MONOFLUOTM KIT - bio-rad.com · processo de coloração. INSTRUÇÕES DE SAUDE E SEGURANÇA ... como tal, material infeccioso. • Evitar o derramamento das amostras. ... Por vezes,

MONOFLUOTM KIT

MONOFLUOTM KIT INFLUENZA 2 X 45 TESTES 52209

MONOFLUOTM KIT ADENOVIRUS 45 TESTES 52210

MONOFLUOTM KIT PARA-INFLUENZA 1+2 45 TESTES 52211MONOFLUOTM KIT PARA-INFLUENZA 3 45 TESTES 52212

DETECÇÃO DE INFLUENZA A E B, PARAINFLUENZA1 E 2, PARAINFLUENZA 3 OU ADENOVIRUS PORIMUNOFLUORESCENCIA

IVD

ÍNDICE

1- INTERESSE CLINICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73

2- PRINCIPIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74

3- COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74

4- PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .77

5- AMOSTRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .785.1 – TÉCNICA PARA RECOLHA DE AMOSTRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78

5.2 – TRATAMENTO DAS AMOSTRAS ANTES DO TESTE I.F. . . . . . . . . . . .79

5.3 - ISOLAMENTO DO VÍRUS EM CULTURA CELULAR . . . . . . . . . . . . . . . .79

6- MODO DE FUNCIONAMENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80

6.1 – MATERIAL NECESSARIO MAS NÃO FORNECIDO . . . . . . . . . . . . . . . .80

6.2 – RECONSTITUIÇÃO E CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES . . . . . . . . . . .81

6.3 - PROCEDIMENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81

7- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82

7.1 – CONTROLO DE QUALIDADE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82

7.2 – LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS . . . . . . . . . . . . .82

8- LIMITES DO TESTE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83

9- CONTROLO DE QUALIDADE DO TESTE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83

10- CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83

11- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83

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1- INTERESSE CLINICOOs vírus Respiratório Sincicial, Influenza A e B, para-Influenza 1, 2 e 3 eAdenovírus são responsáveis por graves infecções respiratórias emcrianças e pessoas fragilizadas. O diagnóstico da origem viral oubacteriana destas infecções é essencial para a implementação dasmedidas terapêuticas apropriadas.O diagnóstico destas doenças virais baseia-se no isolamento do vírus.Na verdade, o diagnóstico serológico não produz resultadossatisfatórios; os títulos de anticorpos aumentam significativamente apenas10 a 15 dias após o início dos sinais clínicos, não sendo normalmentepossível detectá-los na criança.O método de referência continua ainda a ser o isolamento do vírus decultura de células (células Hela, KB, Hep2 ou linhas celulares defibroblastos de origem embrionária) e a sua identificação a partir deuma amostra nasofaríngea ou de líquido de lavagem broncoalveolar. Aamostra é obtida durante a fase de replicação máxima do vírus, 1 a 6dias após o início da doença.A associação dos anticorpos monoclonais específicos destes vírus comtropismo respiratório e a técnica de imunofluorescência permitiram odiagnóstico rápido destas doenças (por análise directa da amostra), semrecorrer ao método de cultura celular, o qual é difícil de realizar. Para cada um destes vírus foram seleccionados anticorpos monoclonaisdirigidos contra as proteínas virais, em primeiro lugar devido à suaespecificidade e, segundo, devido à qualidade da imagem que seobserva durante a aplicação de imunofluorescência; a aparênciahabitual é uma fluorescência granular ou de partículas, claramentevisível, no citoplasma das células infectadas. Estes anticorposmonoclonais também podem ser utilizados para identificar cada umdestes vírus, após respectivo isolamento em cultura celular.A prevalência destas infecções virais levou a Bio-Rad a propor a elaboraçãodo diagnóstico rápido das doenças de etiologia viral, da seguinte forma:• O vírus Respiratório Sincicial (RSV) é responsável por mais de 60%

destas infecções; MONOFLUOTM SCREEN R.S.V. é utilizado paraidentificar este vírus por técnica de imunofluorescência directa em umafase, da amostra recolhida.

• Os vírus Influenza A e B, para-Influenza 1, 2 e 3 e Adenovírus sãoresponsáveis, a vários níveis consoante as regiões e a época do ano,

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por cerca de 30% destas infecções. MONOFLUOTM SCREENINFLUENZA, PARA-INFLUENZA, ADENOVIRUS é utilizado paraconfirmar ou invalidar a presença de um destes vírus, por técnica deimunofluorescência directa em uma fase, na amostra; em caso deresposta positiva, o vírus incriminado pode ser identificado utilizando:- MONOFLUOTM KIT INFLUENZA (referência 52209)- MONOFLUOTM KIT PARA-INFLUENZA 1 + 2 (referência 52211)- MONOFLUOTM KIT PARA-INFLUENZA 3 (referência 52212)- MONOFLUOTM KIT KIT ADENOVIRUS (referência 52210)i

2- PRINCIPIO O dispositivo de teste MONOFLUOTM KIT Influenza destina-se à detecçãodos vírus Influenza A e B em células infectadas, por técnica deimunofluorescência indirecta utilizando anticorpos monoclonaisespecíficos de cada um destes vírus. O dispositivo de teste MONOFLUOTM KIT Adenovirus destina-se àdetecção das diferentes estirpes de Adenovírus.O dispositivo de teste MONOFLUOTM KIT para-Influenza 1+2 destina-se àdetecção dos vírus para-Influenza tipos 1 ou 2 e o dispositivo de testeMONOFLUOTM KIT para-Influenza 3 à detecção do vírus para-Influenzatipo 3. Estes anticorpos monoclonais ligam-se ao antigénio expresso nocitoplasma de células infectadas, obtidas de amostras contendosecreções ou exsudados de células do tracto respiratório, ou apósisolamento do vírus em cultura celular. A adição de conjugado anti-IgG de ratinho, marcado com fluoresceína,torna fluorescentes as células que se fixaram ao anticorpo monoclonal.As células que se ligam aos anticorpos monoclonais específicos,dirigidos contra as proteínas virais, exibem fluorescência, essencialmentecitoplásmica, de aparência granular ou em partículas, no exame aomicroscópio de fluorescência.

3- COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVOPara informações sobre as condições de armazenamento e o prazo devalidade é favor reportar-se à etiqueta da embalagem. Os reagentesguardados à temperatura de +2-8°C, na ausência de contaminaçãomicrobiana, mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validadeindicado na etiqueta (mesmo depois de abertos).

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MONOFLUOTM KIT INFLUENZA (referência 52209)

MONOFLUOTM KIT ADENOVIRUS (referência 52210)

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ETIQUETA REAGENTES APRESENTAÇÃOR1a Monoclonal Anticorpos monoclonais (ratinho) 1 x 2,5 ml

Antibody Anti-Influenza A (clone IA52/9) (frasco anti-Influenza A Conservante: < 0,1% azida sódica conta-gotas)

R1b Monoclonal Anticorpos monoclonais (ratinho) 1 x 2,5 mlAntibody Anti-Influenza B (clone IB82/2) (frascoanti-Influenza B Conservante: < 0,1% azida sódica conta-gotas)

R2 Negative Controlo negativo (sobrenadante de cultura) 1 x 2,5 mlcontrol Conservante: < 0,1% azida sódica (frasco

conta-gotas)R3 Concentrated Conjugado Concentrado (10X): 1 x 1 ml

Conjugate Anticorpos (ovelha), tampão anti-IgG de (frasco (10X) fluoresceína, contendo azul de Evans conta-gotas)

Conservante: < 0,1% azida sódica

R4 Mounting Meio de fixação (pronto a utilizar): 1 x 3 mlmedium Glicerol tamponado para imunofluorescência (frasco

Conservante: < 0,1% azida sódica conta-gotas)

ETIQUETA REAGENTES APRESENTAÇÃOR1 Monoclonal Anticorpos monoclonais (ratinho) 1 x 2,5 ml

Antibody anti-Adenovirus (clone H60 e H72) (frasco Adenovirus Conservante: < 0,1% azida sódica conta-gotas)


conta-gotas)R3 Concentrated Conjugado Concentrado (10X) : 1 x 1 ml

Conjugate Anticorpos (ovelha), tampão anti-IgG de (frasco (10X) ratinho marcado com isotiocianato de conta-gotas)

fluoresceína, contendo azul de EvansConservante: < 0,1% azida sódica



MONOFLUOTM KIT PARAINFLUENZA 1+2 (referência 52211)

MONOFLUOTM KIT PARAINFLUENZA 3 (referência 52212)

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Antibody anti-paraInfluenza 1 e 2 (clone P2 128/14) (frasco paraInfluenza 1 + 2 Conservante: < 0,1% azida sódica conta-gotas)








Antibody anti-parainfluenza 3 (clone Pi3 5/12 (frasco paraInfluenza 3 Conservante: < 0,1% azida sódica conta-gotas)







4- PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃOA qualidade dos resultados está dependente do cumprimento dasseguintes boas práticas de laboratório:• Não utilizar reagentes cujo prazo de validade tenha expirado.• Não misturar nem combinar reagentes de dispositivos que tenham

números de lote diferentes, durante um mesmo procedimento.• Antes de usar, deixar os reagentes estabilizar à temperatura ambiente

(+18-30°C).• Utilizar recipientes em vidro perfeitamente lavados e enxaguados com

água desionizada ou, de preferência, usar material descartável.• Utilizar uma nova ponta de pipeta para cada amostra.• Verificar a qualidade da água desionizada. Se se observarem

organismos fluorescentes num controlo negativo, será necessárioesterilizar a água utilizada por filtração.

• Não deixar que o conjugado seque sobre a lâmina, durante oprocesso de coloração.

INSTRUÇÕES DE SAUDE E SEGURANÇA• Usar luvas descartáveis.• Não “pipetar com a boca".• Qualquer material que entre em contacto directo com as amostras

deverá ser considerado como contaminado e, como tal, materialinfeccioso.

• Evitar o derramamento das amostras.• Respeitar sempre as técnicas e precauções em vigor quanto à

protecção contra riscos microbiológicos, no tratamento e eliminaçãodos materiais e produtos biológicos utilizados para a reacção.

ATENÇÃO: O reagente R3 (conjugado concentrado) contém azidasódica a uma concentração de <0,2%.

R22-32: Nocivo por ingestão. Em contacto com ácidos libertagases muito tóxicos. S28-60: Após contacto com a pele, lavar imediata eabundantemente com água. Este produto e o seu recipientedevem ser eliminados como resíduos perigosos.

Dados de segurança dos produtos estão disponíveis a pedido.

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Xn - Nocivo

5- AMOSTRAEstes vírus estão confinados a secreções e exsudados celulares das viasrespiratórias superiores. Para efectuar um diagnóstico directo por meio de fluorescência, é necessáriorecolher células descamadas das secreções nasais ou traqueo-brônquicas.Se se pretender isolar o vírus em cultura celular, a técnica deimunofluorescência pode igualmente ser aplicada às células que tenhamsido infectadas in vitro, logo que o efeito citopático possa ser detectado.

5.1. TÉCNICA PARA RECOLHA DE AMOSTRASOs vírus Influenza A e B, para-Influenza 1, 2 e 3 e Adenovírus sãoinvestigados em amostras contendo secreções nasais ou traqueo-brônquicas obtidas por técnica de esfregaço em algodão Q-tip® ou poraspiração ou lavagem nasal com solução tampão PBS. Para análisedirecta das amostras em imunofluorescência, as secreções respiratóriaspodem ser transferidas para o laboratório.Em caso de isolamento viral, as secreções são recolhidas em meio detransporte apropriado para manter o vírus: de preferência, soluçãosalina – ou meio MEM tamponado (já que uma parte dos vírus comtropismo respiratório perde a sua natureza infecciosa em meio ácido) eenriquecida com determinadas substâncias destinadas a proteger osvírus: albumina bovina, gelatina, soro de galinha, sacarose e antibiótico.A fórmula seguinte é um exemplo:• MEM, 5 mg/ml albumina bovina, 4.76 mg/ml HEPES, 0.22 mg/ml

bicarbonato de sódio, 1500 U/ml penicilina, 1000 mcg/mlestreptomicina.

Para isolamento, a amostra deve ser transportada em estado decongelação profunda ou a frio. Um elemento fundamental é obter umaquantidade suficiente de secreções. Normalmente torna-se mais eficaz econveniente recolher secreções respiratórias, muitas vezes secreções demuco, por aspiração, utilizando um pequeno tubo acoplado a umrecipiente de recolha de amostras, sendo o tubo inserido no nariz dacriança. Este sistema encontra-se disponível no mercado sob adesignação de “ bomba de sucção de mucosidades”. Caso não sejapossível proceder à aspiração na criança acamada, poder-se-á utilizaruma seringa de elevada capacidade (50 ml), uma bomba de aspiraçãomanual ou, se possível, um sistema de aspiração eléctrico.Por vezes, como por exemplo em casos de bronquiolite, o nariz da

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criança está seco, não sendo, por isso, possível obter secreções emquantidade suficiente. Neste caso, pode-se utilizar a lavagem com umenema nasal: instilar alguns mililitros de solução numa passagem nasale, em seguida, este líquido é imediatamente aspirado.Na maioria dos casos, a aspiração nasal permite recolher, pelo menos,0,2 a 0,5 ml de secreções. Este material é então transferido para olaboratório ou colocado no meio de transporte apropriado paraisolamento do vírus em cultura celular.À temperatura ambiente (18-30°C) , o armazenamento por menos de 3horas não altera a qualidade dos antigénios virais na amostra.Recomenda-se o armazenamento a frio (+2 - 8°C) para isolamento viral,mas a inoculação das culturas celulares não deve ser protelada pormuito tempo, uma vez que o seu poder infeccioso diminui, mesmo apóscongelação profunda a -70°C.

5.2. TRATAMENTO DAS AMOSTRAS ANTES DO TESTE I.F. No laboratório é necessário proceder a várias lavagens sucessivas do materialaspirado para obter uma suspensão de células nasais isentas de muco.• Preparar o volume necessário de tampão PBS para tratamentos e

lavagens, diluindo solução concentrada 10 vezes em água destiladaesterilizada.

• Adicionar 5 ml de PBS a aproximadamente 0,5 - 1 ml de secreções.Agitar lentamente.

• Centrifugar durante 10 minutos a 500 g a +2 - 8°C. Decantar o fluidosobrenadante

• Adicionar 5 ml de PBS ao precipitado e centrifugar. Repetir oprocedimento de lavagem 2 ou 3 vezes para eliminar completamentequalquer muco.

• Após a centrifugação final, adicionar 1 ml de PBS a precipitadocelular. Homogeneizar a suspensão por pipetagem.

• Aplicar as células nas lâminas. • Proceder à fixação e coloração das células (ver a técnica de coloração).

5.3. ISOLAMENTO DO VÍRUS EM CULTURA CELULARUma vez que alguns destes vírus com tropismo respiratório sãotermolábeis, é importante inocular as culturas celulares o maisrapidamente possível após a recolha da amostra.No laboratório, as amostras devem ser congeladas e descongeladas, por

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forma a que as células realizem a citólise e libertem as partículas de vírus.Centrifugar durante 10 minutos a 500 g, à temperatura de +2 - 8°C,para eliminar os detritos celulares (2000 rpm). Inocular, com a amostraobtida, a cultura celular destinada a este fim.As células utilizadas são Hep2, Hela ou KB, bem como linhas celularesdiplóides de fibroblastos embrionários humanos num meio MEMcontendo 5 a 8% de soro fetal de vitela.Os volumes de inoculado e de meio de cultura podem diferir consoante orecipiente utilizado para cultura celular.• Se forem utilizados tubos de Leighton, inocular a cultura com 0,3 ml

de amostra. Manter em contacto durante 2h30 a 37°C e, emseguida, diluir a 1,2 ml com o meio de cultura.

• Se for utilizado um frasco de 25 cm3, inocular com 1 ml de amostra.Incubar a +37°C durante 2h30 e, em seguida, diluir a 12 ml com omeio de cultura. Incubar as células a +37°C até se observar o efeitocitopático do vírus (cerca de 4 a 6 dias).

Observação do efeito citopáticoObservar a célula inoculada ao microscópio óptico de contraste de fasee seguir o desenvolvimento do efeito citopático: separação progressivade pequenas células mais ou menos redondas e refractivas com algumasinclusões nucleares de vírus Influenza e para-Influenza, e grandes célulasredondas formando agregados de Adenovirus.Se, ao fim de 6 a 8 dias, o efeito citopático não for ainda observável,após inoculação de uma amostra, prosseguir, de qualquer forma, com acoloração. A replicação viral pode ser suficiente para ser detectadanesta fase por imunofluorescência.De considerar uma segunda passagem nas células.

6- MODO DE FUNCIONAMENTO

6.1 - MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO• Água destilada ou totalmente desionizada• Lixívia• Papel absorvente• Luvas descartáveis • Tampão de fosfato (PBS) pH 7.2 para IF (concentrado 10X) - 50 ml –

referência 74901

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• Acetona• Pipetas Pasteur esterilizadas• Pipetas automáticas ou semi-automáticas, ajustáveis ou fixas, de 10 a

200µl e 1ml de capacidade de distribuição.• Tubos de ensaio graduados de 10 ml ou 25 ml de capacidade• Tubos descartáveis• Tubos para centrifugação• Lâminas de imunofluorescência – referência 50569 (2 poços) ou

50566 (6 poços)• Lamelas de cobertura • Microscópio de fluorescência• Recipiente para resíduos biológicos perigosos

6.2 – RECONSTITUIÇÃO E ARMAZENAMENTO DOS REAGENTES R3: Diluir o conteúdo do frasco com 9 ml de tampão fosfato para obter adiluição da solução pronta a utilizar. Após diluição, o conjugado anti-IgG de ratinho, conservado à temperatura de +2-8°C e na ausência decontaminação microbiana, mantém-se estável por 3 meses.

6.3 - PROCEDIMENTO

6.3.1. APLICAÇÃO E FIXAÇÃO DAS CÉLULAS

• Análise directa na amostra- Distribuir 20 µl da amostra tratada (resíduo de centrifugação

celular) num poço da lâmina.- Secar as lâminas ao ar utilizando um secador ou deixando secar à

temperatura ambiente.- Fixar em banho de acetona a -20°C durante 5 minutos.- Deixar as lâminas secar ao ar.

• Cultura celular na lâmina- Lavar a lâmina duas vezes durante 1 minuto em banho PBS.- Deixar a lâmina secar ao ar.- Fixar em banho de acetona a -20°C durante 5 minutos.• Cultura celular em frasco

- Retirar o meio. Recolher as células, raspando em 1 ml de PBS.- Resuspender as células, aspirando e rejeitando várias vezes, por

meio de uma pipeta cónica.

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- Em seguida, proceder à aplicação e fixação das células, tal comodescrito na análise directa da amostra.

6.3.2. APLICAÇÃO DE ANTICORPOS

1. Preparar o volume necessário de tampão fosfato (PBS) para lavagem,diluindo a solução concentrada 10 vezes em água destilada esterilizada.

2. Preparar o Conjugado R3 (ver o capítulo 6.2)3. Distribuir uma gota de anticorpos monoclonais específicos (R1a e R1b

para Influenza A e B) nos primeiros poços, (primeiro e segundo poçospara Influenza A e B), tendo o cuidado de cobrir toda a superfície circular.

4. Distribuir uma gota de controlo negativo (R2) no poço seguinte.5. Incubar a lâmina durante 30 minutos a +37°C numa incubadora húmida. 6. Uma vez terminado o tempo de incubação, lavar cuidadosamente a

lâmina com PBS, utilizando um frasco de lavagem. 7. Lavar duas vezes durante 2 a 5 minutos com PBS. Agitar levemente.8. Deixar a lâmina secar ao ar.9. Agitar levemente o conjugado diluído (R3); distribuir uma gota de

conjugado diluído (R3) em cada poço.10.Incubar durante 30 minutos a 37°C em câmara húmida.11.Após incubação, lavar cuidadosamente a lâmina com PBS, utilizando

um frasco de lavagem.12.Lavar duas vezes durante 2 a 5 minutos com PBS. Agitar levemente.13.Mergulhar a lâmina (por alguns segundos) em água destilada.14.Deixar a lâmina secar ao ar.15.Montar com a lamela de cobertura, utilizando o glicerol tamponado

(R4). Verificar se a lâmina se encontra isenta de bolhas de ar. Cobrir alâmina com o verniz.

7- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

7.1 – CONTROLO DE QUALIDADEAplicar simultaneamente a coloração numa lâmina de referência,utilizando células positivas e negativas.

7.2 – LEITURA E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOSExaminar as lâminas utilizando um microscópio de fluorescência, comuma ampliação de X100 e X400:

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• Leitura do poço de controlo negativo: não se observa qualquer célulafluorescente após análise de todo o poço.

• Reacção positiva: fluorescência granular intra-citoplásmica entre outras célulasavermelhadas; observa-se, pelo menos, uma célula fluorescente característica.

• Reacção negativa: não se observa qualquer célula fluorescente apósanálise de todos os poços.

Nota: as lâminas devem ser lidas imediatamente para se obterem osmelhores resultados. No entanto, elas podem ser conservadas àtemperatura de +2 - 8°C, em local escuro, durante 24 horas.

8- LIMITES DO TESTEO diagnóstico de uma infecção recente só pode ser estabelecido combase numa combinação de observações clínicas e dados serológicos. Oresultado de um único teste não constitui prova suficiente para odiagnóstico de uma infecção recente.

9- CONTROLO DE QUALIDADE DO TESTEOs desempenhos dos dispositivos MONOFLUOTM KITS são controladosutilizando lâminas revestidas com controlos positivos e negativos.Estas são testadas com anticorpos monoclonais específicos de cada víruse com sobrenadante negativo.Os resultados são os seguintes:

- com anticorpos monoclonais: presença de células fluorescentes,intensidade ≥ ++

- com sobrenadante de cultura: ausência de células fluorescentes.

10-CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICOTodos os reagentes são fabricados e preparados de acordo com o nossoSistema de Qualidade, desde a recepção das matérias primas até àcomercialização do produto final. Cada lote é submetido a um controlo dequalidade, sendo comercializado apenas quando em total conformidadecom os critérios de aceitação predefinidos. Os registos relacionados com aprodução e controlo de cada lote são arquivados pela Bio-Rad.

11-REFERENCES

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