Multilocus Sequence Typing of Pseudomonas aeruginosa ... · Unit Microbiology Laboratory ประจ าปีงบประมาณ 2560 ... Fiscal Year 2017 ... จ านวน

Suchanya Malila

โรงพยาบาลธรรมศาสตรเฉลมพระเกยรต Thammasat University Hospital หนวยงาน หนวยจลชววทยา

Unit Microbiology Laboratory ประจ าปงบประมาณ 2560

Fiscal Year 2017

Multilocus Sequence Typing of Pseudomonas aeruginosa Isolates Collected from Thammasat University Hospital: A Molecular

Epidemiology Study

นรศรา มงกรแกว Narissara Mungkornkaew

ล าไพร ตรรกวจนวงศ Lumpai Takkavatjanawong

สชญญา มะลลา

โรงพยาบาลธรรมศาสตรเฉลมพระเกยรต Thammasat University Hospital

โครงการวจยเพอพฒนางานของโรงพยาบาลธรรมศาสตรเฉลมพระเกยรต Thammasat University Hospital Research Project for Performance Development

ของ Of

นางนรศรา มงกรแกว

Mrs. Narissara Mungkornkaew

เรอง Subject

Multilocus Sequence Typing of Pseudomonas aeruginosa isolates collected from Thammasat University Hospital: A molecular epidemiology study

ไดผานการตรวจสอบและอนมตทนสนบสนนจาก โรงพยาบาลธรรมศาสตรเฉลมพระเกยรต

Be verified and approved by the Thammasat University Hospital ปงบประมาณ 2560 Fiscal Year 2017

เมอวนท 13 มนาคม 2560 Date 13 March 2017

อาจารยทปรกษาโครงการ Project Advisor ( ) รศ.ดร. วรดา สโมสรสข ประธานกรรมการโครงการ Chair Of Committee ( ) ศ.นพ. กองเกยรต กณฑกนทรากร ผอ านวยการ Director ( ) รศ.นพ. พฤหส ตออดม

ก

บทคดยอ

Pseudomonas aeruginosa เปนเชอแบคทเรยฉวยโอกาสซงอาจเปนสาเหตของโรคตดเชอในโรงพยาบาล โดยเฉพาะอยางยง การตดเชอหลงการผาตด การวจยครงนมวตถประสงคเพอจ าแนกรปแบบ Variation Number Tandem Repeats (VNTR) ของเชอ P. aeruginosa จากแผลผปวยหลงผาตดและน าประปาภายในหองผาตด ในโรงพยาบาลธรรมศาสตร เพอวเคราะหถงแหลงทมาและสาเหตของการตดเชอ P. aeruginosa ในผปวย โดยท าการสกดดเอนเอของเชอ P. aeruginosa จ านวน 18 ไอโซเลท ประกอบดวย เชอทแยกไดจากผปวย 5 ราย และ จากน าประปาในหองผาตด 13 ตวอยาง และท าการวเคราะหการเรยงตวของเบสทซ าๆกน จากชนสวนยนทเปน VNTR 3 ต าแหนง ไดแก ms209 (CACGAA), ms010 (TGGCTG) และ ms061 (GTTGGC) เพ อจ าแนกรปแบบของเชอ โดยใชเทคนค pyrosequencing ผลการจ าแนกรปแบบของเชอ P. aeruginosa โดยใช VNTR จากตวอยางทงหมด 18 ตวอยาง สามารถจ าแนกรปแบบ VNTR แตกตางกนได 9 แบบ บงบอกไดวามเชอ P. aeruginosa จ านวน 9 สายพนธ โดยพบวาตวอยางทเกบไดจากน าประปา ม รปแบบ VNTR 4 แบบ (VNTR type 1-4) และ ตวอยางท เกบไดจากแผลผาตดผ ปวย 5 ราย มรปแบบ VNTR 5 แบบ (VNTR type 6-9) ซงรปแบบ VNTR ของเชอจากน าประปาในหองผาตด แตกตางกบรปแบบของเชอทพบในผปวย งานวจยน แสดงใหเหนวา เชอ P. aeruginosa ทแยกไดจากในผปวย ไมใชสายพนธเดยวกบทแยกไดจากน าประปาในหองผาตด และเชอทแยกไดจากผปวยแตละราย เปนสายพนธทแตกตางกน ผลการวจย สรปไดวา การตดเชอ P. aeruginosa หลงการผาตดของผปวย ไมไดเกดจากเชอทตรวจพบในน าประปา การจ าแนกรปแบบ VNTR ของเชอ ดวยเทคนค pyrosequencing เปนเทคนคทสามารถจ าแนกความหลากหลายทางพนธกรรมของเชอ เพอใชศกษาทางดานระบาดวทยา

ค ำส ำคญ: Pseudomonas aeruginosa, Variation Number Tandem Repeats, Pyrosequencing

ข

ABSTRACT

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterium and a causative agent of hospital-

acquired infection especially postoperative wound infection. The purpose of this study is to

classify VNTR types of P. aeruginosa isolated from postoperative wound infection and tap water

in operating room in Thammasat University Hospital for analysis of the source of Pseudomonas

aeruginosa infection. DNA extraction of 18 P. aeruginosa isolates consisted of 13 tap-water

isolates and 5 surgical wound isolates were done and VNTR types were analyzed with 3 VNTR

loci including ms209 (CACGAA), ms010 (TGGCTG) and ms061 (GTTGGC) using

pyrosequencing technique. Of 18 P. aeruginosa isolates, 9 VNTR types were classified. It has

been suggested that P. aeruginosa isolates in this study were divided into 9 genetic different

strains. The isolates of tap water classified into 4 VNTR types (VNTR type 1 to 4) were different

from 5 VNTR types (VNTR type 6 to 9) of surgical wound isolates. Moreover, each surgical

wound isolate from each patient was characterized in different VNTR type. It was concluded that

postoperative wound infections of P. aeruginosa in patients did not occur from those isolates of

tap water. The VNTR typing using pyrosequencing technique has discriminatory power in genetic

variation of P. aeruginosa isolates for epidemiological study.

Key words: Pseudomonas aeruginosa, Variation Number Tandem Repeats, Pyrosequencing

ค

กตตกรรมประกาศ

งานวจยเรอง Multilocus Sequence Typing of Pseudomonas aeruginosa isolates collected

from Thammasat University Hospital: A molecular epidemiology study ส าเรจลลวงไปไดดวยดจน

เปนรายงานการวจยฉบบน เนองดวยความอนเคราะหและความชวยเหลอจาก รองศาสตราจารย ดร.

วรด า ส โม ส ร ส ข อ าจ าร ยป ระ จ าภ าค ว ช า เท ค น ค ก ารแพ ท ย คณ ะส ห เวช ศ าส ต ร

มหาวทยาลยธรรมศาสตรทกรณาใหค าปรกษา และค าแนะน าในการปฏบตการ การวเคราะห

ผลการวจยรวมทงใหความอนเคราะหต ารา วารสาร และเอกสารทางวชาการ และขอมลตางๆ ทเปน

ประโยชนในการท าวจย ตลอดจนการแกไขตรวจทานรปเลมงานวจยจนส าเรจเปนฉบบทสมบรณ

ขอขอบคณ คณ จฑามาศ เงาะผล บ รษท iScience Technology co.,Ltd. ท ใหความอนเคราะหในการใหความร และค าปรกษาในดานทฤษฎและปฏบตในการท าวจยรวมท งการวเคราะหหาความแตกตางของล าดบเบสเพอจ าแนกสายพนธของเชอ Pseudomonas aeruginosa นอกจากนยงขอบคณ นางสาวปรชมา ค าด นกศกษาปรญญาโทภาควชาเทคนคการแพทย นางสาวพมพมาดา องกรนราธป และนางสาวพรรณวมน จรยะรตนรชต นกศกษาปรญญาตรภาควชาเทคนคการแพทย มหาวทยาลยธรรมศาสตร ในการปฏบตงานวจยทางดานชวโมเลกลจนส าเรจลลวงไปดวยด ขอขอบคณสมาชกหนวยจลชววทยาทกคนทเปนก าลงส าคญในการปฏบตงาน การวจยครงนไดรบทนสนบสนนการวจยจากโรงพยาบาลธรรมศาสตรเฉลมพระเกยรต ปงบประมาณ 2560

นรศรา มงกรแกว

ล าไพร ตรรกวจนวงศ

สชญญา มะลลา

มนาคม 2562

ง

สารบญ

หนา

บทคดยอภาษาไทย ( Abstract Thai) ก

บทคดยอภาษาองกฤษ (Abstract English) ข

กตตกรรมประกาศ (Acknowledgments) ค

สารบญ (Table of Content) ง

สารบญตาราง (List of Tables) จ

สารบญภาพ (List of Figures) ฉ

ค าอธบายสญลกษณและค ายอ (List of Abbreviations) ช

บทท 1 บทน า (Introduction) 1.1 ความเปนมาและความส าคญของปญหา 1 1.2 วตถประสงคของการวจย 2 1.3 ขอบเขตของการวจย 2 1.4 ทฤษฎและแนวคด 2 1.5 สมมตฐานงานวจย 4 1.6 ค าส าคญของการวจย 4 1.7 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 4

บทท 2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ (Literature Review) 2.1 ทฤษฎทเกยวของ 5 2.2 งานวจยทเกยวของ 11

บทท 3 วธการด าเนนงานวจย (Materials and Methods) 3.1 แบคทเรยทใชในงานวจย 14 3.2 การเกบเชอแบคทเรย 15 3.3 การเพาะเชอแบคทเรย 15 3.4 การศกษาลกษณะทาง Phenotype 15 3.5 การศกษาลกษณะทาง Genotype 15

จ

บทท 4 ผลการวจย (Results) 4.1 การศกษาลกษณะทาง Phenotype 23 4.2 การศกษาลกษณะทาง Genotype 28

บทท 5 สรป อภปรายผล และขอเสนอแนะ (Conclusion Discussion and Suggestion) 5.1 สรปผลการวจย 38 5.2 อภปรายผลการวจย 38

บรรณานกรม (Bibliography) 40

ภาคผนวก (Appendices) ภาคผนวก ก (Appendix A) 44

ประวตนกวจย (Curriculum Vitae) 47

ฉ

สารบญตาราง

หนา ตารางท 1. แบคทเรยและแหลงทมา 14 2. แสดง Reaction condition ของ ms209 และ ms061 20 3. แสดง Reaction condition ของ ms010 20 4. แสดงรปแบบของ repeated unit ของ VNTR region ms209, ms010, ms061 21 5. ผลการตรวจพสจนเชอและทดสอบความไวตอสารตานจลชพ 27 6. แสดงผลปรมาณ DNA และคณภาพหลงจากการสกด 29 7. จ านวนเบสซ า CACGAA ของ 18 ตวอยางท VNTR ต าแหนง ms209 34 8. จ านวนเบสซ า TGGCTG ของ 18 ตวอยางท VNTR ต าแหนง ms010 35 9. จ านวนเบสซ า GTTGGC ของ 18 ตวอยางท VNTR ต าแหนง ms061 36 10. รปแบบจ านวนเบสซ าในทกต าแหนงของ VNTR ทสมพนธกบการระบสายพนธ 37

ช

สารบญภาพ หนา

ภาพท

1. P. aeruginosa ทแสดงถง monotrichous flagella 6

2. หลกการของเทคนค Pyrosequencing 11

3. แสดงล าดบการออกแบบ sequencing primer ดวย PyroMark Assay Design software 19

4. PyroMark Q48 Autoprep instrument 22

5. Pyrogram แสดงการเรยงตวของล าดบเบสใหเหนหลงจากเครองวเคราะหแลว 22

6. P. aeruginosa ทไดจากผปวย 1 23





11. P. aeruginosa ทไดจากน าใน OR 1 24













ซ

24.แสดงถงการเลอก condition ไมเหมาะสมตอ primer ms010

พบเปนลกษณะ non-specific band…………………………………………………….......30

25. การท า temperature variant ท annealing step เพอหา condition ทเหมาะสมกบ

primer ms010.......................................................................................................................30

26. ผลผลตของดเอนจากตวอยาง 1 และ 2 กบ primer ms209 ms010 และ ms061 31

ฌ

ค าอธบายสญลกษณและค ายอ

สญลกษณและค ายอ CFU Colony Forming Unit Ft2 ตารางฟต min นาท ml มลลลตร g กรม µL ไมโครลตร

บทท 1 บทน ำ

1.1 ควำมเปนมำและควำมส ำคญของปญหำ เชอ Pseudomonas aeruginosa เปนแบคทเรยแกรมลบ มรปรางแทง ขนาด 0.5-1.0x1.5-5.0 ไมโครเมตร ถกจดอยใน Family Pseudomonadaceae สามารถเคลอนทโดยใช polar flagella เปนแบคทเรยชนดตองการออกซเจน (aerobic bacteria)(1) เจรญเตบโตไดทอณหภม 25 ถง 37 องศาเซลเซยส และสามารถโตท 42 องศาเซลเซยสได ซงใชแยก P. aeruginosa ออกจาก Pseudomonas species(2) โดยทวไปสามารถพบ P. aeruginosa กระจายในดน น า ขยะ หรอในพช และพบเปน normal flora ในล าไสคน นอกจากนพบวา P. aeruginosa ยงเปนสาเหตของการเกดโรคในคน สตว แมลงและตนไมได(1) ปจจบนพบวา P. aeruginosa เปน เชอโรคฉวยโอกาส (opportunistic pathogens) ท มความส าคญ ทเปนสาเหตของการตดเชอในผทภมคมกนต าหรอผปวยทพกรกษาตวในโรงพยาบาล กอใหเกดการตดเชอไดเกอบทกอวยวะ จงมกเรยกโรคตดเชอทเกดจาก P. aeruginosa วาโรคตดเชอในโรงพยาบาล (nosocomial infection) โรคตดเชอจาก P. aeruginosa สามารถแพรกระจายภายในโรงพยาบาลโดยบคลากร อปกรณ-การแพทย การสมผส น ายาฆาเชอ และอาหาร(3) ซงถอเปนปญหาทรนแรงมากในโรงพยาบาลเนองจาก ผปวยในโรงพยาบาลมกเปนผทมภมคมกนต า จงมความเสยงทจะไดรบเชอซงอาจเปนสาเหตของการเสยชวตได(1) นอกจากนยงพบวา P. aeruginosa มอตราการดอตอยาปฏชวนะมาก เนองจากมปจจยทท าใหเกดการดอยาหลายชนด ไดแก การมยนดอยาคอ ampC ท าใหเชอดอตอยา กลม Beta-Lactams, การม Aminoglycoside-modifying enzymes ท าใหเชอดอตอยากลม Aminoglycosides และเชอมกลไก efflux pump ซงเปนกลไกส าคญทท าใหเชอดอตอยาหลายชนด(2)

จากรายงานอบตการณ การตดเชอในโรงพยาบาลธรรมศาสตรเฉลมพระเกยรต ชวงเดอน พฤศจกายน 2558 - เมษายน 2559 พบผปวยตดเชอ P. aeruginosa จากแผลผาตด จ านวน 6 ราย และเมอท าการเพาะเชอจากน าประปาในหองผาตด พบเชอ P. aeruginosa ดงน น การวจยครงนมวตถประสงคเพอตรวจพสจนวา เชอ P. aeruginosa ทเปนสาเหตของการตดเชอในผปวย กบเชอ P. aeruginosa ทพบในสงแวดลอม เปนเชอ สายพนธเดยวกนหรอไม โดยยนสวน VNTR และตรวจวเคราะหดวยเทคนค pyrosequencing

2

1.2 วตถประสงคของกำรวจย 1. เพอศกษาลกษณะทาง Phenotype ของเชอ P. aeruginosa จากคนไข และทพบในหองผาตด 2. เพอศกษาลกษณะทาง Genotype ของเชอ P. aeruginosa จากคนไข และทพบในหองผาตด โดยใชเทคนค pyrosequencing 3. เพออธบายวาเชอทเปนสาเหตของการตดเชอในคนไขและเชอทพบจากสงแวดลอมในหองผาตดเปนเชอสายพนธเดยวกนหรอไม 1.3 ขอบเขตของกำรวจย 1. เชอแบคทเรย: - P. aeruginosa จากคนไข จ านวน 5 isolates - P. aeruginosa จากหองผาตด จ านวน 15 isolates 2. สถานทท าการวจย: - หนวยจลชววทยา รพ.ธรรมศาสตรเฉลมพระเกยรต: ศกษาลกษณะทาง phenotype - ภาควชาเทคนคการแพทย คณะสหเวชศาสตร ม.ธรรมศาสตร: ศกษาลกษณะทาง genotype 1.4 ทฤษฎและแนวคด Pseudomonas aeruginosa เปนแบคทเรยชนดตดสแกรมลบ รปรางเปนทอน สามารถพบไดในดน น า สงแวดลอมทวไป รวมทงผวหนง อยไดท งในสภาพแวดลอมปกต และสภาพออกซเจนต า กอโรคไดทงในคนและสตว เปนเชอฉวยโอกาส (Opportunistic pathogen) จะมการตดเชอกบผทมภมคมกนต าหรอผปวยทพกรกษาตวอยในโรงพยาบาล เปนเชอทส าคญทเปนสาเหตของโรคตดเชอในโรงพยาบาล (Nosocomial infection) สามารถกอใหเกดการตดเชอไดเกอบทกอวยวะ เชน ผวหนง ตา ทางเดนหายใจ และกระแสโลหต เปนตน (4) จากรายงานทวโลกพบวา P. aeruginosa เปนสาเหตของโรคตดเชอในโรงพยาบาลรอยละ 10-15(5) โรคตดเชอจาก P. aeruginosa สามารถแพรกระจายในโรงพยาบาลโดยผานบคลากรทางการแพทย อปกรณการแพทย น ายาฆาเชอตางๆ รวมถงน าและอาหาร ดงการศกษาของ Davane และคณะ ไดศกษาหาความชกของเชอ P. aeruginosa จากสงแวดลอมภายในโรงพยาบาล ไดแก เตยงผาตด อางลางมอ น ายาแชอปกรณผาตด น ายาแชเทอรโมมเตอร น ายาลางมอ ไมถพน และ ยาหยอดตา พบ P. aeruginosa รอยละ 52 โดยพบเชอทอางลางมอและไมถพนมากทสด คดเปนรอยละ 100(6) นอกจากนยงมการศกษาของ Valles และคณะ รายงานวา P. aeruginosa ถกพบในน ากอกจากหองพกผปวยมากทสดคดเปนรอยละ 62.4

3

(7) เชอ P. aeruginosa สามารถเขาสรางกายไดทางบาดแผลทผวหนงหรอเยอบมกผว ซงรวมถงต าแหนงทมการใสสายสวนตางๆเขาสรางกาย เชน สายใหสารน าทางหลอดเลอดและสายสวนปสสาวะ เชอ P. aeruginosa สามารถลกลามจากการตดเชอของบาดแผลเขาสกระแสเลอดท าใหเกดการตดเชอไดหลายอวยวะในรางกาย นอกจากนยงมรายงานวาเชอ P. aeruginosa เปนแบคทเรยส าคญทเปนสาเหตของการตดเชอจากการผาตดดวย (8,9) ดงกรณตวอยางทเคยเกดขนในโรงพยาบาลศนยขอนแกน มผปวยเขารบการผาตดตอกระจก จ านวน 11 ราย ตดเชอจากการผาตด จนท าใหผปวยตาบอด 7 ราย เมอมการเกบตวอยางจากผปวยไปสงตรวจเพาะเชอ พบวาผปวยมการตดเชอแบคทเรย P. aeruginosa ในการศกษาเชอแบคทเรยนนตองศกษาทงคณสมบตภายนอก (Phenotype) ซงเปนการทดสอบชนดของเชอและระดบการดอตอยาตานจลชพและศกษาลกษณะทางพนธกรรม (Genotype) รวมกนส าหรบการศกษาระบาดวทยาเพอหาความสมพนธของเชอกอโรคในคนกบเชอทอยในสงแวดลอม มหลายวธ ไดแก ribotyping, pulse-field gel electrophoresis, random amplified polymorphic DNA (RAPD), multilocus enzyme electrophoresis (MLEE), และ multilocus sequence typing (MLST) วธทสะดวก ใหผลทแมนย าทสดคอ MLST เพราะวธนใชจ านวนยนในการทดสอบมากกวาและสามารถเปรยบเทยบขอมลล าดบนวคลโอไทด (nucleotide) ทไดกบฐานขอมลในอนเตอรเนตทรวบรวมขอมลสายพนธของเชอตางๆทวโลก Multilocus sequence typing (MLST) คอวธการทใชแยกชนดของสงมชวตเชน แบคทเรย เชอรา หรอปรสตใหเฉพาะเจาะจง โดยอาศยความแตกตางของล าดบนวคลโอไทดของสาย DNA ซงเปนล าดบนวคลโอไทดทอยตรงกลาง (internal fragments) ของยน ทมความจ าเปนตอการด ารงชวตอยของเชอ (house-keeping gene) ขนตอนของวธ MLST ประกอบไปดวย data collection, data analysis และ multilocus sequence analysis ขนตอน data collection คอ ขนตอนทเพมจ านวนและก าหนดต าแหนงนวคลโอไทดของชนสวนยนทตองการโดยใชวธ PCR ตอมาวเคราะหล าดบนวคลโอไทดทไดในขนตอน data analysis โดยพจารณาความแตกตางของต าแหนงนวคลโอไทด (allele numbers) ของแตละยนและระบเปน allelic profile หรอ sequence type (ST) รปแบบของต าแหนงการจดเรยงนวคลโอไทดทตางไปจะถกจดเปน allelic profile แบบใหม เมอท าการพสจน allelic profile แลวหากเปนแบบใหมจรงขอมลจะถกน ามาเกบไวในฐานขอมล (MLST database) ขนตอนสดทายของวธนคอ multilocus sequence analysis จะวเคราะหความสมพนธของเชอโดยเปรยบเทยบ allelic profile ของเชอทตองการทดสอบกบขอมลทมอยในฐานขอมล เพอศกษาดานระบาดวทยาและววฒนาการของเชอ ดงตวอยางการศกษาระบาดวทยาทใชเทคนค MLST ของ Chaisatit และคณะ ไดศกษา allelic profile ของเชอ Salmonella enterica ทแยกไดจากเนอไกสดในตลาดของไทย ม

4

allelic profile ของยน 7 ยน thrA-purE-sucA-aroC-hisDhemD-dnaN เปน 141-95-9-417-262-15-4 ซงเมอตรวจสอบ database ของ Salmonella Homepage/server ตรงกบ ST1543 และพบวาเชอ ST1543 เคยตรวจพบมากอนในผปวยชาวเวยดนาม ซงการศกษานนสรปไดวา มการแพรระบาดของเชอสายพนธนในสองประเทศ(10) Khan และคณะ น าเทคนค MLST มาใชในการศกษาเชอ P. aeruginosa สายพนธทพบในทะเลเปรยบเทยบกบสายพนธกอโรคและทพบในสงแวดลอม จากการศกษานสามารถสรปไดวาสายพนธทพบในทะเลเปนคนละสายพนธกบทพบในผปวยและสงแวดลอม(11) 1.5 สมมตฐำนงำนวจย สามารถวเคราะหความเชอมโยงทางสายพนธของเชอ P. aeruginosa ทพบจากคนไขและหองผาตด เมอตรวจพสจนโดยใชหลกการ multilocus sequence typing 1.6 ค ำส ำคญของกำรวจย Pseudomonas aeruginosa, multilocus sequence typing 1.7 ประโยชนทคำดวำจะไดรบ 1. สามารถสบคนและศกษาการระบาดของเชอแบคทเรยในโรงพยาบาลได 2. เปนแนวทางการควบคมและปองกนการเกดโรคตดเชอในโรงพยาบาลได

บทท 2

เอกสำรและงำนวจยทเกยวของ

2.1 ทฤษฎทเกยวของ

2.1.1 อนกรมวธำนของเชอ P. aeruginosa เชอ P. aeruginosa เปนเชอแบคทเรยทจดอย Family Pseudomonadaceae เปนแบคทเรยแกรมลบมรปรางแทง (rod) ตองการอากาศในการเจรญเตบโต สามารถเคลอนทไดโดยใช monotricous flagella ดงภาพท 1 ให pigment ชนด pyocyanin และ pyoverdin ซงเปนpigment ทเปน fluorescent ทละลายน า เปน saprophyte ในดน น า(12) และเปน Normal flora ในล าไสคน P. aeruginosa สามารถท าใหเกดโรคในคนได รวมทงสตว แมลงและตนไมได บางสายพนธของ P. aeruginosa ท าใหเกดการตดเชอฉวยโอกาสโดยเฉพาะผทมภมคมกนต าหรอปวยมากๆ หรอพกรกษาตวในโรงพยาบาลนาน ท าใหเกดโรคตดเชอในโรงพยาบาล จากการศกษาของ สมหวง ดาน-ชยวจตร และสมพรโชคลอยแกว ในป พ.ศ.2532 ทท าการศกษาเชอโรคทเปนสาเหตของการตดเชอในโรงพยาบาล พบวาเชอ P. aeruginosa เปนสาเหตอนดบหนงในการตดเชอในโรงพยาบาล (รอยละ 22. 0) รองลงมาคอ E. coli และ Klebsiella spp. (รอยละ 18.1 และ 14. 0 ตามล าดบ) โรคตดเชอจาก Pseudomonas สามารถแพรกระจายภายในโรงพยาบาลโดยบคลากร อปกรณการแพทย ผวหนง น ายาฆาเชอ และอาหาร โรคตดเชอนเปนปญหาทรนแรงมากในโรงพยาบาลมาก เนองจากผปวยซงมอาการหนกอยแลวจะเสยชวตเนองจากโรคตดเชอจาก Pseudomonas และ Pseudomonas ดอตอยาปฏชวนะมากท าใหยากตอการรกษา P. aeruginosa สามารถตดเชอไดหลายระบบในรางกายเนองจากมหลายปจจยในการกอใหเกด เชน ความสามารถในการเกาะยดตดกบเยอบผว ดอตอยาปฏชวนะ สรางโปรตนทมาท าลายเนอเยอ และม protective outer coat P. aeruginosa สามารถท าใหเกดการตดเชอไดในหลายสวนของรางกายหวใจและกระแสเลอด P. aeruginosa เปนสาเหตอนดบ 4 ในการกอใหเกดโรคตดเชอในกระแสเลอดการตดเชอในกระแสเลอดจะเกดกบผปวยมะเรงเมดเลอดและผทตดเชอในบรเวณอนของรางกาย P. aeruginosa จะมการตดเชอทลนหวใจในผตดยาทฉดยาเขาเสนเลอดด า หรอผทใชลนหวใจเทยม การตดเชอในสวนนอาจเกดจากการบาดเจบหรอมการแพรกระจายของเชอมาจากเนอเยออนหรอการตดเชอในกระแสเลอดซงผปวยโรคเบาหวาน ผตดยาทฉดยาเขาเสนเลอดด าหรอตดเชอในกระแสเลอดจะมความเสยงในการตดเชอทกระดกและขอตอ ระบบประสาทสวนกลาง P. aeruginosa จะท าใหเกดโรคเยอหมสมองอกเสบซงอาจเกดจากการทสมองไดรบบาดเจบจากการผาตดจากการแพรกระจายจากสวนอนของรางกายหรอจากการตดเชอ

6

ในกระแสเลอดตาและห เชอนจะกอใหเกดการตดเชอทหสวนนอกทเรยกวา “Swimmer’s ear" ซงสามารถหายไดเอง แบคทเรยจะกอใหเกดอาการทรนแรงในผสงอายซงน าไปสปญหาดานการไดยน ใบหนาเปนอมพาต หรอเสยชวต สวนการตดเชอทตามกเกดจากการไดรบบาดเจบซงจะท าใหเกดรอยแผลเปนทกระจกตาซงจะท าใหตาบอดในทสด ปจจยทมผลในการท าใหเกดความเสยงในการตดเชอทตารวมถงการใสซอฟทคอนแทคเลนส การใชยาตาทม corticosteroid มอาการโคมา ถกไฟไหมรนแรง หรอรกษาตวอยในหองผปวยหนก ทางเดนปสสาวะตดไดจากการใชเครองมอทางการแพทยหรอการผาตดปอด ปจจยทมผลในการท าใหเกดความเสยงในการตดเชอทปอด ไดแก เปนโรคปอดเรอรง ภมคมกนต า ใชยาปฏชวนะ และผปวยหวใจลมเหลว ผวหนงและเนอเยอออนคนสขภาพดกสามารถตดเชอไดจากการอาบน าหรอเลนน าในสระวายน า hot tubs ทมเชอปนเปอนอย ซงโรคตดเชอ Pseudomonas ทผวหนงนมกจะเกดการสบสนกบโรคอสกอใสและจะเกดอาการรนแรงไดกบผทตดเชอในกระแสเลอดรวมดวย P. aeruginosa เปนสาเหตอนดบสองในการกอใหเกดโรคตดเชอในบาดแผลไฟไหมในผปวยทพกรกษาตวทโรงพยาบาล(13)

ภำพท 1 แสดง monotrichous flagella ของ P. aeruginosa ท ม า : George Musil, Allposters.com [Online], accessed 19 October 2018. Available from https://www.allposters.ie/-sp/Pseudomonas-Aeruginosa-Bacteria-are-Opportunistic-Pathogens-posters_i9005534_.htm

เชอ P. aeruginosa มกลไกการดอตอสารตานจลชพหลายกลไก ไดแก การม surface slime ทเชอสรางขนเปนดานปองกนการซมผานของสารตานจลชพเขาสเซลลและปองกน

7

การถกกลนกนโดยเมดเลอดขาว การม plasmid ทมยนควบคมการดอยาหรอการกลายพนธ ท าใหผนงเซลลมการเปลยนแปลงจนท าใหยาบางชนดผานเขาสเซลลไมได การสรางเอนไซมท าลายสารตาน จล ชพ ท าให เช อ ดอ ตอยา penicillin, ampicillin, cefazolin, tetracycline, chloramphenicol, sulfanimide และยากลม aminoglyciside กลม first drug ไดแก streptomycin, kanamycin เชอจะไวตอยาก ลม beta-lactam ท ผลตออกมาตาน เชอโดยตรง (antipseudomonal beta-lactam) ไดแ ก piperacilin, mesocillin, ticarcillin ก ล ม 3rd แ ล ะ 4 th Gen cephalosporin ไ ด แ ก ceftazidime, cefoperazone, cefapime ก ล ม aminoglycoside ไ ด แ ก gentamicin, tobramicin, amikacin, netilmycin, aztreonam และกลม quinolone ในการรกษาบางครงอาจใชยารวมกน 2 กลมเพอปองกนการดอยา(1)

ดงนนในการรกษาโรคทเกดจากการตดเชอ P. aeruginosa จงนยมใหยาปฏชวนะสองตวรวมกน เชน ยา ceftazidine, ciprofloxacin, imipenem, gentamicin, tobramycin, ticarcillin-clavulanate หรอ piperacillin-tazobactam ใหโดยฉดเขาเสนเลอดด าหรอรบประทาน เปนเวลาสองถงหกสปดาห ถาเปนการรกษาตาจะตองใชยาหยอดตาหรอใชการผาตด ซงบางครงจ าเปนทจะตองตดเนอเยอสวนทตดเชอและถกท าลายออกไป โดยเฉพาะอยางยงในรายทสมองอกเสบ ตดเชอทตา กระดกและขอตอ ห หวใจหรอบาดแผล แตอยางไรกตามโรคตดเชอจาก P. aeruginosa กมอตราการเสยชวตของผปวยสง โดยเฉพาะจากการตดเชอในกระแสเลอด และการตดเชอทปอด อตราการเสยชวตมชวงทกวาง โดยผปวยทตดเชอทหจะมอตราการเสยชวตรอยละ 15-20 จนถงผปวยทตดเชอทหวใจหองซายซงมอตราการเสยชวตรอยละ 89(1)

2.1.2 กำรจ ำแนกเชอ P. aeruginosa เชอ P. aeruginosa เปนเชอทใหผลบวกกบ oxidase เคลอนทได และไม ferment น าตาล glucose และ lactose เมอ เลยงใน MacConkey agar สราง pigment pyocyanin ท ม ส ฟ า pyoverdin ทมสเหลอง เมอสองดวยแสงอลตราไวโอเลต pigment ท ง 2 สจะรวมกนเปนสเขยวละลายน า และสามารถแพรเขาไปในอาหารเลยงเชอ บางสายพนธให pigment สสนมเรยกวา pyorubin ความสามารถในการสราง pyocyanin และการเจรญทอณหภม 4-43 องศาเซลเซยส เปนสมบตทใชการแยก P. aeruginosa ออกจาก Pseudomonas ชนดอนๆ(1)

2.1.3 กำรศกษำควำมหลำกหลำยทำงพนธกรรม ในปจจบนนการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของเชอมประโยชนหลายดาน เชน ใชศกษาทางดานระบาดวทยาเพอหาแหลงทมาของการตดเชอและวธการปองกน, ใชระบและจ าแนกสายพนธของเชอ, สามารถระบความเชอมโยงทางสายเลอดได และใชตรวจหาโรคทางพนธกรรมได วธในการใชศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมมหลายวธ ดงตอไปน

8

2.1.3.1 Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) เปนวธการแยก deoxyribonucleic acid (DNA) ดวยกระแสไฟฟา แตมลกษณะการรนทแตกตางจาก gel electrophoresis ปกต(12) คอ ทศทางของกระแสไฟฟา gel electrophoresis ธรรมดา กระแสไฟฟาทใชจะไปในทศทางเดยวในแนวตรงจากขวลบไปขวบวก ในขณะท PFGE จะรนกระแสไฟฟาสองทศทาง ท ามม +60 และ -60 องศา จงเปนขอดทท าให PFGE สามารถใชแยกชน DNA ทมขนาดใหญระดบ megabases ได ดงนนวตถประสงคการใชงานหลกของ PFGE คอ ใชแยก ชน DNA ทงโครโมโซมของ แบคทเรยหรอรา หลงจากทท าการตดดวย restriction enzyme แลว เพอใชบอกความสมพนธในทาง genetics ของเชอแตสายพนธ(14) 2.1.3.2 Ribotyping ใชขอมลในการว เคราะหจาก rRNA-based phylogenetic analyses แบคทเรยทงหมดม ribosomal genes แตล าดบเบสทแนนอนจะแตกตางกนไปในแตละสายพนธของเชอ ซงกคอเชอจะม genetic fingerprint ทจ าเพาะในแตละสายพนธของตนเอง ดงนนวธ ribotyping กคอการหาล าดบเบสในสวนของ 16S แลวน าไปเทยบกบฐานขอมลเพอระบสายพนธของตวอยาง(15)

2.1.3.3 Multilocus sequence typing (MLST) คอวธการทใชแยกชนดของสงมชวตเชน แบคทเรย เชอรา หรอปรสตใหเฉพาะเจาะจงโดยอาศยความแตกตางของล าดบนวคลโอไทดของสาย DNA ซงเปนล าดบนวคลโอไทดทอยตรงกลาง (internal fragments) ของยน ทมความจ าเปนตอการด ารงชวตอยของเชอ (house-keeping gene) โดยทวไปมกจะใช 7 ยน แตละยนมขนาดประมาณ 450-500 base pairs (bp)(16) house-keeping gene จะมลกษณะของ allele ทมล าดบนวคลโอไทดแตกตางกนอยางชดเจนในแบคทเรยแตละสายพนธ โดยวธนจะพจารณาต าแหนงของนวคลโอไทดโดยไมค านงถงจ านวนนวคลโอไทดทตางกน ซงความแตกตางของการจดเรยงนวคลโอไทดอาจจะมความแตกตางเพยงต าแหนงเดยวหรอหลายต าแหนง ความแตกตางของรปแบบ alleles ของยนทง 7 ชนดนจะเปนตวระบ allelic profile และถกก าหนดเปน sequence type (ST) ขนตอนของวธ MLST ประกอบไปดวย data collection, data analysis และ multilocus sequence analysis ขนตอน data collection คอ ขนตอนทเพมจ านวนและก าหนดต าแหนงนวคลโอไทดของชนสวนยนทตองการโดยใชวธ PCR ตอมาวเคราะหล าดบนวคลโอไทดทไดในขนตอน data analysis โดยพจารณาความแตกตางของต าแหนงนวคลโอไทด (allele numbers) ของแตละยนและระบเปน allelic profile หรอ sequence type (ST) รปแบบของต าแหนงการจดเรยงนวคลโอไทดทตางไปจะถกจดเปน allelic profile แบบใหม เมอท าการพสจน allelic profile แลวหากเปนแบบใหมจรงขอมลจะถกน ามาเกบไวในฐานขอมล (MLST database) ขนตอนสดทายของวธนคอ multilocus sequence analysis จะวเคราะหความสมพนธของเชอโดยเปรยบเทยบ allelic profile ของเชอทตองการทดสอบ

9

กบขอมลทมอยในฐานขอมล เพอศกษาดานระบาดวทยาและววฒนาการของเชอ เปรยบเทยบรปแบบของ allelic profile หรอ ST วาใกลเคยงหรอตางจาก clonal complexes (กลมของเชอ) ทมอยในฐานขอมล(17) ความสมพนธของเชอจะแสดงในลกษณะแผนภมโครงสรางตนไม (dendrogram) โดยใชหลกการ matrix of pairwise differences ระหวาง allelic profile ซงแผนภมจะแสดงใหเหนวารปแบบ allelic profile หรอ ST ของเชอแตละตวมความใกลเคยงหรอแตกตางกนเพยงใด ซงหากพบวาเชอม allelic profile ทใกลเคยงกนมากสนนษฐานไดวานาจะมาจากบรรพบรษเดยวกน 2.1.3.4 Restriction fragment length polymorphism (RFLP) สามารถใชล าดบของ homologous DNA เพอแยกความหลากหลายทางพนธกรรมได ในการวเคราะห RFLP ตวอยางดเอนเอจะถกตดแบงออกเปนชนยอยๆ โดยใชเอนไซมตดจ าเพาะ จากนนจะไดชนสวนดเอนเอของเอนไซมตดจ าเพาะออกมา ซงชนสวนนจะแตกตางกนในแตละสายพนธของเชอ จากนนชนสวนนจะถกแยกตามความยาวของสายดเอนเอดวย gel electrophoresis(18)

2.1.4 Variable Number Tandem Repeat (VNTR) VNTR ถกเรยกอกชอวา mini-satellites(19) เปนนวคลโอไทดสายส นๆมความยาวประมาณ 20-100 bps VNTR loci(20) เปนล าดบซ าของนวคลโอไทดทอยบรเวณ coding และnon-coding regions ซงล าดบ นวคลโอไทดซ านนจะอยตดกน และสงมชวตตางชนดกนจะมจ านวนซ าของ VNTR ทแตกตางกนไปดวย การวเคราะห VNTR เรมตนโดยท าการก าหนดหรอเลอกจ านวนซ าทเราสนใจบนจโนมของสงมชวตทเราสนใจ โดยจะเลอกดจ านวนซ าของเบสใน loci ทแตกตางกนหลายบรเวณ และบรเวณทเราเลอกนนตองมความหลากหลาย (variation region) เกดขนอยมากดวย จากน นใช PCR ในการเพมจ านวนนวคลโอไทดในบรเวณทเราสนใจ และใช standard agarose gel ในการดและเลอกขนาดของ amplicon size ของชน DNA ท เราสนใจ (19) VNTR typing สามารถท าไดอยางรวดเรว มความสามารถในการท าซ าได มความงายในการท า และสามารถเพมความสามารถในการระบและแยกแยะสงมชวตใหละเอยดขนไดโดยเลอกบรเวณ VNTR ทสนใจบนจโนมเพม ขน อกในแตละชดของการทดลอง และบรเวณน นควรมค า discrimination index ทสงดวยเชนกน(19) 2.1.5 Pyrosequencing Technique

ใชหลกการ sequencing by synthesis คอ การหาล าดบของนวคลโอไทดโดยการสงเคราะหสายดเอนเอ และอาศยการตรวจจบ pyrophosphate (PPi) ท ถกปลอยออกมาจากกระบวนการการเตมนวคลโอไทด ในปฏกรยาของ pyrosequencing อาศยการท างานของเอนไซม 4 ชนดคอ DNA polymerase, ATP- sulfurylase, luciferase และ apyrase

10

เรมตนโดยการออกแบบไพรเมอรทจะใชในการเพมปรมาณสารพนธกรรมโดยใช conventional PCR ส าหรบไพรเมอรทใชในงาน pyrosequencing แตกตางจากไพรเมอรทใชในงานอนอนคอไพรเมอรตองถกออกแบบใหตดสารไบโอตนทสายใดสายหนงการจะเลอกตดสาย reverse หรอ forward ขนอยกบทศทจะท าการอานล าดบเบสและเปนสงทจะใชเลอกวาจะออกแบบ sequencing primer ดานไหน ส าหรบงานวจยนผวจยไดตดไบโอตนดาน reverse เพราะตองการไดสายดเอนเอทถกวเคราะหดวย sequencing primer ทอานจากดาน forward เหตผลของการทตองออกแบบไพรเมอรใหตดไบโอตนคอกอนเรมตนปฏกรยาวเคราะหล าดบเบสใน pyrosequencing จะมข นตอนการ purified single strand DNA จาก PCR product กอน โดย magnetic beads coated streptavidin ทเปนสวนหนงของน ายาในกระบวนการท าจะมหนาทดงไบโอตนทตดอยบน สายดเอนเอดาน reverse ของ PCR product ลงมาและจะมการลางสวนทเปนสายดาน forward ออกไปจากปฏกรยา หลงจากนน sequencing primer ทออกแบบใหเปนดาน forward จะเขามาจบเพอท าการสงเคราะหตอไป

หลงจากม sequencing primer เขามาจบกบ single strand DNA จะเรมปฏกรยาโดยมการเตม dNTP ทละชนด หาก dNTP ทเตมลงไปน นเปนเบสคสมกบดเอนเอตนแบบ (DNA template) น วค ล โอไทดก จะ ถ ก DNA polymerase น า เข าไป ตอในส าย ผลจากป ฏ ก รย า Polymerization จะท าให Pyrophosphate ถกปลดปลอยออกมา และจะถกเอนไซม ATP sulfurylase เปลยนไปเปนสารทเปนแหลงพลงงาน ทเรยกวา ATP ซงเปนสารทชวยการท างานของเอนไซม Luciferase ทท าหนาทเปลยนสารตงตน Luciferin ใหกลายเปน Oxyluciferin ซงเปนสารทสามารถใหแสงออกมาในปฏกรยา จากนนแสงทออกมาจะถกตรวจวดดวยเซนเซอรส าหรบตรวจจบแสงแลวแปลงสญญาณแสงทไดออกมาเปน Peak ทเปนสดสวนโดยตรงกบนวคลโอไทดทถกน าเขาไปตอในสายดเอนเอแสดงผลออกมเปน Pyrogram หลงจากนนเอนไซม Apyrase จะท าหนาทในการก าจด dNTPs และ ATP ทหลงเหลออยในระบบกอนเรมการเตม dNTP ชนดใหมและปฏกรยาจะท าซ าแบบเดมอกครงไปเรอยๆจนจบปฏกรยา ซงเทคนค Pyrosequencing นมขดจ ากดในการเตมเบสลงในปฏกรยาไดประมาณ 100 bps(20)

11

ภำพท 2 หลกการของเทคนค Pyrosequencing

ท ม ำ : Zhenzhong Zhang. Use of Pyrosequencing to detect clinically relevant polymorphisms of genes in basal cell carcinoma. Clinica Chimica Acta.2004:137-143 2.2 งำนวจยทเกยวของ จากการศกษาของพนจ กล าคลองตน (2553) เรอง การแพรกระจายเชอ P. aeruginosa ในสถานพยาบาล : กรณศกษาโรงพยาบาลนภาลย จงหวดสมทรสงคราม พบวามเชอแบคทเรย P. aeruginosa มากทสดในหองเกบขยะตดเชอ จ านวน 0.132 cfu/ft.2/min. รองลงมาไดแก แผนกผปวยหนก จ านวน 0.088 cfu/ft.2/min. แผนกผปวยศลยกรรม จ านาน 0.054 cfu/ft.2/min. ตกผปวยสามญ จ านวน 0.051 cfu/ft.2/min. แผนกฉกเฉน จ านวน 0.024 cfu/ft.2/min. และหองตรวจโรคผปวยนอก จ านวน 0.014 cfu/ft.2/min. สวนในหองผาตด เเละแผนกทนตกรรมไมพบเชอแบคทเรย P. aeruginosa สวนเดอนทพบเชอมากทสด ไดแก เมษายน จ านวน 0.77 cfu/ft.2/min. รองลงมาคอ มนาคม จ านวน 0.49 cfu/ft.2/min. มถนายน จ านวน 0.49 cfu/ft.2/min. พฤษภาคม จ านวน 0.41 cfu/ft.2/min. สงหาคม จ านวน 0.41 cfu/ft.2/min. กนยายน จ านวน 0.32 cfu/ft.2/min. กรกฎาคม จ านวน 0.28 cfu/ft.2/min. กมภาพนธ จ านวน 0.28 cfu/ft.2/min. มกราคม จ านวน 0.24 cfu/ft.2/min. พฤศจกายน จ านวน 0.24 cfu/ft.2/min. ตลาคม จ านวน 0.20 cfu/ft.2/min. และธนวาคมจ านวน 0.20 cfu/ft.2/min. ตามล าดบ และพบวามความสมพนธกบปจจยของสภาพแวดลอมทางกายภาพ ไดแก อณหภมอากาศ และอณหภมดน (r = 0.729 และ 0.726 ตามล าดบ) และ มความสมพนธเชงลบกบจ านวนผมารบบรการทงหมดในโรงพยาบาล (r = -0.588) แตไมมความสมพนธกบจ านวนผปวยโรคระบบทางเดนหายใจในโรงพยาบาลนภาลย(1)

12

การศกษาของ Neil Parkinson (2013) เรอง Application of Variable-Number Tandem-Repeat Typing To Discriminate Ralstonia solanacearum Strains Associated with English Watercourses and Disease Outbreaks พบวา การว เคราะหล าดบ เบสโดยการใช VNTR เปนเค รองมอใชส าห รบการแบ งแยกแบบความละเอยดสงในการแยกชนดเชอรา Ralstonia solanacearum IIB sequevar 1 (PIIB-1) โดยท าการแยกเชอจากสงแวดลอม และน าไปใชในการประเมนและตดตามแหลงทมาของเชอโดยเลอกใช VNTR 5 แบบ บน loci ทแตกแตงกน ซงท าใหสามารถแบง VNTR profile ได 17 แบบทแตกตางกนในหมเชอ 75 ตวทแยกมาจากมนฝรง, เจอเรเนยม, ขงหวาน(solanum dulcamara), มะเขอเทศ และสงแวดลอม ซงเชอ R. solanacearum แยกมาจากพช 3 พนททไมมความเกยวของกบการระบาดของโรค โดยพนทๆพชเตบโตมแมน าทถกน ามาใชเพอการชลประทานไหลผาน เชอมโปรไฟล VNTR ทแตกตางกนในแตละพนท แตม โปรไฟล VNTR ทมรปแบบรวมกนกบตนขงหวานทตดเชอทเตบโตทตนน าของแตละพนท ซงผลจากการวเคราะหโปรไฟล VNTR พสจนไดวาแหลงก าเนดของการระบาดมผลมาจากการปนเปอนของเชอลงสน าในแมน า สรปได VNTR สามารถชวยในการศกษาในดานระบาดวทยาของ R. solanacearum และชวยในการควบคมการระบาดของโรคทเกดจากเชอได(21) การศกษาของ Sandrine Dahyot (2018) เรอง Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus lugdunensis พบวา Staphylococcus lugdunensis เปน coagulase-negative Staphylococcus ทมฤทธรนแรงทท าใหเกดการตดเชอทรนแรงมากขน จงเรมการสรางขอมลล าดบเบสของเชอ S. lugdunensis เพอไวใชแยกเชอไดลก และละเอยดมากยงขน โดยท าการเลอก 7 รปแบบของ variable number of tandem repeats (VNTRs) เพอท าการพฒนาหลกการใหมขนมา 2 หลกการคอ multiple-locus VNTR analysis (MLVA) method และ tandem repeat sequence typing (TRST) method โดยใช multilocus sequence typing (MLST) และ multivirulence-locus sequence typing (MVLST) เปน gold standard เพอชวยประเมนความถกตอง การศกษานใชเชอ S. lugdunensis 128 ตวทแยกมาจากหลากหลายตนก าเนด จากการจดกลมตามวธการทง 4 วธมความสอดคลองกนมาก โดยใช MLVA ในการจ าแนกกลมยอยทซบซอนและละเอยดมากขนตามทจดกลมใหญโดยใช MLST กอน เพราะอนทจรง MLVA มความสามารถในการจ าแนกชนดเชอสง เมอเทยบกบ MLST และ MVLST ในแงของจ านวนของ genotype และดชนความหลากหลาย(22) การศกษาของ Nyambura Moremi (2017) เรอง Surveillance of surgical site infections by Pseudomonas aeruginosa and strain characterization in Tanzanian hospitals does not provide proof for a role of hospital water plumbing systems in transmission พบวา การศกษาเรองระบบการ

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0732889315001236?via%3Dihub#!

13

จดการน าในโรงพยาบาล กบการตดเชอ P. aeruginosa ในแผลผาตดแทบจะไมไดท าการศกษาในกลมประเทศทมรายไดนอยเลย ดงนนการศกษาครงนจะแสดงใหเหนถงลกษณะของเชอ P. aeruginosa ทเพาะแยกเชอมาจากผปวย และน า เพอศกษาการเชอมโยงทางระบาดวทยาทเปนไปได โดยในระหวางเดอนธนวาคม 2557 ถงเดอน กนยายน 2558 ไดมการเกบตวอยางจากทวารหนก แผลผาตด และน า มาท าการเพาะเชอ P. aeruginosa และท าการ Typing ดวยเทคนค MLST จากผปวยทงหมด 536 คน พบคนทเปน Surgical site infection (SSIs) 78 คน ตรวจพบเชอ P. aeruginosa ในบาดแผล 8 ครง จากการตรวจบาดแผลทพบ 57 ครง (14%) และจากการเกบน ามา 43 แหงม 29 แหงพบเชอ P. aeruginosa จากการท า MLST พบวาการตดเชอ P. aeruginosa ในบาดแผลผาตดม 3 ใน 8 สายพนธทมล าดบ sequence type เดยวกนกบเชอ P. aeruginosa ทตรวจพบในล าไสผปวย และเชอทแยกไดจากผปวยจะมอตราการดอยามากกวาเชอจากน า สรปไดวาการตดเชอ P. aeruginosa ในแผลผาตดมอตราการต าตด และยงไมสามารถสรปไดวาน าประปาเปนแหลงระบาดของเชอ เพราะ sequence type มความสอดคลองกนระหวางแผลผาตดกบน าประปาเพยง sequence type เดยวคอ ST2307(23)

ในการศกษานผวจยไดเลอกใชการวเคราะหยนสวน VNTR โดยใชเทคนค pyrosequencing ในการหาความเชอมโยงความสมพนธระหวางเชอ P. aeruginosa จากแผลผาตดและจากน าในหองผาตด

บทท 3 วธกำรด ำเนนงำนวจย

3.1 แบคทเรยทใชในงำนวจย เชอ P. aeruginosa ทแยกไดจากแผลผ ปวยหลงผาตดและจากน าหนาหองผาตดในโรงพยาบาลธรรมศาสตร ตงแตชวงเดอน พ.ย. 2558 – เม.ย. 2559 ประกอบไปดวยเชอทแยกไดจากแผลหลงผาตดของผปวย (patient) 5 รายและจากน า (tap water) หนาหองผาตด 13 ตวอยาง (ตารางท 1) ตำรำงท 1 แบคทเรยและแหลงทเกบตวอยาง

No Code Bacteria Source 1 PS-P1 Pseudomonas aeruginosa Patient 2 PS-P2 P. aeruginosa Patient 3 PS-P3 P. aeruginosa Patient 4 PS-P4 P. aeruginosa Patient 5 PS-P5 P. aeruginosa Patient 6 PS-E1 P. aeruginosa Tap water 7 PS-E2 P. aeruginosa Tap water 8 PS-E3 P. aeruginosa Tap water 9 PS-E4 P. aeruginosa Tap water

10 PS-E5 P. aeruginosa Tap water 11 PS-E6 P. aeruginosa Tap water 12 PS-E7 P. aeruginosa Tap water 13 PS-E8 P. aeruginosa Tap water 14 PS-E9 P. aeruginosa Tap water 15 PS-E10 P. aeruginosa Tap water 16 PS-E11 P. aeruginosa Tap water 17 PS-E12 P. aeruginosa Tap water 18 PS-E13 P. aeruginosa Tap water

15

3.2 กำรเกบเชอแบคทเรย เชอ P. aeruginosa จากตารางท 1 จะถกเกบในหลอดทบรรจอาหารส าหรบเกบเชอแบคท เรย (Brain heart infusion broth + 20% glycerol) ท อณ ห ภ ม -80C ท ภ าควช าเทค น คการแพทย คณะสหเวชศาสตร ม.ธรรมศาสตร 3.3 กำรเพำะเชอแบคทเรย ใชอาหารเลยงเชอชนด sheep blood agar; SBA และ maconkey agar ในการเพาะเชอ P. aeruginosa โดยเพาะเชอทอณหภม 37C ใชเวลา 18-24 ชวโมง 3.4 กำรศกษำลกษณะทำง Phenotype 3.4.1 ศกษาลกษณะ colony ของเชอ P. aeruginosa ทเจรญบนอาหารเลยงเชอ SBA ซงพจารณาจาก ขนาด รปราง ความนน ผวหนา ขอบ ความขน ส เนอโคโลนหยาบ/แหง ความสามารถในการสลายเมดเลอดแดง 3.4.2 ตรวจพสจนเชอโดยใชเครอง MALDI-TOF (Biotyper) 3.4.3 ทดสอบความไวตอสารตานจลชพ โดยใชวธ disk diffusion 3.5 กำรศกษำลกษณะทำง Genotype โดยเทคนค Pyrosequencing 3.5.1 อปกรณ น ำยำ และสำรเคม ประกอบดวย 3.5.1.1 ชดสกดดเอนเอ PureLink® Genomic DNA Kits (life technologies, USA) ประกอบดวย

• Lysates preparation • Sterile, DNase-free 1.5-mL microcentrifuge tubes for elution • Microcentrifuge capable of centrifuging >10,000 × g • Optional: sterile water, pH 7.0–8.5, if you are using water for elution components supplied with the Kit • PureLink® Genomic Wash Buffers 1 and 2 • PureLink® Genomic Elution Buffer • PureLink® Spin Columns in Collection Tubes • PureLink® Collection Tubes

3.5.1.2 เครองวดความเขมขน DNA • Spectrophotometer (Malcom, Japan) • กระดาษเชดไรฝ นขย (Kimberly-Clark Professional, USA)

16

3.5.1.3 PCR ประกอบดวย เครองเพมจ านวนสารพนธกรรม หรอ thermal cycler instrument (Bio-Rad Laboratories, Singapore) ชดแยกดเอนเอดวยกระแสไฟฟา หรอ electrophoresis chamber (Cleaver Scientific Ltd, Taiwan) ก บ power supply (Cleaver Scientific Ltd, Taiwan) และเครอง gel documentation system (Gel Doc)(Neo Science, Korea) สวนของน ายาแ ล ะ ส า ร เค ม ท ใ ช ไ ด แ ก MQ water, PyroMark PCR (QIAGEN, Germany), 10XCoralload (QIAGEN, Germany), 10µM primer F (Biosearch technologies, USA), 10µM primer R (Biosearch technologies, USA), DNA template ส าหรบใชในการเพมจ านวนสารพนธกรรมและ agarose gel (Biochemical, Malaysia), 1X TAE Buffer, GelRedTM nucleic- acid gel stain (Biotium, USA) ส าหรบการแยกและการยอมดเอนเอ 3.5.1.4 เครองวเคราะหการเรยงตวของเบสทซ าๆกนโดยใชเทคนค pyrosequencing (Pyromark Q48 autoprep จากบรษท QIAGEN ) ประกอบดวย

PyroMark Q48 Autoprep Software • PyroMarkQ48 autoprep instrument

- PyroMark Q48 Disc - Absorber strip - Sterile pipet tips with filters

• สวนของน ายาและสารเคมทใช ไดแก - PyroMark Q48 Magnetic Beads - Sequencing primer - DNA template - PyroMark Q48 Advanced Reagents - High-purity water

3.5.2 กำรเตรยมตวอยำงดเอนเอเพอใชวเครำะหโดยมวธกำรดงตอไปน 3.5.2.1 การสกดดเอนเอจากตวอยางโดยน า stock เชอ P. aeruginosa มาสกดดเอนเอของเชอโดยใชชดสกดดเอนเอ (DNA extraction kit) หลกการคอ silica-column method วธการท าม 4 ขนตอนหลก คอ preparing lysates, binding DNA, washing DNA และeluting DNA

- Preparing lysates การเตรยมตะกอนตวอยางมหลายแบบ ในการศกษานจะเตรยมตะกอนตวอยางจาก

เซลลแบคทเรยแกรมลบโดยตงอณหภมของ water bath หรอheat block ท 55°C น าเซลลแบคทเรยมาประมาณ 1 mL จากอาหารเลยงเชอท incubate ไว 16-18 ชวโมง จะมเซลลแบคทเรยประมาณ 2 ×

17

109 จากน นน าไปปนตกตะกอนแลวดดสวน supernatant ท ง ใส 180 µL PureLink® Genomic Digestion Buffer ลงไป แลวตามดวย 20 µL proteinase K เพอสลายผนงเซลล จากนนผสมใหเขากนโดยใช vortex จากนน Incubate microcentrifuge tube ท 55°C พรอมทงใช vortex รวมดวยจนกวาเซลลจะถกสลายโดยสมบรณ (ใชเวลาประมาณ 30 นาทจนถง 2 ชวโมง) ใส 20 µL RNase A ผสมให เขากนโดยใช vortex แลว incubate ท อณหภมหอง 2 นาท จากน นใส 200 µL PureLink®

Genomic Lysis /Binding Buffer และผสมใหเปนเนอเดยวกน โดยใช vortex และ ใส 200 µL 96-100% ethanol ผสมใหเขากนโดยใช vortex 5 วนาท เพอใหไดสารละลายทเปนเนอเดยวกน

- Binding DNA น า PureLink® Spin Column ประกอบเขากบ collection tube ใสสารละลายทเตรยมเสรจจากขอ 4.1.1 มประมาณ 640 µL ลงใน PureLink® Spin Column น าไปปนท 10000 × g เปนเวลา 1 นาท ทอณหภมหอง จากนนทง collection tube อนเกา แลวน า PureLink® Spin Column ไปประกอบกบ PureLink® Collection tube อนใหมทมความสะอาด - Washing DNA ใส 500 µL Wash Buffer 1 ทใส ethanol ผสมมากอนเรยบรอยแลว ลงใน column น า column ไปปนท 10000 × g เปนเวลา 1 นาท ทอณหภมหอง ทง collection tube อนเกา แลวน า PureLink® Spin Column ไปประกอบกบ PureLink® Collection tube อนใหม ท มความสะอาด จากนนใส 500 µL Wash Buffer 2 ทใส ethanol ผสมมากอนเรยบรอยแลว ลงใน column น า column ไปปนทความเรวสงสดเปนเวลา 3 นาททอณหภมหอง แลวทง collection tube ไป

- Eluting DNA

ใส spin column ลงใน 1.5 mL microcentrifuge tube ทปราศจากเชอ ใส 25-200 µL PureLink® Genomic Elution Buffer ลงใน column (เลอกปรมาณ elution buffer ทจะใสตามความตองการ) Incubate ทอณหภมหองเปนเวลา 1 นาท แลวน าไปปนทความเรวสงสดเปนเวลา 1 นาท ทอณหภมหอง (ในหลอดม purified genomic DNA) หากตองการเกบ DNA เพมใหท าขนตอน elution อกรอบหนง แลวใช microcentrifuge tube อนใหม ปนทความเรวสงสดเปนเวลา 1.5 นาท ทอณหภมหอง เกบ purified DNA ท -20°C และหลกเลยงการละลาย และแชแขงบอยๆ เพอลดการสลายตวของ DNA 3.5.2.2 การวดคณภาพของดเอนเอทสกด โดยใชเครอง spectrophotometer เปนเครองมอทใชวดการดดกลนแสงชนดนาโน ใชปรมาตรในการวดตวอยางนอยเพยง 1-2 µL ไมตองใชภาชนะส าหรบการใสสาร เชน cuvette เพราะ ใชหลกการแรงตรงผว ตรงระหวาง opitical surface ดานบน และดานลาง เพอใหแสงสองผานตวอยาง หลกการทใช คอ spectrophotometry วดการ

18

ดดกลนแสง ultraviolet ของกรดนวคลอกทความยาวคลน OD230, OD260 และOD280 เพอดการปนเปอนตางๆ และไดทราบคาความเขมขนของ DNA ในหนวย ng/µL 3.5.3 กำรเลอกใช Primer ส ำหรบกำรเพมจ ำนวนสำรพนธกรรมดเอนเอ งานวจยนไดเลอกใชไพรเมอรจากยน ms209 ทไดอางองมาจากการศกษาของ Hoang Vu-Thien, et al (2007)(22) ms010 และ ms061 ท ไดอางองมาจากการศกษาของ Lucie Onteniente, et al (2003) (23) โดยหลกเกณฑการเลอกใชคอขนาดล าดบเบสซ าและคาความสามารถในการใชจ าแนก region ของสายพนธนน (Polymorphism index หรอ Discrimination index) คาสงหมายความวามความสามารถในในการใชจ าแนก region ของสายพนธสง ในงานวจยนไดท าการเลอกใชไพรเมอรขางตนเนองจากมจ านวนเบสซ าขนาด 6 bps เพราะการหาล าดบเบสโดยใชเทคนค pyrosequencing มขอจ ากดคออานล าดบเบสไดคอนขางสนประมาณ 100 bps หากเกนกวาก าหนดจะท าใหการอานผลและแปลผลไมนาเชอถอและมคาความสามารถในการใชจ าแนก region ของสายพนธนน (Polymorphism index หรอ Discrimination index) สงทสดเมอเทยบกบยนอนๆ จงไดท าการสงล าดบเบสบนไพรเมอรจากทอางองใหกบทางบรษท Biosearch Technologies ผลตออกมาเปนน ายาทใชในการท า PCR 3.5.4 กำรออกแบบ sequencing primer เพอใหไดยนในสวนทเปน VNTR ส ำหรบใชในกำรวเครำะหกำรเรยงตวของเบสทซ ำๆ (repeated unit) งานวจยนออกแบบ sequencing primer โดยใช PyroMark Assay Design software วธท าคอในโปรแกรมจะมชองใหใสล าดบเบสทครอบคลมเบสทเรยงตวซ า จากนนนเลอกเนนเบสทเรยงตวซ าโดยก าหนดใหเปน target region และน าล าดบเบสของไพรเมอรทเปนสวน forward และ reverse ใสในชองทก าหนด หลงจากนนโปรแกรมจะท าการประมวลผลเปน sequencing primer ออกมา ส าหรบใชในการวเคราะหการเรยงตวของเบสทซ าๆ (repeated unit) น าล าดบ เบส sequencing primer ทวเคราะหไดสงใหบรษท Biosearch Technologies ผลตเปนน ายา sequencing primer เพอใชในขนตอนการท า pyrosequencing

19

ภำพท 3 แสดงล าดบการออกแบบ sequencing primer ดวย PyroMark Assay Design software 3.5.5 กำรเพมจ ำนวนสำรพนธกรรม (PCR amplification) ดวยกำรใช primer ms209

ms010 และms061 เตรยม master mix ประกอบไปดวย

หลงจากเตรยม master mix แลว น า master mix ใน microtube มาแบงใส PCR tube ตามจ านวน

ตวอยางเชอทตองการทดสอบอยางละเทาๆกน ค านวณโดย total volumn

n คอ ปรมาตรทงหมด

ของ master mix ทเตรยมได หารดวยจ านวนปฏกรยา (reaction) น าแตละ PCR tube ไปใส DNA template เขมขน 5 ng/µL (ไดมาจากการสกด) ทระบหมายเลขของตวอยางเชอทตรงกน ทปรมาณ 4 µL น าไป mix ดวยเครอง vortex น าทก PCR tube ไปใสในเครอง PCR ตงคาท Condition เหมาะสมกบไพรเมอรแตละชนดดงตารางท 2 และ 3 ใชเวลาในการท างานประมาณ 3 ชวโมง หลงจากท า DNA amplification เสรจจะไดผลออกมาเรยกวา PCR product จากนนน ามาแยกดวยกระแสไฟฟาโดยเตรยม เตรยม 1.2 % agarose gel ใน 1X TAE buffer เมอไดเปน agarose gel จงยาย gel มาวางใน gel box ใส 1X TAE buffer ใหทวมแผน gel ใช autopipette ดด 100 bps DNA ladder H3 RTU

DNA free water 5 µL x n + 1 10 µM Primer Forward (ms209 หรอ ms010 หรอ ms061) 0.5 µL x n + 1 10 µM Primer Reverse-Biotin (ms209 หรอ ms010 หรอ ms061) 0.5 µL x n + 1 Coralload 2.5 µL x n + 1 PyroMark PCR 12.5 µL x n + 1

20

(GeneDireX, USA) ปรมาณ 3 µL ใสลงในชอง agarose gel และดด PCR product ใสในชองถดไปตามล าดบ ท าการตอ gel box เขากบเครอง power supply โดยตอสายข วลบไปข วบวก ต งคากระแสไฟฟา 100 V เปนเวลา 30 นาท หลงจาก run gel เสรจ จะน า gel มายอมดวย gel red 15 นาทและแชในน ากลน 15 นาท อานผล gel ดวยเครอง gel doc วเคราะหผลจาก PCR product โดยดการขนแถบดเอนเอ ขนาด 148 bps, 167 bps และ127 bps ของยน ms209 ms010 และms061 ตามล าดบ คดเลอก PCR product ทปรากฏแถบดเอนเอเปนลกษณะชดและเปนแถบเดยวๆ ไมพบแถบจากการปน เป อนห รอจาก ด เอน เอ อนๆ ท ไม จ า เพ าะ เพ อม าท า DNA sequencing โดยใช เทค นค pyrosequencing ตอไป ตำรำงท 2 แสดง Reaction condition ของ ms209 และ ms061 ตำรำงท 3 แสดง Reaction condition ของ ms010 3.5.6 กำรตรวจวเครำะหหำกำรเรยงตวของเบสทซ ำๆกนจำกชนสวนยนทเปน VNTR 3 ต ำแหนง โดยเทคนค pyrosequencing เมอได PCR product ทมลกษณะทเหมาะสมดงทกลาวไวขางตน จะน ามาท าการวเคราะหหาการเรยงตวของล าดบเบสทซ าๆกน (repeated unit) โดยใชเทคนค pyrosequencing เพอ

21

ท าการ sequence typing เชอ P. aeruginosa ในงานวจยครงนไดเลอกใชเครองมอ PyroMark Q48 Autoprep ของบรษท QIAGEN และเลอกใชโหมดของ SEQ assay ซงท างานเกยวกบการวเคราะหล าดบเบสเพอหาจ านวนซ าในชนสวนของยนนนๆ ดงน เขาโปรแกรม PyroMark Q48 Autoprep software ระบขอมลตางๆโดยแบงการระบขอมลออกเปน 2 สวนคอสวนของ setting up an assay คอสวนทตองใสขอมล repeated unit ทเหมาะสมกบต าแหนงของยน VNTR ทเราสนใจ (ตารางท 4) พรอมใสจ านวนซ าทตองการใหเครองวเคราะห ในวจยนเลอกใช 25 repeat เนองจาก repeated unit ประกอบไปดวยล าดบเบส 6 ตว หากใหเครองวเคราะห 25 repeat จะไดจ านวนยนยาว 150 bps ยงพออยในชวงทเครอง pyrosequencing วเคราะหไดและครอบคลมจ านวนการซ าทจะเกดขนไดมากพอ

ตำรำงท 4 แสดงรปแบบของ repeated unit ของ VNTR region ms209 ms010 และ ms061

VNTR region Repeated Unit ms209 CACGAA ms010 TGGCTG ms061 GTTGGC

จากน นใสขอมลเกยวกบตวอยางทตองการท าการวเคราะห โดยชอ ตวอยางทใสในโปรแกรมตองก าหนดใหตรงกบตวอยาง (PCR product sample No. ) ทใสลงในหลม (well) ของ PyroMark Q48 disc ขอมลจะถายโอนจาก software เขา PyroMark Q48 Autoprep instrument (ภาพท 4) หลงจากเครองท างานโดยใชเวลาวเคราะหประมาณ 2-3 ชวโมง จะปรากฏผลเปนลกษณะพคเรยงตวบน pyrogram แสดงล าดบเบสตางๆใชส าหรบการวเคราะหหาจ านวนการเรยงตวของเบสทซ าๆกนเพอจ าแนกรปแบบความแตกตางของจ านวนซ าตอไปได (ภาพท 5)

22

ภำพท 4 PyroMark Q48 Autoprep instrument

ภำพท 5 Pyrogram แสดงการเรยงตวของล าดบเบสใหเหน หลงจากเครองวเคราะหแลว

บทท 4 ผลกำรวจย

4.1 กำรศกษำลกษณะทำง Phenotype จากการเพาะเลยงเชอ P. aeruginosa ทงหมดจาก 13 ตวอยางพบลกษณะ colony บนอาหารเลยงเชอชนด sheep blood agar มลกษณะกลม ขอบเรยบ สขาวเทา มการท าใหเมดเลอดแดงในอาหารชนดเลยงเชอชนด sheep blood agar แตกเหนเปนลกษณะ hemolysis ดงภาพ ท 6-22

ภำพท 6 P. aeruginosa ทไดจากผปวย 1 ภำพท 7 P. aeruginosa ทไดจากผปวย 2

ภำพท 8 P. aeruginosa ทไดจากผปวย 3 ภำพท 9 P. aeruginosa ทไดจากผปวย 4

PS-P1 PS-P2

PS-P3 PS-P4

24

ภำพท 10 P. aeruginosa ทไดจากผปวย 5 ภำพท 11 P. aeruginosa ทไดจากน าใน OR 1

ภำพท 12 P. aeruginosa ทไดจากน าใน OR 2 ภำพท 13 P. aeruginosa ทไดจากน าใน OR 3

ภำพท 14 P. aeruginosa ทไดจากน าใน OR ภำพท 15 P. aeruginosa ทไดจากน าใน OR 5

PS-P5 PS-E1

PS-E2 PS-E3

PS-E5 PS-E4

25

ภำพท 16 P. aeruginosa ทไดจากน าใน OR6 ภาพท 17 P. aeruginosa ทไดจากน าใน OR 7



PS-E8

PS-E6 PS-E7

PS-E9

PS-E10 PS-E11

26


PS-E12 PS-E13

27

ตำรำงท 5 ผลการตรวจพสจนเชอดวยเครอง MALDI-TOF และผลความไวตอสารตานจลชพ

Code Identify by MALDI-TOF Susceptibility Test

CAZ CIP CN AK IPM MEM TZP

PS-P1 P. aeruginosa S S S S S S S





PS-E1 P. aeruginosa S S S S S S S













หมายเหต : CAZ=Ceftazidime (S≥18 I=15-17 R≤14), CIP=Ciprofloxacin (S≥21 I=16-20 R≤15), CN=Gentamicin (S≥15 I=13-14 R≤12), AK=Amikacin (S≥17 I=15-16 R≤14), IPM=Imipemem (S≥19 I=16-18 R≤15), MEM=Meropenem (S≥19 I=16-18 R≤15), TZP=Piperacillin/Tazobactam (S≥21 I=15-20 R≤14), Interpretation zone from CLSI 2018 guideline(24)

28

4.2 กำรศกษำลกษณะทำง Genotype

4.2.1 กำรสกด DNA จำก isolated colony ของเชอ P. aeruginosa จากการสกดเชอ P. aeruginosa โดยใชชดสกดสกดดเอนเอ อาศยวธการ silica-

column ไดท าการวดคณภาพของดเอนเอทสกดดวยเครอง Nanodrop เพอประเมนคณภาพของ DNA ทสกดโดยจะแปลผลจากคา 2 สวนคอ

1. คาดดกลนแสงท 260 และ 280 นาโนเมตร บงบอกถงการปนเปอนของ protein หากอยในชวง 1.8-2.1 ถอวามการปนเปอนของ protein ต า

2. คาดดกลนแสงท 260 และ 230 นาโนเมตร บงบอกความบรสทธของ DNA คา > 1.8 ถอวา DNA มความบรสทธ สง

จากการสกดเชอ P. aeruginosa ทง 18 ตว พบวาไดดเอนเอทมความเขมขน ประมาณ 200 - 400 ng/µL เมอดคาดดกลนแสงท 260 cและ 280 นาโนเมตร ทบงบอกถง การปนเปอนของ protein พบวาทกตวอยางใหผลอยในชวง 1.8-2.1 และชวง คาดดกลนแสงท 260 และ 230 นาโนเมตร ทบงบอกถง ความบรสทธของ DNA พบวาทกตวอยางใหผล > 1.8 (ตารางท 6) จงสรปไดวาการเชอ P. aeruginosa ทง 18 ตว ใหผลดเอนเอทมคณภาพและปนเปอนสงอนนอย เปนดเอนเอทเหมาะสมจะน ามาใชเพมปรมาณสารพนธกรรมและวเคราะหล าดบเบสดวยเทคนค pyrosequencing ตอไป 4.2.2 กำรเพมจ ำนวนสำรพนธกรรม (PCR amplification) โดยใช conventional PCR กบ primer ทจ ำเพำะเพอคดเลอกสวนของยนทตองกำร

ในการเพมจ านวนสารพนธกรรม (PCR amplification) โดยใช conventional PCR ซงจะน าดเอนทสกดมาจากเชอ P. aeruginosa ทง 18 ตว มาท าปฏกรยากบ primer ms209 ms010 และ ms061 เพอคดเลอกยนสวนทตองการ ไดผลการวจย ดงน การเพมจ านวนสารพนธกรรม (PCR amplification) ผ วจ ยไดท าการเลอกใช condition จากงานวจยอางองเดยวกนกบทเลอกใช primer จากยน ms209(25,) ms010 และms061(26) ผลวจยคอทยนสวน ms010 ใหผลออกมาเปนลกษณะเปนแถบดเอนเอแบบ non-specific band คาดวาเกดจากการเลอกใชอณหภมในสวนของ annealing step ไมเหมาะสมในงานวจยเลอกใชทอณหภม 65˚C ตามงานวจยอางอง ท าให primer ms010 จบสายดเอนเออยางไมจ าเพาะ (ภาพท 24)

ในกรณนผวจยจงไดท าการเพมจ านวนสารพนธกรรมใหมโดยปรบ condition ดวยการท า temperature variant ท annealing step เพอหา condition ทเหมาะสมกบ primer สวน ms010 โดยเลอกอณหภมชวง annealing step แตกตางกน ดงน 65˚C 68˚C และ 70˚C ตามล าดบ (ภาพท 25) พบวาท annealing step อณหภม 70˚C เปนอณหภมทเหมาะสมกบ primer สวน ms010

29

ตำรำงท 6 แสดงผลปรมาณ DNA และคณภาพหลงจากสกด วดดวยเครอง Nanodrop

Sample Concentration Abs260/280

(Protein contaminate) Abs260/230

(Purity DNA >1.8) PS-P1 283.50 1.991 2.010 PS-P2 337.90 1.989 2.067 PS-P3 365.50 2.000 2.011 PS-P4 267.85 2.003 1.980 PS-P5 305.25 1.984 2.014 PS-E1 215.95 2.000 2.040 PS-E2 216.65 2.018 2.092 PS-E3 317.45 2.013 2.065 PS-E4 319.65 2.015 2.013 PS-E5 274.95 1.984 1.807 PS-E6 363.45 2.015 1.901 PS-E7 239.15 2.020 2.039 PS-E8 295.35 2.008 2.047 PS-E9 440.00 2.011 2.064

PS-E10 171.35 1.990 1.891 PS-E11 285.20 1.964 1.886 PS-E12 406.85 1.987 2.040 PS-E13 344.40 1.999 1.932

30

ภำพท 24 แสดงถงการเลอก condition ไมเหมาะสมตอ primer ms010 พบเปนลกษณะ

non-specific band

ภำพท 25 การท า temperature variant ท annealing step เพอหา condition ทเหมาะสมกบ primer

ms010

S1 S2 NC S1 S2 NC S1 S2 NC

ms010 (167bps)

100 bps Ladder

200 bps 100 bps

S1 S2 NC S1 S2 NC S1 S2 NC

200 bp 100 bp

ms209 (148bps)

ms010 (167bps)

ms061 (127bps)

31

หลงจากได condition ทเหมาะสม เมอน ามาท าการเพมจ านวนสารพนธกรรม (PCR amplification) ใหผลคอ พบแถบดเอนเอกบ primer ms209 ms010 และ ms061 มลกษณะเปนแถวเดยวและชดเจน ทมขนาดประมาณ 100-200 bps เมอเทยบกบแถบดเอนเอของ 100 bps DNA ladder เปนการยนยนวาในตวอยางมผลผลตของดเอนเอ และเปนยนสวนทตองการ ในสวนของ negative control ไมพบแถบดเอนเอท าใหสามารถบอกไดวาการขนแถบดเอนเอของตวอยางไมไดเกดจากสงปนเปอนหรอแถบอนๆทเกดจากความไมจ าเพาะดงแสดงในรปท 24 เมอได PCR product ทมความเหมาะสมคอขนแถบเดยวและชดเจน จงจะน าไปหา VNTR โดยวธ pyrosequencing ตอไป

ภำพท 26 ผลผลตของดเอนจากตวอยาง 1 และ 2 กบ primer ms209 ms010 และ ms061

4.2.3 กำรตรวจวเครำะหหำกำรเรยงตวของเบสทซ ำๆกนจำกชนสวนยนทเปน VNTR 3 ต ำแหนง โดยเทคนค pyrosequencing

ในการศกษาครงนผวจยไดน าตวอยางเชอแบคทเรย 18 ตวอยางมาท าการหาจ านวนเบสซ า (tamdem- repeats) ในชนสวนของยนทเปน VNTR จาก 3 ต าแหนงคอ ms209 ms010 และ ms061 ดวยเทคนค pyrosequencing โดยใชเครอง PyroMark Q48 autoprep เลอก SEQ assay โดยเครองจะวดปฏกรยาทเกดขนและวเคราะหผลแสดงออกมาเปนพคซงแสดงถงการมเบสตางๆทจ านวนแตกตางกนบนกราฟ pyrogram (ภาพท 27)

32

ภำพท 27 แสดง pyrogram บางสวนของตวอยางทเปน patient 5 กบไพรเมอร ms209 ทมลกษณะเปนพคซงแสดงการมเบสตางๆทจ านวนแตกตางกนและแปลผลออกมาไดเปนล าดบเบสทแสดงให

เหนถงการม repeated unit จ านวนแตกตางกน

ผวจยไดท าการวเคราะหจ านวนของเบสซ าๆสรปผลในตาราง ท าการเปรยบเทยบเพอแบงสายพนธของเชอทไดมาจากทง 18 ตวอยาง ผลทไดคอ VNTR ทต าแหนง ms209 มหนวยเบสซ า (repeated Unit) คอ CACGAA ตวอยางสวนใหญใหผลเบสซ าจ านวน 2 ครง แตจะมตวอยางทเปนของผปวยหมายเลข 1 และผปวยหมายเลข 5 ใหเบสซ าจ านวน 3 ครง ดงแสดงในตารางท 7 สวน VNTR ทต าแหนง ms010 มหนวยเบสซ า (repeated- unit) คอ TGGCTG แตละตวอยางใหจ านวนเบสซ าทหลากหลายตงแต 9-16 ครง ดงแสดงในตารางท 8 และ คอ VNTR ทต าแหนง ms061 มหนวยเบสซ า(repeated unit) คอ GTTGGC แตละตวอยางใหจ านวนเบสซ าทหลากหลายตงแต 7-13 ครง ดงแสดงในตารางท 9 หลงจากไดขอมลของจ านวนเบสซ าจากทกตวอยางในแตละต าแหนงแลว จงน ามาท าตารางสรปรปแบบจ านวนซ า (ตารางท 10) เพอทจ าแนกรปแบบการซ าของทกตวอยางในแตละต าแหนงคอ ms209 ms010 และms061 ตามล าดบผลคอจ าแนกรปแบบซ าไดออกมา

33

9 รปแบบ ท าใหสรปไดวาแบคทเรยใน 18 ตวอยางจ าแนกได 9 สายพนธ โดยในตารางจะแบงใหเปนสเพอบอกรปแบบซ า โดยสเทาเปนรปแบบซ าชนดท 1 โดยซ าแบบ 2,9,10 ก าหนดเปนสายพนธท 1 ประกอบดวยตวอยางจากน าประปาหมายเลข 1 สน าเงนคอรปแบบซ าชนดท 2 โดยซ าแบบ 2,13,12 ก าหนดเปนสายพนธท 2 ประกอบดวยตวอยางจากน าประปาหมายเลข 2,3,4,9 สเขยว คอรปแบบซ าชนดท 3 โดยซ าแบบ 2,14,12 ก าหนดเปนสายพนธท 3 ประกอบดวยตวอยางจากน าประปาหมายเลข 5,6,7,8,10,12,13 สเหลองคอรปแบบซ าชนดท 4 โดยซ าแบบ 2,16,12 ก าหนดเปนสายพนธท 4 ประกอบดวย ตวอยางจากน าประปาหมายเลข 11 สสมคอรปแบบซ าชนดท 5 โดยซ าแบบ 3,16,9 ก าหนดเปนสายพนธท 5 เปนของตวอยางจากผปวยหมายเลข 1 สชมพคอรปแบบซ าชนดท 6 โดยซ าแบบ 2,12,7 ก าหนดเปนสายพนธท 6 เปนของตวอยางจากผปวยหมายเลข 2 สมวงคอรปแบบซ าชนดท 7 โดยซ าแบบ 2,16,13 ก าหนดเปนสายพนธท 7 เปนของตวอยางจากผปวยหมายเลข 3 สแดงคอรปแบบซ าชนดท 8 โดยซ าแบบ 2,12,9 ก าหนดเปนสายพนธท 8 เปนของตวอยางจากผปวยหมายเลข 4 สฟาคอรปแบบซ าชนดท 9 โดยซ าแบบ 3,9,10 ก าหนดเปนสายพนธท 9 เปนของตวอยางจากผปวยหมายเลข 5

34

ตำรำงท 7 จ านวนเบสซ า CACGAA ของ 18 ตวอยางท VNTR ต าแหนง ms209

Sample Source ms209 PS-P1 Patient 1 3 PS-P2 Patient 2 2 PS-P3 Patient 3 2 PS-P4 Patient 4 2 PS-P5 Patient 5 3 PS-E1 Tap water 1 2 PS-E2 Tap water 2 2 PS-E3 Tap water 3 2 PS-E4 Tap water 4 2 PS-E5 Tap water 5 2 PS-E6 Tap water 6 2 PS-E7 Tap water 7 2 PS-E8 Tap water 8 2 PS-E9 Tap water 9 2

PS-E10 Tap water 10 2 PS-E11 Tap water 11 2 PS-E12 Tap water 12 2 PS-E13 Tap water 13 2

35

ตำรำงท 8 จ านวนเบสซ า TGGCTG ของ 18 ตวอยางท VNTR ต าแหนง ms010



36

ตำรำงท 9 จ านวนเบสซ า GTTGGC ของ 18 ตวอยางท VNTR ต าแหนง ms061



37

ตำรำงท 10 สรปรปแบบจ านวนเบสซ าในทกต าแหนงของ VNTR ทสมพนธกบการระบสายพนธตวอยาง

Sample Source VNTR region

Type ms209 (CACGAA)

ms010 (TGGCTG)

ms061 (GTTGGC)

PS-P1 Patient 1 3 16 9 5 PS-P2 Patient 2 2 12 7 6 PS-P3 Patient 3 2 16 13 7 PS-P4 Patient 4 2 12 9 8 PS-P5 Patient 5 3 9 10 9 PS-E1 Tap water 1 2 9 10 1 PS-E2 Tap water 2 2 13 12 2 PS-E3 Tap water 3 2 13 12 2 PS-E4 Tap water 4 2 13 12 2 PS-E5 Tap water 5 2 14 12 3 PS-E6 Tap water 6 2 14 12 3 PS-E7 Tap water 7 2 14 12 3 PS-E8 Tap water 8 2 14 12 3 PS-E9 Tap water 9 2 13 12 2

PS-E10 Tap water 10 2 14 12 3 PS-E11 Tap water 11 2 16 12 4 PS-E12 Tap water 12 2 14 12 3 PS-E13 Tap water 13 2 14 12 3

บทท 5 สรปผล อภปรำยผล และขอเสนอแนะ

5.1 สรปผลกำรวจย การวเคราะหถงแหลงทมาและสาเหตของการตดเชอ P. aeruginosa ในผ ปวย โดยวธ pyrosequencing เพ อจ าแนก รปแบบ Variation Number Tandem Repeats (VNTR) ของเช อ P. aeruginosa จากแผลผปวยหลงผาตดและน าประปาภายในหองผาตด ในโรงพยาบาลธรรมศาสตร โดยท าการสกดเอนเอของเชอ P. aeruginosa จ านวน 18 สายพนธ ประกอบดวย เชอทแยกไดจากผปวย 5 ราย และ จากน าประปาในหองผาตด 13 ตวอยาง และท าการวเคราะหการเรยงตวของเบสทซ าๆกน จากชนสวนยนทเปน VNTR 3 ต าแหนง ไดแก ms209 (CACGAA), ms010 (TGGCTG) และ ms061 (GTTGGC) ผลการจ าแนกรปแบบของเชอ P. aeruginosa โดยใช VNTR จากตวอยางทงหมด 18 ตวอยาง สามารถจ าแนกรปแบบ VNTR ทแตกตางกนไดทงหมด 9 แบบ บงบอกไดวามเชอ P. aeruginosa จ านวน 9 สายพนธ โดยพบวาตวอยางทเกบไดจากน าประปาในหองผาตด มรปแบบ VNTR 4 แบบ ซงเปน VNTR type 1-4 และ ตวอยางทเกบไดจากแผลผาตดผปวย 5 ราย มรปแบบ VNTR 5 แบบ ซงเปน VNTR type 6-9 จากตารางท 10 สรปรปแบบจ านวนเบสซ าในทกต าแหนงของ VNTR ทสมพนธกบการระบสายพนธของทกตวอยางพบวารปแบบ VNTR ของเชอจากน าประปาในหองผาตดแตกตางกบรปแบบของเชอทพบในแผลผาตดของผปวย และในผปวยแตละคนกพบรปแบบ VNTR ทแตกตางกนเองเชนกน ดงนนเราจงสรปไดผปวยตดเชอแผลผาตดไมไดรบเชอเขารางกายขณะท าการผาตดในหอง OR เนองจากเชอ P. aeruginosa ทพบในน าประปาในหองผาตดไมใชสายพนธเดยวกบผปวย นอกจากนผปวยแตละรายทตดเชอกไมไดเปนสายพนธเดยวกน ดงนนอาจเปนไปไดวาผปวยตดเชอ P. aeruginosa จาก colonization ในรางกายผปวยเอง(27)

5.2 อภปรำยผลกำรวจย ในการศกษานไดใช VNTR loci มาท าการจ าแนกรปแบบของเชอ P. aeruginosa ดวยเทคนค pyrosequencing เพอจ าแนกความหลากหลายทางพนธกรรมในแตละสายพนธของเชอ ซงการใชต าแหนง VNTR นมประสทธภาพในการจ าแนกไดด โดยสอดคลองกบการศกษาของ Apablaza และคณะ ทท าการศกษาเกยวกบเชอ Flavobacterium psychrophilum ทกอโรครนแรงในปลากลม salmonids ในประเทศชล และนอรเวยซงการตดเชอนจะสงผลกระทบตอการเพาะเลยงสตวน าทวโลก วธการตรวจหาและระบชนดของเชอแบคทเรย สายพนธนไดใช VNTR เทยบกบ MLST มาท าการวเคราะหความหลากหลายทางพนธกรรม 53 สายพนธของเชอ F. psychrophilum

39

ผลปรากฏวาทงสองวธมความสอดคลองกน(28) จากการศกษาของ Hauck และคณะไดน าเทคนค VNTR มาใชในการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของเชอ Propionibacterium acnes ทไดจากคนไขซงแตละสายพนธจะมความสามารถในการกอโรคไดตางกน(29) นอกจากนยงมการศกษาของ Estaji และคณะใชเทคนค Multiple-Locus Varible Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) ศกษาความหลากหลายของเชอ P. aeruginosa ทเปนสาเหตการตดเชอในระบบทางเดนปสสาวะจากผปวยในแตละหอผปวย ซงน ามาชวยในการศกษาระบาดวทยาในโรงพยาบาลดวย(30) สงทส าคญของการท า pyrosequencing ใหประสบความส าเรจ ขนกบคณภาพของผลผลตจาก PCR เปนหลก โดยผลผลตจาก PCR หลงจาก run gel electrophoresis พบแถบดเอนเอเพยงแถบเดยวชดเจน และตองไดปรมาณทเพยงพอโดยมความเขมขนประมาณ 0.5 -2 picomoles of biotinylated PCR product ดงนนการสกดดเอนเอจากตวอยางเชอใหมคณภาพสงจงมความจ าเปน โดยดจากคาการดดกลนแสงทความยาวคลนตางๆ และคาความเขมขนของดเอนเอทวดไดจากเครอง Nanodrop ควรไดคาการดดกลนแสงท 260 และ 280 นาโนเมตร เทากบ 1.8-2.1 แสดงวา DNA มคณภาพและความบรสทธสง จากนนน า DNA template ทไดไปท า PCR ตอไป โดยตองใชชวงอณหภมทเหมาะสมเพอเพมจ านวนชน DNA ทตองการออกมาไดอยางจ าเพาะ จากนนจะดผลการท า PCR จากการท า gel electrophoresis หากวาผลตผลจาก PCR ทไดมความบรสทธของชน DNA ท ตองการสง จะไดแถบ DNA ปรากฏบน agarose gel เปนแถบเดยวชดเจน และม amplicon size ตรงกบชน DNA ทเราตองการศกษาจากนนน าผลตผล PCR ทมคณภาพไปท า pyrosequencing ตอไป

กลาวโดยสรปเชอ P. aeruginosa ทไดมาจากน าประปาตรวจพบ sequence type 1-4 และเชอทไดจากบาดแผลผปวยผาตดตรวจพบ sequence type 5-9 จงสรปไดวาเชอจากน าประปาในหองผาตดไมใชสาเหตการตดเชอของผปวย แตผปวยอาจตดเชอมาจากปจจยอนๆได และในผปวยแตละรายกพบ ตรวจพบ sequence type ทแตกตางกน จงคาดวาสาเหตขอการตดเชอของผปวยอาจมาจากมการ colonization ของเชอในรางกายแตละบคคลเองกเปนได(23)

40

บรรณำนกรม

1. พนจ กล าคลองตน. 2553. การแพรกระจายของเชอ Pseudomonas aeruginosa ใน

สถานพยาบาล: กรณศกษาโรงพยาบาลนภาลย จงหวดสมทรสงคราม [วทยานพนธ]. กรงเทพฯ.มหาวทยาลยศลปากร.

2. Tang YW, Sussman M, Liu D, Poxton I, Schwartzman J. Molecular medical

microbiology. Elsevier. 2015;2;753. 3. เชอแบคทเรย Pseudomonas aeruginosa (ออนไลน).2011 [เขาถงเมอ 22/5/2018]. เขาถง

ไดจาก : http://www.vcharkarn.com/varticle/42381 4. Bodey GP, Bolivar R, Fainstein V, and Jadeja L. Infections caused by Pseudomonas

aeruginosa. Rev. Infect Dis. 1983;5:2:279-313.

5. Blanc DS, Petignat C, Janin B, Bille J, and Francioli P. Frequency and molecular

diversity of Pseudomonas aeruginosa upon admission and during hospitalization: a

prospective epidemiologic study. Clin Microbiol Infect. 1998;4:242–47.

6. Davane M, Suryawanshi N, Pichare A, and Nagoba B. Pseudomonas aeruginosa from

hospital environment. J Microbiol Infect Dis. 2014;4:1:42-43.

7. Valles J, Mariscal D, Cortes P , Coll P, Villagra A, Diaz E, et al. Patterns of colonization

by Pseudomonas aeruginosa in intubated patients: a 3-year prospective study of 1,607

isolates using pulsed-field gel electrophoresis with implications for prevention of

ventilator-associated pneumonia. Intensive Care Med. 2004;30:1768–75

8. Tosh PK, Disbot M, Duffy JM, Boom ML. Outbreak of Pseudomonas aeruginosa

surgical site infections after arthroscopic procedures: Texas, 2009.SHEA. 2011;32:1179-

86.

9. Masaadeh HA and Jaran AS. Incident of Pseudomonas aeruginosa in post-operative

wound infection. Am J Infect Dis. 2009;51:1-6.

http://www.vcharkarn.com/varticle/42381

41

10. Chaisatit C, Tribuddharat C, Pulsrikarn C, Dejsirilert S. Molecular characterization of

antibioticresistant bacteria in contaminated chicken meat sold at supermarkets in

Bangkok, Thailand. Jpn J Infect Dis. 2012;65:6:527-34.

11. Khan NH, Ashan M, Yoshizawa S, Hosoya S, Yokota A, and Kogure K. Multilocus

sequence typing phylogenetic analyses of Pseudomonas aeruginosa isolates from the

ocean. Appl and Env Microbiol. 2008;74:6194-25.

12. Silby MW, Winstanley C, Godfrey SA, Levy SB, and Jackson RW. Pseudomonas

genomes: diverse and adaptable. FEMS Microbiol Rev. 2011;35:652-80.

13. ภทรชย กรตสน. ต าราวทยาแบคทเรยการแพทย. พมพครงท 2. กรงเทพฯ: ส านกพมพ หจก.

ว.เจ.พรนตง; 2551.

14. Wang CX, and LIU SL. Pulsed-field electrophoresis. Brenner’s Encyclopedia of

Genetics. 2013;529-31.

15. Bouchet V, Huot H, and Goldstein R. Molecular genetic basis of ribotyping. Clin

Microbiol Rev. 2008;262-73.

16. Maiden MCJ, Bygraves JA, Feil E, Morelli G, Russell JE, et al. Multilocus

sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of

pathogenic microorganisms. Proc Natl Acad. Sci. 1998;95:3140-45.

17. Urwin R and Maiden MCJ. Multi-locus sequence typing: a tool for global epidemiology.

Trends Microbiol. 2003;11:479-87.

18. Mittal B, Chaturvedi P, and Tulsyan S. Restriction fragment length polymorphism.

Brenner’s Encyclopedia of Genetics. 2013;190-93.

19. Keim PS. Bacterial variable number tandem repeat. Brenner’s Encyclopedia of Genetics.

2013;274-76.

20. Lerttworapreecha M. New Approach for Nuclotides Sequencing and Application in

Microbiologica Research. Thaksin J.2011;14:112-18.

42

21. Parkinson N. Application of Variable-Number Tandem-Repeat Typing To Discriminate Ralstonia solanacearum Strains Associated with English Watercourses and Disease Outbreaks. Aem Asm Org.2013;79:6016-22.

22. Dahyot S. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) and

Tandem Repeat Sequence Typing (TRST), helpful tools for subtyping Staphylococcus

lugdunensis. Sci Rep.2018;8:11669.

23. Moremi N. Surveillance of surgical site infections by Pseudomonas aeruginosa and strain characterization in Tanzanian hospitals does not provide proof for a role of hospital water plumbing systems in transmission. BMC.2017;6:56.

24. Clinical and Laboratory Standards Institute. M100 performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 28th edition. January 2018.

25. Hoang VT. Multiple-locus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis for Longitudinal Survey of Sources of Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Patients. J Clin Microbiol.2007;45:3175-83.

26. Onteniente L. Evaluation of the Polymorphism Associated with Tandem Repeats for Pseudomonas aeruginosa Strain Typing. J Clin Microbiol.2003;4991-97.

27. Eckmanns T. An outbreak of hospital-acquired Pseudomonas aeruginosa infection caused by contaminated bottled water in intensive care units. J Clin Microbiol.2008;14:454-58.

28. Apablaza P. Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) analysis of Flavobacterium psychrophilum from salmonids in Chile and Norway. BMC.2015;11:150.

29. Hauck Y, Soler C, Gerome P, Vong R, Macnab C, et al. A novel multiple locus variable number of tandem repeat (VNTR) analysis (MLVA) method for Propionibacterium acnes. Infect Genet Evol.2015;33:233-41.

30. Estaji M, Tabasi M, Heravi FS, Khezerloo JK, Radmanesh A, et al. Genotypic identification of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from patients with urinary tract infection. CIMID.2019;65:23-28.

ภำคผนวก

44

ภำคผนวก ก Pyrosequencing

1. คณสมบตของ VNTR region

- Minisettlelite: 6 bps repeat

- PCR product length: 100-200 bps

- Polymorphism index: 0.77-0.91

2. การหา Consensus pattern ใชออกแบบ dispensation order เพอใสขอมลลงไปใน setting up

an assay ทเปนสวนหนงของ pyroMark Q48 Autoprep Software โดยจะท าการ search

whole genome ของเชอ P.aeruginosa ในเวบ pubmed แลวท าการมารคล าดบเบสทตรงกบ

ล าดบเบสบนไพรเมอร ( สเหลองแทน ไพรเมอรดาน forward และสฟาแทนไพรเมอร

ดาน reverse ) ทอางองมาจากงานวจยกอนหนา ท าการหา consensus pattern โดยสงเกตจาก

ล าดบเบสทอยระหวางไพรเมอรดาน forward และดาน reverse

หมายเหต : สเขยวแทนล าดบของ sequencing primer ทออกแบบโดยใชโปรแกรม ms209_6bp/0.77 Consensus pattern: CACGAA Dispensation order : GACT CCCATGACGACCACGACCATGACCACGCCCATGGCAGCCTGGGCAAGCACGAGCACGGCGTCGCCCAGTT

GAACGTGGCGCTGGACGGCAAGACCCTCGAACTGGAGCTGGACAGCCCGGCGATGAACCTGGTCGGTTTC

GAACACGCCGCCAGCACCGACGCGGACAAGGCCGCCGTGGCCAAGGCCCGCGCGCAGCTGGAAAAACCGC

TGGAGCTGTTCGCCCTGCCGGTCACCGCCGGCTGCTCGGTGGCCAGCCAGGAACTGCGGAGTCCGCTGTT

CGGCGACAAGGCGCCGGCCCACGCGCACAAGGAGAAGGCAGGCCACGAACACGAACACGAACACGAACAC

GAACACGGTCATGCCGATATCCACGCCCATTACCAGCTCAGTTGCGAGAAGCCCGAGCTGCTCAAGCTGC

TGACCCTCGCCGAGTTCTTCAAGCGCTTCCCCGCCACCCAGAAAATTCAGGTACAACTGATCGGTCCCGA

CGGCCAGAAAGGCGCCGACCTGGCTCCGGCCAGCGCCGAGCTGAAGCTGTAGGATCGTTCCGGAGGCGCC

GCGAGGGATTCGGCGCGGCGCCCCTCCATCCATTCTCGAGGCTCCGGCGGAGCGTTCCGCCCCTACCCCC

ATGAGCGCACTGATCACCCTGACCAACCTCGGCTTCGCCTGGCCCGGCCAGGCGGAGTTGCTGGACATTC

45

ms010_6bp/0.91 Consensus repeat: TGGCTG Dispensation order : TGCTG GCGCGAACTTCAGCGGGTTGTTCTGCACCGGCTGGATCATGGTCTGCGCCATGCGGAACTCGCCCTTCAG

GCTGGCCCGCGCGCGCAGCACGTCCACCAGTCCTTCCACCAGGCCGCGATAGCTGCGGCCGATGGCTTCC

ATCTGCGCTTCGGCGCCGGCCGGGTCGACCTTCAACTGGGTCATGCCGGCGCCGCGCAGGAACGCTTGCA

GCAGGTCGCCGCCGGCCGACGCGGCGGCGCTTGCCGGCGGCGTCGGCGCCGCCACGCTCGCTGGCTGTGG

CTGTGGCTGTGGCTGTGGCTGTGGCTGTGGCTGTGGCTGTGGCTGTGGCTGTGGCTGTTGGGTGATCCCT

GGGTCGGCGAAGGGCATCGCCAGCGGCGTCGGTTCGGCCGTCGGCAGCGGCTGGGCGACGGGCGTGGCGC

TTGGCGCGGGCGTGTTGCCGAGCAGTTCGGCGAACGGGTCCCAGTCGGCCGGAATCAGCGGTGCGCCGCC

AGCGGGCGGTGGCGCCGGGGTGGTCGCGGGGGGCGGCGGGATCACCGGTTCCGGCGGGCGGAAGTCGTGC

TGTTCGGCCGGTACATGGTCCGGACGCGGCGCCGCGCCGGGCGGCGGCGGGGTGAGGAAGTCGAACAGGT

CGGGCTTGGTGTCCAGCGGCGAGCCGCCCTGGAAATGCGCCGTCACCGCGGGGTGCGGGGTGGGCGCCGG

ms061_6bp/0.87 Consensus repeat: GTTGGC Dispensation order : GTGC ACCAGCGGCGGTTCGTCGACCGGAGGCGCCGAAACGCTGGCCGGCTCCCGGGCTTGCGTGGACGCCGCGA

CGCGCGCGGAGACCGCCGGCGCTTGCCGTGCTACCGATCCGGACGGCGACACTGTTGGCGTTGGCGTTGG

CGTTGGCGTTGGCGTTGGCGTTGGCGTTGGCGTTGGCGTTGGCGTTGGCGTTGCGTCCGCGGCAACTGGC

ATGGGGGGCTGCCGAATGGTCGGCGGCCGGTCGGCGGCAGGCGCCGCGGGCTGGTCGGCGAGAGGCGTCG

AGGTCGGCGCGTCGGCTGTCGCGGCGGCCTCCGTCGTTTCGTCGCCCTTGTCGAACGGTGGCCTGGGCGC

CGGCGGTCGGTGCGCGGGCAGGGCCTGTTCGAAGGCGATCTGCTGCGCGCGCAGCGGCGGAAGGGGGGCA

AGGGTGTCGGACGACACGAGCGGAGCCGTATCCACGGCGTTCAGCTTGAGCATGGCCAGGTCTCGTGGCG

GGTGAATTCTTCCAGTTCGCCTTCCTCGCTGCGTTCGCGCAGCCCCTGGCGCTCGGCGTCGACGTGGCGC

TCCAGTTCGGCGAACTTCTCCAGTTGCCGCTGGCGTTCCAGCAGCTCTCGCCGGCACTGCCGCAGGCGCT

CGCGCTCCCCTTCGAGGCGCTGCGCGGCCTCGGCGCAGTCCTGTTCCAGGCCGGCTTCCTTTTCCCGCAG

CAGCCCTACCTGCTGCTGCCAGGCTTCCAGGCGCCGGCGGTCGAGCATGGCCGCCTGGCAGGCGAGAAAC

AGCCGTTGCTCTTCGGCCAGTCGCCAGTCGCGGTAGTCCCGTTGCGCCGCCTGGCGCTCGGTGTGTTCCT

GCGCCGCGGCGCGAACCCGTAGCAATTGGCGGCCCTGGGCGCGCTCGGCCCGGTCCAGGCGCAGGCGTCG

GACGCGCAACAGCAGAGCCAGGCTCATGCGCAGAGGCTCCGCAACTGCGCGCAGGCCTGTGCGTAATCGC

46

3. ตารางแสดงขอมลของ forward primer, reverse primer และ sequencing primer

Pyromark assay (reference sequence:NC_0025162 PAO1)

FP=Forward primer/RPB=Reverse primer labeled biotin/SP=Sequence primer

Target Primer sequence (5’3’) Length (bp)

Tm %GC Product size

ms209

ms209-FP

CAGCCAGGAACTGCGGAGT 19 72.9 63.2

148 bp ms209-RPB

CTTCTCGCAACTGAGCTGGT(biotin) 20 69.7 55.0

ms209-SP

CACAAGGAGAAGGCA 15 50.5 53.3

ms010

ms010-FP

GCAGGAACGCTTGCAGCAGGT 21 78.1 61.9

167 bp ms010-RPB

CTTCGCCGACCCAGGGATCA(biotin) 20 78.9 65.0

ms010-SP

GCGCCGCCACGCTCG 15 72.4 86.7

ms061

ms061-FP

CTTGCCGTGCTACCGATCC 19 72.9 63.2

126 bp ms061-RPB

CCCCCATGCCAGTTGC (biotin) 16 71.3 68.8

ms061-SP

CCGGACGGCGACACT 15 62.6 73.3

47

ประวตนกวจย โรงพยำบำลธรรมศำสตรเฉลมพระเกยรต

8. ผลงำนวจยทผำนมำ 1. Pootong A, Mungkornkaew N, Chanphorng A, and Cowawintaweewat S. Evaluation of VersaTREK automated microbial detection system. J Med Tech Assoc Thailand. 2011;39. 2. Apisarnthanarak A, Khawcharoenporn T, Thongphubeth K, Yuekyen C, Damnin S, Mungkornkaew N, and Mundy LM. Postflood pseudofungemia due to Penicillium species. Clin Infect Dis. 2012;55:e9-e11. 3. Tangsathapornpong A, Banjongmanee P, Unrit K, Sritipsukho P, Mungkornkaew N, Sajak S. The efficacy of 2% chlorhexidine gluconate in 70% alcohol compared with 10% povidone iodine in reducing blood culture contamination in pediatric patients. J Med Assoc Thai. 2014;8:34-40.

1. ชอ - นำมสกล : 1.1 ภาษาไทย นางนรศรา มงกรแกว 1.2 ภาษาองกฤษ Mrs. Narissara Mungkornkaew 2. ต ำแหนง นกเทคนคการแพทย 3. สงกดหนวยงำน : หนวยจลชววทยา 4. วน/เดอน/ปเกด 18 กมภาพนธ 2523 5. ทอยทตดตอได บานเลขท 37/164 หมบานเปยมสข ตรอก/ซอย ตวานนท 22 ถนน ตวานนท แขวง/ต าบล บางพด เขต/อ าเภอ ปากเกรด จงหวด นนทบร รหสไปรษณย 11250 โทรศพท - โทรสาร - โทรศพทมอถอ 081-8341628 อเมล [email protected] 6. วฒกำรศกษำ ปรญญาโท มหำวทยำลย ธรรมศาสตร 7. สำขำวชำทเชยวชำญ จลชววทยา

48

4. Shima A, Hinenoya A, Samosornsuk W, Samosornsuk S, Mungkornkaew N, and Yamasaki S. Prevalence of Providencia strains among patients with diarrhea and in retail meats in Thailand. Jpn J Infect Dis. 2016;69:323-25. 5. Niyomdecha N, Mungkornkaew N, Samosorksuk W. Serotype and antimicrobial resistance of Salmonella enterica isolated from pork, chicken meat and lettuce, Bangkok and central Thailand. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2016; 47:31-9. 6. Mungkornkaew N, Sookrung N, Chaicumpa W, Somroop S, Pootong A, Samosornsuk S, Tongtawe P, Samosornsuk S. Production of monoclonal antibody specific to Campylobacter jejuni. J Med Tech Assoc Thai. 2017;45:6052-64. 7. Mungkornkaew N, Chanpong A, Thongphubeth K, Khawcharoenporn T, Saiphoklang N, Niyomdecha N, Rienthong S, Samosornsuk W. Efficacy and cost-effectiveness of Tuberculosis Polymerase Chain Reaction (TB-PCR) test comparing to acid fast staining for diagnosis of tuberculosis in Thammasat University Hospital. J Med Tech Assoc Thai. 2017;45:6170-79. 8. Pootong A, Mungkornkaew N, Norrapong B, Cowawintaweewat S. Phylogenetic background, drug susceptibility and virulence factors of uropathogenic E. coli isolate in a tertiary university hospital in central Thailand. Trop Biomed. 2018;35:194-204. 9. Nutalai, D, N. Mungkornkaew, J. Yansombat, S. Samosornsuk, W. Samosornsuk. 2018. Studies on diarrheagenic Escherichia coli isolated from rectal swab patients in Thammasat University Hospital. TUH Journal 3(2): (in press).

Documents

Multilocus Sequence Typing of Pseudomonas aeruginosa ... · Unit Microbiology Laboratory ประจ าปีงบประมาณ 2560 ... Fiscal Year 2017 ... จ านวน