This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Nachweis und quantitative Bestimmung einiger Enzyme des Kohlenhydrat-Stoffwechsels in

Grünalgen

V o n G E R H A R D R I C H T E R

Botanisches Institut der Universität Marburg/Lahn (Z. Naturforschg. 12 b, 662—663 [1957] ; eingegangen am 15. Juni 1957)

Mit der Einführung einzelliger Grünalgen vom Typus der Chlorella als „Modelle" grüner Zellen ist seit lan-gem die Voraussetzung für die erfolgreiche Bearbeitung pflanzenphysiologischer Stoffwechselprobleme gegeben. Man ist bisher jedoch oft auf höhere Pflanzen angewie-sen gewesen, wenn bestimmte Stoffwechselbefunde an Algen enzymologisch unterbaut werden sollten; im be-sonderen Maße trifft dies für die Photosynthese1 und die pflanzliche Atmung2 zu. Der Grund hierfür liegt in erheblichen methodischen Schwierigkeiten, welche die Einzeller bei der Aufarbeitung und quantitativen Erfas-sung ihrer Enzyme bereiten. Infolgedessen sind für Chlorella nur wenige Enzyme des Kohlenhydrat-Stoff-wechsels bekannt geworden3.

Bei .den vorliegenden Untersuchungen diente die koloniebildende Grünalge Hydrodictyon reticulatum (L.) Lagerh. als Versuchsobjekt; systematisch gehört sie wie Chlorella zur Ordnung der Chlorococcales; sie wird seit einigen Jahren im hiesigen Institut kultiviert. Ihre relativ großen, vielkernigen Zellen lassen sich leicht aufschließen und liefern genügende Mengen an Ausgangsmaterial.

Neben methodischen Angaben, welche die verschiede-nen Aufschluß-Verfahren und Möglichkeiten zur Stabili-sierung der gewonnenen Enzymextrakte umfassen, seien hier Befunde über Vorkommen und Menge einiger wichtiger Enzyme des Kohlenhydrat-Stoffwechsels mit-geteilt, wobei Frischgewicht und Proteingehalt als Be-zugssysteme gewählt wurden.

Zur Messung der Enzymaktivitäten dienten — soweit nicht anderweitig vermerkt — die von B Ü C H E R und Mit-arbb. 4 angegebenen einfachen und zusammengesetzten optischen Teste. Sie wurden im Photometer „Eppen-dorf" bei 25° C, einer Schichtdicke von 1,0 cm und einer Wellenlänge von 366 m/u durchgeführt.

Als Maß der Aktivität wurden die von B Ü C H E R und Mitarbb.4 definierten Einheiten gewählt, wobei eine Einheit die Enzymmenge angibt, die in einem Test-volum von 1 ml und einer Schichtdicke von 1,0 cm in 100 Sek. eine Extinktionsänderung von 0,1 hervorzuru-fen vermag.

Die „Spezifische Aktivität" wurde durch Bezugnahme auf 1 mg des in der Enzymlösung vorliegenden Pro-teins erhalten.

Zur groben Abmessung des Materials wurde dessen Frischgewicht verwendet; dieses ist bei Wasserpflanzen naturgemäß nur annähernd bestimmbar. Durch Einhal-tung geeigneter Manipulationen (Entzug der anhaften-den Wasserhülle durch Filtrierpapier!) konnten größere Fehler ausgeschaltet werden (vgl. Tab. 1).

Als eigentliche Bezugsgröße diente der Proteingehalt der Enzympräparate; zu seiner Bestimmung wurde die Methode von L O W R Y und Mitarbb. 5 so modifiziert, daß

Aufschluß-Verfahren Suspensionsmittel

Enzym-Einheiten/mg Protein (Enzym-Einheiten/g Frischgewicht)

Aufschluß-Verfahren Suspensionsmittel

Triose-Isomerase Aldolase Gl-6-Ph-Dehvdro-genase

Triaethanolamin -Salzsäure-Puffer m/20; p H 7,6

92 (580) 10 (44) 4 (18)

Flüssige Luft „Periston" (synth. Blutplasma, B a y e r PK 7,0

87 (680) 8 (43)

Phosphat - Puffer ml 15; p H 7,0 98 (701) 16 (52) 2 (10)

Sand-Zerreibung

Homogenisator P o t t e r - E l v e h j e m

Flüssige Luft Acetonfällung

Phosphat-Puffer TO/15; Ph 7,0

97 (425)

72 (811)

68 (420)

11 (50)

11 (25)

2 (8)

Tab. 1. Auswirkung verschiedener Aufschluß-Verfahren und Suspensionsmittel auf die Aktivität einiger Enzyme im partikel-freien Extrakt (Zentrifugation 30 Min. bei 20 000 g und 0° C).

1 W . V I S H N I A C , Annu. Rev. Plant Physiol. 6 , 1 1 5 [ 1 9 5 5 ] . 2 P . K . S T U M P F , Annu. Rev. Plant Physiol. 3 , 1 7 [ 1 9 5 2 ] . 3 H . H O L Z E R u. E. H O L Z E R , Chem. Ber. 8 5 . 6 5 5 [ 1 9 5 2 ] .

4 G . BEISSENHERZ, H . J . BOLTZE, T H . B Ü C H E R , R . C Z O K , K . H . G A R B A D E , E . M E Y E R - A R E N D T u. G . PFLEIDERER, Z . Natur-forschg. 8 b. 555 [1953],

5 O . H . L O W R Y , N . J . ROSEBROUGH, A . L . F A R R u . R . J . R A N -DALL, J . biol. Chemistry 1 9 3 , 265 [1951].

sie auch bei Anwesenheit von Chlorophyll unbeeinflußt anwendbar war6.

In Tab. 1 sind die Auswirkungen verschiedener Auf-schlußverfahren und Suspensionsmittel auf die Aktivi-tät von Triose-Isomerase, Aldolase und Glucose-6-phos-phat-Dehydrogenase aufgeführt (Messung im partikel-freien Überstand nach Zentrifugation bei 20 000 g und 0° C). Danach ist die Zerreibung der Zellen mit flüssi-ger Luft und die Suspendierung des Reibgutes in Phos-phat- bzw. Triäthanolamin-Salzsäure-Puffer4 für die Ausbeute an aktiven Enzymen optimal.

Als aktivstes Enzym der Extrakte erwies sich — wie auch im Kaninchenmuskel4 — die Triose-Isomerase (Test-ansatz nach BEISSENHERZ 7), deren spezifische Aktivität zwischen 92 und 110 Einheiten lag.

Für die Diphospho-Fructose-Aldolase — dem Enzym mit der zweithöchsten Aktivität, im Gegensatz zum tie-rischen Muskel — wurden 10 — 15 Einheiten pro mg Protein gemessen.

Weiter war eine TPN-spezifische Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (Test nach DE Moss 8) nachweisbar, de-ren spezifische Aktivität mit 4 — 5 Einheiten/mg Protein gemessen wurde. Die von DE Moos8 an Präparaten aus höheren Pflanzen festgestellte Anfälligkeit dieses En-zyms gegen P04-Ionen konnte bestätigt werden (vgl. Tab. 1).

Wider Erwarten zeigten die Extrakte eine Aktivität an Milchsäure-Dehydrogenase, die 1—2 Einheiten/mg Protein betrug. Dieser Befund spräche dafür, daß die Zellen im Prinzip zu einer Gärung befähigt wären, wie sie für einige Bakterien und die Muskelzellen charak-teristisch ist. Ob sie jedoch im normalen Stoffwechsel-geschehen von Bedeutung ist, bleibe dahingestellt.

Die Bestimmung einer für höhere Pflanzen als cha-rakteristisch beschriebenen Alkohol-Dehydrogenäse9,10

gelang weder mit DPN noch mit TPN als Co-Enzym. 6 G. RICHTER, Dissertation, Marburg a. d. Lahn 1956. 7 G . BEISSENHERZ, in COLOWICK-KAPLAN „Methods in Enzymo-

logy", New York 1955. 8 R . D. Moss, in COLOWICK-KAPLAN „Methods in Enzymology",

New York 1955. 9 G . DOTZAUER, H . REDETZKI, K . JOHANNSMEIER u. TH. BÜCHER,

Dtsch. Z. ges. gerichtl. Med. 41, 15 [1952].

Der Nachweis einer TPN-spezifischen Triosephosphat-D ehydro genäse in der Art, wie von ROSENBERG und A R N O N 11 und H A G E M A N und A R N O N 12 beschrieben, war nicht möglich, da einmal das Fructosediphosphat (FDP) nicht völlig frei von Glucose-6-phosphat (Gl-6-Ph) war, zum andern die Extrakte — wie bereits erwähnt — eine relativ hohe Aktivität an Gl-6-Ph-Dehydrogenase auf-wiesen, die sofort mit ihrem Substrat und TPN rea-gierte. FDP (9 • IO"6 Mole/ml), TPN (2,0 • 10~7 Mole/ ml) und zugesetzte reine Gl-6-Ph-Dehydrogenase ( S I G M A ) ergaben einen gleichartigen Reaktionsablauf, was den Gl-6-Ph-Gehalt des FDP bestätigte.

Eine „klassische" DPN-spezifische Triosephosphat-Dehydrogenase (Phosphoglyceraldehyd-Dehydrogenase; PGADH) konnte im „Rüdetest" 4 nicht nachgewiesen werden; der „Arsenat-Test" 4 war wegen der im Ex-trakt vorliegenden Triose-Isomerase-Aktivität nicht brauchbar.

Im Extrakt ist dieses Enzym in seiner Aktivität offen-sichtlich gehemmt, denn selbst die Zugabe von krist. PGADH aus Kaninchenmuskel4 zu einem Testansatz, der Extrakt enthielt, hatte nur eine geringfügige Ex-tinktions-Änderung zur Folge. Ein ähnlicher Befund, der von T E W F I K und STUMPF 13 an Extrakten von Blatt-zellen erhalten wurde, erfährt hierdurch eine Bestäti-gung. Zur exakten Bestimmung dieses Enzyms sind also weitere präparative Schritte unerläßlich; erst dann wird es auch möglich sein, die Frage nach einer DPN- oder TPN-Spezifität zu beantworten.

Herrn Professor Dr. TH. BÜCHER und seinen Mitarbeitern danke ich für ihre verständnisvolle Unterstützung und ihre Hilfsbereitschaft; für die Überlassung eines Arbeitsplatzes sowie von Enzympräparaten und Sub-straten sei an dieser Stelle ebenfalls gedankt.

Durch personelle und sachliche Unterstützung wurden diese Unter-suchungen von der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t in dankenswerter Weise gefördert.

1 0 H . A. STAFFORD U. B. VENNESLAND, Arch. Biochem. Biophy-sics 4 4 , 4 0 4 [ 1 9 5 3 ] .

1 1 L . L . ROSENBERG U. D . L . ARNON, J . biol. Chemistry 2 1 7 , 3 6 1 [ 1 9 5 5 ] .

1 2 R . H . HAGEMAN U. D . L . ARNON, Arch. Biochem. Biophysics 5 7 , 4 2 1 [ 1 9 5 5 ] .

1 3 S . TEWFIK U. P. K. STUMPF, J . biol. Chemistry 1 9 2 , 5 1 9 [ 1 9 5 1 ] ,

Die Permeabilitäts-Eigenschaften der Protoplasten von Bryopsis muscosa Lamour und

Bryopsis plumosa (Huds.) Agardh während des Reizplasmolyse-Ablaufs

V o n G E R H A R D FOLLMANN

Institut und Museum für Meeresforschung, Monaco, und Institut für Virusserologie der Biologischen Bundesanstalt

für Land- und Forstwirtschaft, Braunschweig (Z. Naturforschg. 12 b, 663—665 [1957] ; eingegangen am 4. Juli 1957)

Reizplasmolyse tritt vornehmlich bei marinen Algen aus zahlreichen systematischen Gruppen nach unter-

schiedlichen physikalischen und chemischen Reizen auf1. Die experimentelle Analyse des Vorgangs ergab ein von älteren Erklärungsversuchen abweichendes Bild2. Danach liegen ihm weder reversible Permeabilitäts-Erhöhung oder vorübergehender Semipermeabilitäts-Verlust, noch aktive Protoplasten-Kontraktionen, die zu Zellsaftexkre-tion führen, zugrunde 3, sondern ein reizinduzierter Zu-

1 F. SCHUTT, Ergebn. Planktonexped. Humboldt-Stift. 1, 1 [1895].

2 G . FOLLMANN, Naturwissenschaften 42 , 633 [1955] ; Planta 48, 393 [1957].

3 J . M . JANSE, F lora [ J e n a ] 1 2 2 , 1 [ 1 9 2 7 ] ; S . PRAT , A c t a adriat. 1, 4 [1934] ; E. STADELMANN, Handb. Pflanzenphysiol. II, 71 [1956].