4
High-priority communication $ Mutational analysis of ethanol interactions with G-protein-coupled inwardly rectifying potassium channels Koji Hara, Joanne M. Lewohl 1 , Tomohiro Yamakura 2 , R. Adron Harris* Waggoner Center for Alcohol and Addiction Research and Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 2500 Speedway MBB 1.124, Austin, TX 78712, USA Received 27 October 2000; received in revised form 23 January 2001; accepted 31 January 2001 Abstract G-protein-coupled inwardly rectifying potassium GIRK) channels play a major role in regulating inhibitory responses in the nervous system. Previously, we showed that function of GIRK channels, but not that of the related inwardly rectifying potassium IRK) channels, was enhanced by intoxicating concentrations of ethanol in native and recombinant systems. In addition, by using chimeras constructed between GIRK2 and IRK1 channels and truncation mutants of GIRK2 channel, a region of 43 amino acids in the carboxyl C) terminus of GIRK2 channels was shown to be important for enhancement by ethanol. In the present study, we attempted to define the critical amino acids for ethanol actions within this 43 amino acid region. We made GIRK2 channel mutants with single or multiple amino acids changed to those corresponding to IRK1 channel by using site-directed mutagenesis and expressed them in Xenopus oocytes. Each of the amino acid residues not identical between GIRK2 and IRK1 channels was systematically changed. Ethanol 100 mM) enhanced function of wild type GIRK2 channel by 38%, as observed previously. However, none of the mutants showed any significant difference from wild type, indicating that none of the mutations tested were sufficient to abolish the enhancement by ethanol. D 2001 Elsevier Science Inc. All rights reserved. Keywords: Ethanol; GIRK channels; Site-directed mutagenesis; Xenopus oocytes 1. Introduction G-protein-coupled inwardly rectifying potassium GIRK) channels are important for regulation of synaptic transmis- sion and neuronal firing rates. The outward flow of potassium ions through GIRK channels leads to a decrease in neuronal excitability and potentially regulates inhibitory responses in the central nervous system Dascal, 1997; Jan & Jan, 1997; Neer, 1995). In our previous study Lewohl et al., 1999), ethanol enhanced function of GIRK channels expressed homomerically in Xenopus oocytes, including GIRK1, GIRK2, and GIRK4 channels, but did not affect inwardly rectifying potassium IRK) channels, and these findings were confirmed by results obtained in another laboratory Kobaya- shi et al., 1999). Results of these studies suggest to us that ethanol directly affects GIRK channels without interaction with G proteins or involvement of second messenger and showed that 43 amino acids in the region between amino acid 331 and 373 in the carboxyl C) terminus of GIRK2 channel were important for enhancement by ethanol. The aims of the present study were to determine the site of action of ethanol and to understand the interaction of ethanol with GIRK2 channels. We made 14 mutants of the GIRK2 channel where amino acids were systematically mutated to the corresponding amino acid in IRK to make single, double, or triple mutants or insertion, depending on the location of amino acids. All amino acid residues not identical between GIRK2 and IRK1 channels were exam- ined. To screen for the responses to 100 mM ethanol, these mutants were expressed in Xenopus oocytes and assayed by using a two-electrode, voltage-clamp system. 0741-8329/01/$ ± see front matter D 2001 Elsevier Science Inc. All rights reserved. PII:S0741-832901)00134-3 $ A paper published as a high-priority communication is one that reviewers have identified as being of high scientific significance and have recommended that the study findings should be communicated to the scientific community as soon as possible. * Corresponding author. Tel.: +1-512-232-2514; fax: +1-512-232- 2525. E-mail address: [email protected] R.A. Harris). Editor: T.R. Jerrells 1 Present address: Department of Biochemistry, University of Queens- land, Brisbane, QLD, Australia 4072. 2 Present address: Department of Anesthesiology, Niigata University, School of Medicine, Niigata 951-8510, Japan. Alcohol 24 2001) 5 ± 8

Mutational analysis of ethanol interactions with G-protein-coupled inwardly rectifying potassium channels

Embed Size (px)

Citation preview

����������� ���� ��������

� ������ ������� �� ������ ���������� ��� ����������� ����

������� �������� ������ � ��������

���� ����� ������ �� �������� �������� ���! ��"� #� $���� ������%

�������� ����� �� �� ���� ��� ���� ��� ������ � ��� ������ �� �������� ��� ���� ���� �������� ��������� � ����� � ������

���� !���"�� ��� #$#�%� ������ �& '('#�� � �

#����&�� "' (��)�� "***+ �����&�� �� ��&���� ���� ", ��� �� "**�+ ������� ,� ��� �� "**�

��������

����������� ���� ������� �������� ������ � -�.#�/ �������� ��� � ����� ���� �� ��� ����� ����)��� ��������� �� �� ���&� �

����� 0��&�� ��� �� ������ �� � ����� �� �.#� ��������� ) �� �� �� �� ������ ������� �������� ������ � -.#�/ ��������� ���

�������� ) ���1������ ������������ �� ������ �� ���&� ��� �����)���� ������ .� �������� ) ���� �������� ����� ��� )�����

�.#�" ��� .#�� �������� ��� � ������ � ��� �� �.#�" �������� � ������ �� 2, ����� ����� �� �� ���)�1� -3/ ����� � �� �.#�"

�������� ��� ����� � )� ������� ��� ���������� ) ������� .� �� ������ � �� �� ������ � ������ �� ������� ����� ����� ���

������ ������ ����� ��� 2, ����� ���� ������� 4� ���� �.#�" ������� � ��� ��� ������ �� � ����� ����� ����� ������� � ����

������������� � .#�� ������� ) ���� ����������� � �������� ��� �1������� ��� �� &���!�� ������ 5��� �� �� ����� ���� ����� ��

�� �������� )����� �.#�" ��� .#�� �������� ��� ���������� �������� 5����� -�** ��/ �������� � ����� �� ���� �� �.#�"

������� ) ,67� �� �)���&�� ���&�� ��� ����&��� ���� �� �� � ��� ������ �� ���������� ���������� ���� ���� ��� ��������� ��

���� �� �� � ����� ���� ���� � ������� � �)����� �� ���������� ) ������� � "**� 5���&��� 8������ .��� $�� ����� �����&���

)��"����* 5�����+ �.#� ��������+ 8���������� � ��������+ &���!�� �����

� ���� ������

����������� ���� ������� �������� ������ � -�.#�/

�������� ��� ������� ��� ��� ����� �� ������ ��������

���� ��� �� ����� ������ ����� ��� � ���� ���� �� ������ �

���� ��� �� �.#� �������� ����� � � �������� �� �� �����

�1���)��� ��� �������� ��� ���� ����)��� ��������� ��

�� ������ ���&� � ���� -9������ �::'+ ��� ; ���� �::'+

<���� �::=/� .� � � ���&�� � � � -������ � ���� �:::/�

������ �������� � ����� �� �.#� �������� �1�������

������������ �� &���!�� ������ ���� ���� �.#���

�.#�"� ��� �.#�2 ��������� ) ��� �� ����� �������

�������� ������ � -.#�/ ��������� ��� ���� �������� ����

��������� ) ��� �� �)����� �� ������ ��)����� -��)���

��� � ���� �:::/� #�� �� �� ���� � ���� � ���� � � ��

������ ������ ������ �.#� �������� ���� ���������

��� � ������� �� ��&��&���� �� ������ ��������� ���

������ �� 2, ����� ����� �� �� ������ )����� ����� ����

,,� ��� ,', �� �� ���)�1� -3/ ����� � �� �.#�" �������

���� ������� ��� ���������� ) �������

��� ���� �� �� ������ � � ���� � �������� �� ���

�� ����� �� ������ ��� � �������� �� ��������� ��

������ ��� �.#�" ��������� 4� ���� �2 � ��� �� ��

�.#�" ������� ����� ����� ����� ���� ����������

� ��� � �� ������������� ����� ���� �� .#� � ��!�

������� �� )��� �� ����� � ��� �� ��������� ��������� ��

�� ������� �� ����� ������ $�� ����� ���� ����� �� ��

�������� )����� �.#�" ��� .#�� �������� ���� �1���

����� �� ������ ��� �� ��������� � �** �� ������� ����

� ��� ���� �1������� �� &���!�� ����� ��� ������ )

���� � ������������ &����������� �����

*'2��6,":>*�>? @ ��� ���� ���� � "**� 5���&��� 8������ .��� $�� ����� �����&���

0..A 8*'2� �6,": -*� /**�,2 �,

� $ ����� � )������ �� � ����������� ���� ������� �� ��� ��

��&������ ��&� ��������� �� )���� �� ���� ��������� ������������ ��� ��&�

����������� �� �� � � �������� ��� �� )� ���� ������ � ��

��������� ���� �� �� ���� �� �����)���

% 3������������ � ���� ����A B��=�"�","�"=�2+ ��1A B��=�"�","�

"="=�

+,-��� �������A ������C����� �1����� -#�$� ������/�

5����A ��#� ��������� 0����� �������A 9������� �� D���������� E��&���� �� F �����

����� D���)���� F�9� $ ������ 2*'"�" 0����� �������A 9������� �� $������������ <����� E��&�����

8����� �� ��������� <����� :=��6=�*� ������

$������ "2 -"**�/ =@6

� ��������� �� ����� �

�$#$ ���-��� ��� -�������

&���!�� ������ ������ ����� ���� � ������� ����

G���� � �1����� -���������� H�� E8$/� ��� �1��������

�� ������ ��� ���� �����&�� ) �� $����� 3��� ���

E�� 3������� �� E��&���� �� ��1��� 5����� ���

�)����� ���� $$05# $������ ��� 3������� -8���)�

&����� � � E8$/� ,�$����)��I��� ���� ��� ���� ���

�)����� ���� 8���� -8� �� ��� �(� E8$/� G��� D� �

����� ��� �� �3$0� #<$ 3������ �� ���� �)�����

���� 8������� -�� ������ 3$� E8$/� ��� F.$�����

0������ ��1� �� ��� �)����� ���� F����� -J��������

3$� E8$/�

�$�$ .��!������ �� /��)� 01� ��� �1�

�.#�" ������� �9<$ � )������ ��� �� �D� ������ ..

�8 � ��� !���� ���&���� ) ������ ��� ��!�� .��� ��

0������������ ����� ����� � 3��� ������ J��)����� H������

G��� D� � ����� ���� ���������� ��� �� �9<$� ���

��������� ������� ��� � ������ ��� �� F.$����� 0������

��1� ��� ��� �.#�" ������� �9<$� ���� �������I�� ���

1�.� ������@���������� �1������ ��� ������ ����������

��� " � ���� � ������ ��� �#<$� ���� �������� )

���� �� �3$0� #<$ 3������ ���

�$2$ ������ ��� � /��)� -����

�9<$� �� �.#�" � ���� ����� ����� ����� ����

�������� ) �� ������������� ����� �� �� .#��� ���� ����

) ���� �� F �!3������ 8���9������ � �������� ��

-8�������� �� ������ 3$� E8$/� $�� ����� ����� ����

&������� ) �� )���������� 9<$ ��K �������

�$%$ �������� ��� ��� ��!��������� �� �� ������ �

G���� � �� ���

8 ������ ������ ��� ���� ��������� �� ����� ���� ��

���� �������I�� �� ���� ��� ,������)��I��� ���� ���

���� -"2* ��>"** �� �� ����/� .������� �� &���!��

����� ��� ��������� �� ������)�� ���&�� �� -����� �

���� �::2/� .������ ����� ���� ������ �� �������� D���L�

������ -�D8/ ��������� 66 �� <�3�� � �� �3�� "�2 ��

<��3(,� *�6" �� ��8(2� *�:� �� 3�3�"� *�,, ��

3�-<(,/"� ��� �* �� 1�"�����1���������I����1�"�

������ ������ ���� -�5058/ ��� ��� � �� '�=� 4��� ���

�� � ����#<$ -,* ��>����/ ��� ������� ��� �������

�� ����� ��� ������� ����� ���� ����� ������ ��

3������ ���� ����� -3������ ����� 4��!�� 3������� < �

E8$/ ��������� ��� )���� ���� � -������ �D8 � �����

����� ��� �* ��>� �� ���������� �**�*** ���>� ��

����������� =* ��>� �� ���������� :* ��>� �� �����������

��� ""* ��>� �� �� &��/ ��� ��� )��� � �=�@�:�3� (� "�� , ��� ���� ��������� ����� ���� ��� �� ���������

���������� ��������� -9����������� ; ������� �::"/�

(���� �1�������� ���� �� �� � ��� �� �.#�"

�������� ���� ������ �� � ������ ��� ����)�� -� �**���&�� ��/ ��� ���� ��� -" ��>���/ ��� �D8� ��� ������ ��

������ ���� � ���� ) ���� � ������������ &������

����� ���� �� ������� ���&�� �� -������ � ����

�:::/� ��� ������ ����� �� ����� ���� ������� ���

�� ����� ��������� -*�=@�* ������/ ������ ��� , �

�3�� ��� ����� ���� &������������� � � 6* �J )

���� � 4����� .��� ���� ����� (3�'="D -������� 3��

E8$/ ���� ������ (���� ���� ������� )���� �� �D8

��� ��� ������� � ���� ������ � -��/ ��� ��� �������

��� " �� <�3�� :M �� �3�� � �� ��3�"� ��= �� 3�3�"�

��� = �� �5058 ��� ��� � �� '�=� D��� �� )���� � ����

�)����� �� ������������ ) ���� -�D8/ �� ������ �� ��� �

H��� �� $������� �� ��K ����� �� ����������� ���� ������� �������� ������ � -�.#�/�� �.#�"� ��� ������� �������� ������ � -.#�/� �������� ��

�� ������ )����� ����� ����� ,,� ��� ,',� $���� ����� ��� � �)���� ��������� � �� ��K ���� �� �� �� �.#�"� .������� ����� ���� ����� �� �����

���� ������ � �������� ��� �������� �� ���! )�1��� ��� ����� ���� ����� �� ���������� ������� ��������� ����� �� �������� ��� �������� �� ������ ���

)�1��� ��� ��)��� )���� ����� ����� �������� &���� � ����� ������ � �� �� ������ -�/� �� )�� -�/� ��� ����� -�/ � ��� ��� �������� �� ����� ���� -�/���� � �)��� )���� �� ��)��� ���������� � ���� �� � ��� �� ��)�� ��

)$ 3��� � ��$ 4 �� ���� �% 5���#6 �7(M

��� ��� ��� � ��&���� �� ���&��� ����� �� �� ������� ���

���&��� � ����� ������ � ����� �� ���&�� �� �������

-��&��� � ���� �::=/� $��� ��)�� ��������� ���� ���)�

������� ������ -�** ��/ ��� ������� �� �� �� ��� ��� ���

" ��� )����� �� ����� � �� �� ��� ����

�$�$ ���� �� ��������

$�� ��� �� ��� �1������� �� ������ ���������� )

������ �� �� � ���� �� �� ��� ���� ��� ������ ���������

-�� �� ��� ���/ ���� ���� ��� )����� ��� ���� ����������

�� �** �� ������� 5��� �� �� � ��� ��� ���� �� �

���� ��1 ����� �)����� ���� �� �������� ������ 9�� ���

�1������� �� ����� N 8�5���

� �������

��� �� �� �.#�" ������� ��K ���� ���� ����� �����

,,� � ,', ��� ������� ��� �� ������������� � �� �.#��

��� �� �� .#�� �������� ) ���� ���J����� ��������

����� ������� � ��� � �� ������� )����� �������� ,M,

��� ,M2 �� �.#�" ������� -H��� �/� 4���� ��� ������� ��

����� ����� �� ��� ����� ������&�� �� �.#� ��������� )

�������� ���� .#�� �������� ���� ���������� ��� ����

� ��� ��� ����� �� ��)�� �� $�� � ��� ������ ������

������ � � ����� �� �� ��� ��� � � ������ ���������

������� � �� ��� ���� ��� .� ���� �� �.#�" �������� �**

�� ������ �������� ������ ������ � � ���� ),67 N 27� ����� �� �������� ��� ���&�� � ��������

-������ � ���� �:::/� $�� � ��� ���� ������ � �������

��������� ����� �� ������� ��� ��� ��� �� �������� ����

�� ��� ���� �� -��)�� �/� #���������&� ������� �� ��

������ � � ����� �� ��&���� � ��� -�,2,H B�,225�

9,2M�� 5,=6�� ��� �,M"J B 8,M,0 B< ����� � ,M2/ ���

����� �� H��� "� .� �� ������� �� ��!��� �� � �� ���

���������� � ������� ,M2� � ������� �� � )��� ����������

��� ����� ��� �� ��� � )���� �� ����� ����� ���������

�� ������� ,M2 ���� �������� �������� ���� ���� ���

����&��� �&�� ��� ����� � �������� ������&� � ������

-���������� �� 2"7N ,7� � O ,/�

� ����������

4� ��� ����� ��&� ����� ���&�� �� �� �.#� �����

���� ��� ������&� � ������� ������� �� ������ .#�

�������� ��� ��������&�� 4� ����� ��� �������� )�����

�.#�" ��� .#�� ��������� ����� ��&����� �� �� ������

��������)�� ��� �� ���������� �� �.#� �������� )

������ �� �� �� �������� ��� 3 ����� � )����� �����

����� ""2 ��� 2�" -������ � ���� �:::/� H ��������� �

������I� �� ������ ���� ������� � ������ � ��� ����

����� ��� ) ����� ���� ��� ����� � ������� "6'� ,,��

��� ,'2 �� �.#�" ������� -�.#�"�"6M� �.#�"�,,*� ���

�.#�"�,',/� $���� ���� � ������ � ���� �.#�"�"6M

��� �.#�"�,,* ��� ��� �� �)������� �� �������� � �**

��)�� �

5����� �� ������ �� ����������� ���� ������� �������� ������ �

-�.#�/" � ��� �� �� ������ )����� ����� ����� ,,� ��� ,',�

0����� ����������

) ������

4��� �� ,: N ,

� ���

-�/ H,,6 B�,,:5 ,M N 2

-"/ �,2,H B�,225 ," N '

-,/ 9,2M� 2* N "

-2/ �,2'� ," N =

-=/ H,26 B5,=*� ,= N "

-M/ <,=28 B 8,==# ,, N ,

-'/ 5,=6� 2, N ,

-6/ �,M"JB 8,M,0B< ����� � ,M2 ,: N ,

-:/ < ����� � ,M2 ,6 N =

-�*/ �,M2< ,= N ,

-��/ 0,M=� ,' N ,

-�"/ 8,MM0 2" N ,

-�,/ 8,M63B$,M:8 B�,'*$ 2* N '

-�2/ 5,'�# ,' N 2

� ��� ������ �� ������ ���� � ���� ) ���� � ������������ &������

����� ����� (���� ���� &������������� � � 6* �J� ������� )������ �������� D���L� ������� ��� ��� ������� � ���� ������ � -��/

��� ���� .����� � ����� ������� ) �� ��� ��� ���� ��������� $��� ��)��

��������� ���� ���)������� ������ -�** ��/ ��� ������� �� �� ��

��� ��� ��� " ��� )����� �� ����� � �� �� ��� ���� $�� &�� �� ����

�1������� �� ������ ���������� �� ������ -�� �� ��� ���/ ��� ��

����� N 8�5��� 5��� � �� ��� ���� �� � ���� ��1 ����� �)�����

���� �� �������� ������

H��� "� #���������&� ������� �� ���������� �� ������ � � ����� )

������ �� �� � ��� �� ����������� ���� ������� �������� ������ �

-�.#�/" �������� (���� �1�������� � ��� -�,2,H B�,225� 9,2M��

5,=6�� ��� �,M"JB8,M,0B< ����� � ,M2/ ���� ������� )���� ��

�������� D���L� ������ -�D8/ ��� ��� ������� � ���� ������ � -��/

��� ���� $��� ��)�� ��������� ���� ���)������� �** �� ������ ���

������� �� �� �� ��� ��� ��� " ��� )����� �� ����� � �� �� ��� ���� $��

� ��� ������ ������ ������ � � ����� �� �� ��� ��� � � ������

��������� ������� � �� ��� ���� ���

)$ 3��� � ��$ 4 �� ���� �% 5���#6 �7( '

�� ������ �� �� ��� ��� -�.#�"�"6M� =7N ,7+ �.#�"�

,,*� *7N *7/� .� ������� �.#�"�,', �������� ������

� ������ ��� ���� � ����� ���� �������� ) ������

-,27 N 27/ -������ � ���� �:::/�

4� �������I�� �� ����� ���� 2, ����� ����� �� ���

������&�� �� �.#� ��������� ) �������� ���� .#�� �����

���� ��� ��� �� �� ��� ������� ��� ������ ������ .� ��

������ � �� �� ����� ��� �.#�" ������� � ���� � ��

�� ������� �� )��� ����� � ����� ��������� �� )��� ) ����

����������� � ��������� ���� ����� ��� ���&�� �� � ��

����� � �� �������� �� ����� ����� ������� ��� ������ �����

�� �$D$$ ��� ������ �������� -����� � ���� �::'/� 3���

��� � � � �1��������� ��� � ��� ������ ������ ������

��������� �� ������� � ������ $���������� ���� �� ��� �

�� ��������� �� ����� ��� �������������!��� �� ��

������ ��������� �� ������� ,M2 �� �� ��&��&�� �� ������

������� . ��� �� )� ���� �� �����)���� �.#�" � ) ���

�� �� ���� ��� ��������� �������� ) ��!�� ���� ������

����� ����������� �� �������� ��.#� � ) �� ��&���!��

������ $ ��� ���� ��� �� �.#�= -G.#/ � ) �� ��� )���

������� ���� &���!�� ������ �&�� �9<$ ��)��� -����� �

���� �::M/� �� �� � � � ��� �.#�" � ) ��� �� ���

�����)�� ��� �������� � - �� ���/ �.#�= ��� ����)

�)�� �� �� ����� �� �� � ������ ����&��� ��� �����

���!�� )��� �� � ������ �� �� 3 ����� � ���������

������ ������ ������ ��!�� ����1�������� ��� �������� �

�.#�= -������ � ���� �:::/� $ ������ ����������� �� � �

��� �� �� �� ������� ����� ����� �� �.#� �������� �����

����� �������� �)����� ������ ������ ��� ���� ��� ��

����� ����� ������ �������� �� �� ������ )����� �����

����� ,,� ��� ,M, ���� ���� ������� ��� ������ ������ �� ��

� ���� � ����� � ����� �� ���&��� � � �� � � ��������

����� ����� ����� ��� ��&��&�� �� �� �������� �� )������

��&� ��� ��� �� ������ ��� �������

.� � ����� �� ����� �� �� �� ����� �� ������ ��

�.#� �������� ���� �� ������ �������� �� � ������ �����

����� $�������� �1�������� ��� ��K ���� � �������� ��

������� ��������� �� ������ ��� �.#� ���������

�������� ������

��� � ���� ���! 9�� 8��� ����� ��� ��� ����� �

� ��������� ���� ���! ��� � ������ ) <.�><.$$$

���� $$*M,::�

����������

9������ <� -�::'/� 8��������� &�� �� � ����������&��� � B ��������� ����

����� 8� ==�@=',�

9������������ �� 5�� ; ������� #� $� -�::"/� 3��������� �� ������

������&� �� �� )���� !������ 9��������������,�����1�=������2�

���1����� ���������� ���� ��� 1������9�������� �������� �1�������

�� &���!�� ������ 9 .���-� �� +�! ���� �:�� 26'@2:2�

������ �� 5�� ���� <� H�� ; 3������� 9� 5� -�::M/� 3������ �� � &���!��

������ ������� �������� � B ������� � ) �� �� ������ �.#�� �1�

�������� �� .�$3� � ����� �� ������ 1����� #:� 2",@2":�

���� �� �� ; ���� � <� -�::'/� 3����� ������ � �������� ���� � !�����

��� ���!������ ���� ��� 1����� � ��� :�@�",�

��)������ ��� .!���� ��� ������� ��� <�!�� ��� ���� #�� �����!�� ��� ;

� �������� �� -�:::/� 5����� ����� ������������&��� ������� ����

����� � B ��������� 1� 1����� � �� �*:�@�*:'�

��&���� $�� ����� 9� ��� ; 3��&!��� 3� -�::=/� $��������� ��� ��������

�I���� �� �� � ������ ���������� ���� ������ � ������� -�.#��/� 9���� ���- �'�� =6:@=:=�

������� �� ��� 4������ 4� #�� �������� #� 9�� D��I���!�� 8� ��� ��������

#� $�� ; ������� #� $� -�:::/� ����������� ���� ������� ��������

������ � �������� ��� ����� �� ������� ������ 1� 1����� � ��

�*62@�*:*�

������ 8� ��� ��F ��!��� 8� ��� 5���� 5� .� "��� .����� � 0�� ; ������� #� $�

-�::2/� 0�������� �� �������) ��� ���� �� $ �������@��������������� � ����� ) ��&�� ���������� ����� ��� ��������� ��� ����

�)������ � ��� �� ������� ���������� ��� .���-� �� %:� 6=�@6='�

������ 8� ��� �� F�� 4��!� �� ��� ��������� J� J�� �������!�� �� 9�� H����

8� 5�� ������� �� 0�� J����I ���� 3� H�� ������� �� ��� �����)��� 5� 0��

������� #� $�� ; ��������� <� �� -�::'/� 8��� �� ������� ��� &������

��������� ����� �� �$D$-$/ ��� ������ ��������� 1���� 2(8�

,6=@,6:�

<���� 5� �� -�::=/� ������������ � �������A ������I��� �� �������)����

�������� ���� (�� "2:@"='�

)$ 3��� � ��$ 4 �� ���� �% 5���#6 �7(6