priemonės: RNR išskyrimo rinkinys, kDNR sintezės rin-kinys, PGR plokštelės TL-PGR analizei, plėvelė PGR plokštelės sandarinimui, TL-PGR reakcijos mišinys (Light Cycler 480 probes master mix), oligonukleotidai ir zondas su dviguba fluorescencine žyme, benukleazinis vanduo.


Darbo tikslas: palyginti tiriamojo geno raišką mėginiuose, kuriuose nustatyta meti-linta ir nemetilinta geno seka.

Darbo eiga: RNR išskyrimui iš audinių naudojamas komercinis Macherey-Nagel RNR skyrimo rin-

kinys (Macherey-Nagel Total RNA Isolation). RNR išskyrimas atliekamas laikantis ga-mintojo nurodymų. Išskirtos RNR kokybė vertinama atliekant elektroforezę agarozės 1,5 proc. gelyje. Jei RNR geros kokybės, elektroforegramoje išryškėja 28S ir 18S RNR juos-tos bei iRNR šleifas.

Pirmosios kDNR grandinės sintezei naudojamas UAB „Fermentas“ rinkinys (Fer-mentas, First Strand cDNR Synthesis Kit). Reakcijos mišinys pilamas į mėgintuvėlį, pa-statytą trupintame lede. Reakcijos mišinio sudėtis: 0,1–5 μg totalinės RNR, 0,5 μg/μl oligo(dT) arba 2 μg/μl atsitiktinių heksamerų (gali būti naudojami ir sekai specifiniai pradmenys) ir dejonizuoto vandens, kad galutinis tūris būtų 11 μl. Gautasis reakcijos mišinys atsargiai sumaišomas ir sukamas 3–5 sek. mikrocentrifugoje. Inkubuojama + 70˚C temperatūroje 5 min., mėgintuvėliai atvėsinami lede, jei matomi susidarę lašeliai, jie surenkami trumpu centrifugavimu. Mėgintuvėlis įstatomas į ledą, dedami kiti reakcijos komponentai: 5 x reakcijos buferio – 4 μl, RiboLock ribonukleazės inhibitoriaus (20 vnt./μl) – 1 μl, 10 mM dNTP mišinio – 2 μl. Reakcijos mišinys maišomas atsargiai. Jei yra lašelių, jie surenkami centrifuguojant, 5 min. inkubuojama + 37ºC temperatūroje. Įdedama 2 μl M-MuLV atvirkštinės transkriptazės (galutinė koncentracija mišinyje – 20 vnt./μl). Galutinis reakcijos mišinio tūris yra 20 μl. Mėgintuvėliai 60 min. inkubuojami + 37˚C temperatūroje, reakcija sustabdoma kaitinant + 70˚C temperatūroje 10 min. Mėgin-tuvėliai atvėsinami ant ledo. Gauta pirmoji susintetinta kDNR grandinė, kuri toliau nau-dojama produkto amplifikacijai PGR metu.

TL-PGR reakcijai naudojamas TL-PGR reakcijos mišinys, prasminiai ir antiprasminiai pradmenys (galinė koncentracija 300 nM), Taq Man zondas (100 nM) ir sterilus vanduo. Įprastinė reakcijos mišinio sudėtis: 3 μl vandens, 2 μl pradmenų ir zondo mišinio, 10 μl pagrindinio reakcijos mišinio (Light Cycler 480 probes master mix) ir 5 μl kDNR. Reakcija vykdoma 96 duobučių PGR plokštelėse, kiekvienam mėginiui atliekamos 3 reakcijos. Be tiriamojo geno amplifikuojams ir vidinis standartas – β-aktino kDNR. Taršos kontrolei kiekvienoje eilutėje atliekama bent viena reakcija be kDNR (atitinkamas kiekis vandens). PGR reakcija kartojama 40–45 ciklus: DNR denatūravimas + 95º C temperatūroje 15 sek. ir pradmenų jungimas bei grandinės ilginimas + 60º C temperatūroje 1 min. Reakcijos pra-džioje 5–10 min. aktyvinama karšto starto polimerazė, esanti pagrindinio TL-PGR mišinio sudėtyje (FastStart Taq DNA polymerase), kaitinant + 95º C temperatūroje.

62 |

4.7 pav. Tiriamojo geno raiškos santykinis kiekybinis įvertinimas Ct metodu: Rn – fluores-cencijos signalo intensyvumas, Ct – slenkstinis ciklas (pagal www.appliedbiosystems.com) Geno raiška tiriamuose mėginiuose vertinama kiekybiškai pagal vidutinę Ct vertę

(4.7 pav.). Geno raiška normalizuojama pagal vidinį TL-PGR standartą (santyklinė geno raiška = tiriamojo geno vidutinė raiška/geno standarto vidutinė raiška × 1000). Toliau geno raiška kiekybiškai – vertinama pagal kalibracinę kreivę, kuri kuriama tam tikru san-tykiu skiedžiant žinomos koncentarcijos kDNR (pvz., plazmidės). Palyginamas tiriamojo geno raiškos intensyvumas mėginiuose, kuriuose nustatyta metilinta ir nemetilinta geno seka.

Literatūra: 1. Bartlett JMS, Stirling D, editors. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. Vol.

226. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2003. 2. Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, et al. A genomic

sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in indivi-dual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89(5):1827-31.

3. Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cy-tosines. Nucleic Acids Res 1994;22(15):2990-7.

4. Millar DS, Warnecke PM, Melki JR, Clark SJ. Methylation sequencing from limiting DNA: embryonic, fixed, and microdissected cells. Methods 2002;27(2):108-13.

5. Herman JG, Baylin SB. Methylation Specific PCR. Current Protocols in Human Gene-tics 1998;suppl 16.

6. International Network of Biological Resource Centres for Cancer Research: Recom-mendations on common minimal technical standards. Lyon: IARC; 2006.

Rekomenduojami tinklalapiai: www.mdanderson.org/departments/methylation/ www.dnamethsoc.com/ www.methdb.de/ www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/DNA/Methylation_analysis/ www.web-books.com/MoBio/Free/Ch7F2.htm www.appliedbiosystems.com

PENKTAS LABORATORINIS DARBAS


Penktas laboratorinis darbas

5.1. Genomų palyginimas DNR gardelių metodu

Moderniosios genomikos era. Terminas „pogenominė era“ jau kurį laiką adresuo-jamas ne akademinės visuomenės sluoksniams, bet dažniausiai vartojamas žiniasklaidos. Plačiojoje visuomenėje šis terminas dažniausiai susijęs su žmogaus genomo projektu, o biologijos srities specialistai šį terminą linkę vartoti, siekdami pabrėžti kokybiškai naują biologijos mokslų plėtros laikotarpį. Norėdami geriau suprasti, kodėl dabartinį laikotarpį pagrįstai galime vadinti kokybiškai nauju biologijos plėtros laikotarpiu, prisiminkime, kas įvyko per pastaruosius 20 metų, dėl ko galima būtų skelbti pogenominės eros pradžią.

Natūralu, kad įvykių susijusių su pogenomine era, reikėtų ieškoti genomikos srityje. Ne paslaptis, kad mokslo plėtros politika JAV turėjo didžiulę įtaką genomikos plėtrai. Prisiminkime, kokie įvykiai JAV vyko moderniosios genomikos eros pradžioje. Jau devin-tajame 20 a. dešimtmetyje iš dalies buvo nustatytos kai kurių mikrobų ir bakteriofagų genomų DNR sekos, bet moderniosios genomikos eros pradžia tapatinama su tarptauti-ne konferencija Sveikatos ir aplinkos tyrimų tarnybos prie JAV Energijos departamento (Office of Health and Environmental Research of the US Department of Energy; dabar ši tarnyba vadinama Office of Biological and Environmental Research of the Department of Energy) iniciatyva 1986 m. surengta Santa Fe (Naujoji Meksika). Šioje konferencijoje garsiausi pasaulio mokslininkai aptarė žmogaus genomo programos įgyvendinimo planus, galimybes ir svarbą. Šis susitikimas inicijavo „Genų vietos ir sekos nustatymo žmogaus genome“ stu-diją, kuri vadovaujama JAV Nacionalinės tyrimų tarybos 1988 m. rekomendavo remti žmogaus genomo programą (vėliau pavadintą Žmogaus genomo projektu – Human Ge-nome Project (HGP)) JAV ir pristatė išplėstinį šios programos etapų planą. Tais pačiais metais trys genominių tyrimų centrai buvo įsteigti JAV nacionalinėse Berklio, Livermoro ir Los Alamo laboratorijose, o Nacionalinis sveikatos institutas įsteigė Genomo tyrimų tarnybą, kuri 1989 m. tapo Nacionaliniu žmogaus genomo tyrimų centru, vadovaujamu Džeimso D. Vatsono (J. D. Watson), kurio su kolega Frensiu Kriku (H.C. Crick) tyrimai atlikti penktajame 20 a. dešimtmetyje (J. D. Watson, H.C. Crick, 1953) leido pradėti gy-vosios gamtos genetinės organizacijos principų tyrimus. Šie mokslo plėtros valdymo veiksmai JAV ir genomų tyrimams skiriamas finansavimas užtikrino, kad per kitą de-šimtmetį visame pasaulyje sparčiai tobulėjo automatiniai sekų nustatymo metodai. Tobu-lėjančios technologijos lėmė plataus masto DNR sekų nustatymo projektų plėtrą viso pasaulio tyrimų institucijose, todėl atsirado kompiuterinių duomenų analizės metodų, galinčių susidoroti su DNR sekų nustatymo projektų duomenų gausa, kūrimo būtinybė. Žmogaus genomo programos rezultatų lūkesčiai skatino į procesą įtraukti ir privatų kapi-talą. Kompanija „Celera Genomics“ 1998 m. pranešė apie planus dalyvauti programoje ir konkuruoti su visuomeninėmis organizacijomis.

Konkurencija skatino efektyvinti visuomeninio Žmogaus genomo projekto vykdy-mą, todėl jį prižiūrinčios institucijos 1998 m. paskelbė planus baigti žmogaus genomo DNR sekų nustatymo darbus iki 2003 m., t.y. – iki 50-ųjų DNR struktūros nustatymo metinių. Šio plano uždaviniai buvo:

64 |

• iki 2001 metų pabaigos nustatyti ne mažiau kaip 90 proc. žmogaus genomo DNR fragmentų poziciją genome (Žmogaus genomo darbinis variantas);

• iki 2001 metų pabaigos nustatyti bent 33 proc. žmogaus genomo DNR sekų; • iki 2003 metų pabaigos nustatyti viso žmogaus genomo DNR seką; • visą žmogaus genomo DNR seką paskelbti laisvai prieinamose duomenų bazėse. 2000 m. birželio 26-ąją Prezidentas B. Klintonas priėmė visuomeninio Žmogaus ge-

nomo projekto bei Celera Genomics vadovus, abu pranešė, kad abu projektai perėjo į paskutinį „Žmogaus genomo darbinio varianto pildymo“ etapą. Šio etapo paspartinimui buvo pasiektas susitarimas pasidalyti abiejų konkuruojančių projektų sukaupta informaci-ja. Taip baigėsi visuomeninio ir privataus projektų konkurencija, o pasidalyta informacija įgalino žmogaus genomo DNR seką paskelbti gerokai anksčiau numatyto laiko. Abiejų projektų „darbiniai variantai“ buvo paskelbti specialiuose žurnalų „Science“ ir „Nature“ numeriuose 2001 m. pradžioje (Nature 2001, Science 2001). Žmogaus genomo DNR seka yra laisvai prieinamoje Biotechnologijos informacijos nacionalinio centro (National Center for Biotechnology Information, NCBI) duomenų bazėje (www.nebi.nlm.nih.hov/genomes/index/html)

Žmogaus genomo DNR sekos paskelbimą galima laikyti Pogenominės eros pradžia. Ką gi davė biologijos mokslų plėtrai Žmogaus genomo projektas? Netruko nutilti skam-bios kalbos („Šiandien mes skaitome knygą, kurią rašė Dievas“ – Prezidento B. Klintono kalba, skirta Žmogaus genomo projekto įgyvendinimo pristatymui Baltuosiuose Rūmuo-se) ir atsakymo į šį klausimą ėmė ieškoti akademinė visuomenė. Žmogaus genomo DNR sekos analizė atskleidė tai, kad tik ~ 1,5 proc. genomo sekų yra prasmingų, t. y. koduoja baltymus. Įvairių organizmų (žmogaus, pelės, šimpanzės) genomų palyginimas atskleidė neįtikėtiną šių genomų panašumą. Remiantis šiais duomenimis, galima daryti prielaidą, kad ne organizmų genomų struktūra ir net ne genų DNR seka, bet genų raiška daugiausia lemia ląstelės ir ląstelių visumos – organizmo savybes. Bene svarbiausia pogenominės eros ypatybė yra ne tiek nustatytos organizmų genomų DNR sekos, bet prielaida, padary-ta analizuojant genomų projektų rezultatus, leidusi įvertinti genų raiškos svarbą. Be abejo, ši prielaida savaime dar nesudarė sąlygų kokybiškai naujam biologijos etapui, bet genomų projektų sukaupti DNR sekų duomenys ne tik leido įvertinti genų raiškos svarbą, bet sudarė sąlygas kurti technologijas (proteominė, transkriptominė analizė) labai efektyviems genų raiškos tyrinėjimams. Kokios šių technologijų sukūrimo prielaidos? Norėdami suži-noti atsakymą į šį klausimą, susipažinkime su DNR mikrogardelių technologija, naudoja-ma transkriptomikoje.

5.2. Lyginamoji genomų hibridizacija

Lyginamoji genomų hibridizacija (angl. Comparative Genomic Hybridization, CGH) yra ne kas kita, kaip DNR mikrogardelių technologijos prototipas. Šis metodas paskutiniajame 20 a. dešimtmetyje buvo pradėtas naudoti citogenetikoje (metodo pradininkė suomė Anne Kallioniemi; žr. literatūros nuorodas Science 1992, PNAS 1994), analizuojant pasirinkto genomo kiekybinius DNR pokyčius (chromosomų ar jų dalių amplifikacijas/ delecijas). Šis metodas dažnai naudotas vėžio tyrinėjimuose, nes kancerogenezės proceso metu dažniau-siai prarandamos/įgyjamos atskiros genomo dalys. Metodo esmė – atitinkamai skirtingai



pažymėtos (dažniausiai fluoresceinu (FITC) ir rodaminu) iš skirtingų objektų (tiriamojo ir lyginamojo) išskirtos DNR hibridizacija su tokio paties organizmo kaip tiriamasis ir lygina-masis normalių ląstelių metafazinių chromosomų preparatu (5.1 pav.).

5.1 pav. Lyginamosios genominės hibridizacijos principinė schema (pagal Kallioniemi ir kt., 1992) Kaip parodyta 5.1 pav., skirtingai pažymėta DNR hibridizuojasi su atitinkama ge-

nomo sritimi ir „nudažo“ šią sritį metafazinių chromosomų preparate priklausomai nuo tos genomo srities DNR fragmentų santykio tiriamojo ir lyginamojo objektų genomuose. Genomų sritys, kurių DNR fragmentų po lygiai, yra ir tiriamojo, ir lyginamojo objekto genomuose, po hibridizacijos metafazinių chromosomų preparate neįgyja nei fluorescei-nui, nei rodaminui būdingos spalvos. O genomo sritys, kurių DNR fragmentų kiekiai skiriasi tiriamojo ir lyginamojo objekto genomuose, po hibridizacijos metafazinių chro-mosomų preparate įgyja fluoresceinui ar rodaminui būdingą spalvą (5.2 pav). Naudojant fluorescencinę mikroskopiją ir kiekybinę metafazinių chromosomų preparato vaizdo analizę, galima įvertinti, kurių genomo sričių kiekybinis santykis lyginamojo ir tiriamojo objekto genomuose lygus 1, o kurių genomo sričių yra daugiau/mažiau tiriamojo (palygi-nus su lyginamojo) objekto genome ir kokiu santykiu.

Taigi, CGH metodu galima nustatyti kiekybinius genomo sričių pokyčius – struktū-riniai genomo pokyčiai, pvz., inversijos ar translokacijos šiuo metodu nenustatomos. Kitas metodo taikymo apribojimas yra tai, kad dėl natūraliai besitęsiančio replikacijos

66 |

proceso sudėtinga parinkti tiriamąjį ir lyginamąjį objektus, kurių genomų replikacija būtų vienodo laipsnio. Vienas šios problemos sprendimo būdas – ląstelių sinchronizacija daž-niausiai netinka naudojant klinikinę medžiagą. Taigi dvigubas atskirų tiriamojo ir lygina-mojo objektų genomo sričių santykinis skirtumas gali būti nustatytas dėl genomų replika-cijos laipsnio skirtumų ir turėtų būti atitinkamai vertinamas interpretuojant rezultatus. Bene svarbiausias standartinės CGH technologijos naudojimo apribojimas yra metodo jautrumas. Prieš ~ 20 metų sukurta technologija galima aptikti genomo sričių praradimus, jei prarasta sritis yra ne mažesnė nei 10 Mb. Tiesa, šios technologijos jautrumas kur kas didesnis, kai analizuojamos amplifikacijos. Šiuo metodu galima nustatyti 1 Mb genomo srities amplifikaciją. Deja, toks metodo jautrumas nepakankamas moderniosios genomi-kos eroje, kai tyrimų objektu tapo kiekvienas atskiras genas.

5.2 pav. Metafazinių chromosomų preparato vaizdas po lyginamosios genominės hibridiza-cijos (Pagal Kollioniemi et al., Science 1992)

5.3. DNR mikrogardelių technologija

Informacija, kaupiama apie žmogaus genomą, Žmogaus genomo projekto vykdymo metu leido tobulinti CGH technologiją ir kurti DNR gardelę ne iš gamtinių chromoso-mų, bet iš žinomos sekos genomo fragmentų. Tokių fragmentų šaltiniu DNR mikrogar-delių kūrimui buvo panaudotos BAC bibliotekos (Solinas-Toldo ir kt., 1997, Pinkel ir kt., 1998, Geschwind ir kt., 1998), bet šios DNR mikrogardelės – tai tik nedidelė žmogaus genomo dalis. Kitas DNR fragmentų šaltinis – DNR bibliotekos. Šis DNR fragmentų šaltinis taip pat buvo naudojamas DNR mikrogardelių kūrimui. DNR mikrogardelės pirmiausia buvo naudojamos ne genomo dalių kopijų skaičiaus analizei, bet genų raiškos analizei (Schena ir kt., 1995, De Risi ir kt., 1996). Sukaupta 30000 žmogaus genų DNR biblioteka (Delsukas ir kt., 1998), pakankamai tolygiai reprezentavo visą žmogaus geno-mą, todėl pasiūlytą ją panaudoti DNR mikrogardelių, skirtų genomo dalių kopijų skai-čiaus analizei, gamybai. Prielaidos, kad tokia DNR mikrogardelė patikimai atskleidžia viso žmogaus genomo dalių kopijų skaičiaus pokyčius, buvo patvirtintos naudojant genominę ląstelių kultūrų su žinomais DNR pokyčiais (Pollack ir kt., 1999). Nuo tada DNR biblio-tekos (ar genų fragmentų oligonukleotidai) plačiai naudojami DNR mikrogardelių tech-nologijoje (5.3 pav.).



5.3 pav. Lyginamoji genomų hibridizaciją naudojant DNR mikrogardelių technologiją; Na-viko audinio gennome padidėjęs geno erbb2 kopijų skaičius (Pagal Polack et al., Nature Ge-net, 1999) Palyginę standartinę CGH ir CGH, naudojant mikrogardeles (a-CGH, array-CGH)

(5.1 ir 5.3 pav.), pastebėsime, kad vienintelis šių technologijų skirtumas – mikrogardelė, bet šis skirtumas labai padidino metodo jautrumą ir net vienintelio geno kopijų skaičiaus pokyčiai tapo pastebimi. Šis technologinis patobulinimas tapo įmanomas dėl Žmogaus genomo projekto, taip pat dėl kitų organizmų genomų projektų rezultatų. Mikrogardelių naudojimas genų raiškos analizei biologijos, biomedicinos mokslų plėtrai atvėrė kokybiš-kai naują etapą, pavadintą „pogenomine era“. Taigi, dabartinį etapą biologijoje pagrįstai vadiname pogenomine era ne dėl to, kad buvo baigti Žmogaus genomo ir kitų organizmų genomų projektai, bet todėl, kad šių projektų rezultatai leido sukurti technologijas, labai paspartinusias biologijos vystimąsi.

5.4. DNR mikrogardelių technologijos taikymo etapai

Kaip ir kiekvieno metodo naudojimas biologijoje DNR mikrogardelių eksperimen-tas turi būti pradėtas nuo klausimo, į kurį reikalingas atsakymas. Jei klausimas susijęs su genų raiška ar genomo dalių kopijų skaičiumi – DNR mikrogardelių technologija gali padėti, todėl verta susipažinti su šios technologijos taikymo etapais (5.4 pav.).

Kitas etapas – tyrimo planas. Planuojant tyrimą, būtina konsultuotis su bioinforma-tikais. Akivaizdu, kad rezultatų analizės etapu bioinformatikų dalyvavimas neišvengiamas, bet tuomet bioinformatikos specialistas jau neturi galimybių pakeisti tyrimo plano (deja, tuo metu bioinformatikai dažnai konstatuoja, kad tyrimo planas – netinkamas, todėl re-zultatai nereikšmingi). Planuojant tyrimą, pasirenkama, kas yra tiriamasis ir lyginamasis objektai, nustatomas tiriamojo bei lyginamojo objekto medžiagos surinkimo būdas, DNR ar RNR išskyrimo metodas, pasirenkamas DNR mikrogardelės tipas (gamybos būdas, fragmentų kiekis ir tankis).

DNR mikrogardelių eksperimento etapu iš surinktų objektų išskiriama DNR ar RNR, ji pažymima, vykdoma lyginamojo ir tiriamojo objekto medžiagos hibridizacija su DNR mikrogardele, po hibridizacijos mikrogardelė plaunama (5.5 pav.).

68 |

Baigus eksperimentines procedūras, vaizdo analizės etapu mikrogardelė skanuojama naudojant DNR mikrogardelių skenerį (5.5 pav.). Šis etapas yra pradinis eksperimento rezultatų surinkimo etapas.

5.4 pav. DNR mikrogardelių technologijos taikymo etapai (Pagal Taylor http://stats.ox.ac.uk/~taylor)

5.5 pav. Mikrogardelių eksperimento, mikrogardelės vaizdo analizės, duomenų normaliza-vimo ir rezultatų analizės schema (Pagal Taylor http://stats.ox.ac.uk/~taylor)



Kitas labai svarbus etapas – duomenų normalizavimas. Jo metu panaikinamos pa-klaidos, atsirandančios dėl techninių sąlygų nepastovumo (DNR/RNR kokybė, kiekis, žymėjimo kokybė) tyrimo metu. Tam naudojamos duomenų surinkimo programos, ku-rios paprastai yra komercinės ir parduodamos kartu su DNR mikrogardelių skeneriu.

Kitas – rezultatų analizės etapas yra bene sudėtingiausias DNR mikrogardelių tech-nologijos taikymo etapas. Jo metu naudojamos rezultatų analizės programos, kurių yra tiek komercinių, tiek sukurtų akademinių institucijų. Labai svarbu, kad šios programos būtų nuolat atnaujinamos. Viena tokių sukurta Norvegijos DNR mikrogardelių konsor-ciumo yra laisvai prieinama akademiniams vartotojams ir nuolat yra atnaujinama. Ją gali-ma parsisiųsti iš http://www.molmine.com. Šiuo etapu gaunamas atsakymas, kokių genų raiška, ar kurių genomo dalių kopijų skaičius yra skirtingas tiriamajame ir lyginamajame objekte, koks tas santykis.

Paskutiniu DNR mikrogardelių technologijos taikymo etapu – rezultatų patvirtini-mo ir interpretavimo etapu naudojamos ne pogenominės technologijos, bet atskirų genų analizės technologijos (tikrojo laiko PGR), kuriomis patikrinama, ar gauti skirtumai yra reikšmingi, taip pat, atsižvelgiant į genų funkcijas, formuluojamos tyrimų išvados.

5.5. DNR mikrogardelės ruošimas

Šiuo metu DNR mikrogardelių eksperimentams naudojamos tiek komercinės, tiek laboratorijoje paruoštos gardelės. Laboratorinio darbo metu gardelė ruošiama laboratori-nėmis sąlygomis.

Būtina įranga: DNR mikrogardelių spausdintuvas, šaldoma centrifuga su rotoriumi mikroplokštelių centrifugavimui, mikropipetė.

Naudojami reagentai ir priemonės: DNR mikrogardelių spausdinimo ir hibridi-zavimo rinkinys, 44000 žmogaus genomo fragmentų rinkinys.

Vienkartės priemonės: mikromėgintuvėliai, antgaliai automatinėms pipetėms, vienkartinės pirštinės.

Darbo tikslas: paruošti žmogaus viso genomo mikrogardelę iš 2000 fragmentų, reprezentuojančių visą genomą.

Darbo eiga: pasirenkami 2000 žmogaus genų, esančių X, Y bei kitose chromosomo-se, iš 44000 žmogaus genomo fragmentų rinkinio. Mikrogardelės gamyba vykdoma pagal DNR mikrogardelių spausdinimo ir hibridizavimo rinkinio gamintojo rekomendacijas.

5.6. Genomų palyginimas naudojant DNR mikrogardelių technologiją

Tam naudosime laboratorijoje paruoštą 2000 fragmentų žmogaus genomo gardelę. Kadangi joje yra genų, esančių X ir Y chromosomose, tai lyginamuoju ir tiriamuoju ob-jektais patogu naudoti vyro ir moters ląstelių genominę DNR.

Būtina įranga: DNR mikrogardelių skeneris, šaldoma mikrocentrifuga, mikrocen-trifuga, mikropipetės, duomenų analizės programinė įranga „ArrayPro“, rezultatų anali-zės programinė įranga „J-Express Pro“.

Naudojami reagentai ir priemonės: DNR/pRNR (priešprasminė RNR) žymėji-mo rinkinys, vyro ir moters genominė DNR, DNR mikrogardelių spausdinimo ir hibridi-zavimo rinkinys.

70 |


Darbo tikslas: palyginti 2000 žmogaus genų skaičių vyro ir moters genomuose. Darbo eiga Vyro ir moters genominė DNR pažymima pagal DNR/pRNR žymėjimo rinkinio

gamintojo rekomendacijas. Hibridizacija, mikrogardelės plovimas po hibridizacijos vyk-domas pagal DNR mikrogardelių spausdinimo ir hibridizavimo rinkinio gamintojo re-komendacijas. Mikrogardelė skenuojama, naudojant „ArrayPro“ programinę įrangą. Re-zultatai analizuojami naudojant „J-Express Pro“ programinę įrangą.

Literatūra 1. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, et al.

Comparative genomic hybridization for cytogenetic analysis of solid tumors. Science 1992;258(5083):818–21.

2. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Piper J, Tanner M, Stokke T, Chen L, et al. Detection and mapping of amplified DNA sequences in breast cancer by comparative genomic hybridization. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91(6):2156-60.

3. Solinas-Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, Nickolenko J, Benner A, Döhner H, et al. Matrix-based comparative genomic hybridization: biochips to screen for genomic imba-lances. Genes Chromosomes Cancer 1997;20(4):399–407.

4. Pinkel D, Segraves R, Sudar D, Clark S, Poole I, Kowbel D, et al. High resolution analy-sis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to micro-arrays. Nat Genet 1998;20(2):207–11.

5. Geschwind DH, Gregg J, Boone K, Karrim J, Pawlikowska-Haddal A, Rao E, et al. Kli-nefelter’s syndrome as a model of anomalous cerebral laterality: testing gene dosage in the X chromosome pseudoautosomal region using a DNA microarray. Dev Genet 1998;23(3):215–29.

6. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. Quantitative monitoring of gene expres-sion patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995;270(5235):467–70.

7. DeRisi J, Penland L, Brown PO, Bittner ML, Meltzer PS, Ray M, et al. Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat Genet 1996;14(4):457–60.

8. Deloukas P, Schuler GD, Gyapay G, Beasley EM, Soderlund C, Rodriguez-Tomé P, et al. A physical map of 30,000 human genes. Science 1998;282(5389):744–6.

9. Pollack JR, Perou CM, Alizadeh AA, Eisen MB, Pergamenschikov A, Williams CF, et al. Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat Genet 1999;23(1):41-6.

10. Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 1953;171(4356):737-8.

11. Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, et al. The sequence of the human genome. Science 2001; 291(5507):1304–51.

12. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, et al. Initial sequ-encing and analysis of the human genome. Nature 2001;409(6822):860-921.

Sonata JARMALAITĖ, Violeta KLEIZAITĖ, Kęstutis SUŽIEDĖLIS, Donatas ŽVINGILA

MOLEKULINĖS GENETIKOS PRATYBOS

Metodinė knyga

Redagavo T. Leskauskienė

SL 344. 2008-03-27. 7 leidyb. apsk. l. Tiražas 50 egz. Užsakymas 233. Išleido leidykla „Technologija“, K. Donelaičio g. 73, 44029 Kaunas

Spausdino leidyklos „Technologija“ spaustuvė, Studentų g. 54, 51424 Kaunas

Documents

MOLEKULINĖS GENETIKOS PRATYBOS · ruošiamieji darbai susideda iš keleto etapų: 1. Medžiagos rinkimo strategijos sukūrimas. 2. Medžiagos paėmimas. 3. Medžiagos transportavimas