Aplicaciones de la Epidemiología Molecular en la Salud Animal.Caso Estudio: Brucelosis

Ing. Duglas Ernesto León NúñezAbril 2012

República Bolivariana de VenezuelaMinisterio del Poder Popular para la Agricultura y Tierras

Instituto nacional de investigaciones agrícolasEscuela Socialista de Agricultura Tropical

Doctorado en Biotecnología Agrícola Mención Animal

Aplicaciones de la Epidemiología Molecular en Salud Animal

Caso Estudio: Brucelosis

Autor:Ing. Duglas Ernesto León NCátedra: Epidemiología MolecularFacilitadora: Dra. Rita Tamasaukas.

Maracay, Abril de 2012

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TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN...........................................................................................................3

EPIDEMIOLOGIA DE LA BRUCELOSIS............................................................................5

UTILIDAD DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL ESTUDIO DE LAS ZOONOSIS...............6

TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE BRUCELLA....................................................................7

PCR MÚLTIPLE (BRUCE-LADDER)..................................................................................8

PCR TIEMPO REAL (REAL – TIME) EN BRUCELOSIS.....................................................10

APLICACIONES DE MLVA (Detección De Polimorfismos En Las Secuencias Repetidas En Tandem) EN BRUCELOSIS.....................................................................................11

ANÁLISIS DE BRUCELAS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPO PULSADO (PFGE)13

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................14

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INTRODUCCIÓN

La brucelosis es una infección bacteriana producida por una bacteria del

género Brucella Gram negativa, pequeña, inmóvil y aerobia estricta, de crecimiento

lento que no poseen cápsulas ni forman esporas. La brucelosis también conocida

como aborto de Bang o Fiebre de Malta, descrita en los marinos de la guerra de

Crimea. (Ariza, 2002)

La Brucelosis en animales, es una enfermedad infecciosa limitante del

desarrollo productivo. Se encuentra ubicada en la lista B de la OIE donde se

enumeran enfermedades transmisibles que se consideran importantes desde el

punto de vista socioeconómico y/o sanitario a nivel nacional y cuyas repercusiones

en el comercio internacional de animales y productos de origen animal son

considerables (MEDEROS et al. 1981 y OIE, 2003, citado por RODRÍGUEZ, et al,

2005).

Según ACHA y SZYFRES (2001), La brucelosis es una enfermedad de alta

contagiosidad que afecta diversas especies animales, se transmite al hombre y

constituye una zoonosis que es aún motivo de preocupación a nivel mundial. En tal

sentido GODFROID et al, (2005), establecen que Si bien la enfermedad humana ha

estado asociada a un reservorio animal, la complejidad de la interacción entre

humanos y animales se ha incrementado en los últimos años ante la aparición de

nuevas especies.

SAMARTINO (2003), señala que la Brucelosis es una enfermedad de curso

crónico, afecta de forma severa la salud del animal al ocasionar abortos en varias

especies de importancia zootécnica, lo que genera un impacto económico negativo

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en la industria por las importantes pérdidas originadas en la producción de carne y

leche.

En el caso particular de Venezuela, la brucelosis es una enfermedad que

causa importantes pérdidas económicas, especialmente en la ganadería bovina, la

misma constituye un problema de salud pública. La enfermedad se conoce en el

país desde el año 1930 pero no fue sino hasta el año 1968 cuando el Ministerio de

Agricultura y Cría (MAC), publica la resolución para la campaña nacional de control

de la brucelosis que aun continúa en vigencia (MAC, 1987). En la actualidad, el

organismo que regula la materia sanitaria animal es el “Instituto Nacional de Salud

Agrícola Integral” INSAI, el cual está encargado de velar por el cumplimiento de las

normas establecidas para el control y erradicación de la enfermedad.

VARGAS (2003) señala que en Venezuela la brucelosis constituye un

verdadero problema de salud pública al cual se le viene dando mayor importancia

en los últimos años. La enfermedad es principalmente de tipo ocupacional,

afectando al personal que trabaja en ganaderías, mataderos, granjas porcinas y

laboratorios que pueden entrar en contacto con placentas, secreciones y fetos

abortados de animales infectados, siendo observadas alteraciones osteoarticulares y

cardiacas de tipo crónico en muchos pacientes afectados.

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EPIDEMIOLOGIA DE LA BRUCELOSIS

La epidemiología de la brucelosis es compleja y ha tenido variaciones con el

tiempo. Se estima que anualmente existen en el mundo más de 500.000 casos

nuevos, representando una de las zoonosis más frecuentes. La enfermedad es

endémica en países del Mediterráneo como Portugal, España, el sur de Francia,

Italia, Grecia, Turquía y África del Norte, así como en Centro y Sudamérica, algunas

partes de México, Asia y el medio Oriente (PAPPAS, et al 2006).

Las formas de transmisión al ser humano son principalmente la ingestión de

productos de origen animal no pasteurizados, contacto directo con un animal

infectado o por la inhalación de partículas. La ruta más común de transmisión es a

través del consumo de productos no pasteurizados, principalmente leche, quesos,

mantequilla y helados. Así mismo los trabajadores de mataderos, veterinarios,

ganaderos y trabajadores de laboratorios tienen alto riesgo de adquirir la infección.

(SBRIGLIO, et al 2007)

El “Centers for Disease Control and Prevention” (2000), establece que la

Brucella, ha sido considerada como un arma biológica, pues se piensa que la

liberación al medio ambiente de partículas que contengan esta bacteria produciría

82.500 casos nuevos de brucelosis.

DORIS (2006), señala que en el caso particular de los animales, la forma

principal de contagio es la vía digestiva, esta se produce cuando los animales lamen

fetos abortados, terneros recién nacidos y/o los genitales de otros animales, y si

estos están brucelosos se produce una ingestión masiva de bacterias. También es

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importante la ingestión de pastos, forrajes y aguas contaminados con secreciones

vaginales y leche de hembras enfermas.

Algunos autores consideran que el contagio por vía cutánea tiene por lo

menos, la misma importancia, por ejemplo: se pueden producir infecciones

mediante las camas infectadas, cuando haya lesiones en las tetillas o en los

extremos de los miembros o en el espacio interdigital que faciliten la penetración

del agente patógeno en capas profundas de la piel, al ordeñar, quizás puedan

introducir Brucella en la piel de los pezones las manos humedecidas con leche

infectada (Rodríguez et al., 2005). La vía genital puede ser importante solo si se

realiza inseminación artificial con semen infectado, de lo contrario, la brucelosis

bovina no es una enfermedad venérea. El semen de un toro infectado puede

contener grandes cantidades pero sin embargo no contagia a la vaca. La razón es

que la acidez de la vagina contribuye a destruir a las brucelas.

La vigilancia epidemiológica, entendida como información para la acción,

constituye un instrumento de vital importancia para identificar, medir y analizar los

problemas y condicionantes de la salud que afectan a la población y sobre esa base,

tomar decisiones orientadas a promocionar la salud. (GARCÍA, 2004).

UTILIDAD DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN EL ESTUDIO DE LAS ZOONOSIS

Las técnicas de biología molecular para la detección rápida y directa de

ácidos nucleicos de los diferentes microrganismos son muy útiles en el estudio

epidemiológico de las enfermedades infecciosas. Un gran número de estas técnicas

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de identificación rápida se han desarrollado con base en la amplificación enzimática

de secuencias específicas de ácidos nucleicos; estas técnicas incluyen: la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR), el RFLP (Restriction Fragment lenght Polymorphism),

ribotyping (ribotipificación), PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis), RAPD (Random

Amplified Polymorphic ADN) Ampliación al azar del ADN y el Spoligotyping, MLVA

(detección de polimorfismos en las secuencias repetidas en tandem)

Estos nuevos métodos de análisis a nivel genético han aumentado la

posibilidad de diferenciar las cepas bacterianas y han permitido llevar a cabo

estudios epidemiológicos moleculares. La comparación de cepas para establecer su

identidad se basa en el hecho de que las cepas relacionadas epidemiológicamente

provienen de la expansión clonal de un precursor único. (MÁTTAR, 2000)

En el caso de la Brucelosis, como de otras enfermedades, muchas de estás

técnicas han venido desarrollándose y protocolizándose, de manera tal que hoy en

día constituyen herramientas de caracterización molecular que permiten hacer

estudios epidemiológicos comparativos entre los diversos biovares existentes.

TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE BRUCELLA

En la tipificación de Brucelas, se utilizan técnicas de PCR convencional,

múltiple y a tiempo real, así como PCR-RFLP y MLVA (detección de polimorfismos en

las secuencias repetidas en tandem). En tal sentido GARCIA (2009), en sus estudios

doctorales, analizó los polimorfismos entre las especies y biovariedades de Brucella

y se han seleccionado un panel de marcadores moleculares basados en inserciones,

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deleciones, mutaciones puntuales y secuencias repetidas en tandem para la

discriminación de Brucella.

PCR MÚLTIPLE (BRUCE-LADDER)

GARCIA (2009), desarrolló una técnica de PCR múltiplex (Bruce-ladder) capaz

de discriminar en un solo ensayo entre todas las especies de Brucella (B. abortus, B.

melitensis, B. suis, B. ovis, B. canis y B. neotomae), incluidas los aislamientos de

mamíferos marinos, y las cepas vacunales B. abortus RB51, B19 y B. melitensis Rev1

(Figura 1).

FIGURA 1. RESULTADO DE LA PCR BRUCE-LADDER: (m), Brucella de aislamientos marinos; (M), B.

melitensis; (Rev1), B. melitensis Rev1; (O), B. ovis; (A), B. abortus; (RB51), B. abortus RB51; (B19), B.

abortus B19; (S), B. suis; (C), B. canis; (Neo), B. neotomae. Los números indican el peso molecular de

los fragmentos amplificados. Con flechas blancas se indican las diferencias entre especies. Cada

especie o cepa vacunal presenta un perfil característico que permite su diferenciación mediante una

PCR convencional. (GARCIA 2009)

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De forma similar, GARCIA (2009) mediante otros ensayos de PCR múltiplex ha

sido posible discriminar entre las cinco biovariedades de B. suis. Estos mismos

ensayos se han desarrollado también en formato para PCR a tiempo real basados en

sondas TaqMan MGB. Por otra parte, mediante el análisis por MLVA se ha

demostrado la estabilidad genética de la cepa vacunal Rev1, independientemente

del origen geográfico, comercial o tipo de aislamiento.

En ese mismo Orden de ideas GARCIA (2009) señala que mediante esta

misma técnica se ha demostrado la existencia de brotes epidemiológicos por B. suis

y se ha confirmado la infección cruzada de B. suis entre animales salvajes y

domésticos.

GARCIA (2009) concluye que éste ensayo, que se realiza en un solo paso,

permite saber qué tipo de brucela causa la infección. La técnica ha sido evaluada en

siete laboratorios europeos con más de 600 cepas de Brucella de origen animal y

humano y de distinta procedencia geográfica. Se puede realizar en menos de 24

horas, en cualquier laboratorio de diagnóstico básico, sustituye a las técnicas

biológicas y bioquímicas clásicas y evita la excesiva manipulación de este importante

patógeno.

Esta técnica ha sido reconocida y recomendada por la OIE (Organización

Mundial de Sanidad Animal) en su último “Manual de brucelosis bovina” para la

tipificación molecular de Brucella, sustituyendo a otras como la PCR-AMOS.

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PCR TIEMPO REAL (REAL – TIME) EN BRUCELOSIS

La PCR en tiempo real (o PCR cuantitativa) surgió para resolver el problema

de la cuantificación de la técnica de la PCR. En la PCR en tiempo real se emplean

sondas marcadas con fluorocromos. Las sondas de hidrólisis, frecuentemente

empleadas en esta técnica, son oligonucleótidos que presentan fluorocromos en

ambos extremos y tienen una secuencia complementaria a parte del fragmento de

ADN que se quiere amplificar (FIBAO, 2007)

Los estudios de GARCÍA (2009), permitieron protocolizar un ensayo de PCR a

tiempo real que permite la detección específica de todas las especies y

biovariedades del género Brucella con una sensibilidad de 100 fg de ADN y una

especificidad del 100% (Figura 2).

FIGURA 2. DETECCIÓN DE ADN DE B. ABORTUS MEDIANTE PCR A TIEMPO REAL. En colaboración con

la empresa española de biotecnología veterinaria Ingenasa se han desarrollado varios kits

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comerciales de PCR a tiempo real para la detección de Brucella y la diferenciación específica en una

sola reacción de B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. ovis. GARCÍA (2009)

APLICACIONES DE MLVA (Detección De Polimorfismos En Las Secuencias Repetidas

En Tandem) EN BRUCELOSIS

En 1980 A. R. Wyman y R. White descubrieron, por azar, la primera región

hipervariable del ADN humano, y subsecuentemente se fueron hallando otras

regiones de ese tipo cerca de los genes de la globina, la insulina, la mioglobina y

otros. Estas secuencias no codificantes e hipervariables del ADN (de una longitud

aproximada de entre 6 y 25 pb) repetidos en tándem un número variable de veces

en sus siglas en ingles (VNTR), están ubicados en regiones Centroamérica y

teloméricas de los cromosomas y forman secuencias de entre 5 y 50 kb de longitud.

(FERNANDO, J. JEAN-LOUIS G, 2003).

Esta técnica molecular es empleada para el análisis genético de los microrganismos

particulares, tales como bacterias patógenas, que se aprovecha del polimorfismo de

secuencias de ADN repetidas en tándem, por lo que su uso en brucellas ha tenido

aplicaciones en filogenia y en caracterizaciones específicas para el análisis de las

vacunas.

El diagnóstico y la tipificación correctas son esenciales para llevar a cabo estudios

epidemiológicos que permitan el control y la erradicación de la infección por

brucelosis.

Las aplicación de técnicas moleculares que permiten discriminar a nivel genético

entre cepas de la misma bacteria, lo que se conoce como MLVA (de forma coloquial

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podríamos definir estas técnicas como “pruebas de paternidad” pero aplicadas a los

microorganismos).

Para el control sanitario de la brucelosis, se emplean vacunas vivas y es esencial que

estas sean estables e idénticas independientemente del origen geográfico, comercial

o tipo de aislamiento. GARCÍA (2009) demostró que mediante el uso de MLVA se

puede emplear para garantizar la calidad y estabilidad de las vacunas de brucelosis.

En los estudios de GARCÍA (2009), se realizaron aislamientos de B. suis los ciales

demuestran una perfecta correlación entre las pruebas moleculares y otras técnicas,

siendo capaces de demostrar la existencia de brotes epidemiológicos y confirmar la

infección cruzada de B. suis entre animales salvajes (jabalíes) y domésticos (cerdos)

(FIGURA 3)

FIGURA 3. Ejemplo de análisis molecular por MLVA de aislamientos de B. suis. Los recuadros en rojo

señalan una posible infección cruzada de B. suis entre jabalíes y cerdos domésticos en un caso (a), y la

existencia de brotes epidemiológicos en el otro (b). GARCÍA (2009)

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ANÁLISIS DE BRUCELAS POR ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPO PULSADO (PFGE)

Las técnicas moleculares para el análisis de ADN cromosomal como el PFGE

han demostrado ser un método eficiente para resolver divergencias entre las

diferentes cepas de brucelas y ha sido bastante utilizado en el estudio

epidemiológico de las mismas. La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) es

una de las técnicas más modernas utilizadas en estudios epidemiológicos, ya que es

capaz de separar fragmentos de 10 kpb hasta 10.000 kpb y por esta razón ha

demostrado ser altamente discriminatoria para estudios epidemiológicos por su

habilidad para diferenciar intre especies de aislados bacterianos en estudios

epidemiológicos de zoonosis.

Los estudios sugieren que PFGE es una técnica útil en la diferenciación de

cepas provenientes de animales y del hombre y que puede complementar otras

técnicas moleculares para propósitos epidemiológicos, para prevención y control de

importantes infecciones bacterianas. Este método es además, fácilmente

reproducible, relativamente estable y rápido en comparación con métodos que

requieren hibridizaciones de ADN (MÁTTAR, 2000).

La Brucella ovis es reconocida mundialmente como un importante patógeno

de ovejas, y también ha sido identificado en los ciervos de cría en Nueva Zelanda.

Anteriormente, sólo un tipo de cepa de B. ovis ha sido identificado. Utilizando la

técnica de ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPO PULSADO (PFGE) en aislamientos de

campo de B. ovis, se para determinó si las ovejas y los ciervos se ven afectados por

las mismas cepas (Ridler, et.al. 2005)

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