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中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１２）：１～６

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研究报告

α突触核蛋白 Ｎ端结构域参与线粒体功能的调控

吕　王乐　张　韬　刘　琦　范春香　张　凌　赵焕英　赵春礼　杨　慧（首都医科大学北京神经科学研究所 北京市神经再生修复研究重点实验室 神经变性病教育部重点实验室　北京　１０００６９）

摘要　目的：确定αＳｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白与线粒体相互作用的功能结构域，并检测该结构域对线粒体功能的影响。方法：构建重组融合蛋白质粒 ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎＷＴ、ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎＮ和 ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎ△Ｎ，转染人胚肾ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，通过免疫共沉淀明确αＳｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白与线粒体相互作用的功能结构域。使用表达 αＳｙｎｕｃｌｅｉｎ蛋白的病毒上清感染小鼠多巴胺能神经细胞 ＭＮ９Ｄ，通过免疫荧光、流式细胞术检测线粒体膜电位及 Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ释放。结果：成功构建了 ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎＷＴ、ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎＮ和 ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎ△Ｎ融合蛋白质粒，免疫共沉淀明确 αＳｙｎｕｃｌｅｉｎＮ端为其功能结构域，ＪＣ１染色发现 Ｎ端使线粒体膜电位降低，流式细胞术证实 Ｎ端使Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ释放明显增加。结论：αＳｙｎｕｃｌｅｉｎＮ端是其与线粒体相互作用的功能结构域，Ｎ端降低线粒体功能。

关键词　α突触核蛋白Ｎ端结构域　线粒体　线粒体膜电位　细胞色素ｃ中图分类号　Ｒ７４２．５

收稿日期：２００９０６０１　　修回日期：２００９０８２３ 国家自然科学基金（３０６７０６５５）、北京市教育委员会科技发展计划项目（ＫＭ２００６１００２５００２）、教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目（２００６００２５００４）、北京市自然基金面上项目（７０８２０１１）、北京市属高等学校人才强教计划（２００９０７１１３）资助项目通讯作者，电子信箱：ｈｕｉｙａｎｇ＠ｃｃｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

　　帕金森病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）是常见的神经

系统变性病，主要源于中脑黑质致密部（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｎｉｇｒａ

ｐａｒｓｃｏｍｐａｃｔａ，ＳＮｐｃ）多巴胺神经元退行性变导致的细

胞死亡。ＰＤ病理特征是黑质纹状体多巴胺神经元死

亡和细胞质内类蛋白质物质减少，以及特征性“Ｌｅｗｙ

体（Ｌｅｗｙｂｏｄｉｅｓ，ＬＢｓ）。Ｌｅｗｙ体内多种蛋白质富集，包

括 αＳｙｎｕｃｌｅｉｎ、ｐａｒｋｉｎ、泛素、神经微丝等，其中，α

Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ（αＳｙｎ）是主要成分［１］。ＰＤ病因尚不清楚，

目前认为其发病机制主要涉及线粒体功能障碍、氧化

应激、αＳｙｎ错误折叠、泛素蛋白酶系统异常、慢性炎症

等，其中线粒体功能障碍是中心环节［２，３］。ＰＤ发生过

程中线粒体的一些变化与αＳｙｎ蛋白密切相关，有证据

表明，αＳｙｎ能与线粒体共定位并相互作用［４］。

　　αＳｙｎ由１４０个氨基酸组成，研究认为Ｎ端可与细

胞膜可逆结合，是形成α螺旋的必需结构［５］；去掉Ｎ端

３２个氨基酸，αＳｙｎ不再进入线粒体［６］。因此探讨 α

ＳｙｎＮ端是否为其与线粒体相互作用的功能结构域以

及Ｎ端对线粒体功能的影响，对进一步明确 αＳｙｎ蛋

白与线粒体的关系具有重要意义。

１　材料和方法

１．１　材　料

　　ＨＥＫ２９３Ｔ和 ＭＮ９Ｄ细胞株均由本室保存；引物合

成（上海英骏生物技术有限公司北京测序部）；Ｐｒｉｍｅｒ

ＳＴＡＲＨＳＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、限制性核酸内切酶（ＴａＫａＲａ

公司）；Ｔ４ＤＮＡ连接酶（ＮＥＢ公司）；ＤＮＡ凝胶纯化回

收试剂盒（天根生化科技北京有限公司）；ＷｉｚａｒｄＰｌｕｓＭｉｄｉｐｒｅｐｓＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；

Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司）；ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／

Ｆ１２培养基、胎牛血清（ＦＢＳ）和胰蛋白酶（Ｇｉｂｃｏ公司）；

表达αＳｙｎ蛋白的病毒上清本室保存；ＲＩＰＡ裂解液（北

京普利莱基因技术有限公司）；ｍｙｃ单克隆抗体

（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司）；ＶＤＡＣ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司）；ＪＣ１

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２９Ｎｏ．１２２００９

染料（Ｓｉｇｍａ公司）；Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ释放检测试剂盒

（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ公司）。

１．２　方　法

１．２．１　αＳｙｎＮ与 αＳｙｎ△Ｎ真核表达载体的构建　

以ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎＷＴ为模板，ＰＣＲ方法构建 αＳｙｎ

Ｎ（１～６５）和 αＳｙｎ△Ｎ（６１～１４０）基因片段。引物序

列：Ｎ端上游５′ＣＧＧＡＡＴＴＣ（ＥｃｏＲＩ）ＣＧＣＧＡＴＧＧＡＴＧＴ

ＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＧＧ３′；下 游 ５′ＧＧＧＧＴＡＣＣ（ＫｐｎＩ）

ＴＴＡＡＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＧＣＴＣＴＴ３′。 △Ｎ端 上 游 ５′

ＧＡＡＧＡＴＣＴ（ＢｇｌＩＩ）ＣＧＡＡＡＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＣ３′；下游

５′ＧＧＧＧＴＡＣＣ（ＫｐｎＩ）ＴＴＡＧＧＣＴＴＣＡＧＧ３′。基因片段

与目的载体分别相应双酶切，１．５％琼脂糖凝胶电泳酶

切产物，紫外灯下切割含目的片段和空载体的凝胶，胶

纯化回收试剂盒回收产物；室温、Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用

连接１ｈ，连接产物转化ＤＨ５α感受态细胞，筛选并鉴定

阳性克隆。将表达有 ｐＣＭＶｍｙｃ／ｖｅｃｔｏｒ，ｐＣＭＶｍｙｃ／α

ＳｙｎＷＴ、ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎＮ和 ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎ△Ｎ

的菌株扩增培养，大量提取质粒，鉴定后以备转染。

１．２．２　细胞培养和转染　ＨＥＫ２９３Ｔ细胞接种于含

１０％ ＦＢＳ的 ＤＭＥＭ培养基中，５％ ＣＯ２、３７℃培养。选

用对 数 生 长 期 的 细 胞 用 于 质 粒 转 染。按 照

Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００说明书进行操作。

１．２．３　免疫共沉淀反应（ＣＯＩＰ）　转染２４ｈ，弃培养

基，收获细胞。ＰＢＳ洗两遍，离心弃上清，加５００μｌ预冷

ＲＩＰＡ裂解液（含蛋白酶抑制剂），４℃缓慢摇晃１ｈ充分

裂解。４℃，１４０００ｒ／ｍｉｎ，１５ｍｉｎ，收集上清。准备Ｐｒｏｔｅｉｎ

Ｇａｇａｒｏｓｅ，ＰＢＳ配制成５０％浓度，４０μｌＰｒｏｔｅｉｎＧａｇａｒｏｓｅ

（５０％），４℃缓慢摇晃３０ｍｉｎ去除非特异杂蛋白降低背

景。４℃，１４０００ｒ／ｍｉｎ，１５ｍｉｎ，收集上清，加１μｇＭｙｃ鼠

单克隆抗体，４℃缓慢摇晃过夜。６０μｌＰｒｏｔｅｉｎＧａｇａｒｏｓｅ

捕捉抗原抗体混合物，４℃缓慢摇晃过夜。收集琼脂糖

珠抗原抗体复合物，弃上清，预冷 ＲＩＰＡｂｕｆｆｅｒ洗３遍，

８００μｌ／遍。加 ６０μｌ２×ＳＤＳＰＡＧＥ上样缓冲液，煮沸

５ｍｉｎ，上清电泳。

１．２．４　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ　ＢＣＡ法测蛋白浓度，ＳＤＳＰＡＧＥ

电泳，湿转法将蛋白转移至ＰＶＤＦ膜，８％脱脂牛奶封闭

１ｈ，分别入Ｍｙｃ鼠单克隆抗体（１∶１０００），ＶＤＡＣ山羊抗

体（１∶２０００），４℃过夜。０．１％ＴＢＳＴ洗膜４次，入相应

二抗，室温孵育１ｈ，洗膜同前。加入化学发光液，于暗

室化学发光及显影、定影。

１．２．５　病毒上清感染ＭＮ９Ｄ细胞　ＭＮ９Ｄ细胞接种于

包被有多聚Ｌ赖氨酸并含１０％ ＦＢＳ的 ＤＭＥＭＦ１２培

养基中，５％ ＣＯ２、３７℃培养。细胞生长至８０％汇合，加

入表 达 αＳｙｎ的 病 毒 上 清 及 终 浓 度 ８ｍｇ／Ｌ的

Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ，６ｈ半定量更换培养基，２４ｈ全部更换培养

基，４８ｈ终止细胞生长，进行后续实验。

１．２．６　ＪＣ１检测线粒体膜电位变化　ＪＣ１（Ｓｉｇｍａ）溶

于ＤＭＳＯ，－２０℃储存。收集细胞，ＰＢＳ洗两遍，加入

９μｇ／ｍｌＪＣ１染料，５％ ＣＯ２、３７℃避光孵育１０ｍｉｎ，ＰＢＳ

洗两遍，荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

１．２．７　流式细胞术检测 Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ释放　收集细

胞，ＰＢＳ 洗 两 遍，３００μｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ

（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＩｎｎｏＣｙｔｅＴＭＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ

ＲｅｌｅａｓｅＫｉｔ）将细胞悬浮，Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ抗体室温孵育１

ｈ，ＦＩＴＣＩｇＧ室温避光孵育１ｈ，冷 ＰＢＳ洗两遍，迅速流

式细胞仪检测。

２　结　果

２．１　ｐＣＭＶｍｙｃ／αｓｙｎ各片段重组质粒的鉴定

　　ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ和 ＢｇｌＩＩ／ＫｐｎＩ分别双酶切重组质粒

ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎＮ和 ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎ△Ｎ，１．５％琼

脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，可见成功切出目的片段

（图１）；且测序正确。ｐＣＭＶｍｙｃ／αｓｙｎ各片段重组质

粒构建成功。

图１　ｐＣＭＶｍｙｃ／αｓｙｎ各片段重组质粒酶切鉴定

Ｆｉｇ．１　Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ

ｏｆｐＣＭＶｍｙｃ／αｓｙｎｆｒａｇｍｅｎｔｓ１：Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆαｓｙｎ／△ＮｗｉｔｈＢｇｌＩＩａｎｄＫｐｎＩ；２：Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆα

ｓｙｎ／ＮｗｉｔｈＥｃｏＲＩａｎｄＫｐｎＩ；３：Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆαｓｙｎ／ＷＴｗｉｔｈＢｇｌＩＩ

ａｎｄＫｐｎＩ；Ｍ：２ｌｏｇｍａｒｋｅｒ．（ＷＴ：４２０ｂｐ；Ｎ：１９５ｂｐ；△Ｎ：２３７ｂｐ）

２．２　ｐＣＭＶｍｙｃ／αｓｙｎ各片段在 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中表达

　 　 转 染 ｐＣＭＶｍｙｃ／ｖｅｃｔｏｒ，ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎＷＴ，ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎＮ和 ｐＣＭＶｍｙｃ／αＳｙｎ△Ｎ质粒于

ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，转染２４ｈ收集全细胞蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法，Ｍｙｃ抗体检测蛋白表达。结果显示：转染２４ｈ后，ＨＥＫ２９３Ｔ细胞成功表达αｓｙｎ各片段蛋白（图２）。

２

２００９，２９（１２） 吕　王乐 等：α突触核蛋白Ｎ端结构域参与线粒体功能的调控

图２　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＨＥＫ２９３Ｔ细胞αｓｙｎ

各片段蛋白表达水平

Ｆｉｇ．２　ＡｓｓａｙｏｆＭｙｃｔａｇｇｅｄαｓｙｎｐｒｏｔｅｉｎ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＨＥＫ２９３ＴｕｓｉｎｇＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔＭｙｃｔａｇｇｅｄｖａｒｉｏｕｓαｓｙｎｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄ

ｉｎＨＥＫ２９３Ｔｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓ

１：αｓｙｎ／△Ｎ；２：αｓｙｎ／Ｎ；３：αｓｙｎ／ＷＴ；４：ｍｙｃｖｅｃｔｏｒ

２．３　免疫共沉淀检测 αｓｙｎ各片段与线粒体蛋白

ＶＤＡＣ相互作用

　　αｓｙｎ各片段质粒转染 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，２４ｈ后收

集全细胞蛋白，Ｍｙｃ抗体进行免疫共沉淀（ＣＯＩＰ），

ＶＤＡＣ抗体检测蛋白复合物。结果显示：Ｍｙｃ抗体沉淀

的蛋白复合物中，αｓｙｎ／ＷＴ和 αｓｙｎ／Ｎ组可以检测到

线粒体蛋白ＶＤＡＣ，αｓｙｎ／△Ｎ未检测到ＶＤＡＣ。说明，

αｓｙｎ／ＷＴ和 αｓｙｎ／Ｎ可能与线粒体蛋白 ＶＤＡＣ相互

作用，但去掉Ｎ端后即消失（图３）。

图３　免疫共沉淀检测αｓｙｎ各片段与

线粒体蛋白ＶＤＡＣ相互作用

Ｆｉｇ．３　ＣＯｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｗｉｔｈａｎｔｉｍｙｃ

ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＷＢａｎａｌｙｓｉｓｄｅｔｅｃｔｖｏｌｔａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔ

ａｎｉｏｎｃｈａｎｎｅｌ（ＶＤＡＣ）Ｂｏｔｈｌａｎｅｓｏｆαｓｙｎ／ＷＴａｎｄαｓｙｎ／Ｎｓｈｏｗａｎｅｘｐｅｃｔｅｄｂａｎｄｏｆ

３３ｋＤａ，ｔｈｅｓｉｚｅｏｆＶＤＡＣ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｐｏｔｅｎｔｉａｌｄｉｒｅｃｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ

ｂｅｔｗｅｅｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｔｈｅＮｔｅｒｍｉｎａｌｏｆαｓｙｎ

２．４　ＪＣ１检测线粒体膜电位

　　目前认为ＪＣ１是检测线粒体膜电位的最佳探针。

线粒体膜电位高时发桔红光；线粒体膜电位低时为单

体发绿光。通过ＪＣ１染料颜色的变化可以反映线粒体

膜电位的高低。使用表达有 αＳｙｎ的病毒上清感染

ＭＮ９Ｄ细胞２４ｈ，加入９μｇ／ｍｌＪＣ１，３７℃染色１０ｍｉｎ，

荧光显微镜观察，结果显示：正常ＭＮ９Ｄ细胞（图４ａ）和

感染空载体细胞组（图４ｄ），ＪＣ１发桔色光；过表达 α

ＳｙｎＷＴ（图４ｃ）和过表达 αＳｙｎＮ（图４ｂ）的 ＭＮ９Ｄ细

胞，ＪＣ１发绿光，而且过表达 αＳｙｎＮ组绿色更加显

著。说明，过表达 αＳｙｎＷＴ和 αＳｙｎＮ后，均使线粒

体膜电位降低，而αＳｙｎＮ使线粒体膜电位降低得更加

明显。另外，ＪＣ１染色流式细胞术检测线粒体膜电位

变化，可见，过表达 αＳｙｎＮ组与其他组相比，Ｐ２门内

散点集中部位下移，即红光减弱（图５ｄ），提示线粒体

膜电位降低。对各组细胞绿光与红光比值进行统计

（图５），比值越高说明线粒体膜电位降低越明显，发现

αＳｙｎＮ组比值最高，与其他对照组相比有统计学差异

（ｐ＜０．０５，＃Ｐ＜０．０１）。

图４　荧光显微镜观察ＪＣ１染色

Ｆｉｇ．４　Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ

ａｎａｌｙｓｉｓｏｆＪＣ１ｓｔａｉｎｉｎｇＪＣ１ｌａｂｅｌｅｄｎｏｒｍａｌｃｅｌｌｓ（ａ）ａｎｄｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒ

（ｄ）ａｒｅｉｍａｇｅｄｗｉｔｈｔｈｅｏｒａｎｇｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｎｏｒｍａｌｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，

ｗｈｅｒｅａｓｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈαＳｙｎＮ（ｂ）ｏｒｗｉｔｈαＳｙｎＷＴ（ｃ）

ｓｈｏｗｔｈｅｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｕｎｄｅｒｔｈｅｓａｍｅｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｔｈｅｇｒｅｅｎ（ｍｏｎｏｍｅｒ）ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｃｅｌｌｓｗｉｔｈｌｏｗｅｒΔψｍ

ａｎｄａｂｓｅｎｃｅｏｆＪＣ１ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｏｒａｎｇｅｉｎｄｉｃａｔｅｓｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ

ｗｉｔｈＪＣ１ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｏｆｎｏｒｍａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ．

Ｐｉｃｔｕｒｅｓａｒｅｓｈｏｗｎｕｎｄｅｒ×６０ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ

２．５　流式细胞术检测ＭＮ９Ｄ细胞Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ释放

　　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ（Ｃｙｔｃ）由线粒体释放入胞浆是凋亡

的关键环节。ＩｎｎｏＣｙｔｅＴＭＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣＲｅｌｅａｓｅＫｉｔ，通过

流式细胞术检测Ｃｙｔｃ释放。试剂盒中Ｃｙｔｃ抗体只识

别线粒体而非胞浆的Ｃｙｔｃ，检测到的Ｃｙｔｃ信号强度即

反映线粒体Ｃｙｔｃ含量，信号减弱表示 Ｃｙｔｃ由线粒体

释放。结果显示：不加Ｃｙｔｃ抗体只加荧光二抗的正常

３

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２９Ｎｏ．１２２００９

图５　ＪＣ１染色流式细胞术检测线粒体膜电位

Ｆｉｇ．５　ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｄｏｔｐｌｏｔｓｆｏｒＪＣ１ｓｔａｉｎｉｎｇＵｓｉｎｇｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄＭＮ９Ｄｃｅｌｌｓ，Δψｍｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ

ａｆｔｅｒＪＣ１ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｕｎｉｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｆｌｕｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＦＩＴＣＡａｎｄ

ＰＥＡｓｔａｎｄｆｏｒｇｒｅｅｎａｎｄｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＲｅｇｉｏｎＰ２

ｅｎｃｌｏｓｅｓｔｈｅｈｉｇｈΔψｍｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｄｅｂｒｉｓ

ｗａｓｄｉｓｃａｒｄｅｄ．（ａ）Ｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（ｂ）Ｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ

ｗｉｔｈｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒ（ｃ）ＣｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＳｙｎ／ＷＴ（ｄ）Ｃｅｌｌｓ

ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＳｙｎ／Ｎ（ｅ）ＴｈｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｒａｔｉｏｏｆＦＩＴＣＡ（ｇｒｅｅｎ）ｔｏ

ＰＥＡ（ｒｅｄ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．ＴｈｅｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＳｙｎ／ＷＴｏｒＳｙｎ／

Ｎｅｘｈｉｂｉｔｅｄａｒｏｂｕｓｔｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ

ｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５，＃Ｐ＜０．０１）

ＭＮ９Ｄ细胞为阴性对照（图６ａ）；未感染的正常 ＭＮ９Ｄ

细胞组和感染空载体组可见Ｐ３门表现较强Ｃｙｔｃ信号

（图６ｂ，６ｃ），说明正常细胞大部分Ｃｙｔｃ在线粒体；过表

达αＳｙｎＮ组，波峰明显左移，信号减弱，（图６ｅ），说明

Ｃｙｔｃ由线粒体释放明显增多；过表达 αＳｙｎＷＴ组，波

峰比正常对照稍左移，左移幅度不如 αＳｙｎＮ组（图

６ｄ），说明过表达αＳｙｎＮ比过表达αＳｙｎＷＴ引起Ｃｙｔ

ｃ的释放程度要强。将 Ｐ３门内的细胞比例进行统计

（图６ｆ），比例越低说明 Ｃｙｔｃ由线粒体释放越多，发现

αＳｙｎＮ组比例值最低，与其他组相比有统计学差异

（Ｐ＜０．０５）。

３　讨　论

　　αｓｙｎ是ＰＤ病理学特征性Ｌｅｗｙｂｏｄｙ的重要成分，在ＰＤ发病过程中发挥重要作用。αｓｙｎ基因突变可以导致家族型 ＰＤ；αｓｙｎ转基因动物能够模拟大部分 ＰＤ相关的病理特征和行为改变。目前认为ＰＤ发病机制涉及线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性神经递质毒性作用

以及炎症因素等，其中线粒体功能障碍是中心环节［２，３］。

　　有文献报道αｓｙｎ能够定位于线粒体，引起线粒体功能改变［４，６～９］。本实验在 ＨＥＫ２９３Ｔ中证实 αｓｙｎ全长蛋白能与线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白 ＶＤＡＣ相互作用（图３）。进一步证实 αｓｙｎ与线粒体存在密切的相互关系，与文献报道一致。另外，有研究证实去

掉Ｎ端３２个氨基酸，αｓｙｎ不再进入线粒体，Ｎ端可能是其进入线粒体的前导肽［６］。本实验从 αｓｙｎＮ端结构域着手研究其与线粒体的关系。

　　αｓｙｎ由１４０个氨基酸组成。根据其结构特点，Ｎ端本应终止于第６０位氨基酸，但考虑到Ｎ端出现连续５个氨基酸（ＫＴＫＥＧＶ）高度保守序列，为不破坏此结构故将其延长至６５位氨基酸。在ＨＥＫ２９３Ｔ细胞，分别过表达带ｍｙｃ标签的αｓｙｎ全长（ＷＴ）、Ｎ端和去掉Ｎ端蛋白，免疫共沉淀证实 αｓｙｎ全长和 Ｎ端蛋白分别能

与线粒体ＶＤＡＣ相互作用，去掉Ｎ端相互作用消失（图３）。说明，αｓｙｎＮ端对其与线粒体相互作用具有重要意义。另外，仅αｓｙｎＮ端即与 ＶＤＡＣ相互作用，提示Ｎ端不仅是αｓｙｎ进入线粒体的前导肽，还可能是其功能结构域。这与本室前期研究一致［１０］。另外，ＶＤＡＣ作为转运阴离子、阳离子、ＡＴＰ及其他代谢物进出线粒体的通道蛋白，通过与钙离子、ＡＴＰ、ＮＡＤＨ及不同蛋白质相互作用，调节线粒体外膜通透性，对维持线粒体及

细胞活性具有重要作用。ＶＤＡＣ作为线粒体渗透性转运孔（ＰＴＰ）重要组分决定 ＰＴＰ的开放状态。ＰＴＰ高通透性开放引起线粒体肿胀、膜电位降低及 Ｃｙｔｃ等释放，导致细胞凋亡或坏死［１１］。ＶＤＡＣ作为 ＰＴＰ的主要成分，成为启动线粒体介导的细胞死亡的重要因素。

αｓｙｎ能与 ＶＤＡＣ相互作用，提示 αｓｙｎ可能影响 ＰＴＰ的开放状态，改变线粒体膜通透性，影响线粒体功能致

细胞死亡。

　　文献报道，αｓｙｎ能引起线粒体膜电位降低［６，１２］。

在鼠多巴胺神经细胞ＭＮ９Ｄ中过表达αｓｙｎ，ＪＣ１反映线粒体膜电位，发现过表达Ｎ端，线粒体膜电位明显降

低（图４，图５）。提示αｓｙｎ可能通过 Ｎ端作用引起线

４

２００９，２９（１２） 吕　王乐 等：α突触核蛋白Ｎ端结构域参与线粒体功能的调控

粒体膜电位降低。

　　线粒体膜电位降低引起线粒体膜通透性改变，ＰＴＰ

开放，线粒体大幅度肿胀、外膜破裂、内外膜间促凋亡

因子释放，使细胞凋亡或死亡。其中，Ｃｙｔｃ释放是细胞

凋亡过程的关键一环。有文献报道，αｓｙｎ能与 Ｃｙｔｃ

相互作用引起Ｃｙｔｃ释放［１３］。通过流式细胞术，我们发

图６　流式细胞术检测ＭＮ９Ｄ细胞Ｃｙｔｃ释放

Ｆｉｇ．６　ＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＭＮ９Ｄｃｅｌｌｓｗｉｔｈａｎｔｉ

ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈＦＩＴＣ：ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓＭＮ９ＤｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈαＳｙｎＷＴｏｒαＳｙｎＮ，ａｎｄ２４ｈｌａｔｅｒｔｈｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｗｉｔｈｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｕｓｉｎｇ

ＩｎｎｏＣｙｔｅＴＭＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣＲｅｌｅａｓｅＫｉｔ，ｗｈｉｃｈｏｎｌｙｄｅｔｅｃｔｓｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｎｉｎｔａｃｔｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｗｉｔｈｏｕｔｌａｂｅｌｉｎｇｔｈｏｓｅｒｅｌｅａｓｅｄｉｎｔｏｃｙｔｏｐｌａｓｍ．（ａ）

Ｃｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔｓｔａｉｎｉｎｇ（ｂ）Ｃｏｎｔｒｏｌｃｅｌｌｓｗｉｔｈｏｕｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈａｎｔｉｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ．Ｐ３ｚｏｎｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｓｉｇｎａｌｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｎ

ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｗｉｔｈｍｉｎｉｍｕｍａｍｏｕｎｔｏｆｆｒｅｅ，ｏｒｒｅｌｅａｓｅｓｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ（ｃ）Ｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｅｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒ（ｄ）ＣｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈαＳｙｎＷＴ．Ｔｈｅ

ｓｉｇｎａｌｉｓｏｎｌｙｓｌｉｇｈｔｌｙｍｏｖｅｄｔｏｌｏｗｅｒｌｅｖｅｌｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ（ｂ）ａｎｄ（ｃ），ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｍａｊｏｒｉｔｙｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｒｅｍａｉｎｓｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ（ｅ）Ｃｅｌｌｓ

ｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈαＳｙｎＮ．ＭｏｒｅｔｈａｎｈａｌｆｏｆｔｈｅｓｉｇｎａｌｉｓｏｕｔｓｉｄｅｏｆｚｏｎｅＰ３，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ（ｆ）Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ

ｏｆＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｏｎｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）

现αｓｙｎ全长蛋白能引起 Ｃｙｔｃ释放，Ｎ端引起 Ｃｙｔｃ

释放的程度比全长蛋白更加显著（图５）。进一步提示

Ｎ端是αｓｙｎ的重要功能结构域，Ｎ端自身引起的细胞

毒性比全长蛋白更加严重。另外，Ｃｙｔｃ释放也反映线

粒体膜通透性改变及ＰＴＰ呈高通透性开放状态。

　　过表达αｓｙｎＮ能明显降低线粒体膜电位，增加线

粒体Ｃｙｔｃ释放，但是，过表达 αｓｙｎＷＴ相应改变较

弱，这可能与 αｓｙｎＣ端结构域（９６～１４０）的保护作用

有关［１４］。另外，本课题组也发现过表达 Ｃ端蛋白细胞

生长良好，有一定保护作用［１０］。Ｃ端结构域可能在一

定程度上抑制了 Ｎ端的毒性作用，使 αｓｙｎ全长蛋白

对线粒体的影响较单独Ｎ端要小。

　　总之，αｓｙｎ蛋白可能通过 Ｎ端结构域与线粒体

ＶＤＡＣ相互作用，引起线粒体膜电位降低，使膜通透性

改变及ＰＴＰ开放状态改变，导致 Ｃｙｔｃ释放，该过程相

互影响、相互促进，最终引起细胞凋亡或死亡。这可能

是ＰＤ过程中αｓｙｎ蛋白引起多巴胺能神经元死亡的机

制之一。

５

中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２９Ｎｏ．１２２００９

　　αｓｙｎ、线粒体和 ＰＤ三者的关系尚需探索，深入研

究αｓｙｎ结构域与线粒体功能障碍的关系对于进一步

认识αｓｙｎ蛋白以及ＰＤ发病机制具有重要意义。

参考文献

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ＮｔｅｒｍｉｎａｌｏｆαＳｙｎｕｃｌｅｉｎＩｎｖｏｌｖｅｄｉｎＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＦｕｎｃｔｉｏｎ

ＬＬｉ　ＺＨＡＮＧＴａｏ　ＬＩＵＱｉ　ＦＡＮＣｈｕｎｘｉａｎｇ　ＺＨＡＮＧＬｉｎｇ　ＺＨＡＯＨｕａｎｙｉｎｇ　ＺＨＡＯＣｈｕｎｌｉ　ＹＡＮＧＨｕｉ（ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＣｅｎｔｅｒｏｆＮｅｕｒａｌＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄＲｅｐａｉｒ，

ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＮｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＤｉｓｅａｓｅｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００６９，Ｃｈｉｎａ）

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｏｆαＳｙｎｕｃｌｅｉｎｉｎａｆｆｅｃｔｉｎｇｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｈｏｗｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｔｏｂｅｉｍｐａｉｒｅｄ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ，ｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｄｔｈｅｒｅｌｅａｓｅｏｆＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＨａｒｖｅｓｔｏｆαＳｙｎＮａｎｄαＳｙｎ△ＮｂｙＰＣＲ，ｔｈｅｎｓｕｂｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐＣＭＶＭｙｃｍａｍｍａｌｉａｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＨＥＫ２９３ＴｃｅｌｌｓｂｙＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００．ＡｆｔｅｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｃｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｈｒｏｕｇｈｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｒｅｌｅａｓｅｏｆＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｔｈｒｏｕｇｈｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｔｏｄｅｔｅｃｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ＣＯＩＰｈａｓｐｒｏｖｅｄｔｈａｔＮｔｅｒｍｉｎａｌｍａｙｂｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｏｆαＳｙｎｕｃｌｅｉｎｉｎａｆｆｅｃｔｉｎｇｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮｔｅｒｍｉｎａｌｃｏｕｌｄｄｅｐｏｌａｒｉｚｅｔｈｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｄｉｎｄｕｃｅｔｈｅＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃｒｅｌｅａｓｉｎｇｉｎＭＮ９Ｄｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＮｔｅｒｍｉｎａｌｍａｙｂｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｏｍａｉｎｏｆαｓｙｎｕｃｌｅｉｎａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮｔｅｒｍｉｎａｌｃｏｕｌｄｄｅｃｒｅａｓｅｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｎｔｅｒｍｉｎａｌｏｆαｓｙｎｕｃｌｅｉｎ　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ　Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｃ

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