Ph. D. disszertáció

Nanoszkopikus környezet hatása a fotoszintetikus reakciócentrum

mőködésére

Dorogi Márta

Témavezetı: Dr. Nagy László, egyetemi docens

Szegedi Tudományegyetem

Orvosi Fizikai és Biofizikai Intézet

Szeged, 2008

1

Tartalomjegyzék

1. Bevezetés 5

2. Irodalmi áttekintés 7

2.1. A fotoszintézis lényege és jelentısége………………………….. 7

2.2. A fotoszintetikus reakciócentrum szerkezete és mőködése …… 9

2.2.1. Egyszeri töltésszétválasztás………………………………… 11

2.2.2. A QA-QB →QAQB

- elektrontranszfer jellemzıi……………... 13

2.2.3. Többszöri töltésszétválasztás……………………………….. 15

2.2.4. A membránkörnyezet hatása a töltésszétválasztásra………... 17

2.3. A szén nanocsövek és a biológiai anyagok……………………… 22

2.3.1. A szén nanocsövek szerkezete és tulajdonságaik……............ 22

2.3.2. A szén nanocsövek és a biológiai anyagok közötti

kölcsönhatás……………………………………………………….. 23

3. Célkitőzések 25

4. Anyagok és módszerek 27

4.1. Mintaelıkészítés, preparatív eljárások…………………………... 27

4.1.1 A baktériumtörzs jellemzése………………………………… 27

4.1.2. Az R-26 baktériumtörzs tenyésztése………………………... 27

4.1.3. Reakciócentrumok preparálása……………………………… 28

4.1.4. Lipoproteid rendszerek preparálása…………………………. 29

4.2. Vizsgálatok optikai módszerei…………………………………… 31

4.2.1 „Steady state” abszorpciómérések…………………………… 31

4.2.2. Abszorpcióváltozás kinetikai mérése…………………........... 31

4.2.2.1. Az abszorpcióváltozás mérése a ms–s –os tartományban 31

4.2.2.2. Az abszorpcióváltozás mérése a µs–s -os tartományban.. 33

4.2.2.3. Abszorpcióváltozás adatainak kiértékelése……………... 34

4.2.3. Fluoreszcencia vizsgálatok……………………………........... 35

4.3. RC/szén nanocsı kompozit elıállítása…………………………… 36

4.3.1. A felhasznált szén nanocsı minták jellemzése……………… 36

4.3.2. SWNT/RC komplex preparálása ……………………………. 37

2

5. Eredmények és megvitatásuk 39

5.1. A vezikulák minıségi vizsgálata…………………………………. 39

5.2. A lipidkörnyezet hatása a reakciócentrumon belüli

elektrontranszportra…………………………………………………... 41

5.2.1. Egyszeres töltésszétválasztás………………………………... 41

5.2.1.1. QA-QB → QAQB

- elektron transzfer kinetikája és

Energetikája……………………………………………………… 41

5.2.1.2. Anionos lipidek (PG és CL), hatásai PC mátrixban…….. 47

5.2.2. Többszörös töltésszétválasztás………………………………. 49

5.2.2.1. QA-QB

-→ QAQB2- elektrontranszport……………………. 49

5.2.2.2. Az elektrontranszfer többszörös gerjesztés után (A

szemikinon keletkezésének és eltőnésének bináris oszcillációja.) 53

5.2.3. Inhibítorok hatása lipid környezetben………………………. 55

5.3. A töltésstabilizálódás termodinamikai jellemzése………………. 60

5.4. Fényindukált transzmembrán pH-változások fotoszintetikus

reakciócentrum/lipoproteid vezikulákban……………………………. 67

5.4.1. A piranin spektroszkópiai jellemzése……………………….. 68

5.4.2. A lipoproteid vezikulák protonáteresztıképessége…………. 73

5.4.3. A proteoliposzóma áteresztıképessége, RC jelenlétébe......... 77

5.5. A fotoszintetikus RC és szén nanocsövek közötti kölcsönhatás… 79

5.5.1. A szén nanocsı környezet hatása a RC-on belüli

töltésstabilizálódásra……………………………………………….. 79

5.5.2. A szén nanocsövek és a RC-ok közötti redox kölcsönhatás… 85

6. Összegzés 88

7. Közlemények 91

8. Köszönetnyilvánítás 93

9. Irodalomjegyzék 94

Összefoglaló 101

Summary 122

3

Rövidítések jegyzéke

ATP adenozin-trifoszfát

BChl bakterioklorofill monomer

BPheo bakteriofeofitin monomer

Ch Na-kolát-puffer (5mM KCl, 5mM K-foszfát, 1mM piranin, pH 6.8

+ 4% nátrium kolát)

CL kardiolipin

Col koleszterin

DMPC 1,2-Dimiristoyl-sn-Glycero-3-Phosphatidylcholine

DPPC 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphatydilcholine

POPC 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3- Phosphatydilcholine

∆G Gibbs-féle szabadenergia-változás

∆H entalpia-változás

∆S entrópia-változás

Fe2+ vas II. ion (nem-hemtípusú vas)

FTIR Fourier transzformált infravörös

kAP a P+QA-→PQA töltésrekombináció sebességi állandója

kBP a P+QB-→PQB töltésrekombináció sebességi állandója

KAB kinonok közötti elsı elektrontranszfer egyensúlyi állandója

LDAO N,N-dimetil-dodecilamin-N-oxid, Lauraldimetilamin-N-oxid

L,M,H a bakteriális reakciócentrum fehérje alegységei (light, middle,

heavy)

OG oktilglikozid

PC foszfatidilkolin

PE foszfatidiletanolamin

PG foszfatidilglicerol

PI foszfatidilinozitol

PSI a növények és cianobaktériumok elsı fotokémiai rendszere

PSII a növények és cianobaktériumok második fotokémiai rendszere

QA elsıdleges vagy primer kinon, elsı stabil elektron akceptor

QB másodlagos vagy szekunder kinon, másodlagos elektron akceptor

4

QH2 dihidro-kinon, kinol

UQ10 ubikinon-10, 2,3-dimetoxi-5-metil-6-kaizoprenol-p-benzokinon

Rb. Rhodobacter

RC fotoszintetikus reakciócentrum fehérje

NADP Nikotinamid-adenin-dinukleotid

NT szén nanocsı

SWNT egyfalú szén nanocsı

SWNT/RC bio-nanokompozit

MWNT többfalú szén nanocsı

SP, P, P+, P* alapállapotú, oxidált, gerjesztett bakterioklorofill dimer,

elsıdleges, vagy primer donor

TRIS 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propándiol

TX-100 Triton X-100, oktil-fenol-polietilén-glikol-éter

5

1. Bevezetés

A fotoszintézis során az autotróf élılények: növények és egyes

baktériumok; a Nap fényenergiájának segítségével szerves vegyületeket, és

oxigént állítanak elı. A fény begyőjtését, majd átadását a fotoszintetikus

reakciócentrumok nagy részénél klorofillmolekulák végzik.

Mivel a fotoszintéziskor lejátszódó fényenergia átalakítása kémiai

potenciállá egyike a természetben megtalálható alapvetı folyamatoknak, a

folyamat intenzív kutatás tárgya napjainkban is. Az utóbbi húsz év technikai

fejlıdése ((opto)elektronika, számítástechnika, molekuláris biológia, stb.)

különös fellendülést hozott a részletek kutatásában.

Az intenzív kutatásoknak köszönhetıen, egészen alapos ismeretanyag

győlt össze a töltésszétválasztásról és -stabilizálódásról, amelyek az izolált

reakciócentrum-fehérjében (RC) is lejátszódnak. A bakteriális RC

kristályosításáért 1988-ban (Michel, Deisenhofer, Huber) és 1993-ban a

nagytávolságú elektrontranszfer elméletéért (Marcus) kaptak Nobel-díjat.

Nagymennyiségő adat elsısorban izolált rendszerekrıl, detergensbe ágyazott

reakciócentrumok mőködésérıl áll rendelkezésünkre. Kevésbé ismert azonban a

fehérje szerkezete és funkciója a membránban, különösen in vivo, és az, hogy

miként indukálja a fény a redox reakciókat a csatolt proton átadási

folyamatokkal, amelyek jelentısek a membrán energizálásában.

Mindezek mellett a kutatásokban különleges figyelmet kap az elképzelés,

miszerint biológiai anyagok, például fehérjék hatékony komponensei lehetnek

olyan rendszereknek, melyekben a különleges tulajdonsággal bíró szervetlen

anyagok (pl. szén nanocsövek - NT) is részt vesznek. Kézenfekvı tehát a két

rendszerbıl egy újfajta, ún. bio-nanokompozit elıállítása, mely sikeresen

ötvözné mindkét anyag értékes tulajdonságait. A RC elınyös tulajdonságai

között kell megemlítenünk azt, hogy benne a fénnyel való gerjesztés hatására

közel 100% hatékonysággal töltésszétválasztás történik. Különös figyelmet

kaphat az, hogy jellemzı fényelnyelése a közeli infravörös tartományban van. A

szén nanocsövek különleges elektromos vezetési sajátságokkal rendelkeznek. Az

6

egyfalú szén nanocsövekben a félvezetı és fémes vezetési tulajdonságok

keverednek, míg a többfalú szén csövek fémes vezetık. Vannak irodalmi adatok

arra is, hogy a szén nanocsövek redoxreakciókat katalizáló enzimekkel redox-

kapcsolatban lehetnek (pl. glükózoxidázzal). Különös lehetıség adódik arra,

hogy a RC-ban létrejövı fényindukált elektrontranszport és a szén nanocsövek

redoxtulajdonságait összekapcsoljuk.

A NT közülük is elsısorban az egyfalú szén nanocsövek (SWNT)

egydimenziós elektromos és struktúrális adottságaik miatt számos felhasználási

lehetıséget kínálnak, pl. a nanoelektronikában (diódákban, tranzisztoroknál,

logikai kapuknál, és memória kártyáknál). A különleges figyelem megalapozott,

mert: az SWNT hatására a biológiai anyag (pl. fehérje) szerkezetében és

mőködésében specifikus változások következhetnek be. Az így nyert komplex

egyedi elektromos tulajdonságai miatt alkalmas lehet különbözı specifikus

feladatok megoldására, pl. energiaátalakításra és energia tárolására.

A fotoszintetikus RC/lipoproteid és a RC/karbon nanocsı komplexek

érdekes és meglepı összehasonlításra adhatnak alapot. Mindkét rendszer a

nanoszkópikus mérettartományba tartozik, amely ezzel együtt különleges

tulajdonságokat is okoz ezekben a rendszerekben. Ebbıl a szempontból nem

elhanyagolhatóak a rövidtávú, közvetlen kölcsönhatások (pl. a RC közvetlen

környezetében levı lipidek, vagy a RC-szén nanocsı kölcsönhatások), de a

rendszer egészére kiterjedı a tulajdonságai sem. Példának említhetjük azt, hogy a

szén nanocsı/RC kapcsolat következtében az egész komplex elektromos

tulajdonsága megváltozhat, mint ahogyan a RC/zárt vezikuláris rendszeré is.

Dolgozatomban e két rendszer elınyös tulajdonságait is megpróbálom

kihasználni.

7

2. Irodalmi áttekintés

2.1. A fotoszintézis lényege és jelentısége

A fotoszintézis az egyetlen folyamat a természetben, amely során

nagyobb mennyiségő napenergia tárolódik. Ez az alapvetı energiaátalakítási

folyamat, amely lehetıvé teszi a fotoszintetizáló baktériumok és növények

növekedését és szaporodását, amennyiben rendelkezésre áll kellı mennyiségő

széndioxid (CO2), víz (H2O) és ezekhez képest csekélyebb mennyiségben

bizonyos ásványi anyagok. A növények által termelt szerves anyagok jelentik a

primer táplálék- és energiaforrást az összes fotoszintézisre nem képes heterotróf

szervezet számára is. Joggal állíthatjuk, hogy a fotoszintézis a legtöbb földi

életfolyamat és biológiai energiatermelés alapvetı forrása. A legáltalánosabb

definíció szerint a halobaktériumok energiaátalakító folyamata is

fotoszintézisnek tekinthetı, hiszen a napfény energiája alakul át ezekben a

szervezetekben is kémiai energiává. Igaz a halobaktériumokban a

fényenergiaátalakítást retinálfehérjék (bakteriorhodopszinok) végzik, és a

gerjesztést követıen elektrontranszport nélkül jön létre az ATP szintézis

energetikai feltételét jelentı transzmembrán protongradiens. Az összes fosszilis

tüzelı- és nyersanyag (kı- és barnaszén, kıolaj, földgáz) korábbi korok

biomasszájából, tehát végsı soron a fotoszintézisbıl származik. Az egyszerő,

energiaszegény anyagokból komplexebb, energiában gazdag anyagok épülnek

fel. A folyamat bonyolult redoxlépések sorozata, amihez az energiát a napfény

biztosítja. Ennek mőködéséhez olyan anyagra van szükség, amely képes elnyelni

a fénykvantumokat, az elnyelt energiát más molekuláknak átadni, majd

visszatérni az alapállapotba, hogy újabb fotonokat nyelhessen el. Ezt a bonyolult

feladatot egy speciálisan szervezıdött pigment-protein rendszer látja el, aminek

legjellemzıbb vegyületei a klorofillmolekulák. Öt különbözı klorofilltípus van

(a, b, c, d és f), amelyek csak kevéssé térnek el kémiai struktúrájukban. Az a és b

típus a legfontosabb, mivel ezek fordulnak elı a magasabb rendő növényekben

és a zöld algákban. A fotoszintézis reakciójának mérlegegyenlete a következı:

8

6 CO2 + 6 H2O + fényenergia → C6H12O6 + 6 O2

A fényenergia felhasználásával a CO2-ból és a H2O-bıl glükóz és oxigén

szintetizálódik.

A fényszakasz mőködtetéséhez folyamatos megvilágítás szükséges. A

fotonok energiáját csak könnyen gerjeszthetı vegyületekkel lehet felfogni,

abszorbeálni. Ez a szerepe a speciálisan szervezıdött pigment-protein

rendszernek. Ezen folyamatban, növényekben és cianobaktériumokban két

egymástól jól elkülöníthetı fotokémiai rendszer (PSI és PSII) vesz részt. A PSII-

höz kapcsolódó komplex egyedülálló módon képes a víz fényindukált

elbontására protonokká és molekuláris oxigénné, miközben redukáló elemek

láncolatán keresztül az energia egy része proton elektrokémiai potenciál

formájában raktározódik. Ez a potenciál az adenozin-trifoszfát (ATP)

szintézisének energiaforrásául szolgál. Az energia másik hányada átkerül a PSI-

re, ahol újabb foton abszorpciója révén válik a folyamat teljessé a nikotinamid-

adenin-dinukleotid (NADP+) redukcióját eredményezve. A sötétszakasz

mőködtetését a fényszakasz végtermékei biztosítják. A sötétszakasz lényegében

a szén-dioxid megkötését és redukcióját végzi, ehhez kell az ATP és a redukált

NADP+.

9

2.2. A fotoszintetikus reakciócentrum szerkezete és

mőködése

Baktériumokban a fotoszintetikus energiaátalakítás folyamatai

lényegesen egyszerőbbek, mint növényekben. Amíg növényekben két fotokémiai

reakciócentrum mőködik, addig baktériumokban csak egy. A bíborbaktériumok

RC-a a növények PSII fotokémiai rendszerével mutat nagymértékő hasonlóságot.

A fotoszintetikus RC intracitoplazmatikus membránrendszerbe (ún.

kromatoforákba) ágyazott pigment-protein komplex, amely fehérje-

alegységekbıl és redox-tulajdonságokkal rendelkezı kofaktorokból áll (1. ábra).

A bíborbaktériumok reakciócentruma három alegységbıl áll, amelyeket angol

elnevezésük alapján (light, middle, heavy) az L, M és H betőkkel jelölünk.

Nevüket az elektroforetikus mozgékonyságuk alapján történı molekulatömeg

meghatározási módszer, az SDS gélelektroforézis eredményei alapján kapták. Az

elnevezés azonban félrevezetı, mert a DNS-szekvencia alapján, deduktív módon

kikövetkeztetett aminosavsorrendbıl meghatározott molekulatömegek alapján

kiderült, hogy valójában a H-alegység épül fel a legkevesebb aminosavból, tehát

ez a legkisebb molekulatömegő. A félreértést az okozta, hogy ez az alegység a

legkevésbé hidrofób, így az SDS-gélen a legkisebb mozgékonyságot, és ennek

megfelelıen a legnagyobb molekulatömeget mutatta. A hiba ellenére az

elnevezést az irodalomban megtartották és máig is ezt használják.

A RC-ba ágyazódott L- és az M-polipeptidek 180°-os forgási szimmetriát

és nagyfokú homológiát mutatnak. Az aminosavak közel 70%-a apoláris, és öt-öt

hidrofób láncot (α-hélixet) képeznek a membránon keresztül. A H-alegységnek

csak egy transzmembrán hélixe van, többi része szorosan kapcsolódik az LM-

komplexhez a citoplazmatikus oldal felıl.

10

1. ábra A bíborbaktériumok fotoszintetikus apparátusának elhelyezkedése a fotoszintetikus membránban, és a közöttük levı folyamatok vázlata. Az ábra a kromofórok fotoszintetikus reakciócentrumban való elhelyezkedését is mutatja. A vasatomon átmenı, membrán síkjára megközelítıen merıleges C2 szimmetriatengely két ágában helyezkednek el a redoxkomponensek. Ezen az ábrán az A ág komponensei láthatók. SP: primer donor két bakterioklorofillje; BChl: bakterioklorofill monomer; BPheo: bakteriofeofitin monomer; QA és QB elsıdleges és másodlagos elektronakceptor molekulák. (http://moose.bio.ucalgary.ca/index.php?page=Shadows_of_the_Past)

A “fehérjevázhoz” nem-fehérjetermészető redoxaktív pigmentmolekulák,

ún. kofaktorok is kapcsolódnak. Ezek a következık:

- négy bakterioklorofill (BChl)

- két bakteriofeofitin (BPheo)

- elsıdleges kinon (QA)

- másodlagos kinon (QB)

- nem-hemtípusú vas (Fe2+).

A négy BChl közül a két legközelebbi dimert alkot (SP), és mint

elsıdleges elektrondonor vesz részt a redox-folyamatokban, a másik kettı pedig

monomerként helyezkedik el az elektrontranszport láncban (1. ábra).

Részletesebb áttekintésként lásd pl. (Allen és mtsai., 1987) publikációt.

A kofaktorok két, a bakterioklorofill dimeren és a Fe2+-on átmenı, a

membránra merıleges síkra vonatkoztatott, megközelítıleg tükörszimmetrikus

ágat (A és B) alkotnak. Ezek közül azonban csak az A-ág aktív. A B-ág mentén

természetes körülmények között nem játszódik le elektrontranszfer, biológiai

jelentıségérıl nincs tudomásunk. Az elektrokémiából ismert, hogy a kinonok

11

„kételektron kémiával” rendelkeznek, vagyis két elektronnal redukálhatók, és a

kettıs redukció után két proton felvételére képesek. A kinonok jól definiált

középponti redoxpotenciállal rendelkeznek (olyannyira, hogy az

elektrokémiában a kinon/hidrokinon elektródot a redoxpotenciál meghatározások

szabványaként is szokás alkalmazni), középponti potenciáljuk azonban erısen

függ a környezet polarizálhatóságától (dielektromos állandójától) és

protonálhatóságától (az oldószer protikus vagy aprotikus voltától). Mivel

környezetük erısen különbözik, a QA és QB redox- és kötési tulajdonságai

jelentısen eltérnek. A QA a fehérje erısen hidrofób környezetében található,

normál körülmények között egy elektronnal redukálható, a RC-hoz erısen

kötıdik, és onnan csak nehezen választható le. A QB környezetében sok a

vízmolekula, a protonálható aminosavak győrőként veszik körbe a pK-juknak

megfelelıen. Redukciójához két elektron szükséges (két H+ felvétele mellett),

majd az így képzıdött dihidro-kinol (QH2) a RC-ról leválik, helyébe újabb

(oxidált) kinon kerül a membrán kinon-raktárából (Feher és mtsai.,

1989;Paddock és mtsai., 1994).

2.2.1. Egyszeri töltésszétválasztás

Fény hatására a RC-ban töltésszétválasztás indul meg. Másodlagos donor

távollétében újabb gerjesztés hiányában az elektron a QB- -ról visszatér a SP+-ra.

Ezt nevezzük egyszeri töltésszétválasztásnak.

A fotoszintetikus RC-ban az elnyelt foton hatására az SP gerjesztett

állapotba jut (PQAQB ⇒ P∗QAQB), majd oxidálódik és az elektronja az

alacsonyabb energiájú QA-ra (P∗QAQB ⇒ P+QA-QB), végül a másodlagos kinonra,

QB-re (P+QA-QB ⇒ P+QAQB

-) kerül. Izolált RC-okban - az izolálási körülmények

miatt - egyéb donor rendszerint nincs jelen, így a keletkezett töltéspár

rekombinációja figyelhetı meg.

Rhodobacter (Rb.) sphaeroides R-26 törzs esetén a P+QA- töltéspár

élettartama kb. τ ≈ 100 ms, szemben a P+(QAQB)- τ ≈ 1 s-os élettartamával. A

QB-ról a P+-ra az elektron kb. 95%-os valószínőséggel a QA-n keresztül kerül

12

vissza (indirekt út), a fennmaradó 5%-ban közvetlen töltésrekombináció történik.

A folyamatot a 2. ábra szemlélteti.

2. ábra A töltésszétválasztás folyamatának vázlata a Rb. sphaeroides-bıl izolált RC-ban gerjesztés után. A kék folytonos nyilak az elıremenı töltés szétválasztást, a lila szaggatott nyilak a visszairányú töltésrekombinációs folyamatokat szemléltetik. A függıleges tengelyen az elektrontranszfer egyes komponenseinek a normál hidrogénelektródhoz viszonyított középponti potenciáljait mutatjuk be. A számadatok a reakciók élettartamait mutatják.

0.6

-0.8

-1.0

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

SP*

P+BPheo-

P+BPheo QA-

P+BPheo QA QB-

SP

3 ps

230 ps

12 ns

1 ns

100 ms

1 s

Em

(V

)elõremenõ

elektrontranszport, töltésszétválasztás

töltésrekombinációsfolyamatok

200 µµµµs

h νννν

13

2.2.2. A QA-QB →QAQB

- elektrontranszfer jellemzıi

A RC gerjesztése után az elektron a BPheo-en keresztül mintegy 200 ps

alatt a QA-ra, majd kb. 200 µs alatt a QB-re kerül, ezzel megtörténik a

szétválasztott töltések stabilizálódása. Korábbi elképzelések szerint (Paddock és

mtsai., 1991) ez az elektrontranszport egyetlen lépésben történik és egyetlen,

150-200 µs körüli kinetikai komponenssel írható le (az egyszerőség kedvéért ezt

az értéket mutatom a 2. ábrán is). Azt is kimutatták, hogy ezt az

elektrontranszportot mind a hımérséklet, mind a pH befolyásolja, ellentétben a

PQA → P+QA- elektrontranszporttal. Mivel a másodlagos kinon energiaszintje

mintegy 60 mV-tal alacsonyabb az elsıdleges kinonénál, azt gondolták, hogy ez

a szabadenergiakülönbség lehet a folyamat hajtóereje. Újabb eredmények szerint

azonban világosnak tőnik, hogy a QA-QB → QAQB

- elektrontranszfer legalább két

kinetikai komponensbıl áll (Tiede és mtsai., 1996;Graige és mtsai., 1998).

Vannak adatok arra vonatkozóan is, hogy a QA- helyen más kinonokkal

(menakinonnal; a Rhodopseudomonas viridis nevő baktériumban természetes

kinon a QA helyen) helyettesített RC esetén ez az elektrontranszport lépés három

komponensbıl is állhat (Li és mtsai., 1997). A két jellemzı kinetikai összetevı

közül az egyik a már korábban is megismert 150-200 µs-os komponens,

amelynek jellemzıi valóban a fent leírtak. Kiderült azonban, hogy létezik egy

gyorsabb, néhány tíz mikroszekundumos kinetikai komponens, amely a pH-val

és a hımérséklettel alig változik (Tiede és mtsai., 1996). Kinonhelyettesítéses

mérések azt is igazolták, hogy ez a komponens a QA és a QB közötti

szabadenergiakülönbségtıl is független (Graige és mtsai., 1998). Okamura és

munkatársai ezen eredmények alapján alkották meg a QA-QB → QAQB

-

elektrontranszfernek azt a modelljét, amely szerint ez a folyamat a RC

konformációs mozgásai (ezzel együtt a QB jellegzetes „befordulása”) által

limitált („conformation gated mechanism”, (Graige és mtsai., 1998).

E modell szerint a gyors, néhány tíz mikroszekundumos komponens a

fehérjén belüli, ún. „intrinsic” (vagy tényleges) elektrontranszport, amely

valóban független a hımérséklettıl és a pH-tól. A második, néhány száz

mikroszekundumos komponens megjelenését a QA -ra érkezı töltés indukálja. A

14

redukált QA olyan hosszú távú töltéselmozdulást indukál a kinonakceptor

komplex közvetlen környezetében, amely a hidrogénkötések átrendezıdéséhez

vezet, ezáltal a fehérje konformációja is megváltozik („elektrosztatikus domino”,

(Sebban és mtsai., 1995). Ez a konformációs mozgás szükséges ahhoz, hogy a

másodlagos kinon, QB, az elektron fogadására alkalmas ún. proximális, azaz a

vasatomhoz közeli pozícióban rögzüljön, ami feltétele az elektrontranszportnak.

Legújabb eredmények alapján valószínősíthetı, hogy a fehérje konformációs

mozgásainak egyik kulcslépése a QB2- protonációjában fontos szerepet játszó

GluL212 aminosav protonációja (Mezzetti és mtsai., 2002).

Újabban Remy és munkatársai Fourier transzformált infravörös (FTIR)

spektroszkópiás mérések alapján megkérdıjelezik, hogy a másodlagos kinonnak

ez az erıteljes mozgása lenne a sebességmeghatározó tényezı (Remy és

Gerwert, 2003). Szerintük a nagyon gyors (12 µs és 150 µs) komponensek a

fehérjén belüli protonációs út elején levı két hisztidin aminosavak (HysL126 és

HysL128) protonációjával kapcsolatosak, míg a lassú (az ı mérési körülményeik

között 1.1 ms komponens) a QB környezetében levı GluL212 és AspL210

aminosavak protonációja miatt van. Egy nagyon fontos megállapításuk szerint a

QA-QB → QAQB

- elektrontranszport nem egyetlen lépésben történik (mint azt a

korábbi modellek állítják), hanem egy intermedieren keresztül, és szerintük ez a

HysL190, HysL219 és GluM234 valamint a Fe2+-ionból álló klaszter lenne. A

megállapításuk furcsa módon, nem váltott ki komolyabb érdeklıdést az

irodalomban. Egyre érdekesebb adatok győlnek azonban a QA-QB → QAQB

-

elektrontranszportról, és a konformációs mozgás limitáló szerepérıl (ami

dogmaként íródott be az irodalomba az elmúlt években). Breton és munkatársai

FTIR spektroszkópiai mérésekkel azt találták, hogy az elektrontranszport

gyakorlatilag független attól, hogy a QB kinon proximális, vagy disztális

helyzetben van-e (Breton és mtsai., 2004).

Legújabb krisztallográfiai (Baxter és mtsai., 2004;Baxter és mtsai.,

2005b)és FTIR mérések (Breton és mtsai., 2004;Breton, 2007) nem mutattak ki

nagy kinonmozgásokat az elektrontraszfer során (Koepke és mtsai., 2007)

találtak ugyan kristályszerkezetet, amelyben a másodlagos kinon az eddigiekhez

hasonlóan proximális illetve disztális pozícióban volt, de a szerkezet azt

15

valószínősíti, hogy a kinonnak a disztálisból proximálisba való átmenete során

nincs szükség a korábban elképzelt izoprénlánc körüli 180º-os elfordulásra. A

szerkezeti mozgások kimutatására igen érzékeny technika, a tranziens grating

mérése sem mutatott ki jelentıs struktúrális mozgásokat a QA-QB → QAQB

-

elektrontranszport során (Ohmori és mtsai., 2008). Ezek alapján észszerőnek

látszik az a feltételezés, hogy még ha lehetséges is jelentısebb kinonmozgás az

elektrontranszport során, az nem feltétlenül jár együtt jelentıs

konformációváltozásokkal (Baxter és mtsai., 2005a).

A QA-QB → QAQB

- elektrontranszfer paramétereit meghatározhatjuk

közvetlenül a kinon → szemikinon átalakulás nyomonkövetésével, a

redoxátmenet miatt bekövetkezı abszorpcióváltozás mérésével 397 vagy 402

nm-nél. Ez azonban nem könnyő feladat, mert az extinkciós koefficiens igen

kicsi, így a jel/zaj viszony is nagyon kicsi, a minta fényszórása viszont igen nagy

a látható tartomány legelején. Praktikusabb a BPheo abszorpciójában, a

kinonokon megjelenı töltés miatt bekövetkezı elektrokróm eltolódás mérése a

750-770 nm közelében (Tiede és mtsai., 1996). Mivel ez az elektrokróm

eltolódás más a QA- és a QB

- állapotokban, a QA-QB → QAQB

- elektrontranszfer

kinetikája mérhetı. Mi is ezt a megoldást választottuk.

2.2.3. Többszöri töltésszétválasztás

Fiziológiás körülmények között a töltésrekombináció valószínősége

nagyon kicsi, mert az egyszeri fényfelvillanás hatására képzıdı töltéspárt

(P+QA-) egy másodlagos donor (pl. citokróm c2+) még a töltésrekombináció

bekövetkezése elıtt redukálja, így a reakciócentrumban fény hatására újabb

töltésszétválasztás történhet (Kleinfeld és mtsai., 1985). (A folyamatot in vitro is

modellezhetjük a rendszerhez adott külsı elektrondonorral.) Az oxidált dimer

visszaredukálása után a reakciócentrum újabb töltésszétválasztásra válik

alkalmassá. A második fényfelvillanás már heterogén reakciócentrumot ér

(QA-QB és QAQB

- állapotok) és csak azokban következik be újabb

töltésszétválasztás, amelyekben QA oxidált állapotban van, mert a QA csak egy

elektron fogadására képes. A második fényfelvillanást követıen, két elektron

16

felvétele után, a másodlagos kinon a vizes fázisból két protont köt meg és

dihidro-kinon (kinol, QH2) keletkezik. Mivel a Q és QH2 lazábban kötıdik a

reakciócentrumhoz, mint a szemikinon (QB-, egyszeresen redukált kinon), így a

keletkezett kinol leválik a RC-ról és helyébe új oxidált kinon (Q) kötıdik (3.

ábra).

3. ábra A fotoszintetikus reakciócentrumban végbemenı folyamatok sorozatos fényimpulzusokkal történı gerjesztéskor. Az ábrán feltüntettem az elektrontranszfer útját, a protontranszport, a cyt c2+ oxidációjának, és a kinoncserének a lehetıségeit. Q, QA, QB, oxidált, QA

-, QB- redukált, (QBH)-, (QBH2), QH2 protonált kinonformák; cyt c2+

redukált, cyt c3+ oxidált citokrómformák; P elsıdleges donor; H+(1) valamint H+(2) elsı és második proton.

kAB(2)

PQAQB

P*QAQB

P+QA-QB

PQAQB-

P+QA-(QBH)

P*QA(QBH)

PQA(QBH2)

PQA(QBH)-

hνννν

cyt c2+ cyt c3+

hνννν

cyt c2+

cyt c3+

H+(1)

H+(2)

Q

kAB(1)

17

2.2.4. A membránkörnyezet hatása a töltés-

szétválasztásra

Az elızı pontban említett kinetikai adatok LDAO (lauraldimetilamin-N-

oxid)-micellákba ágyazott fotoszintetikus reakciócentrumok elektrontranszport-

sajátságait jellemzik. 14C-gyel jelölt detergensekkel (Feher és Okamura, 1978)

és strukturális adatokkal (Deisenhofer és Michel, 1989) igazolható volt, hogy a

RC körül viszonylag keskeny (kb. 3 nm) hidrofób zóna alakul ki, amely néhány

száz detergens- vagy lipidmolekulával való kölcsönhatást tesz lehetıvé. Ezek a

kölcsönhatások a kofaktorokra különbözı hatásokkal lehetnek. A primer donor a

periplazmatikus felszínhez közelebb, a pigment-protein komplex belsejében

helyezkedik el. A QA, az intracitoplazmatikus felszínhez ugyan közelebb van, ám

meglehetısen jól beágyazva egy apoláris, a H-alegység által védett környezetbe

(Feher és mtsai., 1989;Deisenhofer és Michel, 1989). A P+QA- töltésrekombi-

náció sebessége detergensben és foszfatidilkolin (PC) lipidben nem mutatott

lényeges eltérést. A QB, ezzel szemben közelebb van a citoplazmatikus

felszínhez. A környezetében számos ionizálható, protonációra/deprotonációra

képes aminosav oldallánc van (Kalman és Maroti, 1994), így a QB

redoxpotenciálja nagyon érzékenyen változik a környezeti hatásokra, és az

esetleges lipidösszetétel változásaira is. A QB redukciója (mind az elsı, mind a

második elektronnal) protonok felvételével jár együtt, amelyben fontos szerepet

játszanak a környezetében lévı protonálható aminosav oldalláncok.

Természetesen a fı célunk az, hogy megértsük, milyen a RC szerkezete

és hogyan mőködik az élı membránban. Az élı membrán összetettsége (ld. 4.

ábra) azonban nagyon megnehezíti annak az eldöntését, hogy milyen

komponensek, milyen hatások befolyásolják a RC-szerkezetet és mőködést.

Igen nagy fontosságúak azok a vizsgálatok, amelyek mesterséges - de az

élı lipidkörnyezetben is megtalálható lipidekbıl összeállított - lipidmembránban

történtek, mert ezekben a RC strukturális és funkcionális paraméterei közelebb

vannak az in vivo körülmények között mértekhez (lásd pl. (Maroti, 1991;Nagy

és mtsai., 1999;Palazzo és mtsai., 2000). Például a P+QB- töltéspár élettartama

hosszabb, a QB-oldal betöltöttsége magasabb, a KAB, a kinonok közötti elsı

18

elektrontranszfer egyensúlyi állandója (KAB = [QAQB-]/[QA

-QB]) nagyobb. A

folyamat ∆GAB0 stabilizációs energiája abszolút értékben nagyobb (negatívabb)

az in vivo membránban, így mesterséges lipidmembránban is (Nagy és mtsai.,

1999).

4. ábra A modell a Rb. sphaeroides in situ kromatofora felszínét mutatja. (Sturgis és

Niederman, 2008)

A membránkörnyezetnek a töltésstabilizálódásra gyakorolt hatása

összetett. A lipidkörnyezet nem csak strukturális mátrix a RC számára, hanem

aktív szerepe is van.

a) A fotoszintetikus membránban a fehérjék szerkezeti flexibiltása, az

aminosavoldalláncok mozgási szabadsági foka, nagyobb, mint detergensben

(Nagy és mtsai., 1999).

b) A biológiai, így a fotoszintetikus membránok is, jellemzı módon reagálnak a

környezet különbözı (stressz)paramétereinek megváltozásaira, külsı és belsı

jelzésekre (szignálokra). Ez többek között azt is jelenti, hogy a sejt a membrán

19

összetételét jellemzı módon képes megváltoztatni úgy, hogy a lipid

kettısréteg stabilitása megmaradjon. Ezt a különbözı lipidkomponensek

(kettısréteget képzı és kettısréteget nem képzı lipidek) szükségesnek

megfelelı módon történı megváltoztatásával éri el (Batterton és Van Baalen,

1971).

c) Vannak a fotoszintetikus membránnak olyan komponensei, amelyek szorosan

hozzátartozó részei a redoxátmeneteknek. A legnyilvánvalóbb példa erre az

ubikinon (UQ) (növényekben a plasztokinon), amely része a RC

kinonciklusának.

d) Egyre több bizonyíték van arra, hogy olyan molekulák is kötıdnek a RC-hoz

amelyek nem vesznek részt tranziensen a redoxreakciókban, de azok

kinetikáját, energetikáját befolyásolják (Lancaster és Michel, 1997). LDAO

detergensmolekulákat és SO42--ionokat találtak a Rps. viridis reakciócentrum

kristályokhoz kapcsolódva (McAuley és mtsai., 1999;Wakeham és mtsai.,

2001;Camara-Artigas és mtsai., 2002). Kardiolipint (CL) (Nogi és mtsai.,

2000), valamint foszfatidiletanolamint (PE) (Fathir és mtsai., 2001) találtak a

baktériumok RC-ból készült kristályaiban (5. ábra). A foszfatidilglicerolnak

(PG) a növények második fotokémiai rendszere D1 proteinjéhez való

specifikus kötıdését írták le (Kruse és Schmid, 1995), valamint az in vivo

specifikus funkcióját mutatták ki (Hagio és mtsai., 2000;Sato és mtsai.,

2000;Gombos és mtsai., 2002).

e) A fotoszintetikus elektrontranszportnak a paraméterei és a membránlipidek

közötti kapcsolatot különbözı stresszkörülmények esetén is kimutatták (Aro

és mtsai., 1993).

A különbözı foszfolipidek (1,2-Dimyrisroyl-sn-Glycero-3-Phophocholine

(DMPC), 1,2-Dipalmytoyl-sn-Glycero-3-Phophatydilcholine (DPPC), 1-

Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phophatydilcholine (POPC), szójabab, vagy

tojássárgája lecitin) széles körben használtak a biológiai membránok

funkciójának és szerkezetének modellezésénél. A PC és a PG jelentıs

mennyiségben megtalálható a fotoszintetikus baktériumok membránjaiban

(Nagy és mtsai., 1999), a CL-nek specifikus jelentısége is lehet a fotoszinte

20

5. ábra A Thermochromatium (korábban Chromatium) tepidum (a), Blastochloris

(korábban Rhodopseudomonas (Rps)) viridis (b) és a Rhodobacter sphaeroides (c) RC-ának összehasonlítása a kristályszerkezetük alapján. Az egyes RC-hoz kapcsolódó nem redoxaktív, de az elektrontranszport tulajdonságait módosító kofaktorokat is feltüntettük (Fathir és mtsai., 2001).

tikus apparátus mőködésében. Mivel a CL két foszfatidilglicerol-molekulából áll,

szerepének kiderítésében jelentısége lehet annak a megfigyelésnek, hogy mutáns

cianobaktériumokban a PG az elektronnak a QB-n történı stabilizálódását

befolyásolhatja (Gombos és mtsai., 2002;Hagio és mtsai., 2000).

A POPC speciális figyelmet kaphat, mert fiziológiai hımérsékleten

folyékony fázisba vihetı (fázisátmenete -2.6±2.1 ºC). Ugyanakkor az általunk

alkalmazott rendszer fázissajátságait nehéz megjósolni az elég nagy

mennyiségben jelenlevı koleszterin, ubikinon és RC miatt. A (Thewalt és

mtsai., 1992b) által POPC/Chol rendszerre bemutatott fázisdiagram alapján

azonban azt valószínősíthetjük, hogy az általunk vizsgált rendszerben a gél és a

folyadékkristályos fázisok keveredése fordulhat elı.

21

A membrán protonáteresztı képessége sok tényezıtıl függ. Függhet a

membrán fizikai/kémiai paramétereitıl (pl. fluiditásától), mikroszerkezetétıl

(éppen melyik fázisban található, milyen kompartmentek lehetnek benne),

fehérjetartalomtól, és egyéb molekulafajták (pl. szabad zsírsavak, koleszterin)

jelenlététıl (Lande és mtsai., 1995;Deamer és Nichols, 1989;Krishnamoorthy és

Krishnamoorthy, 2001). A koleszterinek kitüntetett szerepe van a

protonáteresztıképesség befolyásolásában (Lande és mtsai., 1995;Gensure és

mtsai., 2006). A koleszterin jelenléte csökkenti a proton áteresztıképességet, de

egy bizonyos koncentráció fölött, feltehetıen a koleszterin domének megjelenése

miatt az ugrásszerően megnı.

A fehérjék jelenléte is növelheti a proton áteresztıképességet. Ennek

valószínő oka az, hogy nı a membrán heterogenitása, megváltozik a

doménszerkezete, környezetükben megváltozik a mikrostruktúra (Barlic és

mtsai., 2004;Riegler és Mohwald, 1986).

A kutatások egyik fı célja az lehet, hogy meghatározzuk, milyen

tényezık hogyan befolyásolják a transzmembrán protongradiens, protonmozgató

erı (proton motive force, pmf) kialakulását, fennmaradását, illetve annak

megszőnését (lecsengését). A feladat azonban nem könnyő, nagyon sok tényezı

figyelembe vételét, sok kalibrálást igényel. Figyelembe kell venni a rendszer

pufferkapacitását, az egyes komponenseknek a protonaktivitásra gyakorolt

hatását (például a H+ aktivitási koefficiense , fH+=0.33 0.03% Triton X-100

mellett, viszont csak fH+=0.12 0.04% dodecilmaltozid mellett (Kalman és mtsai.,

1997), amely változik a pH-val is). Az általunk használt puffer kapacitása a

számunkra érdekes semleges pH-tartomány körül nem sokat változik, ezért ha az

abszolút érték meghatározása nem is olyan könnyő, viszonylag jó közelítés

adható a változások mértékérıl.

A RC-on belüli elektrontranszportot a lipoproteid rendszerben rövid és

hosszútávú kölcsönhatások befolyásolják. A rövidtávú kölcsönhatások közé a

RC fehérje és a membránalkotók (foszfolipidek, koleszterol, kinon) közötti

közvetlen kölcsönhatások tartoznak. Fontos, hogy a közvetlen kapcsolatok

mellett a lipoproteid rendszer (liposzóma) egésze, nevezzük nanoszkópikus

környzetnek, is hatással lehet a mőködésre. Megváltozhat pl. pH, az

22

elektrosztatikus környezet (dielektromos állandó). Érdemes észrevenni, hogy a

RC/lipszóma vezikulák jellemzıen kb. 100 nm átmérıjőek. Ez az átmérı a

látható fény hullámhosszának kb. a negyed része, vagy annál is kisebb, vagyis az

elektromágneses tér az oszcillációja során egynegyed periódust (vagy még

kevesebbet) ír le a liposzómán való áthaladása során.

Adódik a lehetıség a RC szerkezeti és mőködési sajátosságainak más

nanoszkópikus rendszerekben való vizsgálatára is. A következı fejezetben ennek

lehetıségét mutatom be.

2.3. A szén nanocsövek és biológiai anyagok

2.3.1. A szén nanocsövek szerkezete és tulajdonságaik

A szén korábban ismert két allotróp módosulata mellett (grafit és

gyémánt) 1985-ben a fulleréneket fedezték fel (Kroto és mtsai., 1985), 1991-ben

a többfalú szén nanocsöveket (multi-walled carbon nanotubes: MWNT, (Iijima,

1991)), majd két évvel késıbb a fullerénekbıl közvetlenül származtatható

egyfalú szén nanocsöveket (single-walled carbon nanotubes: SWNT(Gallagher

és mtsai., 1993).

Az egyfalú szén nanocsövek hat szénatomot tartalmazó győrők

hálózatából épülnek fel úgy, hogy szerkezetüket egy hengerré tekert grafit sík

képezi és a végeket félfullerének zárják le (6. ábra). A csıvégek 6-6 darab öt

szénatomos győrőt tartalmaznak a görbület miatt. A grafit sík feltekeredési

módjától függıen beszélhetünk karosszék, cikk-cakk és királis szén

nanocsövekrıl aszerint, hogy a királis szög milyen értéket (Θ=30°, Θ=0° és

0°<Θ<30° az elıbbi felsorolásnak megfelelıen) vesz fel. A többfalú szén

nanocsövek szerkezetére a feltekert grafit síkokból álló koncentrikus

hengerpalástok jellemzık (Collins és mtsai., 2001).

23

gyémántgyémánt

(10,10) csı

C60„buckminster” fullerén

grafit

gyémántgyémánt

(10,10) csı

C60„buckminster” fullerén

grafit

gyémántgyémánt

(10,10) csı

C60„buckminster” fullerén

grafit

A szén nanocsövek (NT) igen elınyös fizikai tulajdonságokkal rendel-

keznek, melyek alapján számos technológiai alkalmazás lehetıségét kínálják fel.

Ezek általánosságban két nagy csoportra oszthatók. Az elsı csoportba a mak-

roszkópikus, leginkább mechanikai, tulajdonságok kihasználását sorolhatjuk (pl.

6. ábra A szén allotróp módosulatai: gyémánt, grafit, fullerén, egyfalú és többfalú szén nanocsı

a szénszálak helyettesítését). Erre azért van mód, mert a szén nanocsövek nagy

mechanikai szilárdsággal rendelkeznek. A másik csoport a rohamosan fejlıdı

nanotechnológiában való egyéb alkalmazások, a szén nanocsövek különleges

elektromos, optikai, mágneses, téremissziós sajátságainak felhasználásával.

2.3.2. A szén nanocsövek és a biológiai anyagok közötti

kölcsönhatás

A szén nanocsövek megfelelı fizikai paramétereiknek köszönhetıen

kompozit anyagok elıállítására is igen alkalmasak. Mind az egyfalú, mind a

többfalú NT-bıl különbözı polimerekkel vagy szervetlen vegyületekkel

kombinálva hozzák létre a kompozitokat. Ezeket az anyagokat igen széles

körben használják fel: a NT-kel megerısített, fém-mátrixú kompozitoknak

egyedülálló mechanikai tulajdonságaik vannak; a NT-et templátként alkalmazzák

24

szervetlen nanoszerkezetek elıállítására; ezen kívül felmerült annak lehetısége,

hogy a NT-et elektromos egységként elemekben és szenzorokban is kompozit

anyagként felhasználják.

Az elızıekben felsorolt alkalmazási területek mellett speciálisabb

felhasználást jelent a NT-k kompozitjainak elıállítása biológiai anyagokkal,

amelyre a NT-k optimális fizikai tulajdonságain kívül megfelelı

elektronszerkezete miatt van lehetıség.

Kismérető proteinek NT felülethez való kötıdésével bioelektrokémiai

reakciók katalizálhatók (Britto és mtsai., 1996;Davis és mtsai., 1997), 7. ábra).

Ezen kívül a nagymértékben rendezett szén nanocsövek immobilizációs

mátrixként, vagy mediátorként alkalmazhatók harmadik generációs

amperometriás bioszenzor készülékek kifejlesztésénél (Sotiropoulou és

Chaniotakis, 2002). A NT-k egydimenziós elektronszerkezete alkalmas lehet a

heterogén elektron transzfer reakciók tanulmányozására (pl. amikor különleges

biomolekulák képesek elektronikus kommunikációra a határfelületen). Már

vannak eredményes kísérletek, melyekben redox aktív fehérjék prosztetikus

csoportja és a NT-k felülete közötti elektrontranszfert tudtak kimutatni (Davis és

mtsai., 2003). A vizsgálatok azt mutatták, hogy a fehérje szerkezetét és

funkcióját nagymértékben befolyásolja a nanocsı környezet. A szójabab

peroxidáz aktivitásának 30%-a, az αkimotripszin aktivitásának csupán 1%-a

marad meg, ha ezek a proteinek az SWNT-höz kötıdnek (Karajanagi és mtsai.,

2004).

7. ábra Egyfalú szén nanocsı felhasználásával készített amperometriás glükóz bioszenzor mőködésének elvi vázlata ((Davis és mtsai., 1997) alapján)

SWNT glükóz

e--transzfer makroszkópikus

25

3. Célkitőzések

Lipid kettısréteg szerepének meghatározása

1) A fotoszintetikus RC foszfatidil-kolin (PC), foszfatidil-glicerol (PG) és

PC+ kardiolipin (CL) lipidekbıl készített liposzómákba ültetése, és

annak a megmutatása, hogy

a.) az így készített rendszerek nagy valószínőséggel lipid

kettısrétegbıl álló zárt vezikulák;

b.) bennük a RC orientációja valószínőleg véletlenszerő.

2) A RC másodlagos kinonaktivitásának meghatározása PC és PG

liposzómákban (a P+Q- → PQ töltésrekombináció lassú

komponensének az amplitudója alapján).

3) A QA-QB → QAQB

- elıremenı elektrontranszport detergensben mért,

irodalomból ismert paramétereinek (gyors- és lassúfázis részaránya,

idıállandói) meghatározása mind a PC, mind a PG rendszerben.

4) Az anionikus lipidek RC-hoz való specifikus kötıdési helyeinek

meghatározása.

5) A többszörös gerjesztés során a RC többszörös átfordulásának

jellemzése különbözı membránkörnyezetekben.

A töltésstabilizálódás energetikája lipidekben

6) A P+Q- → PQ töltésrekombináció lassú komponensének kinetikájából

a QA és QB közötti szabadenergiakülönbségek meghatározása PC és

PG liposzómákban

7) A KAB hımérsékletfüggésébıl a QA/QB állapotok közötti standard

szabadentalpiakülönbségek és a két állapot közötti entrópiakülönbség

kiszámítása.

26

Transzmembrán protongradiens

8) Fluoreszkáló jelzımolekula (piranin) liposzómába való beépítésével a

transzmembrán protongrádiens kiépülésének, és fennmaradásának

kimutatása, kinetikájának meghatározása.

A fotoszintetikus RC és egyfalú szén nanocsövek

kapcsolata

9) A fotoszintetikus reakciócentrumok egyfalú szén nanocsövekhez

kapcsolása és az így kapott bio-nanokompozit (SWNT/RC) anyag fı

spektroszkópiai tulajdonságainak meghatározása.

27

4. Anyagok és módszerek

4.1. Mintaelıkészítés, preparatív eljárások

4.1.1. A baktériumtörzs jellemzése

Vizsgálataimhoz a Rb. sphaeroides R-26 törzset használtam. Az R-26

törzs karotinoidmentes, az abszorpciós spektrumából hiányoznak a karotinoidok

sávjai, ezért folyadékkultúrájának színe jellemzıen kék (a vadtípusú tenyészet

színe vöröses/barnás). Mivel normális körülmények között a karotinoidok

védenek a fotooxidációval szemben, e törzs sejtjei fotoheterotróf nevelési

körülmények között érthetıen érzékenyek a tápoldat oxigénkoncentrációjára

(lásd „Az R-26 baktériumtörzs tenyésztése” fejezet).

4.1.2. Az R-26 baktériumtörzs tenyésztése

A folyadékkultúrákhoz az 1,5%-os agaron nıtt masszív szúrt

tenyészetekbıl vettünk mintákat a 10-15 cm3 szukcinát-tartalmú Siström-

tápoldatot tartalmazó, jól zárható, kémcsövekbe. A továbbtenyésztéshez 200-250

cm3, majd 1000 cm3-es üvegeket használtunk. Minden egyes átoltás után 4-6

órára sötétbe tartottuk a sejteket, hogy az oldatban levı oxigént a sejtek a

légzésükhöz felhasználják. Erre azért van szükség, mert a tápoldatban maradt

kismennyiségő oxigén a sejtek egy részét elpusztítja, ezzel is lassítva a tenyészet

növekedését. A sötétperiódus után a tenyészeteket fényre tettük a fotoheterotróf

nevelési körülmények biztosítására. A megvilágítás 40 W teljesítményő wolfram

izzószálas lámpákkal történt, amelyeket kb. 20 cm-re helyeztünk el a

tenyészetektıl. Az izzólámpák által termelt hı egyúttal biztosította az optimális,

kb. 30 oC hımérséklet is. 4-5 napig állandó fényben történı tenyésztés után a

sejteket lecentrifugálva (6000 x g, 20 perc ), majd mosópufferrel (10mM TRIS;

28

100mM NaCl) mosva a felhasználásig -20 - -25 oC-on lefagyasztva tároltuk

(Nagy és mtsai., 1991). Literenként kb. 8 gramm baktériumtömeget tudtunk

összegyőjteni.

4.1.3. Reakciócentrumok prepalálása

A RC-ok preparálásához nagyobb mennyiségő sejtre van szükség.

Kb.100 g vizes tömegő fagyasztott sejtbıl indultunk ki, amelyeket a befagyasztás

elıtt többször átmostunk TRIS-pufferrel (10 mM TRIS; 100 mM NaCl; pH 8,0).

Hígítás után ultrahanggal feltörtük a sejteket. Az ultrahangos feltáráshoz

SONOPLUS Ultrasonic homogenizer-t használtunk (Bandelin, Németország).

Egy speciálisan a sejtfeltárásra tervezett, jégbe állított üvegedényben a készülék

TT 13 titánfejét használva, 1 órán át közel 100% (kb. 70 W) teljesítménnyel

impulzus üzemmódot használva (5 impulzus/periódus) ultrahangoztuk a sejteket.

A számunkra szükségtelen sejtmaradványokat (sejtfal, feltöretlen sejtek)

centrifugálással távolítottuk el (kb. 40000 x g, 10 perc), majd a felülúszót

ultracentrifugáltuk (240000 x g, 90 perc). Az üledékben kapott kromatofórát

finom ecsettel felszuszpendáltuk és 0,45% LDAO detergenst tartalmazó TRIS-

pufferrel kioldottuk a fehérjéket, amit újabb ultracentrifugálással választottunk el

a nem szolubilizált részektıl. A felülúszóból a RC-ot frakcionált ammónium-

szulfátos kicsapással, majd DEAE Sephacell anioncserélı

oszlopkromatográfiával tisztítottuk. Az oszlopkromatográfia elıtt a mintát

dializálással sómentesítettük. A kromatográfia során szedett frakciókból azokat

tartottuk meg, amelyekben az OD280nm/OD800nm arány 1,2-1,5 között volt. A

koncentráció és a tisztaság megállapítása után UQ10 hozzáadásával a QB-

aktivitást 90% felettire állítottuk be. Az ilyen módon izolált RC-at –20 oC-on

tároltuk.

29

4.1.4. Lipoproteid rendszerek preparálása

A már tisztított RC-okat PC, illetve PG alapú vezikulákba helyeztem.

PC/PG, foszfatidilinozitol (PI), UQ10 (2,3-dimetoxi-5-methil-6-dekaizoprenol-p-

benzokinon) és koleszterin (Col) megfelelı mennyiségő és koncentrációjú

kloroformos oldatait kevertem össze. A mennyiségi arányok megállapítását

hosszú kísérletezés elızte meg (lásd „Eredmények” fejezetben), míg sikerült egy

olyan leírást megadni, amely az elvárásainknak megfelelı tulajdonságokkal

rendelkezı liposzómát eredményezett. A keverés után az oldószert

nitrogénárammal távolítottam el úgy, hogy az összetevık az Eppendorf-csı

falára vékony filmet alkotva száradjanak fel. Beszárítás után a csöveket 20 percre

vákuumba helyeztem, így a maradék oldószert is eltávolíthattam. Ilyen

állapotban a minta akár 1-2 hétig lefagyasztva tárolható (Ollivon és mtsai.,

2000a;Trotta és mtsai., 2002).

Ezek után a csövekbe 500 µl Na-kolát-puffert (Ch) (5 mM KCl, 5 mM K-

foszfát, 1 mM piranin, pH: 6,8, + 4% nátrium-kolát) mértem és 3*7 percig

folyamatos ultrahanggal kezeltem ügyelve arra, hogy a közeg hımérséklete ne

emelkedjen szobahımérséklet fölé. Az így elkészített Ch/lipid alapú kevert

micellákhoz adtam a fotoszintetikus reakciócentrum LDAO detergenses oldatát,

majd vortex-szel egy percig intenzíven kevertettem. A kevert micellákat

tartalmazó mintát elıször 5 mM foszfátot, 5 mM KCl-ot és 1 mM piranint

tartalmazó pufferrel (pH: 6,8) ekvilibrált Sephadex G-50 molekulaszőrıre

vittem, és ugyanezzel a pufferrel eluáltam. Az elúció során a RC-ot tartalmazó

oldat gyakorlatilag egyetlen frakcióban volt összegyőjthetı, csak egy-két elı és

utófrakció tartalmazott még RC-ot, ám csak igen kicsiny koncentrációban. Az

összegyőjtött frakcióban a RC már zárt vezikulákba épült be, de a vezikulák

mindkét oldalán levı térben (mind a vezikulák belsejében, mind pedig azon

kívül) megtalálható a piranin jelzımolekula a kiindulási koncentráció szerint. A

fıfrakciót újabb kromatográfiás eljárásnak vetettem alá, mely az elsıtıl csupán

abban különbözött, hogy a puffer nem tartalmazott piranint. Ez az eljárás

biztosította azt, hogy az oszlopon való áthaladás után a külsı térben levı

piranintól megszabadulhassunk. Ebben az esetben is jól el tudtunk különíteni egy

30

központi frakciót, melyben a számunkra fontos RC/lipid együttesek nagyobbik

része került. (Trotta és mtsai., 2002;Nagy és mtsai., 2004). A kísérleti

elrendezést a 8. ábra szemlélteti.

8. ábra: A RC/liposzóma zárt vezikulák elkészítésének, és a piranin jelzımolekulának a vezikulák belséjébe építésének vázlata. Sárga vonal a lipid kettısréteget, a kék pálcikák a RC-ot, a zöld pontok pedig a piraninmolekulákat jelölik.

Piraninos oszlop

Kevert micella Reakciócentrum

A reakciócentrum beépült a zárt vezikulába. A zöld színő pöttyök a vezikula belsejében található piranint jelzik.

Piranin nélküli oszlop

Detergens kimosása

Kevert micellák pyranint (zöld pöttyök) tartalmazó

térben

Proteoliposzóma képzıdése

I. oszlop II. oszlop

31

4.2. Vizsgálatok optikai módszerei

4.2.1. "Steady state" abszorpciómérések

A RC szuszpenzió és RC/lipoproteid rendszerek abszorpciós spektrumát

UNICAM spectrometer UV4 típusú spektrofotométerrel határoztam meg. A

fényszórás minimumra csökkentése érdekében a spektrofotométer közeli

mintahelyzetét használtam. Mivel a spektrumot igen széles

hullámhossztartományban kellett meghatározni az UV tartománytól a közeli IR-

ig, a mérésekhez kvarcküvettát használtam.

A RC tisztaságát az OD280nm/OD800nm arány meghatározásával

jellemeztük (lásd a „Reakciócentrumok preparálása” fejezetet), a koncentrációt

az ε800= 280 M-1cm-1 alapján határoztuk meg.

A liposzóma keletkezését a 650 nm-nél mért fényszórás

meghatározásával ellenıriztük. Ezt a hullámhosszt azért választottuk, mert itt a

RC-nak alig van fényelnyelése.

4.2.2. Abszorpcióváltozás kinetikai mérése

4.2.2.1. Az abszorpcióváltozás mérése a ms–s -os tartományban

A RC-ok fényfelvillanás által gerjesztett abszorpcióváltozását

(megválasztott hullámhosszokon) házilag összeállított egysugaras

spektrofotométerrel mértem (9. ábra, (Tandori és mtsai., 1995). A nem gerjesztı

hatású mérıfényt egy stabilizált tápegységgel táplált 50 W-os, 12 V-os autóizzó

(L) szolgáltatta, amelyet egy monokromátor (M, Jobin Yvon) belépı résére

fókuszáltunk, a kilépı fényt pedig egy fényzáron (SH) át a küvettatartóban (K)

levı mintára élesítettük. A mintán áthaladó fényt egy fotoelektron-sokszorozó

(PM, Hamamatsu R928) fotokatódjára képeztük le. A telítési gerjesztést egy

xenonvillanólámpa (Xe, EG&G FX200, t1/2=8.5 µs) biztosította, amelybıl a fény

32

egy, csak a 750 nm feletti sugarakat átengedı, keresztezett optikai szőrın (F1) át

érte el a mintát. A megmaradt vörös sáv elegendı volt a telítési gerjesztéshez. A

fotokatód elé széles sávú kék keresztezı szőrıt tettünk, hogy védje a PM-t az

erıs gerjesztı fényimpulzussal szemben (F2). A fényfelvillanás elıtti

stacionárius állapot kiegyenlítésére 200 mV kiegyenlítı (offset-) feszültséget

kapcsoltunk a fotokatódra, amit a mérıfény hatására a munkaellenálláson (10-

100 kΩ) fellépı feszültséggel a flash elıtt kiegyenlítettünk. Így a számítógépbe

épített A/D konverterbe csak a gerjesztés által kiváltott, majd felerısített jel

kerül. A mérési folyamat vezérlését és az adatok győjtését egy IBM PC/386 AT

számítógéppel végeztük.

Az elsı gerjesztés hatására létrejövı töltésstabilizálódást a P+Q- → PQ

töltésrekombináció nyomonkövetésével vizsgáltuk 430 nm-nél, ahol az

impulzusgerjesztés után keletkezı P+ visszaredukálódását mértük. A második

töltés stabilizációjának vizsgálata során 450 nm-nél mértük a fényindukált

abszorpcióváltozást, ahol a gerjesztés után keletkezı szemikinon keletkezését,

illetve második gerjesztés után az eltőnését követhetjük nyomon (Nagy és

mtsai., 1999).

Ugyanilyen elrendezés mellett mértem 700 – 800 nm tartományban a

QA/QA- és QB/QB

- differenciaspektrumokat, feleslegben alkalmazott (>40 µM)

ferrocén jelenlétében (a ferrocén a gerjesztés után keletkezı P+ donorja,

alkalmazása megakadályozza a P+Q- → PQ töltésrekombinációt). A QA-

spektrumot terbutrin jelenlétében mértük, mert ez a gátlószer blokkolja a QB -

oldalt. Az említett hullámhossztartományban 10 nm-enként pontonként

megmértem a kinetikákat és meghatároztam az exponenciális lecsengések

amplitúdóját. A számított amplitúdókat tekintettem a fény-sötét

abszorpcióváltozásnak.

33

PM < CM K

SHF2

F1

L

Xe

9. ábra A fényindukált abszorpcióváltozást mérı készülék blokkdiagrammja. L:50 W-os, 12 V-os autóizzó; M: monokromátor; SH: fényzár; K: küvettatartó; PM: fotoelektron-sokszorozó; Xe: xenonvillanólámpa a nagyfeszültségő tápegységével; F1;F2: optikai szőrık; C: számítógép.

4.2.2.2. Az abszorpcióváltozás mérése a µµµµs–s -os tartományban

Az LDAO detergensmicellákba és PC, illetve PG liposzómákba ágyazott

RC-ok QA-QB → QAQB

- elektrontranszferének kinetikáját a BPheo abszorpciója

elektrokróm eltolódásának mérésével határoztuk meg, 771 nm-nél (Tiede és

mtsai., 1996). A méréseket az SZBK Biofizikai Intézetében Dr. Váró György

laboratóriumában végeztük, az általa összeállított abszorpciókinetikai

berendezéssel (Lakatos és mtsai., 2002). Az egysugaras abszorpciómérı

berendezésben a mérıfényt egy 250 W-os halogénlámpa szolgáltatta. A

szükséges hullámhosszt 771 nm-es interferenciaszőrıvel választottuk ki, a lámpa

infravörös sugarait hıszőrıvel szőrtők ki. A RC-ot a primer donor (SP) Qy

sávjánál, 597 nm-nél gerjesztettük Nd:Yag lézerrel (532 nm) pumpált

Rhodamine 6G festéklézerrel. A gerjesztı fényimpulzus hossza 8 ns volt. A

fotoelektron-sokszorozó jelét áram/feszültség konverzió után számítógépbe

ültetett tranziens rekorderkártyával rögzítettük 200 ns/pont konverziós

sebességgel. Kiszámoltuk az abszorpcióváltozásokat, és széles idıablakban, 10-6

– 10 s intervallumban, mintegy hét nagyságrendet átfogva, logaritmikus

idıskálán ábrázoltuk.

34

4.2.2.3. Abszorpcióváltozás adatainak kiértékelése

A gerjesztésindukált abszorpcióváltozás rutinszerően használható a

töltésszétválasztás kinetikájának spektrofotometriás vizsgálatainál (Tandori és

mtsai., 1995;Tandori és mtsai., 1991;Lakatos és mtsai., 2002). A P/P+ BChl

dimer elsıdleges elektrondonor és a Q/Q- akceptor komplex kinonjai

redoxállapotairól általában a 430, 450, 603, 860 nm-nél mért abszorpcióváltozás

kinetikái, illetve a BPheo 771 nm-nél mért elektrokróm eltolódásának a

kinetikája tájékoztat (Nagy és mtsai., 1999;Tandori és mtsai., 1995;Tiede és

mtsai., 1996).

A vizsgált reakciók többsége elsırendő folyamatként kezelhetı, így

exponenciális függvénnyel írható le. A kinetikák általában több fázist is

tartalmaznak (több exponenciális összegeként kezelhetık):

(1)

ahol At az amplitúdó idıfüggése, Ai az i-edik komponens amplitúdója a t = 0

idıpontban, ki pedig, a sebességi állandója.

A kinetikai paraméterekbıl a QA-QB → QAQB

- elektrontranszport ∆G0

szabadenergiaváltozása, azaz a töltés stabilzációs energiája is kiszámolható. A

folyamat KAB = [QAQB-]/[QA

-QB] egyensúlyi állandója a mért kAP és kBP

idıállandókból kiszámolható: KAB = kAP/kBP-1. Az egyensúlyi állandó ismeretében

pedig: ∆GAB0 = -kB⋅T⋅ln KAB, ahol kB a Boltzmann-állandó, T az abszolút

hımérséklet (Wraight és Stein, 1980;Kleinfeld és mtsai., 1985).

A szemikinon keletkezésének és eltőnésének bináris oszcillációja lénye-

gében két paraméterrel a Ke elektronegyensúlyi (Ke=[QAQB-]/[QA

-QB]) és Kq

kinonegyensúlyi állandóval (Kq = [QAQB]/[QA…] = [QA-QB]/[QA

-…]) kielégítıen

leírható (Tandori és mtsai., 1991;Nagy és mtsai., 1999;Halmschlager és mtsai.,

2002). Itt [QA…] és [QA-…] azt a RC-populációt jelenti, amelyben a másodlagos

kinon kötıhelye aktív maradt, de az a gerjesztés idıpontjában idılegesen üres.

∑=

⋅−⋅=n

i

tk

iti

1

eAA

35

A QB oldali kinon kötési egyensúlyi állandó, Kq = [QAQB]/[QA...] = [QA-

QB]/[QA-...], a RC gerjesztés utáni 450 nm-nél mért szemikinon jel

oszcillációjából határozható meg (Nagy és mtsai., 1999;Tandori és mtsai.,

1991;Halmschlager és mtsai., 2002). Itt a [QA...] és [QA-...] kifejezi az elsıdleges

kinon redukált és oxidált koncentrációját a RC-ban.

4.2.3. Fluoreszcencia vizsgálatok

A liposzómák belsejébe kötött piranin fluoreszcenciájának vizsgálatához

Perkin-Elmer MPF-44A típusú, Hitachi gyártmányú fluoreszcencia

spektrofotométert használtam. A készülék blokkdiagrammja a 10. ábrán látható.

10. ábra A Perkin-Elmer MPF-44A típusú fluoreszcencia spektrofotométer blokkdiagramja. Jelölések: 1: XE-lámpa, 2: fényszaggató, 3: gerjesztési monokromátor, 4: nyalábosztó, 5: minta, 6: emissziós monokromátor, 7: fotomultiplier, 8: erısítı, 9: regisztráló, 10: potenciométer, 11: függvénygenerátor, 12: referenciaerısítı, 13: nagyfeszültségő tápegység. Piros vonallal a fény útját jelöltem.

A gerjesztést 470 nm-rel végeztük, a fluoreszcenciát az emissziós

maximumnál (510 nm-nél) figyeltük meg. A minta keverésére speciális,

keverıvel ellátott mintatartót készítettünk, amely biztosította a külsı

megvilágítás követelményeit is és a minta reagensekkel való kezelhetıségét is. A

folyamatos megvilágítás céljából egy diavetítı-izzó fényét száloptikán keresztül

a készülékbe helyezett küvettára vezettük. Az izzó és a száloptika közé helyezett

hıszőrı üveg védte a mintát a káros infravörös sugaraktól. A hıszőrı üveg mellé

36

vörös szőrıt helyeztünk, amelynek a transzmissziója a megfigyelés

hullámhosszán (510 nm) elhanyagolható volt. Ez az elrendezés a megfigyelési

oldalon levı monokromátorral együtt minimálisra csökkentette a szórt fénynek a

fotoelektron-sokszorozóba való jutásának a lehetıségét.

A fotoelektron-sokszorozó jelét megfelelı kompenzáció és erısítés után

digitális tárolóoszcilloszkópba (HITACHI VC-6025), és a mérés után IBM

számítógépbe vittük át tárolás és további feldolgozás céljából. Ezzel

kiküszöböltük a készülék eredeti analóg rekorderét, az adatfeldolgozás

pontosabbá és gyorsabbá tétele érdekében. A valódi fluoreszcenciasepktrumok

meghatározása a reabszorpcióra való korrigálással történt, a korrekciós

paramétereket korábban a készülékhez elkészített táblázatból vettem.

4.3. RC/szén nanocsı kompozit elıállítása

4.3.1. A felhasznált szén nanocsı minták jellemzése

Az egyfalú szén nanocsöveket Mikó Csilla tisztította Forró László

laboratóriumában (Institute of Physics of Complex Matter, Ecole Polytechnique

Fédérale de Lausanne, CH-1015 Lausanne, Svájc). A kereskedelmi forgalomban

is kapható (Carbon Nanotechnologies Incorporated Company) nagynyomású

szénmonoxid atmoszférában készült (HiPco) szén nanocsövek tisztítása nedves

oxidációs módszerrel történt, a következık szerint: 100 mg nyers HiPco SWNT-t

oxidáltunk 60 ml 30%-os H2O2-ben, és 110 ml 22%-os HCl elegyével. Az

oldatot keverés mellett 70 °C, 9 órán át folyamatos reflux alatt tartottuk. Ezt

követıen szobahımérsékletőre hőtöttük, majd az SWNT-ket leszőrtük és mostuk

desztillált vízzel 7-es pH eléréséig. Végül 120 °C-on, 30 percig szárítottuk. A

tisztított SWNT-k hozama 90%, amit transzmissziós elektronmikroszkóppal

(TEM) határoztunk meg. A csövek átlagos átmérıje 1-5 nm.

37

4.3.2. SWNT/RC komplex preparálása

500 µl fotoszintetikus RC-hoz 25 µl SWNT-t adtunk valamint 3 µl kinont

(UQ-10-et 60 mM UQ-10 30%-os TX-100 törzsoldatból), 10 ± 3 mg RC/mg

SWNT tömegarányban. Ezt követıen a detergens eltávolítása érdekében 3 napig

dializáltuk 10 mM TRIS és 100 mM NaCl pufferben. A mintát naponta rövid és

óvatos ultrahangozásnak vetettük alá a homogenizálás érdekében (vízfürdıben

ELMA Transsonic 310 típusú ultrahangozó készülékkel). A dialízis befejezése

után a mintához 1 ml, az elızıvel megegyezı összetételő puffert adtunk, majd

ultracentrifugáltuk (4 °C, 10 perc, 20000 g). Ezután a felülúszót leöntöttük, a

csapadékhoz pedig 1 ml desztillált vizet adtunk és az elıbbi körülményeknek

megfelelıen ultracentrifugáltuk. A felülúszót ismét eltávolítottuk, a csapadékhoz

200 µl desztillált vizet adtunk, majd ultrahangoztuk az elızıvel megegyezı

paraméterek mellett. Ezek után néhány cseppet N2-áramban üveglapra

szárítottunk. A minta egy részét szobahımérsékleten, a másik részét

hőtıszekrényben 4 0C-on tartottuk. Mértük az egyensúlyi abszorpciós

spektrumokat, a minta aktivitását a fényindukált abszorpcióváltozás mérésével

jellemeztük.

A RC/SWNT kötıdést az ultracentrifugálás üledékéke és felülúszója

steady state abszorpciós spektrumának és gerjesztésindukált abszorpcióváltozá-

sának összehasonlításával ellenıriztük. A kapcsolódás kimutatható volt atom-

erımikroszkópos (AFM) vizsgálattal is. A 11. ábra az egyfalú karboncsövek és a

RC, a 12 ábra az egyfalú karboncsı/RC komplexek AFM képeit mutatják

(Dorogi és mtsai., 2006).

38

11. ábra Az egyfalú karboncsövek (baloldal) és a RC (jobboldal) AFM-képei és a vonalmenti magasságprofilok. A felvételek AC mód-ban történtek, a letapogatás frekvenciája: 2 vonal/s. A RC magassága: 9±1 nm (jobb oldal), SWNT magasság: 2-4 nm (bal oldal).

12. ábra Az egyfalú karboncsı/RC komplex AFM képe és a vonalmenti magasságprofilok A felvétel AC mód-ban készült, a letapogatási frekvencia: 2 vonal/s. , a SWNT/RC komplex magassága: 12-15 nm.

39

5. Eredmények és megvitatásuk

5.1. A vezikulák minıségi vizsgálata

A 13. ábrán a Rb. sphaeroides R-26 karotinoidmentes törzsébıl izolált

fotoszintetikus RC-ok alapállapotú "steady state" abszorpciós spektruma látható.

A spektrumok felvételére több okból is szükség volt. A preparálás során

rutinszerően a tisztaság megállapítására, a RC koncentrációjának a

meghatározására, illetve a RC-nak a liposzómába való beépülésének az

ellenırzésére használtuk ıket.

A 13. ábrán látható spektrum jellemzı csúcsai:

- 360 nm: S0 –Sn átmenetek (amelyet Soret-sávnak nevezünk);

- 530 nm: Bakteriofeofitinek abszorpciója;

- 600 nm: Bakterioklorofill fényelnyelése;

- 760 nm Bakteriofeofitin fényelnyelése;

- 802 nm: Bakterioklorofill monomer fényelnyelése;

- 860 nm: Bakterioklorofill primer donor fényelnyelése.

A liposzómába való beépülést a 800 nm-es abszorpció

nyomonkövetésével ellenıriztük. A RC-koncentrációt az ε800= 280 M-1cm-1

alapján határoztuk meg. A gerjesztés hatására a 860 és 600 nm-nél levı csúcsok

eltőnnek („bleaching”), de jellemzı változás történik 430 nm-nél is. Ezek a

hullámhosszak alkalmasak arra, hogy a töltésszétválasztás kinetikáját nyomon

kövessük.

A kísérlet beállítása során, kezdetben, szükséges volt annak ellenırzése,

hogy mennyire homogén a liposzóma mérettartománya, tartalmazza-e a RC-ot és

a piranin jelzımolekulát. A késıbbiek során, a rutinméréseknél ezt a lépést már

elhagyhattuk. A liposzóma keletkezését a 650 nm-nél mért fényszórás

meghatározásával ellenıriztük. Ezt a hullámhosszt azért választottuk, mert itt a

RC-nak alig van fényelnyelése.

40

13. ábra A Rb. sphaeroides R-26 törzsbıl izolált fotoszintetikus reakciócentrum abszorpciós spektruma. [RC]: 0.8 µM; puffer: 10 mM TRIS, 100 mM NaCl, pH: 8.0.

A RC-ot a 800 nm-es abszorpciójának, a piranint pedig az 510 nm-nél

mért fluoreszcenciájának a nyomonkövetésével ellenıriztük. Minden egyes

frakció 0.5 ml volt és mértük az említett paramétereket. Az eredményt a 14.

ábrán foglaltuk össze. A rutinszerő preparálásoknál a reakciócentrum/liposzóma

frakció szemmel láthatóan elvált és a 14. ábra tapasztalatai alapján 0.5-0.7 ml-es,

gyakorlatilag egyetlen frakcióban volt összegyőjthetı. A szabad piranin a

molekulaszőrı oszlopról a liposzómánál késıbb, több frakcióban összegyőjtve

szedhetı le. A koncentráció helyes megválasztásával (5 µM-nál kisebb

piraninkoncentráció) a liposzóma frakció gyakorlatilag teljesen elválasztható.

0

0.2

0.4

350 450 550 650 750 850

Hullámhossz (nm)

Ab

szor

pci

ó

41

14. ábra A molekulaszőrı oszlopkromatográfia elúciós profilja a RC abszorpciója, az oldat fényszórása és a fluoreszcenciája szerint. Igen nagy (50 µM-nál nagyobb) piraninkoncentráció alkalmazásakor mért elúciós profil látható, egyetlen kromatográfia esetén. A kísérleti körülményeket a szövegben írtuk le (lásd „Anyagok és módszerek” fejezet).

5.2. A lipidkörnyezet hatása a reakciócentrumon

belüli elektrontranszportra

5.2.1. Egyszeres töltésszétválasztás

5.2.1.1. QA-QB → QAQB

- elektron transzfer kinetikája és

energetikája

A RC a baktériumok intracitoplazmatikus membránrendszerében

irányítottan helyezkedik el. Ez azt jelenti, hogy a primer donor az

extracitoplazmatikus felszín felé, a kinon-akceptor rendszer az

intracitoplazmatikus felszín felé tekint. A folyamatos töltésszétválasztást az

extracitoplazmatikus térben levı vízoldékony c2 típusú citokróm biztosítja. Ez az

orientáció szükséges ahhoz, hogy a reakciócentrum a citokróm bc komplex-szel

42

együtt transzmembrán protongradienst hozzon létre a folyamatos mőködés során

(vö. 1. ábra).

A mesterséges lipidmembránba azonban a RC véletlenszerő

irányítottsággal épül be. Ez a random orientáció nem teszi lehetıvé

protongradiens kiépülését, tehát valamilyen módon egyirányúvá kell tennünk az

elektrontranszportot. Ennek egy lehetséges módja az, hogy a már elkészített

liposzómákhoz citokrómot adunk. Mivel a citokróm számára a membrán nem

átjárható, csak azokkal a RC-okkal reagál, amelyek megfelelı irányba néznek,

vagyis a primer donorjuk a külsı felszín felé fordul.

Ellenırizhetı ez a tény a fényindukált abszorpcióváltozás mérésével. A

15 ábra azt mutatja, hogy citokróm jelenlétében a gerjesztés után keletkezı

oxidált primer donor (P+) gyorsan redukálódik (a citokróm redukálja), és ezt

követi egy lassú (másodperces idıtartományba esı) töltésrekombinálódás. A

töltésrekombinálódás komponense a citokróm nélküli minta kb. felét teszi ki

mind a PC, mind a PG rendszerben. Jellemzıen a PC-ban ez kb. 40 %, a PG-ban

60 %. A biexponenciális analízis adatait az 1. táblázatban mutatom be.

Mindegyik kinetikai görbében megtalálható egy kb. 120 ms-os

komponens, ami az LDAO detergensmicellákban is jelentkezik. Ez a komponens

a P+QA- → PQA töltésrekombináció folyamatával azonosítható, és csak nagyon

kevéssé változik a kísérleti körülményekkel. A lassú komponens, ami az LDAO

detergensben 0.8 – 1 s körüli érték szokott lenni, a foszfatidil liposzómákban

2.05 – 3.6 s között mutatkozott. PG-ban mértük a hosszabb élettartamokat. Mivel

a lassú komponens gyakorlatilag a P+QAQB- → PQAQB töltésrekombináció

eredménye, a hosszabb élettartam mindenképpen stabilabb töltésszeparált

állapotot jelent. Sıt, a PG alapú liposzómák esetén, mindkét mintában, csak egy

konstans bevezetésével sikerült maradék nélkül a görbék analízise. Nagyon

valószínő, hogy azért, mert ezekben a mintákban egy hosszú élettartamú

szemikinonforma keletkezik, ami a mi idıskálánkon konstansként jelentkezik.

43

15. ábra A PC és PG liposzómákba beépített fotoszintetikus RC fényindukált abszorpcióváltozása citokróm jelenlétében és nélküle. A folytonos vonallal kihúzott görbéket a 1. táblázatban összefoglalt kinetikai paraméterek alapján számoltuk. Mérési körülmények: puffer: 10 mM foszfátpuffer, 5 mM KCl, pH: 6.8; [RC]: 3 µM; hullámhossz: 430 nm.

A0BP (%) kBP (s

-1) A

0AP (%) kAP (s

-1) ∆G0

QA-QB→QAQB- (meV)LDAO 93,1 0,8 6,9 10,0 -62

PC 98,0 0,4 2,0 8,3 -77

PC+cyt 40,3 0,5 1,1 8,3

PG 71,0 0,1 29,0 4,0 -89

PG+cyt 41,6 0,1 21,0 3,7

1. táblázat: A Rb.sp. R-26-ból izolált RC-ok 603 nm-nél mért fényindukált abszorpcióváltozásának kinetikai paraméterei az LDAO detergens, PC és PG liposzóma rendszerekben. (15. ábra). A

0AP és A

0BP abszorpció változás jelének gyors és lassú

fázisának relatív kiinduló amplitúdói. kAP és kBP az indexben megadott fázishoz tartozó sebességi állandó. ∆G°QA -QB →QAQB

– kiszámolásának módja megtalálható az „Anyagok és módszerek” fejezetben.

Jól látható, hogy a töltésstabilizálódás a lipid/RC-ben mindenképpen

nagyobb, mint a detergensben. A PG-ban jelentıs stabilizálódás érhetı el, igen

közeli az in vivo rendszerben mérthetı kb. -95 meV-os energiaszinthez (Nagy és

mtsai., 1999). Terbutrin hozzáadásával minden esetben a gyors komponens

részesedése jelentısen megnı, citokróm hozzáadásával pedig a detergensben

mért jelnek a PC-ben és PG-ben kb. 50 %-át tapasztalhatjuk.

44

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

Minták

∆∆ ∆∆G

0 meV

PG

PC+PG

PC

PC+CL

LDAO

A különbözı rendszerekben meghatározott ∆GAB0 értékeket a 16. ábrán

foglaljuk össze. Méréseink szerint mindegyik vezikuláris rendszerben magasabb a

QB- középponti potenciálja (nagyobb a QA

-QB → QAQB- elektrontranszport

szabadenergiaváltozása), mint az LDAO detergensben. Az irodalomban, a CL

különleges szerepét írták le (Rinyu és mtsai., 2004), de vizsgálataink szerint

PC/PG kevert lipidekbıl álló vezikulákban nagyobb a töltésstabilizálódás mértéke,

mint akár a PC/CL vezikulákban is. Az elıbbi rendszerben ez az érték gyakorlatilag

megegyezik az in vivo membránban mért stabilizációs energiával.

16. ábra A QA-QB → QAQB

- elektrontranszport ∆GAB0 szabadenergiaváltozása az LDAO

detergens és különbözı vezikuláris rendszerekben (a jelölés szerint). A ∆GAB0

szabadenergiakülönbséget a P+Q- → PQ töltésrekombináció paramétereibıl számoltuk, az „Anyagok és módszerek” részben leírtak szerint.

A QA-QB →QAQB

- elektrontranszfer vizsgálatának egyik lehetséges

módja a BPheo abszorpció elektrokróm eltolódásának vizsgálata a közeli

infravörös tartományban. Itt a RC jellegzetes abszorpcióváltozást mutat attól

függıen, hogy a töltéspár a primer, vagy a szekunder kinonon csapdázódik. Ezt a

QB/QB- illetve QA/QA

- differenciaspektrumot mutatjuk be a 17. ábrán. A mérési

körülményeket az „Anyagok és módszerek” részben mutatom be. Az ábrán

megfigyelhetı egyrészt az, hogy a QB/QB- izoszbesztikus pontja a QA/QA

- -hez

képest a nagyobb energiák (kék tartomány) felé tolódik el, másrészt, az

45

abszorpcióváltozás mértéke a QB/QB- esetén kisebb. Ha tehát az elektron a QA

-QB

rendszerrıl a QAQB- rendszerre kerül, jól mérhetı abszorpcióváltozást

tapasztalhatunk. Mi a 771 nm-nél mérhetı abszorpciós maximumot választottuk

a kísérleteinkben.

17. ábra A PC liposzómába ágyazott RC QB/QB- és QA/QA

- abszorpciójának differenciaspektruma a közeli infravörös tartományban. Mérési körülmények: puffer: 10 mM foszfátpuffer, 5 mM KCl, pH: 6.8; [RC]: 3 µM; [ferrocén]: 100 µΜ; a QA

- méréséhez 400 µΜ terbutrint adtunk a mintához.

A 18. ábrán a fotoszintetikus RC 771 nm-nél mért fényindukált

abszorpcióváltozását mutatjuk be a BPheo abszorpciójának elektrokróm

eltolódása alapján. A RC-okat LDAO detergensmicellákba illetve PC és PG

liposzómákba ültettük be. Az idıskála hat nagyságrendet ölel fel.

A 18. ábra alapján ebben a hat nagyságrendet felölelı idıskálában (10-5

→ 10 s) az abszorpcióváltozás kinetikai görbéi két fı fázisból, egy gyors és egy

lassú fázisból állnak. A gyorsabb fázis a szubmikroszekundumtól a néhány száz

mikroszekundumig, a lassabb a néhány tíz milliszekundumtól a néhány

szekundumig tartó szakasz. Mindkét fázis további gyors és lassú tartományra

osztható. A szubmilliszekundumos szakasz a QA-QB → QAQB

- elıremenı

elektrontranszportra, míg a milliszekundum/szekundumos tartomány a

P+(QAQB)- → PQAQB töltésrekombinációra jellemzı.

46

A 18. ábra az LDAO detergensmicellába, PC és PG vezikulákba ágyazott

RC-ok abszorpcióváltozását tartalmazza terbutrin (a QB oldal kompetitív

gátlószere) jelenlétében (+) és anélkül (-). A négy komponensnek megfelelıen

exponenciális illesztéseket végeztem, melynek kiszámolása megtalálható az

„Anyagok és módszerek” fejezetben. Az illesztett görbéket a folytonos vonal

jelzi.

(2)

Itt NAB(1) és NAB(2) az elıremenı elektrontranszport komponenseihez

tartozó abszorpcióváltozás amplitúdói a t = 0 idıpontban, kAB(1) és kAB(2)

ugyanezen komponensek sebességi állandói. NAP és NBP a P+QA- → PQA és P+QB

-

→ PQB töltésrekombinációs folyamatokhoz rendelhetı abszorpcióváltozás-

komponensek amplitúdói, kAP és kBP ugyanezek sebességi állandói.

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

1,E-05 1,E-04 1,E-03 1,E-02 1,E-01 1,E+00 1,E+01

Idı (s )

Ab

szo

rbc

ióvá

lto

zás

(O

D)

PC -

LDAO -

PG -

PG +

LDAO, PC +

P+QA-QB→P

+QAQB-

P+QA-QB↔P+QAQB

-

P+(QAQB)-→ PQAQB

P+QA-QB

18. ábra LDAO detergensbe, PC illetve PG liposzómába ültetett RC-ok 771 nm-nél mért fényindukált abszorpcióváltozása. A QB kötıhely blokkolása érdekében az LDAO és a PC mintákhoz 100 µM, a PG mintához 400 µM terbutrint adtunk („+”: kezelt, „-“: kezeletlen). A folytonos vonallal meghúzott görbéket a 2-es táblázatban összefoglalt paraméterek alapján számoltuk. Gerjesztés: 597 nm; Puffer: 10 mM TRIS, 100 mM NaCl, pH: 8,0 (LDAO) és 5 mM foszfát, 5 mM KCl, pH: 6,8 (PC,PG).

tk

BP

tk

AP

tk

AB

tk

ABBPAPABAB eNeNeNeNtN

⋅−⋅−⋅−⋅− ⋅+⋅+⋅+⋅= )2()2(

)1()1()(

47

Az exponenciális illesztés paramétereit a 2. táblázatban foglaltam össze.

Megállapíthatjuk, hogy a leggyorsabb, az intrinsic elektrontranszfer komponens

sebessége nem különbözik lényegesen a detergens és lipid rendszerekben (a 2.

táblázat elsı és második oszlopa). A bemutatott sebességi állandók 60 µs körüli

idıállandókat jelentenek. Nagyobb a változás a fehérje konformációs

mozgásaiban. Az LDAO detergensben mérhetı reakciósebességhez képest (a 2.

táblázat harmadik és negyedik oszlopa) a PC vezikulákban nıtt, míg a PG

vezikulákban jelentısen csökkent a reakciósebesség.

A négy oszlop a töltésrekombinációra jellemzı paramétereket mutatja. A

P+QA- → PQA rekombináció sebessége lényegében nem változott, ha a RC-ot az

LDAO detergens helyett PC liposzómába ágyaztuk (kAP = 9.3 s-1, ami 107 ms

körüli idıállandónak felel meg). A PG liposzómában ez a töltésrekombináció

sokkal lassabb, kAP = 4.9 s-1, ez megfelel kb. 200 ms idıállandónak). A

másodlagos kinonról történı P+QB- → PQB töltésrekombinációs folyamatok

mind a PC, mind a PG vezikulákban jelentısen lassultak. A detergensben

tipikusnak mondható kb. 1,3 s-ról 2,6 s-ra nıtt PC-ban, és 4 s fölé PG-ban.

(Megjegyzem, hogy PG-ban a leglassabb komponens valójában még ennél is

lassabbnak adódik, az általunk alkalmazott idıablakban nem láttuk a lecsengési

kinetikák végét, így az exponenciális bontás itt pontatlanabb.)

A 18. ábrán az is látszik, hogy a QB-oldalt blokkoló herbiciddel,

terbutrinnal, a detergensben és PC liposzómában gyakorlatilag teljesen gátolni

tudtuk az elektrontranszportot, míg PG-ban még igen magas koncentrációban is

maradt jelentıs QB-aktivitás.

5.2.1.2. Anionos lipidek (PG és CL) hatásai PC mátrixban

Detergens micellákban ágyazott reakciócentrumokban az elsıdleges kinon

energetikáját a hozzáadott PC nem változtatja meg, míg a CL növeli a QA/QA-

rendszer középponti potenciálját (az in vivo rendszerben mérhetı irányába tolja

el, (Rinyu és mtsai., 2004). Kíváncsiak voltunk arra, hogy PC vezikulákba

ágyazott RC esetén milyen hatással van a vezikulákhoz adott PG (és CL) az

interkinon elektrontranszport és a töltésrekombináció kinetikájára.

48

P+(QA-QB ) →

P+ (QAQB-)1

P+ (QA-QB ) →

P+ (QAQB-)2

P+(QA-QB

-) →

P(QAQB2-)

P+(QA -QB)- →

P(QAQB)2-

A

(%)

kAB(1)

(s-1)

A

(%)

kAB(2)

(s-1)

A

(%)

kAP

(s-1)

A

(%)

kBP

(s-1)

LDAO 5.7 16800 8.4 3100 11.9 9.3 73.9 0.77

PC 7.6 15500 6.2 4100 1.7 9.3 84.4 0.39

PG 6.0 16700 3.4 710 41.4 4.9 49.2 0.26

2. táblázat A 771 nm-él mért abszorpcióváltozás illesztési paramétereinek összefoglalása. A számolásokat a 15. ábrán bemutatott mért értékekre a fent ismertetett multiexponenciális modellt feltételezve végeztük. A(%) az adott komponens amplitúdóját jelenti a teljes jel maximumának százalékában, kAB(1), kAB(2), kAP és kBP az egyes komponensek sebességi állandói.

Ez azért is fontos információ, mert az in vivo membrán igen jelentıs

mennyiségben tartalmaz PC-t és PG-t. CL-et csak kisebb mennyiségben, de

ennek a lipidnek a szerepe igazoltan igen jelentıs. A 19. ábrán a PC intakt

vezikulákba ágyazott RC-ok QA-QB → QAQB

- elıremenı elektrontranszport-

jának, valamint a P+(QAQB)- → PQAQB töltésrekombináció sebességi állandóját

láthatjuk növekvı PG és CL koncentráció esetén.

A titrálási görbék Michaelis-Menten típusú kinetikával többé-kevésbé jól

leírhatók. Érdekes, hogy ugyanazon lipidféleség, a PG esetében más más kon-

centrációk alkalmazásával érhetı el a kezdeti reakciósebesség fele. Úgy tőnik,

hogy a töltésrekombináció ugyanolyan mértékő lassulásához nagyobb PG

koncentráció szükséges a lipidvezikulában, mint az interkinon elektron-

transzferhez. Az elıbbi esetben kb. 300 PG/RC, míg az utóbbi esetben kb. 80

PG/RC arány esetén lehet a kezdeti reakciósebességet a felére csökkenteni. Az

eltérı koncentrációviszonyok egy lehetséges magyarázata az lehet, hogy a

töltésrekombináció mérésekor látszólagos elektronegyensúlyi állandót mérünk

KABapp., hiszen a lassú kinon egyensúly miatt a kinonkicserélıdés kinetikáját is

hozzámérjük a töltésrekombináció kinetikájához. A nagyobb PG koncentráció

feltehetıen a kinonkicserélıdés kinetikáját is befolyásolja.

49

0 .0 0

0 .2 5

0 .5 0

0 .7 5

1 .0 0

0 .0 1 0 .1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0

[L ip id ] /[R C ]

k

(re

l.)

k B P

k A B

k B P

P G

C L

0

0 .0 0

0 .2 5

0 .5 0

0 .7 5

1 .0 0

0 .0 1 0 .1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0

[L ip id ] /[R C ]

k

(re

l.)

k B P

k A B

k B P

P G

C L

0

19. ábra A fotoszintetikus RC-ok interkinon elektrontranszferjének kAB (telt kör szimbólum) valamint töltésrekombinációjának kBP (üres szimbólum) kinetikája a PG és a CL függvényében PC mátrixban. A sebességi állandókat a PC vezikulákban mérhetı sebességi állandókhoz normáltuk, azokat egységnek tekintve. Folyamatos és szaggatott vonallal a Michaelis-Menten egyenlet alapján illesztett görbék láthatók.

Bár a dolgozatomnak nem a CL a fı témája, megjegyzem, hogy

végeztünk méréseket CL-el is. A titrálási görbe sokkal összetettebb. Úgy tőnik,

hogy van egy kezdeti, nagyon erıs kötıdés a CL és a RC között, és egy nagyobb

koncentrációhoz tartozó gyengébb kötıdés. A jelenség további vizsgálatokat

igényel.

5.2.2. Többszörös töltésszétválasztás

5.2.2.1. QA-QB

-→→→→ QAQB2- elektrontranszport

In vivo membránban a gerjesztés után a RC-ot egy másodlagos donor

redukálja, így az alkalmassá válik újabb fotonnal egy újabb töltésszétválasztásra.

De csak azok a RC-ok reagálnak az újabb gerjesztés után amelyekben az

elsıdleges kinon, QA, oxidált állapotban van, mert a QA csak egyetlen elektron

fogadására képes. Az elsı gerjesztés után redukált QA az elektronját a QB-re

50

továbbítja, majd a második gerjesztés után szintén, így kétszeresen redukált QB

keletkezik (QB2-), ami két proton megkötése után (QBH2) leválik a RC-ról. In

vivo rendszerben a másodlagos donor valamilyen citokrómmolekula, in vitro is

lehet citokróm, de egyéb mesterséges donorféleségek is ismertek.

Ha mesterséges donor jelenlétében a RC abszorpcióváltozását 450 nm-nél

második gerjesztés után vizsgáljuk, akkor nyomon követhetjük az elektronnak a

redukált QA-ról a már redukált QB-re kerülését (QA-QB

-→ QAQB2-, második

elektrontranszport). Erre azért van lehetıség, mert az egyszeresen

redukáltkinonnak (szemikinonnak) ezen a hullámhosszon jellemzı abszorpciója

van, míg a kétszeresen redukált kinonnak (dihidrokinon, vagy kinol) nincs.

A 20. ábrán a PC és PG vezikulákba ágyazott RC-ok fényindukált

abszorpcióváltozását mutatjuk be citokróm donor jelenlétében a második

gerjesztés után. A második inpulzus 1 s-mal az elsı után érkezett. Láthatjuk,

hogy az abszorpcióváltozás a mOD nagyságrendbe esik. Mind a PG, mind a PC

vezikulák esetében összetett az abszorpcióváltozás kinetikája. Van egy gyorsabb

szubmilliszekundumos változás, és egy lassabb, szekundum körüli változás.

Mivel a citokróm az általunk is alkalmazott alacsony ionerısségő mintában

mikroszekundumos idıállandóval redukálja a primer donort, az ebbe az

idıtartamba esı komponenst csak egy gyors abszorpciónövekedésként látjuk az

ábrán. A szubmilliszekundumos gyors komponens felel meg a QA-QB

-→ QAQB2-

elektrontranszportnak. A szekundum körüli lassabb komponens valójában a már

fentebb leírt P+(QAQB)- → PQAQB töltésrekombináció eredménye. Ezt a

komponenst azért látjuk, mert a RC-ok vezikulába való beépülése teljesen

véletlenszerő. Kb. 50%-uk fordul az extravezikuláris tér felé, és 50%-uk

ellentétes irányultságú. Mivel a citokróm nem jut át a membránon, a RC-oknak

csak a fele reagál ezzel a donorral. Azokban a RC-okban, amelyekben a citokróm

redukálta a primer donort a gerjesztés után láthatjuk a szubmikroszekundumos

fázisú második elektrontranszfert, a többiben a töltésrekombináció P+ jelét látjuk.

Jól egyezik ezzel az elképzeléssel a mi megfigyelésünk is, hiszen a RC-ok

nagyjából a fele mutatja a P+ jelet (20. ábra).

A PG-ban a folyamat bonyolultabb. A P+ jel nagyobbnak adódik, kb.

80%. Ez vagy azt jelenti, hogy más a RC-ok orientációja ebben a vezikulában

51

1

2

3

4

5

6

1.E-05 1.E-04 1.E-03 1.E-02 1.E-01 1.E+00

Idı (s)

Ab

szo

rpc

ióv

ált

ozá

s (

mO

D)

PG

PC

(kevesebb RC néz az extravezikuláris tér felé), vagy a RC-ok citokróm-hoz való

hozzáférhetısége változott meg a detergenshez, vagy a vezikulához képest.

A második elektrontranszfer sebessége mindkét lipidben nagyobb a

detergensben mérthez képest. LDAO-ban 740 s-1, PC-ben 3300 s-1, PG-ben 1500

s-1-nek adódott.

Láthatjuk, hogy PC-ban nagyobb a második elektrontraszport sebessége

(jól egyezik ez az irodalomban látható értékekkel, (Nagy és mtsai., 1999;Taly és

mtsai., 2002)). PG-ban is nagyjából megkétszerezıdött a reakciósebesség, de

messze nem éri el a PC-ban mérhetı értéket. Érdemes megjegyezni, hogy a

második elektrontranszfer sebessége az in vivo membránból kivont lipidekbıl

készített vezikulákban 1250 s-1, ami inkább a PG-ben mért értékhez van közelebb

(Nagy és mtsai., 1999). Ennek lehetısége nem elhanyagolható, hiszen a PG

pozitív, a PC negatív töltéső lipid.

20. ábra A PC és PG vezikulákba ágyazott RC-ok fény indukált abszorpcióváltozása citokróm donor jelenlétében a második gerjesztés után. A mérési körülmények megegyeznek a 15. ábra szövegében leírtakkal, kivéve: 40 µM citokrómot adtunk a mintához; a mérés hullámhossza: 450 nm volt.

52

5.2.2.2. Az elektrontranszfer többszörös gerjesztés után (A szemikinon keletkezésének és eltőnésének bináris oszcillációja)

A RC töltésrekombinációs kinetikájának vizsgálatából arra következtet-

hetünk, hogy a PG jelentısen befolyásolja a kinonegyensúly kinetikáját és

egyensúlyát. A kötött/nemkötött kinon arány vizsgálatára a szemikinon keletke-

zésének és eltőnésének mérését választottam ismétlıdı gerjesztés után, másodla-

gos donor jelenlétében. Összehasonlításképpen bemutatom az LDAO detergens-

ben és a sejtekbıl kivont összes lipidbıl készült vezikuláris rendszerben mért

adatokat is, amelyeket az irodalomból (Nagy és mtsai., 1999) vettünk.

A 21. ábra azt mutatja, hogy az LDAO-ban, a sejtekbıl kivont összes

lipidben, valamint a PC-ban az oszcilláció csillapodása kisebb a PG-ban mérthez

képest. A PG-ban nem csak az oszcilláció csillapodása nagyobb, hanem az

egyensúlyi szint is valamivel magasabb, mint az elsı gerjesztés után mérhetı

amplitúdó fele.

A szemikinon keletkezésének és eltőnésének bináris oszcillációja lénye-

gében két paraméterrel a Ke elektronegyensúlyi (Ke=[QAQB-]/[QA

-QB]) és Kq

kinonegyensúlyi állandóval (Kq = [QAQB]/[QA…] = [QA-QB]/[QA

-…]) kielégítıen

leírható (Tandori és mtsai., 1991;Nagy és mtsai., 1999;Halmschlager és mtsai.,

2002). Itt [QA…] és [QA-…] azt a RC-populációt jelenti, amelyben a másodlagos

kinon kötıhelye aktív maradt, de az a gerjesztés idıpontjában idılegesen üres.

A Ke és Kq egyensúlyi állandók felhasználásával a keletkezı szemikinon

koncentrációja az „m”-edik fényimpulzus után kiszámolható, így az oszcilláció

maga jól modellezhetı (Tandori és mtsai., 1991;Halmschlager és mtsai., 2002).

A 21. ábra a mért (telt szimbólumok) és a számított (üres szimbólumok)

értékeket is bemutatja.

Az oszcillációk analízise azt mutatja, hogy a Ke elektronegyensúlyi

állandó mindegyik esetben igen nagy. Igaz a Ke az LDAO → összes lipid → PC

→ PG irányba növekszik, a csillapodás mértéke mégsem magyarázható az

elektronegyensúly megváltozásával (mert az már az LDAO detergensben is igen

nagynak mondható. A Kq változása nem mutatja ezt a tendenciát, de igen

53

kicsinek mutatkozik a PG-ban. Ez azt mutatja, hogy a Kq = [QAQB]/[QA…] =

[QA-QB]/[QA

-…] egyenlet szerint a QB-t tartalmazó reakciócentrumok aránya a

PG-ban igen kicsi. Ez igen érdekes, ha meggondoljuk, hogy a töltésrekombináció

élettartama igen nagy. Feltételezhetı azonban, hogy a lassú kinonegyensúly

miatt hosszú élettartamú szemikinonformák keletkeznek, többek között

valószínőleg a QA- is.

21. ábra A PC-bıl, PG-bıl és a kromatoforákból kivont összes lipidbıl készített liposzómákba és LDAO detergensmicellákba ágyazott RC-ok 450 nm-nél mért abszorpcióváltozása sorozatos-gerjesztés után. Az abszorpcióváltozás bináris oszcillációja a szemikinonok keletkezésével/eltőnésével magyarázható. Az elektron és kinon egyensúlyi állandókat, Ke és Kq, valamint a QB

--inaktív RC-ok (QA-) arányát is

feltüntettük. Mérési körülmények: megegyezıek a 18. ábra szövegében leírtakkal LDAO micellákra és liposzómákra nézve. Gerjesztési frekvencia: 1 Hz LDAO és PC esetén, 0,2 Hz PG esetében. Mindegyik rendszerhez másodlagos donorként 100µM ferrocént adtunk. Az összes lipidre és az LDAO mintákra vonatkozó adatokat az irodalomból vettük (Nagy és mtsai., 1999).

54

5.2.3. Inhibítorok hatása lipid környezetben

Jól ismert, hogy bizonyos vegyületek a másodlagos kinonnal

kompetícióban lehetnek a RC QB-kötıhelyéért. Ezek a gátlószerek

redoxaktivitást nem mutatnak, ezért a QB-helyre kötıdve gátolják az

elektrontranszportot. A mezıgazdaságban sokáig alkalmazták e vegyületeket

gyomírtószerekként. A legismertebbek, és bakteriális rendszerekben is

hatékonyak a triazinvegyületek, közöttük is az atrazin és a terbutrin.

Megjegyzem, hogy ma már Magyarországon (és az Európai Unióban is) ezek a

vegyületek tiltólistán vannak, feltehetıen onkogén hatásúak, de az Egyesült

Államokban és Kínában igen népszerőek még.

A terbutrin I50-értéke (vagyis az a koncentráció, amely 50 %-os gátlást

okoz) 2 µM körül van, ami azt jelenti, hogy kb. 50-100 µM koncentrációban az

elektrontranszportnak majdnem 100 %-os gátlását lehet elıidézni vele. Ilyen

koncentrációban alkalmazva gyakorlatilag teljes gátlást okoz a PC vezikulákban

is. Érdekes, hogy PG-vezikulákban még jóval nagyobb koncentrációban sem

gátolja teljesen az elektrontranszportot. A 22. ábrán bemutatott

abszorpcióváltozásokat PC esetében 100 µM, PG esetében 400 µM terbutrin

jelenlétében mértük. Vizes oldatban a terbutrin oldhatóságának felsı határa 400

µM. Azt hogy ennek a csökkent gátlásnak mi lehet az oka jelenleg nem tudjuk.

További vizsgálat tárgyát képezheti, hogy ez egyszerően csak oldhatósági

kérdés, a vizes és lipidfázis közötti megoszlás kérdése, vagy a RC-szerkezet PG

környezetbeni megváltozásának tulajdonítható.

A 3. táblázatban összefoglaltuk az egyes komponensekhez (LDAO

detergens, PC és PG vezikuláris rendszer) tartozó, 603 nm-nél mért kinetikai

paramétereket. Ebben az idıtartományban csak a P+QA- → PQA és P+QB

- → PQB

töltésrekombinációs folyamatokhoz rendelhetı abszorpcióváltozás-komponensek

láthatók, amelyek lényegében megegyeznek a 15. ábrán bemutatottakkal.

Kristályszerkezeti adatok igazolják, hogy a fotoszintetikus RC-hoz

különbözı nem redoxaktív kofaktorok így lipidek is kapcsolódnak (McAuley és

mtsai., 1999;Wakeham és mtsai., 2001;Camara-Artigas és mtsai., 2002).

55

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

-0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Idı (s)

Ab

szo

rbció

vált

ozás (

rel.

)

PC -

PG -

PC +

PG +

0

22. ábra Rb. sphaeroides R-26–ból nyert, PC és PG vezikulákba ágyazott RC-ok fény indukált abszorpcióváltozása 603 nm-nél, terbutrin jelenlétében (+), illetve anélkül (-). A folyamatos vonalak a számolt görbéket mutatják. A mérési feltételek megegyeznek a 18. ábra szövegében leírtakkal, kivéve: a PC illetve PG liposzómákhoz 100 µM illetve 400 µM terbutrint adtunk. 603-nm-nél a primer donor redoxállapotát figyelhetjük meg. Mivel ezen a hullámhosszon a RC extinkciós koefficiense negatív, a görbéket a jobb áttekinthetıség miatt ellentétes elıjellel ábrázoltam.

3. táblázat A Rb. sphaeroides R-26-ból izolált RC-ok 603 nm-nél mért fényindukált abszorpcióváltozásának kinetikai paraméterei az LDAO detergens, PC és PG liposzóma rendszerekben. Feltüntettem a kinetikai paraméterekbıl számolt töltésstabilizációs energiaértékeket is.

N01(%) k1(s

-1) N02(%) k2(s

-1) ∆G0

(meV)

LDAO 93.1 0.90 6.9 10.0 -60.2

LDAO+terb.

5.0 0.90 95.0 10.0

PC 98.0 0.38 2.0 8.3 -76.9

PC+cyt. 40.3 0.49 1.1 8.3

PC+terb. 12.1 1.33 83.4 8.3

PG 71.0 0.13 29.0 4.0 -88.5

PG+cyt. 41.6 0.12 21.0 3.7

PG+terb. 30.0 0.12 66.0 6.25

N01(%) k1(s

-1) N02(%) k2(s

-1) ∆G0

(meV)

LDAO 93.1 0.90 6.9 10.0 -60.2

LDAO+terb.

5.0 0.90 95.0 10.0

PC 98.0 0.38 2.0 8.3 -76.9

PC+cyt. 40.3 0.49 1.1 8.3

PC+terb. 12.1 1.33 83.4 8.3

PG 71.0 0.13 29.0 4.0 -88.5

PG+cyt. 41.6 0.12 21.0 3.7

PG+terb. 30.0 0.12 66.0 6.25

kBP -1

kAP -1

56

A 23. ábrán az általam is vizsgált PC és CL helyzetét mutatom be a

kristályszerkezeti adatok alapján. A PG-ra vonatkozóan nincsenek

kristályszerkezeti adatok, de a funkcionális vizsgálatok alapján

valószínősíthetjük, hogy a RC kinonakceptor komplexéhez közel helyezkedhet

el. Kötıdése a CL kötıdéséhez hasonló módon történhet. Foszfátcsoportjai a RC

pozitív potenciálú felszíneihez kötıdhetnek, míg az apoláros szénhidrogénlánc a

membrán apoláros régiójába merül. Kísérleti tény, hogy az izolált

reakciócentrumhoz adott CL megváltoztatja mind a QA, mind pedig a QB

középponti redoxpotenciálját. Ez pedig vagy azzal magyarázható, hogy a CL

kötıhelye a preparálás után nem telített (vagyis maradnak szabad kötıhelyek),

vagy azzal, hogy egyéb, a kristályszerkezetben nem látható, ezért feltehetıen

gyengébb (vagy nem olyan jól definiált) kötıhelyei is léteznek. A PG esetében

hasonló jelenségekre gondolhatunk, igaz a kristályszerkezetekben eddig még

nem mutatták ki. A 23. ábrán az is látható, hogy a CL és a PC a RC nagyjából

ellentétes oldalain található, egymástól elég távol, a felszínhez kötıdve.

57

CLPC

CLPC

23. ábra A PC és a CL helyzete a Rb. sphareoides R-26 RC-ában a kristályszerkezeti kép alapján. Ebben az ábrázolásban a különbözı színek jelentése a következı: fehér - hidrogén, világoskék – szén, piros – oxigén, sötétkék – nitrogén. Zöld színnel a PC- és CL-molekulákat jelöltem. Az ábrát HyperChem 7.0 programmal készítettük a brookhaveni Protein Data Bank-ból (www.rcsb.org) letöltött fájl alapján. A fájl kódja: (1M3X).

A PC környezetének lehetséges kölcsönhatásait mutatom be a 24. ábrán. Az ábra

a fehérje QB-környezetének hidrogénkötésrendszerét mutatja be vázlatosan.

Kékkel az L-alegység D (transzmembrán) és a membránnal párhuzamos hélixei

közötti, pirossal az M-alegység N-terminusához közeli nem-hélix szekvenciáját

mutatom be. A hélixek közötti kölcsönhatások között a H-kötések gyakorlatilag

nem jöhetnek számításba, annál fontosabbak viszont a nem-helikális szakaszok

esetében. Ezek a szakaszok azonban igen érzékenyek a környezeti tényezık

megváltozására. A kiterjedt hidrogénkötésrendszer pedig azt eredményezi, hogy a

rendszer bármely pontján bekövetkezı változás hatására az egész

hidrogénkötésrendszer megváltozik. Mivel a hidrogénkötésrendszer a QB-t és a QA-

t is egységes kinonakceptor komplex-szé formálja (a környezı aminosavakkal

együtt), akár a QA, akár a QB környezetében történik változás, az kihat a másik

rendszerre is.

58

H2O1045

PCO31

OValL220

N

4.12

GlyL221O

TyrL222O

OGSerL223O N

IleL224N

LeuL219

AspL218OD2

NH2ArgL217 PheL215

O2UQ10

3.413.62

2,71

AspL213OD1

2.52H2O1118

3.2

OPheL216

3.38 3.29

NGlyM48

2.76

ProM49O

2.882.91

LeuM47 O667GlnM46

H2O1111

2.67

side chain peptide-O Peptide-N

2.89

2.67

H2O1045

PCO31

OValL220

N

4.12

GlyL221O

TyrL222O

OGSerL223O N

IleL224N

LeuL219

AspL218OD2

NH2ArgL217 PheL215

O2UQ10

3.413.62

2,71

AspL213OD1

2.52H2O1118

3.2

OPheL216

3.38 3.29

NGlyM48

2.76

ProM49O

2.882.91

LeuM47 O667GlnM46

H2O1111

2.67

side chain peptide-O Peptide-N

2.89

2.67

H2O1045

PCO31

OValL220

N

4.12

GlyL221O

TyrL222O

OGSerL223O N

IleL224N

LeuL219

AspL218OD2

NH2ArgL217 PheL215

O2UQ10

3.413.62

2,71

AspL213OD1

2.52H2O1118

3.2

OPheL216

3.38 3.29

NGlyM48

2.76

ProM49O

2.882.91

LeuM47 O667GlnM46

H2O1111

2.67

side chain peptide-O Peptide-N

2.89

2.67

24. ábra A QB-oldal és a PC körüli aminosavak közötti kölcsönhatások lehetséges rendszere a Rb. sphaeroides R-26 RC-ában. Pirossal az L-, kékkel az M-alegység megfelelı szekvenciáját jelöltem. Folytonos vonallal a kovalens (peptid-) kötéseket, szaggatott vonallal a hidrogénkötéseket mutatom be. Az ábrát HyperChem 7.0 programmal készítettük a PDB 1M3X fájl alapján.

A PC kötıdésére vonatkazóan rendelkezésünkre állnak kristályszerkezeti

adatok (PDB, www.rcsb.org, 1M3X), így a kölcsönhatások rendszere viszonylag

jól jellemezhetı. A PC igen közel helyezkedik el az L-alegység L220-as

pozícióban levı valinhoz, amely része lehet az itt említett kiterjedt

hidrogénkötésrendszernek. A PG esetében nincsenek ilyen adataink, de a

spektroszkópiai adatok alapján valószínősíthetı, hogy az is a kinonakceptor

komplex közelében kötıdhet a RC felszínéhez.

59

5.3. A töltésstabilizálódás termodinamikai

jellemzése

A kinonállapotok közötti standard szabadentalpiakülönbségek

meghatározhatók az egyensúlyi állandó hımérséklet függésének van't Hoff

típusú ábrázolása meredekségébıl:

(3)

Az interkinon elektrontranszporthoz tartozó aktivációs termodinamikai

paraméterek meghatározhatók az Eyring egyenletbıl:

(4)

ahol a k a meghatározott sebességi állandó, κ az átviteli együttható (a mi

esetünkben általában egynek tekintjük (Mancino és mtsai., 1984)), h a Planck

állandó, R az egyetemes gázállandó és ∆H# és ∆S# az aktivációs entalpia és

entrópia változások. ∆H# kiszámolható a meredekségbıl, a ∆S# meghatározható

a mért adatokra legjobban illeszkedı egyenesbıl.

A 25. ábra az LDAO detergensbe, PC, PG valamint PC/CL (1:1 mólarány)

liposzómába ágyazott Rb. sphaeroides RC-ok 771 nm-en mért

abszorpcióváltozását mutatja a hımérséklet függvényében. Ezen a

hullámhosszon a BPheo abszorpcióváltozásának elektrokróm eltolódását

mérhetjük, amit a kromofór fehérjekörnyezetében bekövetkezı töltéskompenzáló

proteinrelaxációs folyamatok okoznak (Tiede és mtsai., 1996). Az idıablak

nagyon széles (6 nagyságrend), így mind az elıremenı P+QA-QB → P+QAQB

-

elektrontranszfer (illetve a hozzákapcsolódó relaxációs folyamatok), mind pedig

a P+(QAQB)- → PQAQB töltésrekombináció követhetı egyetlen, logaritmikus

idıskálán. Mindegyik görbe két jól elkülöníthetı kinetikai komponensre

bontható. Az elsı szakasz a milliszekundumnál gyorsabb tartomány, az

elıremenı P+QA-QB → P+QAQB

- elektron transzferrel, a lassabb, 100 ms illetve

2

0)(lnRT

H

dT

Kd AB ∆=

TR

H

R

S

h

R

T

k 1lnln

##

⋅∆

−∆

+⋅

=κ

60

szekundumos tartomány a P+(QAQB)- → PQAQB töltésrekombinációval hozható

kapcsolatba.

Az elıremenı elektrontranszfer amplitúdója mindegyik minta esetében

független volt a hımérséklettıl, a kísérleti hibák határain belül maradt. Ez azt

jelzi, hogy a membránkörnyezet nem változtatja meg sem a QA/QA- sem a QB/QB

-

redoxkomponensek extinkciós koefficiensét egyik hımérsékleten sem. Egyúttal

azt is mutatja, hogy az elıremenı P+QA-QB → P+QAQB

- elektrontranszfer

gyakorlatilag teljes mértékben végbemegy mindegyik mintában, mindegyik

hımérsékleten. Más szóval a QA- teljes mennyisége oxidálódik a

fehérjekörnyezettıl függetlenül.

Mind az elıremenı elektrontranszfer, mind pedig a töltésrekombináció

sebessége növekedett a hımérséklet növekedésével, mindegyik mintában. A

P+QA-QB → PQAQB töltésrekombináció LDAO detergensben jól modellezhetı

volt, ha a sebességi állandót konstans (8 s-1) értéken tartottuk. Ugyanez a PC

esetében minimális hımérsékletfüggést mutatott, megállapításaink szerint

azonban nem ment túl a kísérleti hibák határain (szintén 8 s-1). Nagyobb volt a

változás a PG illetve PC/CL mintában. PG-ben az 5 oC-on mért 4,3 s-1–ról

6,6 s-1-ra nıtt a sebessége szobahımérsékleten. A PC-t és CL-t 1:1 arányban

tartalmazó proteoliposzomákban a P+QA-QB → PQAQB töltésrekombináció

sebessége lényegében a PC-ben mért értékhez hasonló nagyságú és

hımérsékletfüggéső volt. Megjegyzendı, hogy a PG/RC rendszerek optikai

tulajdonságai sokkal rosszabbak voltak, mint a többi rendszeréi. Különösen a

szubmilliszekundumos tartományban volt kicsi a jel/zaj viszony.

61

25. ábra Detergensbe, PC, CL hozzáadásával preparált PC, illetve PG liposzómába ágyazott Rb. sphaeroides RC-ok abszorpcióváltozása 771 nm-en a hımérséklet függvényében. A vékony vonalak a legjobb illesztést szemléltetik (a megfelelı kinetikai paramétereket ld. 4. táblázat). Mérési körülmények: 3 µM RC, 10 mM TRIS, 100 mM NaCl, 0.01% LDAO, pH 8.0 (LDAO) és 5 mM foszfát, 5 mM KCl, pH 6.8 (PC és PG liposzómák).

62

4. táblázat A Rb. sphaeroides R-26 törzsébıl izolált RC egyes elektrontranszfer lépéseinek sebességi állandói különbözı hımérsékleteken LDAO detergens, illetve PC, PG, PC:CL (1:1) liposzómában. Az egyes elektrontranszfer-lépéseket a megfelelı sebességi állandójukkal jelöltem. A multiexponenciális analíziseket a Table Curve (Jandel Scientific) programmal végeztem.

LDAO PC

T (K) kAB(1)gyors (s-1)

kAB(1)lassú (s-1)

kAP (s-1) kBP (s-1)

T (K) kAB(1)gyors

(s-1) kAB(1)lassú

(s-1) kAP (s-1) kBP (s-1)

278 25974 5155 0,991 278 11198 1031 0,301 283 9881 3883 0,968 283 13394 1714 0,316 288 13605 3187 0,924 288 16369 2584 0,327 293 7692 2448 0,873 293 18900 3427 0,346 298 10753 2404 0,880 298 22573 4398 0,367 303 6369 1031 0,836 303 32446 6289 0,390 308 6807 792 0,789 308 10684 0,429 313 313 13245 0,466

PC+CL PG

T (K) kAB(1)gyors (s-1)

kAB(1)lassú (s-1)

kAP (s-1) kBP (s-1)

T (K) kAB(1)gyors

(s-1) kAB(1)lassú

(s-1) kAP (s-1) kBP (s-1)

278 12534 1703 7,95 0,183 278 10870 1000 4,36 0,162 283 14281 1844 8,26 0,186 283 11364 913 4,48 0,163 288 15358 2361 8,33 0,196 288 12346 919 4,64 0,166 293 16730 3256 8,36 0,201 293 11227 934 5,10 0,168 298 17845 3557 8,62 0,213 298 12821 942 5,35 0,181 303 20312 4308 8,93 0,226 303 21612 944 5,62 0,184 308 24436 4390 9,71 0,252 308 22226 862 5,78 0,223 313 22852 4504 10.0 0,269 313 22222 950 6,58 0,272

63

A 25. ábrán bemutatott mérési eredmények kiértékelése során (ld 5. táblázat)

meghatározható az egyes komponensek idıállandóinak (és az ezekbıl

származtatható sebességi állandóknak: kAB(1)gyors, kAB(1)lassú, kAP, kBP)

hımérsékletfüggése és ábrázolhatóak az ln(k/T) értékek az 1/T függvényében (26.

ábra). Ebben az ún. Eyring-féle ábrázolásban kiszámolhatjuk az egyes

elektrontranszfer-lépések aktiválási szabadentalpia-értékeit, valamint azok entalpia-

illetve entrópiahozzájárulásait. Más szóval, meghatározhatjuk azt, hogy az egyes

folyamatokat a szabadentalpia, vagy az entrópia megváltozása irányítja-e. A legtöbb

esetben a hımérsékletfüggés egyetlen egyenes komponenssel volt leírható.

A ∆H#, T∆S# és ∆G# paramétereket a 27. ábra mutatja az általunk vizsgált és

kiszámolt értékeket (5. táblázat) különbözı rendszerekben. Az ábrákon a vízszintes

vonal a szobahımérsékletnek megfelelı 2,5 kJ/mol energiaszintet jelenti.

Amennyiben a kapott energiaérték ettıl az értéktıl jelentısen eltér, az a folyamat

jelentıs aktiválási energiát igényel, tehát ez a folyamat lesz a sebességmeghatározó

lépés. Az LDAO és PC rendszerben a P+QA-QB → P+QAQB

- elektron transzfer

mindkét komponensének szabadentalpiaváltozása méréseink szerint jelentısen eltér

az R*T értéktıl, tehát ez entalpia által meghatározott folyamat. Ez a folyamat a

késleltetett lumineszcencia mérések alapján ugyancsak entalpia által vezérelt

folyamatnak mutatkozott. Mivel az LDAO és PC esetén a P+QA-QB → PQAQB

töltésrekombináció nem változott lényegesen a hımérséklettel, így erre a

komponensre nem határoztunk meg termodinamikai paramétereket. PG esetén

azonban jelentısebb hımérsékletfüggés volt tapasztalható, amelybıl az adódott,

hogy a folyamat nagyobb entrópiahozzájárulással rendelkezik. Általában

megállapíthatjuk, hogy az LDAO és PC kivételével mindegyik rendszerben jóval

nagyobb az entrópiaváltozás, mint a szabadentalpia megváltozása.

Érdekes, hogy az aktiválási szabadentalpia (∆G#) mindegyik rendszerben

ugyanakkora, vagyis független a fehérjekörnyezettıl.

64

LDAO

-8-6-4

-2024

6

0.0032 0.0033 0.0034 0.0035 0.0036 0.0037

1/T [1/K]

ln(k

/T)

k BP

k AB(1)gyors

k AB(1)lassú

PC

-8-6-4-20246

0.0031 0.0032 0.0033 0.0034 0.0035 0.0036 0.0037

1/T [1/K]

ln(k

/T)

k AB(1)gyors

k AB(1)lassú

k BP

LDAO

-8-6-4

-2024

6

0.0032 0.0033 0.0034 0.0035 0.0036 0.0037

1/T [1/K]

ln(k

/T)

k BP

k AB(1)gyors

k AB(1)lassú

PC+CL

-8-6

-4

-2

02

4

6

0.0030 0.0032 0.0034 0.0036 0.0038

1/T [1/K]

ln(k

/T)

k AB(1)gyors

k AB(1)lassú

k BP

26. ábra LDAO detergensbe, PC, PG valamint PC/CL (1:1 mólarány) liposzómába ágyazott Rb. sphaeroides RC-ok 771nm-nél mért abszorpcióváltozásának sebességi állandói különbözı hımérsékleten (Eyring-ábrázolás). A méréspontokat a 25. ábra mérésgörbéi alapján, a kihúzott egyeneseket az Eyring-model alapján (lásd szövegben) számoltam.

65

27. ábra A Rb. sphaeroides R-26 törzsébıl izolált RC egyes elektrontranszfer lépéseinek aktiválási entalpia (fent), entrópia (középen) és szabadentalpia (lent) értékei LDAO detergens, illetve PC, PG, PC:CL (1:1) liposzómákban. Az egyes elektrontranszfer lépéseket sebességi állandójukkal jelöltem. A vastag vonal az R*T (szobahımérsékletnek megfelelı 2,5 kJ/mol) aktiválási energiát jelöli mindhárom ábrán (lásd. 5. táblázat).

T

∆∆ ∆∆S#

(kJ/

mol

)

-80

-60

-40

-20

0

k AB (1) gyors

k AB (1) lassú

k AP

k BP

LDAO PC PG PC+CL

∆∆ ∆∆H

# (k

J/m

ol)

-10 0

10 20 30 40 50 60

k AB (1) gyors

k AB (1) lassú

k AP

k

LDAO PC

PG PC+CL

∆∆ ∆∆H

# (k

J/m

ol)

-10 0

10 20 30 40 50 60

k AB (1) gyors

k AB (1) lassú

k AP

k

LDAO PC

PG PC+CL

66

LDAO PC PG PC+CL

∆H#(kAB(1)gyors)

(kJ/mol) 28.7 25.634 14.9 11.0

∆H#(kAB(1)lassú)

(kJ/mol) 51.9 49.15 -3.4 27.4

∆H#(kAP) (kJ/mol) 5.7 2.1

∆H#(kBP) (kJ/mol) 3.9 6.417 7.0 8.968

T∆S#(kAB(1)gyors)

(kJ/mol) -20.6 -28.0 -34.1 -37.6

T∆S#(kAB(1)lassú)

(kJ/mol) -0.6 -8.5 -59.5 -42.00

T∆S#(kAP) (kJ/mol) -63.1 -65.48

T∆S#(kBP) (kJ/mol) -69.2 -74.7 -70.0 -67.86

∆G#(kAB(1)gyors)

(kJ/mol) 49.3 53.7 49.0 48.6

∆G#(kAB(1)lassú)

(kJ/mol) 52.5 57.6 56.1 53

∆G#(kAP) (kJ/mol) 68.8 67.6

∆G#(kBP) (kJ/mol) 73.1 81.1 77.0 76.5

5. táblázat A Rb. sphaeroides R-26 törzsébıl izolált RC egyes elektrontranszfer lépéseinek aktiválási entalpia (∆H#), entrópia (T∆S#) és szabadentalpia (∆G#) értékei LDAO detergens, illetve PC, PG, PC:CL (1:1) liposzómákban. Az egyes elektrontranszfer-lépéseket a megfelelı sebességi állandójukkal jelöltem. A paramétereket az abszorpciókinetikai vizsgálatokból származó adatok (5. táblázat) exponenciális analízisét követı Eyring-féle ábrázolás útján kaptuk.

67

5.4. Fényindukált transzmembrán pH-változások

fotoszintetikus reakciócentrum/lipoproteid

vezikulákban

Szükséges volt annak ellenırzése, hogy a pH-változás kimutatásához

használni kívánt jelzımolekula befolyásolja-e a RC-on belüli töltésszétválasztást.

Ebbıl a célból ellenıriztük a RC fényindukált abszorpcióváltozását 430 nm-nél

piranin jelenlétében. Mint azt a 28. ábra mutatja, a piranin a pH-méréseknél

alkalmazottnál jóval nagyobb koncentrációban is csak kis mértékben

befolyásolja az elektrontranszportot. Tehát ez a jelzımolekula ebbıl a

szempontból megfelel a céljainknak. További méréseinknél mindössze 50 µM

koncentrációban használtuk a piranint, így az elektrontranszportra gyakorolt

hatásától gyakorlatilag nem kell tartanunk.

28. ábra A fotoszintetikus RC fényindukált abszorpcióváltozása piranin nélkül és jelenlétében LDAO detergensmicellákban. Mérési körülmények: mint a 15. ábránál; hullámhossz: 430 nm. A piranin koncentrációja 10 mM volt.

-0.1

0.1

0.3

0.5

0.7

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

Idı (sec.)

Abs

zprp

ció

vált

ozás

(re

l.)

kontroll

+10 mM pyranin

68

5.4.1. A piranin spektroszkópiai jellemzése

A piranin pH indikátor festék (sav-bázis indikátor), ionos alakja más

szerkezető, mint a nem disszociált alakja. Ezt mutatják az abszorpciós

spektrumon jól látható csúcsok 405 és 454 nm-nél (29. ábra). A pH

növekedésével a 405 nm-nél látható csúcs abszorpciója csökken, míg a 454 nm-

nél mérhetı csúcs értéke növekszik. 417 nm-nél az abszorpcióváltozásnak

izoszbesztikus pontja van.

Ha az abszorpciós maximumokhoz tartozó

(5)

értékeket (450 nm-nél), illetve az

(6)

értékeket (405 nm-nél) ábrázoljuk a pH függvényében, akkor jellegzetes, a

Henderson-Hasselbach modellre jól illeszkedı lefutású görbéket kapunk (30.

ábra). A méréspontokra a Henderson-Hasselbach egyenletet (lásd késıbb)

illesztve meghatározhatjuk a festék indikátorexponensét (pK átcsapási pontját).

Az indikátor átcsapási pontja az a pont, amelynél a disszociált és

disszociálatlan alakja egyenlı koncentrációban van jelen. Ábrázoltuk a két

abszorpciós csúcs pH függését, aminek segítségével a pK, azaz a disszociációs

állandó negatív logaritmusa meghatározható. Ha az indikátor gyenge sav, a

disszociációs egyensúlyra és a K disszociációs állandóra a következık írhatók

fel:

(7)

(8)

HAA

HAmért

EE

EE

−

−

−

HAA

HAmért

EE

EE

−

−−

−

1

+− +↔ HAHA

[ ][ ][ ]HA

AHK

−+

=

69

29. ábra: Piranin abszorpciós spektrumának pH-függése a spektrum látható tartómányában. A nyíl a pH növekedésének irányát jelöli.

30. ábra A piranin vizes, pufferelt közegben, 454 és 405 nm-nél mért relatív abszorpciója a pH függvényeben. Az abszorpciót az (Emért-EHA)/(EA

--EHA) (454 nm-nél) és az 1-(Emért-EHA)/(EA

--EHA) (405 nm-nél) összefüggés alapján normáltuk. Emért: az aktuális abszorpció az adott pH-n; EHA: a teljesen protonált (savas) forma abszorpciója alacsony pH-n; EA

-: a teljesen deprotonált (bázikus forma) abszorpciója magas pH-n.

0

5

10

15

20

25

30

300 350 400 450 500

Hullámhosssz (nm)

εε εε( λλ λλ

) (m

M-1

cm-1

)

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

4 5 6 7 8 9 10pH

Ab

szor

pci

ó (r

el.) 405 nm 454 nm

7,48

70

(9)

Ha a (8) egyenlet negatív logaritmusát vesszük és átrendezzük,

megkapjuk a Henderson-Hasselbach egyenletet.

(10)

(11)

Mivel az átcsapási pontban a savas és bázikus forma koncentrációja

azonos az ekkor mérhetı pH a pK-t adja. Ez ábránkról leolvasható: pK=7,48

Irodalmi adatok szerint a piranin sokkal érzékenyebben meghatározható a

fluoreszcencia mérésével, mivel fluoreszcenciahatásfoka igen nagy. Mivel

távolabbi célunk az, hogy meghatározzuk biológiai rendszerekben az intermedier

anyagcsere következtében bekövetkezı pH-változást, felvettük a piranin

emissziós és gerjesztési fluoreszcenciaspektrumát különbözı pH-értékeken. A

31. ábra egy ilyen mérés eredményét mutatja. A pH növekedésével, tehát az

oldat lúgosodásával, az 510 nm-nél mérhetı emisszió növekszik, ha a gerjesztést

465 nm-nél végezzük. A gerjesztési színképben tehát a 465 nm-nél a pH

növekedésével növekvı fluoreszcenciaintenzitást, 410 nm-nél csökkenı

intenzitást láthatunk. Mint ahogyan azt az abszorpciós színkép kiértékelésénél is

tettük, itt is ábrázoltuk a jellegzetes csúcsok normált intenzitását a pH

függvényében (32. ábra). Ebben az ábrázolásmódban is meghatározhatjuk a pK

értéket, amely igen jó közelítéssel az abszorpcióváltozásból meghatározottal volt

egyenlı. Ebben a vizsgálatban pH=7,45-nek adódott.

[ ] [ ]( )HAA

A

EE

EE

HAA

HAmért

+=

−

−−

−

−

[ ] [ ][ ]−

+ −−=−A

HAKH logloglog

[ ][ ]−

−=A

HApKpH log

71

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

4 5 6 7 8 9 10pH

I Fl (

re.)

465 nm410 nm

7,45

31. ábra A piranin vizes pufferes oldatának fluoreszcencia gerjesztési (baloldali görbék) és emissziós spektrumainak (jobboldali görbék) pH-tól való függése. A méréseket az „Anyagok és módszerek” fejezetben leírtak szerint végeztük. A nyíl a pH növekedésének az irányát mutatja.

32. ábra A piranin vizes, pufferelt közegben, 465 és 410 nm-nél mért relatív gerjesztési fluoreszcenciaintenzitása a pH függvényében. A fluoreszcenciaintenzitásokat az (Emért-EHA)/(EA

--EHA) (465 nm-nél) és az 1-(Emért-EHA)/(EA--EHA) (410 nm-nél) összefüggés

alapján normáltam. Emért: az aktuális fluoreszcenciaintenzitás az adott pH-n; EHA: a teljesen protonált (savas) forma fluoreszcenciaintenzitása alacsony pH-n; EA

-: a teljesen deprotonált (bázikus forma) fluoreszcenciaintenzitása magas pH-n. A fluoreszcenciát 510 nm-nél mértem.

72

Adott koncentráció és adott pH esetén maguk az intenzitásértékek

informatívak lehetnek, de a biológiai rendszerben a pH változását jobban

nyomon követhetjük a 410 és 465 nm-nél levı gerjesztési maximumok

arányának változásával. Az adott rendszerben ugyanis nem tudjuk, hogy a

fluoreszcenciaintenzitás változása egyedül a protonkoncentráció megváltozása

miatt történt-e. A pH két hullámhosszon egyidıben történı nyomonkövetése a

fluoreszcencia pH-val való antiparalell változása miatt csábító lehetıség. Steady

state mérések esetében, amikor a spektrumok felvétele lehetséges, ez a módszer

alkalmazható. Készítettünk is kalibrációt a pH meghatározására, a 465/410 nm

csúcsarány „belsı sztenderdként” való alkalmazására (33. ábra). Kinetikai

méréseknél azonban két tényezı is nehezíti a vizsgálatot. Az egyik az, hogy

ezeken a hullámhosszakon spektrális átfedések vannak a feofitinek, a citokróm

és egyéb RC-ban található kofaktorok Soret-sávjai között. Ezek közül a citokróm

különösen jelentıs, hiszen ennek abszorpciója változik a fotociklus során. A

másik ok egyszerő technikai. Az általunk is használt Perkin-Elmer

spektrofluorimeterrel nem lehet két hullámhosszon egyszerre gerjesztést

alkalmazni.

73

33. ábra A piranin 465 és 410 nm-nél gerjesztésnél mért fluoreszcenciájának aránya vizes, pufferelt közegben. A fluoreszcenciaintenzitásokat a 32 ábrán bemutatott gerjesztési spektrumokból vettem.

5.4.2. A lipoproteid vezikulák protonáteresztı-

képessége

Kísérleteink fı célja az volt, hogy megmérjük a liposzómába ágyazott RC

fotokémiája által létrehozott transzmembrán pH-gradiens kiépülésének

kinetikáját, becslést adjunk annak nagyságára, és ha lehetıség van rá,

meghatározzuk a protonmozgató erı (pmf) egyes komponenseinek részarányát.

Ehhez elıször a RC nélküli liposzómák protonáteresztıképességét kellett

megvizsgálnunk. Elképzeléseink és korábbi tapasztalataink szerint egy telített,

illetve telítetlen zsírsavláncot is tartalmazó lipid áll legközelebb az in vivo

membránhoz, ezért kísérleteinkhez a 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-

Phosphocholin-t (POPC) választottuk.

Korábbi tapasztalatunk az volt, hogy a liposzóma frakció minısége

függött attól, hogy milyen detergensféleséget használtunk a lipid feloldásakor, a

liposzómapreparálás során így kétféle detergenssel is próbálkoztunk: nátrium-

74

koláttal (Ch) és oktilglükoziddal (OG). Azt is tapasztaltuk (amint irodalmi

adatok alapján várható volt), hogy a piranin a negatív töltései révén erısen

kötıdik a PC liposzóma pozitív felületi töltéseihez. Ennek elkerülésére

PC:Col:PG = 5:1:1 tömegarányban kevert koleszterinnel (Col) és PG-lal együtt

szárítottuk az eppendorf csı falára a lipidfrakciót. Irodalmi adatok vannak arra is,

hogy a koleszterin csökkenti a protonvezetıképességet, ezért a késıbbiekben ezt

a vegyületet is hozzáadtuk a frakcióhoz. A pH-ugrást KOH hozzáadásával értük

el, a liposzóma integritását a mérés végén hozzáadott detergenssel, TX-100-zal

ellenıriztük. A KOH koncentrációját célszerően úgy választottuk meg, hogy a

kezdeti pH=7.2, egy pH-egységet változzon. Így a pH-változás a piranin pK-ja

(pK=7.4) körüli nagyjából lineáris tartományban történt.

Eredményeinket a 34. ábra szemlélteti. KOH hozzáadására a piranin

fluoreszcenciája hirtelen növekedett, majd egy tranziens fázison át egyensúlyi

állapotot ért el. A kezdeti fluoreszcencianövekedés kis részben származhat a még

mindig a felszínhez kötött piranintól, valamint attól, hogy a hozzáadott OH--

ionok hatására protonok szabadultak ki a liposzóma belsı terébıl (és/vagy az

OH--ionok diffundáltak befelé). Ez a diffúzió az egyszerő PC-liposzómák

esetében volt a legnagyobb. Col minden esetben növelte a liposzómák

protonokkal szembeni záródását. Várakozásunknak megfelelıen az OG-dal

készített liposzómák mutattak nagyobb zártságot, ezért a következıkben ezzel a

detergenssel készítettük a liposzómát. Az egyensúlyban adott TX-100 tovább

növelte a fluoreszcenciát, ami arra utalt, hogy a TX-100 hozzáadása elıtti

állapotban a piranin a zárt liposzómák belsejében jelezte a pH-változást, amit a

detergens szétroncsolt.

75

34. ábra A POPC, PG, és Col alapú Ch vagy OG detergensben oldott liposzómákba zárt piranin fluoreszcenciájának idıbeli lefutása. A KOH hozzáadását a külsı térben 1 pH egységnyi ugrás a TX-100 hozzáadását a liposzómák szétesése követi. A függıleges tengelyen a piranin maximális fluoreszcencia értékére kalibrált számértékeket látjuk. λexc: 465 nm, λem: 510 nm.

A pH-változást három különbözı bázisféleséggel indukáltuk. A

legkézenfekvıbb a KOH volt, de alkalmaztuk a glicilglicint (gly-gly) is, amely

egy nagy negatív töltéső ionra disszociál, amely nem jut át a membránon, illetve

a Tris-HCl-lel, ami számára a membrán széles pH-tartományban szabadon

átjárható. A mennyiségeket minden esetben úgy választottuk meg, hogy a

külsıtartományban a pH 1 egységet változzon. A liposzómán belüli pH

megváltozása jól látható (35. ábra): KOH hozzáadásával a piranin

fluoreszcenciája, tehát a liposzómán belüli pH gyorsan követte a külsı pH

megváltozását. Gly-gly hozzáadásával a belsı pH csak alig emelkedett. Tris-HCl

hozzáadásával a pH meghatározott, jól mérhetı kinetikával növekszik,

valószínőleg a Tris membránon való átjutásának megfelelıen. A KOH vagy gly-

gly hozzáadása után a transzmembrán proton gradiens felépül, amelyet meg lehet

szüntetni TX-100 hozzáadásával, a liposzóma frakció széttördelésével.

Nehezebb megmagyarázni azt, hogy miért van hatással a

protonáteresztıképességre az, hogy milyen detergenssel készült a liposzóma.

Miért volna különbség a liposzóma permeabilitásában, ha más detergenst

76

használunk? A membrán alegységszerkezete azonban, különösen magasabb Col

koncentráció esetén, függhet attól, hogy milyen detergenssel történt a liposzóma

készítése. Az is elképzelhetı, hogy detergens-molekulák maradnak a

liposzómában, és azok akár nagyon csekély mennyiségben is növelhetik a

permeabilitást.

35. ábra A piranin fluoreszcenciájának idıbeli lefutása POPC/Col/PG (5:1:1) liposzómákban, amelyek OG detergenssel lettek szolubilizálva. KOH, TRIS (pK:8.1) vagy gly-gly (pK:3.4) (1 M, pH:8.0) és TX-100 (0.1%) hozzáadása után a bezárt piranin pH változása és a liposzómák szétesése látható. λexc: 465 nm, λem: 510 nm.

77

5.4.3. A proteoliposzóma áteresztıképessége RC

jelenlétében

Alkalmas rendszerben a zárt lipoproteid vezikulákba épített RC

fotociklusával ki lehet építeni a transzmembrán protongradienst. A fotociklushoz

biztosítani kell a megfelelı donor-akceptor rendszert. Donorként cyt c2-t,

akceptorként pedig decil-kinont használtunk. A fotociklus fennmaradásához, a

redoxegyensúly megtartásához K4[Fe(CN)6]-t adtunk a rendszerhez, ami

visszaredukálta a keletkezett oxidált citokrómot, így az újra alkalmas lett a

fotociklusban való résztvételre. Ezekben a kísérletekben foszfatidil-inozitolt (PI)

használtunk a PG helyett, ami szintén negatív töltéső lipid, így a PG-t

helyettesítheti.

Eredményeinket a 36. ábra szemlélteti. Az ábrán a nyilak a fény be-

illetve kikapcsolásának az idıpontját mutatják. Látható, hogy a fotociklust

követı pH-változás csak akkor következik be, ha a fotociklus záródik, decil-

kinon hozzáadásával. Maximális pH-növekedés azonban csak akkor érhetı el, ha

a liposzómát szétroncsoljuk, és gyakorlatilag kompartmentek nélküli

szuszpenzióban mérjük a fluoreszcenciaváltozást.

Összegezve, megállapíthatjuk, hogy sikerült fényindukált pH-változást

kimutatnunk a RC proteoliposzómarendszer fotociklusa során.

Ennek optimális feltételei közé tartoznak:

a) a palmitoil-, illetve oleilcsoportok fontosak lehetnek a membrán megfelelı

fizikai/kémiai állapotának, mikroviszkozitásának fenntartásához;

b) a koleszterin is fontos a fizikai/kémiai állapot meghatározásában, nagy

mértékben befolyásolhatja a víztartalmat, a protonáteresztı-

képességet;

c) a piranin membránfelszínhez való kötıdését meg kell akadályozni

anionikus lipid (PG vagy PI) hozzáadásával;

78

d) a lipid szolubilizálásához célszerőbb oktilglükozid detergenst használni,

mint koleszterint.

36.ábra A piranin fluoreszcenciájának idıbeli lefutása látható POPC/koleszterin/PG (5:5:1 molekula arány) liposzómákban, amelyek OG detergenssel lettek szolubilizálva, majd RC (0.2 µM) hozzáadása következett. “A” részben: 2 µM cyt c2+ és 1.5 mM K4[Fe(CN)6] hozzáadásával elindult a fotociklus. “B” részben: 100 µM decylquinone-t, a “C” részben: TX-100 adtunk a mintához. λexc: 465 nm, λem: 510 nm. A nyilak a folytonos fény be (on) és kikapcsolását (off) jelzik.

79

5.5. A fotoszintetikus RC és szén nanocsövek közötti kölcsönhatás

5.5.1. A szén nanocsı környezet hatása a RC-on belüli

töltésstabilizálódásra

Mintegy 30 éve ismert, hogy ha a fotoszintetikus RC-ot üveglapra

szárítjuk, akár detergenst is tartalmazó filmmel együtt (Clayton, 1978), vagy

trehalóz gélben (Palazzo és mtsai., 2000), hasonlóképpen a szuszpenzióban levı

mintához fotokémiai aktivitást mérhetünk, amit a fényindukált

abszorpcióváltozás is mutat. Fényindukált abszorpcióváltozást akkor is

mérhetünk, ha a RC-fehérjét az egyfalú szén nanocsıvel (SWNT-vel) együtt

szárítjuk az üveglapra. Az egyetlen telítési fényimpulzus után mért

abszorpcióváltozás mind 430, mind 860 nm-nél jellegzetes, kétfázisú kinetikát

mutat. A 37. ábra felsı részén látható a RC abszorpcióváltozás kinetikája 860

nm-nél egyszeri telítési fény hatására LDAO szuszpenzióban, detergenssel és

detergens nélkül üveglapra szárított mintákon. A mérési adatokat exponenciális

illesztéssel analizáltuk (lásd „Anyagok és módszerek” fejezetben).

860 nm-nél a (BChl)2 elsıdleges elektron donor redox állapota látható.

Az LDAO detergens oldatban a gyors komponens idıállandója kAP = 8,3 s-1, a

lassú komponensé kBP = 0,87 s-1, amely a teljes lecsengés kb. 95 %-a jelezve a

lassú töltésrekombinációt a P+ és QB – között. Üveglapra szárítás után detergens

jelenlétében, a lassú komponens részaránya jelentıs mértékben (10% alá)

csökkent, és a sebességi állandója is növekedett (1,15 s-1-re). Ha a detergenst

kidializáltuk leszárítás elıtt, a gyors fázis 36%-át tette ki a teljes amplitudónak,

és a csökkenı lassú fázis sebességi állandója a detergens nélküli kBP = 0,87 s-1

értékrıl detergensbeni kBP = 0,44 s-1 értékre változott. Amikor a RC-kat SWNT-

hez kötöttük és üveglapra szárítottuk, a minta aktivitása néhány hétig

megmaradt. Közvetlenül a preparálás után a lassú komponens értéke kBP=0.37 s-1

, mintegy 50%-a a teljes jelnek (6. táblázat). Érdemes azt megfigyelni, hogy a

detergens nélküli leszárított RC töltésrekombinációjának kinetikája (kBP=0.44 s-1)

80

nem különbözik lényegesen a nanocsöves mintáétól (kBP = 0.37 s-1) de az utóbbi

mintában a lassú komponens részaránya mintegy 20%-kal kisebb. Hasonló

kinetikát figyelhetünk meg 430 nm-en (37. ábra, alsó panel). Tehát a lassú

komponens részaránya a leszárítás után drasztikusan lecsökkent (30%-ra). Ez a

komponens teljesen eltőnt 24 órás várakozás után. A NT-kel együtt leszárított

RC-ok lassú fázisának idıállandója gyakorlatilag nem változott egy hét alatt (kBP

= 0.23 s-1) és a részarányuk is alig változott (60 %-ról 52 %-ra).

81

37. ábra Rb. sphaeroides R-26 RC-ok fény indukált abszorpcióváltozása 430 nm-nél (alul) és 860 nm-nél (felül) különbözı körülmények között. (a) RC LDAO detergens micellákban; (b) RC detergens nélkül boroszilikát üveglapra szárítva közvetlenül a leülepedés után; (c) RC LDAO detergenssel boroszilikát üveglapra szárítva közvetlenül leülepedés után. A kinetikai paramétereket a 6. táblázatban tüntettem fel.

82

860 nm 430 nm

A1(%) kBP(s-1) A2 (rel.) kAP(s-1) A1(%) kBP(s-1) A2 (%) kAP(s-1)

RC_susp 95.0 0.87 5.0 8.30 87.0 0.67 13.0 8.3

RC_driedLDAO_0_day 8.0 1.15 92.0 9.66 34.0 0.39 66.0 8.3

RC_driedLDAO_1_day - - - - 3.0 0.52 97.0 8.3

RC_driedNodet_0_day 64.0 0.44 36.0 8.00 51.0 0.41 49.0 8.00

SWNTRC_0_day 43.0 0.37 57.0 6.13 59.0 0.23 41.0 4.7

SWNTRC_1_week 33.0 0.37 67.0 5.57 52.0 0.23 48.0 4.6

6. táblázat A 860 és 430 nm-en mért abszorpcióváltozás kinetikájának (37. ábra) paraméterei. A1(%) és A2(%) a lassú és a gyors komponensek relatív amplitúdói, kBP és kAP pedig az idıállandói. Jelölések: RC_susp - RC-ok LDAO detergens szuszpenzióban; RC_driedLDAO_0 day és RC_driedLDAO_1_day - boroszilikát üveglapra szárított RC detergensben a szárítás után azonnal (0_day) és egy nap múlva (1_day); RC driedNodet 0 day – az üveglapra szárított RC-ok detergens nélkül a szárítás után azonnal; SWNTRC 0 day és SWNTRC 1 week – a szén nanocsı/RC kompozitok üveglapra szárítva azonnal és egy hét múlva mérve.

83

A pozitív és/vagy negatív töltések megjelenése az aminosavoldalláncok

közötti hidrogénkötések, a fehérjén belüli elektrosztatikus hálózat átrendezıdését

eredményezi. A gyors töltésmozgásokat a lassabb protein relaxációk követik.

Ezek a töltésmozgások láthatók a fehérje relaxációs kinetikákban, a 771 nm-en

mért abszorpcióváltozásnál. Az abszorpcióváltozás jól nyomon követhetı a 38.

ábrán is látható szemilogaritmikus ábrázolásban. Ezen a hullámhosszon a BPheo

elektrokróm abszorpcióeltolódását lehet látni (Tiede és mtsai., 1996). Mivel a

logaritmikus idıskála több nagyságrendet fog át, a P+QA-QB → P+QAQB

-

elektron transzfert kísérı gyors fázist, és a P+(QAQB)- → PQAQB töltés

rekombinációt jelentı lassú fázist is nyomon követhetjük egyetlen ábrán. A

kinetikai paraméterek (amplitudók és sebességi állandók) a multiexponenciális

jel felbontásából kinyerhetık. Ennek összegzése látható a 7. táblázatban. A

mintavételezési idı általában mikroszekundum körüli volt, ami lehetıvé tette a

néhány tíz mikroszekundumos leggyorsabb komponens felbontását is. A szén

nanocsıhöz kötött RC vizsgálatakor a görbéket csak kb. 100 µs-tól tudtuk

felbontani az erıs fényszórás miatt. Az LDAO detergensben levı RC-ok jelében

a gyorsabb fázis sebességi állandója kAB(1)fast = 13 500 s-1 volt, lassú komponens

kAB(1)slow = 3300 s-1 amely értékek jól összehasonlíthatóak az irodalmi adatokkal,

(Nagy és mtsai., 2004;Tiede és mtsai., 1996). Ha a RC-ok üveglapra vannak

szárítva, a gyors komponens idıállandója kb. kétszerese a detergensben

mértének, kAB(1)fast = 26300 s-1 (v.ö. kAB(1)fast = 13 500 s-1 a detergensben), míg a

lassú komponensé jelentısen lecsökken, kAB(1)slow = 75 s-1 (v.ö. kAB(1)slow = 3300 s-

1 a detergensben, 6. táblázat).

A SWNT/RC leszárított mintában a nagyon gyors komponenst nem

tudtuk feloldani a fényszórás miatti kicsi jel/zaj viszony miatt. A lassú

komponens idıállandója kAB(1)slow = 530 s-1-nak adódott, ami kisebb, mint a

detergensbeni RC-on mérté, de jelentısen nagyobb a szarított RC-énál.

84

38. ábra Boroszilikát üveglap felszínére leszárított Rb. sphaeroides R-26 RC-ok abszorpcióváltozása egyszeri telítési lézerfény után 771 nm-en. Jelölések: RC_susp – RC LDAO detergens szuszpenzióban; RC_dried és SWNTRC_dried – RC és SWNT/RC kompozit üveglapra szárítva.

85

P+(QAQB)- →

P(QAQB)

P+QA- → PQA

(QA-QB →

QAQB-)2

(QA-QB →

QAQB-)1

771 nm

A1

(rel.)

kBP

(s-1)

A2

(rel.)

kAP

(s-1)

A3

(rel.)

kAB(1)slow

(s-1)

A4

(rel.)

kAB(1)fast

(s-1)

RC_susp 0.64 0.92 0.20 8.0 0.06 3300 0.10 13500

RC_dried 0.004 0.91 0.75 8.3 0.106 75 0.14 26300

SWNTRC 0.28 0.625 0.62 8.3 0.10 530 n. r.

n. r. = nem meghatározott

7. táblázat A 771 nm-en mért abszorpcióváltozás kinetikájának (38. ábra) paraméterei. Jelölések: RC_susp – RC LDAO detergens szuszpenzióban; RC_dried és SWNTRC – RC és SWNT/RC kompozit üveglapra szárítva.

5.5.2. A szén nanocsövek és a RC-ok közötti redox

kölcsönhatás

Az egyszeri telítési fénygerjesztés után másodlagos donor jelenléte nélkül

a P+ redoxállapotát követhetjük az idı függvényében. Másodlagos donor (pl.

ferrocén vagy citokróm) jelenlétében 450 nm-nél sorozatos telítési gerjesztések

után az abszorpció jellegzetes bináris oszcillációját láthatjuk. Ennek a

magyarázata az, hogy míg az elsıdleges kinon (QA) egy elektronnal képes

redukálódni, a másodlagos kinon (QB) kettıvel. A másodlagos donor

jelenlétében egyszeresen redukált szemikinon (QB-) keletkezik, amelynek

abszorpciója van 450 nm-nél. Második gerjesztésre az ezen a hullámhosszon

nem abszorbeáló kétszeresen redukált és két protonnal protonált QBH2 forma

keletkezik. Minden páratlan gerjesztéskor a szemikinon, páros számú

gerjesztéskor pedig a kétszeresen redukált kinon keletkezik.

A 39. ábra a RC LDAO detergensben és az SWNT/RC kompozit

újranedvesített mintájának abszorpcióváltozását mutatja másodlagos donor

86

(ferrocén) jelenlétében sorozatos gerjesztések után. A detergens oldatban az

oszcilláció csak kis mértékő csillapodást mutat, míg a NT-höz kapcsolt minta

oszcillációja gyakorlatilag pár ciklus után megszőnik. Ez arra utal, hogy ebben a

mintában a kinonátfordulás (a másodlagos kinon leválása és RC-hoz való

kötıdése) csak kis mértékben lehetséges, ami a várakozásoknak teljesen meg is

felel.

Érdekes a hatása a terbutrinnak. Már az elsı gerjesztésnél is egy

megnövekedett amplitúdót láthatunk. Ez valószínőleg arra utal, hogy a terbutrin,

a QB oldal kompetitív inhibítora, gátolja az elektrontranszportot a NT felé, ami a

QA- szemikinon (ugyancsak abszorbeáló) forma koncentrációját növeli.

39. ábra Rb. sphaeroides R-26 RC-nak 450 nm-nél mért abszorpcióváltozása sorozatos telítési gerjesztések után LDAO detergensszuszpenzióban és NT-hoz kapcsolva. Az SWNT/RC komplexet az üveglapnak a pufferoldatba való mártásával újranedvesített állapotában mértük. Ha szükésges volt, 100 µM terbutrint adtunk a reakcióelegyhez. Mérési körülmények: 10 mM TRIS, pH:8.00, 100 mM NaCl, 100 µM ferrocén. A flash ismétlıdések ideje 0,5 Hz volt. : RC in LDAO, : SWNTRC, ∆: SWNTRC + terb

Kísérleteinkben elsıként láttunk közvetlen bizonyítékot arra, hogy az

SWNT-k a RC fehérjék specifikus helyéhez funkcionálisan kötıdhetnek,

amelynek egy lehetséges vázlatát a 40. ábra mutatja. A NT-hez való kapcsolódás

hatására a fotoszintetikus RC-ban a fény indukált töltéspár stabilizációja

87

következik be. A NT-nek a RC-hoz való kapcsolódása növeli a P+QB– állapot

élettartamát, valószínőleg a pozitív (az oxidált primer elektron donor, P+) és a

negatív (szemikinon formák, QA- és QB

-, a redukált primer és szekunder kinon)

töltések felhalmozódásának következtében. A gerjesztés után a proteinen belüli

direkt töltésmozgásokat a fehérjeszerkezet lassabb reorganizációja követi. A

P+Q– állapot megnövekedett élettartama a P+QA– ↔ P+QB

– csoportok közötti

nagyobb szabad energia különbséget jelentheti. A stabil RC/NT bio-

nanokompozit különbözı gyakorlati felhasználások lehetıségét kínálja, például a

mikroelektronikában, az analitikában, képalkotó rendszerekben, vagy az energia

átalakításában és tárolásában.

40. ábra A RC kofaktorok elrendezıdésének, a közöttük levı elektrontranszportnak, valamint a SWNT és RC közötti lehetséges kölcsönhatásnak a vázlata. A terbutrin (elektrontranszport inhibítor, herbicid) gátolja a QA és QB közötti elektron transzportot (az ábrán „X”-el jelölve).

( BChl )2

BChl

BPheo

Q A Q B

e -

e -

SW NT

RC

e -

FeII

e -

hνννν Fe III

Fe III

( BChl )2

BChl

BPheo

Q A Q B

e -

e -

SW NT

RC

e -

FeII FeII FeII

e -

hνννν Fe III Fe III

Fe

Fe III Fe III

?

II

88

6. Összegzés

Lipid kettısréteg szerepe

1) A RC-ot PC, PG és PC+CL lipidekbıl készített liposzómákba beültettük, és

megmutattuk, hogy

a) az így készített vezikulák nagy valószínőséggel lipid kettısrétegbıl álló zárt vezikulák;

b) bennük a RC orientáció véletlenszerő.

2) A RC másodlagos kinonaktivitása (a P+Q- - PQ töltésrekombináció lassú komponensének az amplitudója alapján értelmezve) a PC liposzómában nagyobb (84.4 %) az LDAO detergenshez (73.9 %) képest, PG liposzómában azonban kb 50%. Ez utóbbi valószínőleg a QB kötıhely hozzáférhetıségének csökkenésével magyarázható.

3) Megmértük és meghatároztuk a QA- - QB elıremenı elektrontranszport

irodalomból (detergensben) ismert mindkét komponensét mind a PC, mind a PG rendszerben.

a) A gyorsfázisnak sem a részaránya (amplitúdója), sem az idıállandója nem különbözött a liposzóma rendszerekben, jelezve, hogy az intrinsic elektrontranszfer valószínőleg hasonló mechanizmus alapján történik.

b) A lassú fázisban viszont lényeges különbség mutatkozott. A pozitív fejcsoportú PC-ban a sebességi állandó növekedett (gyorsabb elektrontranszport), a negatív töltéső PG-ban csökkent (lassabb elektrontranszport) az LDAO-hoz képest.

4) A negatív töltéső PG-ban a terbutrin csak részlegesen gátolja a QB oldal aktivitását.

5) Az anionikus lipidek specifikusan tudnak kötıdni a RC-hoz.

a) A PG kötıdése jól közelíthetı Michaelis-Menten kinetikával, jelezvén, hogy feltehetıen egy specifikus kötıhely lehet (vagy ha több van, azok kötési erıssége nem különbözik lényegesen).

b) A CL kötıdése az alacsony koncentrációknál eltér a Michaelis-Menten kinetikától. Alacsony koncentrációnál igen erıs (akár szubsztöchio-metrikus) kötıdés figyelhetı meg.

6) PC liposzómában nem csak az elsı elektrontranszfer sebességi állandója növekedett, hanem a másodiké (kAB(2)) is a detergenshez képest. Érdekes módon, a PG liposzómában is nıtt ez a sebességi állandó (az elsı elektrontranszferé jelentısen csökkent ebben a rendszerben).

7) A többszörös gerjesztés során a RC többszörös átfordulását a KAB (elektronegyensúlyi) és Kq kinonegyensúlyi állandó szabja meg. A

89

membránkörnyezetben úgy tőnik, hogy a Kq a meghatározó tényezı, ami igen kicsi a PG liposzómákban.

A töltésstabilizálódás energetikája lipidekben

8) A P+Q- - PQ töltésrekombináció lassú komponensének kinetikájából

meghatároztam a QA és QB közötti szabadenergiakülönbséget PC és PG liposzómákban (-62, -77, -89 mV LDAO, PC és PG rendszerekben rendre). Ez a tendencia az in vivo állapothoz való közeledést jelenti, jelezvén,hogy ezek a lipidek fontos szerepet töltenek be a RC-n belüli töltésstabilizálódásban az élı szervezetben.

9) A KAB hımérsékletfüggésébıl kiszámítottam a QA/QB állapotok közötti standard szabadentalpiakülönbségeket és a két állapot közötti entrópiakülönbséget a már ismert ∆GAB felhasználásával.

a) A folyamatokat lényegében az entalpiaváltozás vezérli,

b) a ∆H-t lényegesen a CL csökkentette,

c) az entrópia hozzájárulás mindegyik lipidben kisebb volt a detergenshez képest, de csak a detergensben volt nagyobb a termikus szintnél (k*T=25 mV/mol).

90

Transzmembrán protongrádiens

10) Sikerült fluoreszkáló jelzımolekulát (piranint) beépíteni liposzómába,

a) az így elkészített lipoproteid vezikulák hosszú ideig stabilak maradtak szobahımérsékleten is,

b) protonáteresztıképességük kb. 15-25%-ban sokáig megmaradt, ami további kalibrációk után alkalmas lehet arra, hogy membránpotenciált számolhassunk, illetve annak komponenseit szétválasszuk.

A fotoszintetikus RC és egyfalú szén nanocsövek kapcsolata 11) Sikerült a fotoszintetikus reakciócentrumokat egyfalú szén nanocsövekhez

kapcsolni és az így kapott bio-nanokompozit (SWNT/RC) anyag fı spektroszkópiai tulajdonságait meghatározni; a) Ez a kapcsolat a fehérjén belüli elektrontranszportot jellemzıen módosítja,

a fénygerjesztés által kiváltott pozitív és negatív töltések felhalmozódását eredményezi.

b) A fehérjén belüli töltésmozgást követı relaxációs folyamatokra is hatással van.

c) A SWNT és a RC között a fénnyel való gerjesztés után redoxkölcsönhatás lehetséges. Ez a jelenség különbözı gyakorlati alkalmazások modellje lehet.

91

7. Közlemények

a) A disszertáció alapjául szolgáló közlemények 1) Francesco Milano, Márta Dorogi, Kornélia Szebényi, László Nagy, Péter

Maróti, György Váró, Livia Giotta, Angela Agostiano and Massimo Trotta (2007) Enthalpy/entropy driven activation of the first interquinone electron

transferin bacterial photosynthetic reaction centers embedded in vesicles of

physiologically important phospholipids, Bioelectrochemistry, 70, 1, 18-22 IF: 1.558

2) Márta Dorogi, Zoltán Bálint, Csilla Mikó, Klára Hernádi, László Forró, György Váró and László Nagy (2006) Stabilization effect of single-walled

carbon nanotubes on the functioning of photosynthetic reaction centers, Journal of Physical. Chemistry. B , 110, 43, 21473-21479 IF: 4.033

3) Márta Dorogi, Francesco Milano, Kornelia Szebényi, György Váró, Livia Giotta, Massimo Trotta, Angela Agostiano, Péter Maróti, László Nagy (2005) Reaction centers in lipids, Acta Biologica Szegediensis, 49(1-2), 195-197

4) László Nagy, Francesco Milano, Márta Dorogi, Massimo Trotta, Gábor Laczkó, Kornélia Szebényi, György Váró, Angela Agostiano and Péter Maróti (2004) Protein/lipid interaction in bacterial photosynthetic reaction

center: The role of phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol in charge

stabilization, Biochemistry, 43, 40, 12913-12923 IF: 4.224

5) Márta Dorogi, Francesco Milano, Massimo Trotta, Angela Agostiano, György Váró, Péter Maróti and László Nagy, (2002) Connection of charge

stabilization with proton translocation in photosynthetic reaction

center/liposome membranes, XIXth IUPAC Symposium on Photochemistry – Budapest, P51, 187-188.

6) Francesco Milano, Massimo Trotta, Márta Dorogi, Béla Fischer, Livia Giotta, Angela Agostiano, Péter Maróti, László Kálmán, and László Nagy, (2008) Measuring light generated transmembrane proton gradient in photosynthetic

reaction center/artificial lipid vesicles (in prep.)

b) Egyéb kölemények 1) Hiroko Ohmori, László Nagy, Márta Dorogi and Masahide Terazima (2008)

Charge stabilization in reaction center protein investigated by optical heterodyne detected transient grating spectroscopy, accepted to Eur. Biophys. J. with Biophys. Lett., 37, Pages: 1167-1174 IF: 1.857

2) László Nagy, Márta Dorogi, Hiroko Ohmori, Masahide Terazima and Smuel Malkin (2005) Photoacoustic and thermal grating investigations of charge stabilzation in reaction center protein, Proceedings of Forum Acusticum, Budapest, 2005, 790

92

c) Oktatási anyag:

1) Dorogi Márta, Szebényi Kornélia, Nagy László (2004) Abszorpciós kinetikai mérések alkalmazása a fotoszintetikus reakciócentrumban végbemenı elektrontranszport-folyamatok jellemzésére, http://fotoszintezis.szbk.u-szeged.hu/fototan/fototan.htm

93

8. Köszönetnyilvánítás Szeretném megköszönni Dr. Nagy László egyetemi docensnek, témavezetımnek a dolgozat elkészítésében nyújtott segítségét, rendkívül értékes tanácsait és türelmét. Köszönök mindent, amit közös munkáink során tıle megtanulhattam, elleshettem, és köszönöm a sok tartalmas szakmai beszélgetést. Hálás vagyok azért, hogy látott bennem lehetıséget, felkarolt, és megtanította nekem az alapokat, és annál még sokkal többet.

Köszönetemet fejezem ki Dr. Maróti Péter egyetemi tanárnak, a biológia tudományok doktorának, hogy a tanszékén dolgozhattam. Köszönöm Dr. Váró Györgynek az SZBK Biofizikai Intézet tudományos fımunkatársának segítségét, a 771 nm-es mérések elkészítésében. Köszönöm Dr. Bálint Zoltánnak a Graz-i Orvostudományi Egyetem Orvosi Alapkutatási Központ tudományos munkatársának a sok tanácsot, biztatást, és az AFM-es képek elkészítését. Köszönetemet fejezem ki Massimo Trotta-nak és Francesco Milano-nak, a University of Bari, Depatrment of Chemistry, munkatársainak azért, hogy laboratóriumukban dolgozhattam. Köszönöm Szebényi Kornéliának, hogy szegedi évei alatt érdeklıdött munkám iránt. Hálás vagyok továbbá Dunai Péternének, aki körültekintıen elrendezte az adminisztrációval kapcsolatos ügyeimet az egyetemen töltött évek alatt. Köszönöm Laskayné Tóth Judit laboránsoknak, hogy laboránsi munkaköre lelkiismeretes és odaadó ellátásával gördülékennyé tette a munkát számomra. Külön köszönettel tartozom Dr. Vass Imrének az SZBK Növénybiológiai Intézet igazgatójának, amiért lehetıvé tette, hogy dolgozatomat intézetében befejezhettem, és segítségével folytathatom kutatói pályámat az MTA Szegedi Biológiai Központ Növénybiológiai Intézetében. Szeretném kifejezni köszönetemet Szüleimnek, akiknek önfeláldozó segítsége nélkül nem juthattam volna el idáig. Férjemnek tartozom még köszönettel, hogy mindvégig mellettem állt, és tanácsaival segítségemre volt a dolgozat elkészítésében.

94

9. Irodalomjegyzék

Allen, J. P., G. Feher, T. O. Yeates, H. Komiya, and C. D. Rees. 1987. Structure of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26:The protein subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 84:6162-6166.

Aro, E. M., I. Virgin, and B. Andersson. 1993. Photoinhibition of Photosystem II. Inactivation, protein damage and turnover. Biochimica et Biophysica

Acta 1143:113-134.

Barlic, A., I. Gutierrez-Aguirre, J. M. M. Caaveiro, A. Cruz, M. B. Ruiz-Arguello, J. Perez-Gil, and J. M. Gonzalez-Manas. 2004. Lipid phase coexistence favors membrane insertion of equinatoxin-II, a pore-forming toxin from Actinia equina. Journal of Biological Chemistry 279:34209-34216.

Batterton, J. C. and C. Van Baalen. 1971. Growth responses of blue-green algae to sodium chloride concentration. Archives of Microbiology 76:151-165.

Baxter, R. H. G., N. Ponomarenko, V. Srajer, R. Pahl, K. Moffat, and J. R. Norris. 2004. Time-resolved crystallographic studies of light-induced structural changes in the photosynthetic reaction center. Proceedings of

the National Academy of Sciences of the United States of America 101:5982-5987.

Baxter, R. H. G., B. L. Seagle, N. Ponomarenko, and J. R. Norris. 2005b. Cryogenic structure of the photosynthetic reaction center of Blastochloris viridis in the light and dark. Acta Crystallographica Section D-Biological

Crystallography 61:605-612.

Baxter, R. H. G., B. L. Seagle, N. Ponomarenko, and J. R. Norris. 2005a. Cryogenic structure of the photosynthetic reaction center of Blastochloris viridis in the light and dark. Acta Crystallographica Section D-Biological

Crystallography 61:605-612.

Breton, J. 2007. Steady-state FTIR spectra of the photoreduction of Q(A) and Q(B) in Rhodobacter sphaeroides reaction centers provide evidence against the presence of a proposed transient electron acceptor X between the two quinones. Biochemistry 46:4459-4465.

Breton, J., M. C. Wakeham, P. K. Fyfe, M. R. Jones, and E. Nabedryk. 2004. Characterization of the bonding interactions of QB upon photoreduction via A-branch or B-branch electron transfer in mutant reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochimica et Biophysica Acta 1656:127-138.

95

Britto, P. J., K. S. V. Santhanam, and P. M. Ajayan. 1996. Carbon nanotube electrode for oxidation of dopamine. Bioelectrochemistry and

Bioenergetics 41:121-125.

Camara-Artigas, A., D. Brune, and J. P. Allen. 2002. Interactions between lipids and bacterial reaction centers determined by protein crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 99:11055-11060.

Clayton, R. K. 1978. Effects of dehydration on reaction centers from Rhodopseudomonas sphaeroides. Biochimica et Biophysica Acta 504:255-264.

Collins, P. C., M. S. Arnold, and P. Avouris. 2001. Engineering carbon nanotubes and nanotube circuits using electrical breakdown. Science 292:706-709.

Davis, J. J., K. S. Coleman, B. R. Ayamian, C. B. Bagshaw, and M. L. H. Green. 2003. Chemical and biochemical sensing with modified single walled carbon nanotubes. Chemistry-A European Journal 9:3732-3739.

Davis, J. J., R. J. Coles, and H. A. O. Hill. 1997. Protein electrochemistry at carbon nanotube electrodes. Journal of Electroanalytical Chemistry 440:279-282.

Deamer, D. W. and J. W. Nichols. 1989. Proton flux Mechanisms in model and biological-membranes. Journal of Membrane Biology 107:91-103.

Deisenhofer, J. and H. Michel. 1989. The Photosynthetic Reaction Center from the Purple Bacterium Rhodopseudomonas viridis. Science 245:1463-1473.

Dorogi, M., Z. Balint, Cs. Miko, B. Vileno, M. Milas, K. Hernadi, L. Forro, Gy. Varo, and L. Nagy. 2006. Stabilization Effect of Single-Walled Carbon Nanotubes on the Functioning of Photosynthetic Reaction Centers. Journal of Photochemistry and Photobiology 110:21473-21479.

Fathir, I., T. Mori, T. Nogi, M. Kobayashi, K. Miki, and T. Nozawa. 2001. Structure of the H subunit of the photosynthetic reaction center from the thermophilic purple sulfur bacterium, Thermochromatium tepidum Implications for the specific binding of the lipid molecule to the membrane protein complex. European Journal of Biochemistry 268:2652-2657.

Feher, G., J. P. Allen, M. Y. Okamura, and C. D. Rees. 1989. Structure and function of bacterial photosynthetic reaction centres. Nature111-116.

Feher, G. and M. Y. Okamura. 1978. Chemical composition and properties of reaction centers. The photosynthetic bacteria, Plenum, New York349-386.

96

Gallagher, M. J., D. Chen, B. P. Jacobsen, D. Sarid, L. D. Lamb, F. A. Tinker, J. Jiao, D. R. Huffman, S. Seraphin, and D. Zhou. 1993. Characterization of Carbon Nanotubes by Scanning Probe Microscopy. Surface Science 281:L335-L340.

Gensure, R. H., M. L. Zeidel, and W. G. Hill. 2006. Lipid raft components cholesterol and sphingomyelin increase H+/OH- permeability of phosphatidylcholine membranes. Biochemical Journal 398:485-495.

Gombos, Z., Zs. Varkonyi, M. Hagio, M. Iwaki, L. Kovacs, K. Masamoto, S. Itoh, and H. Wada. 2002. Phosphatidylglycerol Requirement for the Function of Electron Acceptor Plastoquinone QB in the Photosystem II Reaction Center. Biochemistry 41:3796-3802.

Graige, M. S., G. Feher, and M. Y. Okamura. 1998. Conformational gating of the electron transfer reaction QA

-QB --> QAQB- in bacterial reaction centers of

Rhodobacter sphaeroides determined by a driving force assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 95:11679-11684.

Hagio, M., Z. Gombos, Zs. Varkonyi, K. Masamoto, N. Sato, M. Tsuzuki, and H. Wada. 2000. Direct Evidence for Requirement of Phosphatidylglycerol in Photosystem II of Photosynthesis. Plant Physiology 124:795-804.

Halmschlager, A., M. Trotta, J. Tandori, L. Rinyu, I. Pfeiffer, and L. Nagy. 2002. A mathematical model for quinone-herbicide competition in the reaction centres of Rhodobacter sphaeroides. Functional Plant Biology 29:443-449.

Iijima, S. 1991. Helical microtubules of graphitic carbon. Nature 354:56-58.

Kalman, L., T. Gajda, P. Sebban, and P. Maroti. 1997. pH-Metric Study of Reaction Centers from Photosynthetic Bacteria in Micellular Solutions: Protonatable Groups Equilibrate with the Aqueous Bulk Phase. Biochemistry 36:4489-4496.

Kalman, L. and P. Maroti. 1994. Stabilization of Reduced Primary Quinone by Proton Uptake in Reaction Centers of Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry 33:9237-9244.

Karajanagi, S. S., D. Y. Kim, R. S. Kane, and J. S. Dordick. 2004. Enzyme-nanotube conjugates as functional nanomaterials. Abstracts of Papers

American Chemical Society 227:U890.

Kleinfeld, D., M. Y. Okamura, and G. Feher. 1985. Electron transfer in reaction centers of Rhodopseudomonas sphaeroides. II. Free energy and kinetic relations between the acceptor states QA Qff and QAQB 2-. Biochimica et

Biophysica Acta 809:291-310.

97

Koepke, J., E. M. Krammer, A. R. Klingen, P. Sebban, G. M. Ullmann, and G. Fritzsch. 2007. pH modulates the quinone position in the photosynthetic reaction center from Rhodobacter sphaeroides in the neutral and charge separated states. Journal of Molecular Biology 371:396-409.

Krishnamoorthy, I. and G. Krishnamoorthy. 2001. Probing the link between proton transport and water content in lipid membranes. Journal of

Physical Chemistry B 105:1484-1488.

Kroto, H. W., J. R. Heath, S. C. Obrien, R. F. Curl, and R. E. Smalley. 1985. C-60 - Buckminsterfullerene. Nature 318:162-163.

Kruse, O. and G. H. Schmid. 1995. The role of phosphatidylglycerol as a functional effector and membrane anchor of the D1-core peptide from photosystem-II particles of the cyanobcterium oscillatoria-chalybea. Zeitschrift fur Natzrforschung C-A Journal of Biosciences 50:380-390.

Lakatos, M., G. Groma, C. Ganea, J. K. Lanyi, and Gy. Varo. 2002. Characterization of the Azide-Dependent Bacteriorhodopsin-Like Photocycle of Salinarum Halorhodopsin. Biophysical Journal 82:1687-1695.

Lancaster, C. R. D. and H. Michel. 1997. The coupling of light-induced electron transfer and proton uptake as derived from crystal structures of reaction centres from Rhodopseudomonas viridis modified at the binding site of the secondary quinone, Q(B). Structure 5:1339-1359.

Lande, M. B., J. M. Donovan, and M. L. Zeidel. 1995. The relationship between membrane fluidity and permeabilities to water, solutes, ammonia, and protons. Journal of General Physiology 106:67-84.

Li, J., D. Gilroy, D. M. Tiede, and M. Gunner. 1997. Kinetic Phases in the Electron Transfer from P+QA

-QB to P+QAQB- and the Associated

Processes in Rhodobacter sphaeroides R-26 Reaction Centers. Biochemistry 37:2818-2829.

Mancino, L. J., D. P. Dean, and R. E. Blankenship. 1984. Kinetics and thermodynamics of the P870

+QA--]P870

+QB- reaction in isolated reaction

centers from the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas

sphaeroides. Biochimica et Biophysica Acta 764:46-54.

Maroti, P. 1991. Electron transfer and proton uptake of photosynthetic bacterial reaction centres reconstituted in phospholipid vesicles. Journal of

Photochemistry and Photobiology 8:263-277.

McAuley, K. E., P. K. Fyfe, J. P. Ridge, N. W. Isaacs, R. J. Cogdell, and M. R. Jones. 1999. Structural details of an interaction between cardiolipin and an integral membrane protein. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the U. S. A. 96:14706-14711.

98

Mezzetti, A., E. Nabedryk, J. Breton, M. Y. Okamura, M. L. Paddock, G. Giacometti, and W. Leibl. 2002. Rapid-scan Fourier transform infrared spectroscopy shows coupling of GLu-L212 protonation and electron transfer to QB in Rhodobacter sphaeroides reaction centers. Biochimica et

Biophysica Acta 1553:320-330.

Nagy, L., E. Fodor, J. Tandori, L. Rinyu, and T. Farkas. 1999. Lipids affect the charge stabilization in wild-type and mutant reaction centers of Rhodobacter sphaeroides R-26. Australian Journal of Plant Physiology 26:465-473.

Nagy, L., F. Milano, M. Dorogi, A. Agostiano, G. Laczko, K. Szebenyi, Gy. Varo, M. Trotta, and P. Maroti. 2004. Protein/Lipid Interaction in the Bacterial Photosynthetic Reaction Center: Phosphatidylcholine and Phosphatidylglycerol Modify the Free Energy Levels of the Quinones. Biochemistry 43:12913-12923.

Nagy, L., A. Puskas, J. Tandori, M. Droppa, and G. Horvath. 1991. Effect of DCMU on photosynthetic purple bacteria. Photosynthetica 25:167-171.

Nogi, T., I. Fathir, M. Kobayashi, T. Nozawa, and K. Miki. 2000. Crystal structures of photosynthetic reaction center and high-potential iron-sulfur protein from Thermochromatium tepidum: Thermostability and electron transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 97:13561-13566.

Ohmori, H., L. Nagy, M. Dorogi, and M. Terazima. 2008. Charge stabilization in reaction center protein investigated by optical heterodyne detected transient grating spectroscopy. European Biophysics Journal with

Biophysics Letters 37:1167-1174.

Ollivon, M., S. Lesieur, C. Grabielle-Madelmont, and M. Paternostre. 2000. Vesicle reconstitution from lipid-detergent mixed micelles. Biochimica et

Biophysica Acta-Biomembranes 1508:34-50.

Paddock, M. L., G. Feher, and M. Y. Okamura. 1991. Reaction centers from three herbicide resistant mutants of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1: Kinetics of electron transfer reactions. Photosynthesis Research 27:109-119.

Paddock, M. L., S. H. Rongey, P. H. McPherson, A. Juth, G. Feher, and M. Y. Okamura. 1994. Pathway of Proton Transfer in Bacterial Reaction Centers: Role of Aspartate-L213 in Proton Transfers Associated with Reduction of Quinone to Dihydroquinone. Biochemistry 33:734-745.

Palazzo, G., A. Mallardi, M. Giustini, D. Berti, and G. Venturoli. 2000. Cumulant Analysis of Charge Recombination Kinetics in Bacterial Reaction Centers Reconstituted into Lipid Vesicles. Biophysical Journal 79:1171-1179.

99

Remy, A. and K. Gerwert. 2003. Coupling of light-induced electron transfer to proton uptake in photosynthesis. Nature Structural Biology 10:673-644.

Riegler, J. and H. Mohwald. 1986. Elastic interactions of photosynthetic reaction center proteins affecting phase-transitions and protein distributions. Biophysical Journal 49:1111-1118.

Rinyu, L., E. W. Martin, E. Takahashi, P. Maroti, and C. A. Wraight. 2004. Modulation of the free energy of the primary quinone acceptor (QA) in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides: contributions from the protein and protein–lipid(cardiolipin) interactions. Biochimica et

Biophysica Acta 1655:93-101.

Sato, N., M. Hagio, H. Wada, and M. Tsuzuki. 2000. Requirement of phosphatidylglycerol for photosynthetic function in thylakoid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.

S. A. 97:10655-10660.

Sebban, P., P. Maroti, M. Schiffer, and D. K. Hanson. 1995. Electrostatic Dominoes: Long Distance Propagation of Mutational Effects in Photosynthetic Reaction Centers of Rhudubacter capsulatus. Biochemistry 34:8390-8397.

Sotiropoulou, S. and N. A. Chaniotakis. 2002. Carbon nanotube array-based biosensor. Analytical and Bioanalytical Chemistry 375:103-105.

Sturgis, N. J. and A. R. Niederman. 2008. Atomic force microscopy reveals multiple patterns of antenna organization in purple bacteria: implications for energy transduction mechanisms and membrane modeling. Photosynthesis Research 95:269-278.

Taly, A., L. Baciou, and P. Sebban. 2002. The DMPC lipid phase transition influences differently the first and the second electron transfer reactions in bacterial reaction centers. FEBS Letters 532:91-96.

Tandori, J., L. Nagy, and P. Maroti. 1991. Semiquinone oscillation as a probe of quinone herbicide binding in bacterial reaction centers. Photosynthetica 25:159-166.

Tandori, J., L. Nagy, A. Puskas, M. Droppa, G. Horvath, and P. Maroti. 1995. The IleL229 -> Met mutation impairs the quinone binding to the QB-pocket in reaction centers of Rhodobacter sphaeroides. Photosynthesis

Research 45:135-146.

Thewalt, J., N. Kitson, C. Araujo, A. Mackay, and M. Bloom. 1992. Models of Stratum-Corneum Intercellular Membranes - the Sphingolipid Headgroup Is A Determinant of Phase-Behavior in Mixed Lipid Dispersions. Biochemical and Biophysical Research Communications 188:1247-1252.

100

Tiede, D. M., J. Vazquez, J. Cordova, and P. A. Marone. 1996. Time-resolved electrochromism associated with the formation of quinone anions in the Rhodobacter sphaeroides R26 reaction center. Biochemistry 35:10763-10775.

Trotta, M., F. Milano, L. Nagy, and A. Agostiano. 2002. Response of membrane protein to the environment: the case of photosynthetic Reaction Centre. Materials Science & Engineering C-Biometic and Supramolecular

Systems 22:263-267.

Wakeham, M. C., R. B. Sessions, M. R. Jones, and P. K. Fyfe. 2001. Is There a Conserved Interaction between Cardiolipin and the Type II Bacterial Reaction Center? Biophysical Journal 80:1395-1405.

Wraight, C. A. and R. R. Stein. 1980. Redox equilibrium in the acceptor quinone complex of isolated reaction centers and the mode of action of O-phenanthroline. FEBS Letters 113:73-77.

101

Összefoglaló 1. Bevezetés

A fotoszintézis során az autotróf élılények: növények és egyes baktériu-

mok; a Nap fényenergiájának segítségével szerves vegyületeket, és oxigént állí-

tanak elı. A fény begyőjtését, majd átadását a fotoszintetikus reakciócentrumok

nagy részénél klorofillmolekulák végzik. Mivel a fotoszintéziskor lejátszódó

fényenergia átalakítása kémiai potenciállá egyike a természetben megtalálható

alapvetı folyamatoknak, a folyamat intenzív kutatás tárgya napjainkban is. Az

utóbbi húsz év technikai fejlıdése ((opto)elektronika, számítástechnika,

molekuláris biológia, stb.) különös fellendülést hozott a részletek kutatásában.

Az intenzív kutatásoknak köszönhetıen alapos ismeretanyag győlt össze

a töltésszétválasztásról és -stabilizálódásról, amelyek az izolált reakciócentrum-

fehérjében (RC) is lejátszódnak. A bakteriális RC kristályosításáért 1988-ban

(Michel, Deisenhofer, Huber), a nagytávolságú elektrontranszfer elméletéért

1993-ban (Marcus) kaptak Nobel-díjat. Nagymennyiségő adat elsısorban izolált

rendszerekrıl, detergensbe ágyazott RC-ok mőködésérıl áll rendelkezésünkre.

Kevésbé ismert azonban a fehérje szerkezete és funkciója a membránban, külö-

nösen in vivo, és az, hogy miként indukálja a fény a redox reakciókat a csatolt

proton átadási folyamatokkal, amelyek jelentısek a membrán energizálásában.

Mindezek mellett különleges figyelmet kap újabban az az elképzelés,

hogy biológiai anyagok, például fehérjék hatékony komponensei lehetnek olyan

rendszereknek, melyekben a különleges tulajdonsággal bíró szervetlen anyagok

(pl. szén nanocsövek) is részt vesznek. Kézenfekvı tehát a két rendszerbıl egy

újfajta, ún. bio-nanokompozit elıállítása, mely sikeresen ötvözné mindkét anyag

értékes tulajdonságait. A RC elınyös tulajdonságai között kell megemlítenünk

azt, hogy benne a fénnyel való gerjesztés hatására közel 100% hatékonysággal

töltésszétválasztás történik, és azt, hogy jellemzı fényelnyelése a közeli infra-

vörös tartományban van. A szén nanocsövek kivételes elektromos vezetési saját-

ságokkal rendelkeznek. Az egyfalú szén nanocsövekben a félvezetı és fémes

102

vezetési tulajdonságok keverednek, míg a többfalú szén csövek fémes vezetık.

Vannak irodalmi adatok arra is, hogy a szén nanocsövek redoxreakciókat

katalizáló enzimekkel redox-kapcsolatban lehetnek (pl. glükózoxidázzal).

Rendkívüli lehetıség adódik arra, hogy a RC-ban létrejövı fényindukált

elektrontranszport és a szén nanocsövek redoxtulajdonságait összekapcsoljuk.

A szénnanocsövek, közülük is elsısorban az egyfalú szén nanocsövek

(SWNT) egydimenziós elektromos és struktúrális adottságaik miatt számos fel-

használási lehetıséget kínálnak, pl. a nanoelektronikában. A figyelem

megalapozott, mert: az SWNT hatására a biológiai anyag (pl. fehérje)

szerkezetében és mőködésében specifikus változások következhetnek be. Az így

nyert komplex egyedi elektromos tulajdonságai miatt alkalmas lehet különbözı

specifikus feladatok megoldására, pl. energiaátalakításra és energia tárolására.

A RC/lipoproteid és a RC/szénnancsı komplexek érdekes és meglepı

összehasonlításra adhatnak alapot. Mindkét rendszer a nanoszkópikus mérettarto-

mányba tartozik, amely ezzel együtt különleges tulajdonsgokat is kölcsönöz

ezeknek a rendszereknek. Ebbıl a szempontból nem elhanyagolhatóak a rövid-

távú, közvetlen kölcsönhatások (pl. a RC kapcsolata a közvetlen környezetében

levı lipidekkel, vagy a RC-szénnanocsı kölcsönhatások), de a rendszer egészére

kiterjedı a tulajdonságai sem. Példának említhetjük azt, hogy a szén nanocsı/RC

kapcsolat következtében az egész komplex elektromos tulajdonsága

megváltozhat, mint ahogyan a RC/zárt vezikuláris rendszeré is. Dolgozatomban e

két rendszer elınyös tulajdonságait is megpróbálom kihasználni.

2. Irodalmi áttekintés

A fotoszintézis az egyetlen folyamat a természetben, amely során

nagyobb mennyiségő napenergia tárolódik. Ez az alapvetı energiaátalakítási

folyamat teszi lehetıvé a fotoszintetizáló baktériumok és növények növekedését

és szaporodását, amennyiben rendelkezésre áll kellı mennyiségő széndioxid, víz

és ezekhez képest csekélyebb mennyiségben bizonyos ásványi anyagok.

Baktériumokban a fotoszintetikus energiaátalakítás folyamatai lényege-

sen egyszerőbbek, mint növényekben. Amíg növényekben két fotokémiai

103

reakciócentrum mőködik, addig baktériumokban csak egy. A bíborbaktériumok

RC-a a növények PSII fotokémiai rendszerével mutat nagymértékő hasonlóságot.

A fotoszintetikus RC intracitoplazmatikus membránrendszerbe (ún. kromato-

forákba) ágyazott pigment-protein komplex, amely fehérje-alegységekbıl és

redox-tulajdonságokkal rendelkezı kofaktorokból áll A “fehérjevázhoz” nem-

fehérjetermészető redoxaktív pigmentmolekulák, ún. kofaktorok is

kapcsolódnak: négy bakterioklorofill (BChl), két bakteriofeofitin (BPheo),

elsıdleges kinon (QA), másodlagos kinon (QB), nem-hemtípusú vas (Fe2+).

A négy BChl közül a két legközelebbi dimert alkot (SP), és mint

elsıdleges elektrondonor vesz részt a redox-folyamatokban, a másik kettı pedig

monomerként helyezkedik el az elektrontranszport láncban. Részletesebb

áttekintésként lásd pl. (Allen és mtsai., 1987) publikációt.

A kofaktorok két, a bakterioklorofill dimeren és a Fe2+-on átmenı, a

membránra merıleges síkra vonatkoztatott, megközelítıleg tükörszimmetrikus

ágat (A és B) alkotnak. Ezek közül azonban csak az A-ág aktív. A kinonok két

elektronnal redukálhatók, és a kettıs redukció után két proton felvételére képe-

sek. Jól definiált középponti redoxpotenciállal rendelkeznek, középponti potenci-

áljuk azonban erısen függ a környezet polarizálhatóságától (dielektromos állan-

dójától) és protonálhatóságától (az oldószer protikus vagy aprotikus voltától).

Mivel környezetük erısen különbözik, a QA és QB redox- és kötési tulajdonságai

jelentısen eltérnek. A QA a fehérje erısen hidrofób környezetében található, egy

elektronnal redukálható, a RC-hoz erısen kötıdik, és onnan csak nehezen

választható le. A QB környezetében sok a vízmolekula, a protonálható

aminosavak győrőként veszik körbe a pK-juknak megfelelıen. Redukciójához

két elektron szükséges (két H+ felvétele mellett), majd az így képzıdött dihidro-

kinol (QH2) a RC-ról leválik, helyébe újabb (oxidált) kinon kerül a membrán

kinon-raktárából (Feher és mtsai., 1989;Paddock és mtsai., 1994). 14C-gyel jelölt detergensekkel (Feher és Okamura, 1978) és strukturális

adatokkal (Deisenhofer és Michel, 1989) igazolható volt, hogy a RC körül

viszonylag keskeny (kb. 3 nm) hidrofób zóna alakul ki, amely néhány száz deter-

gens- vagy lipidmolekulával való kölcsönhatást tesz lehetıvé. Ezek a kölcsönha-

tások a kofaktorokra különbözı hatásokkal lehetnek. A primer donor a periplaz-

104

matikus felszínhez közelebb, a pigment-protein komplex belsejében helyezkedik

el. A QA, az intracitoplazmatikus felszínhez ugyan közelebb van, ám meglehetı-

sen jól beágyazva egy apoláris, a H-alegység által védett környezetbe (Feher és

mtsai., 1989;Deisenhofer és Michel, 1989). A QB ezzel szemben közelebb van a

citoplazmatikus felszínhez. A környezetében számos ionizálható, protonációra/

deprotonációra képes aminosav oldallánc van (Kalman és Maroti, 1994), így a

redoxpotenciálja nagyon érzékenyen változik a környezeti hatásokra, és az

esetleges lipidösszetétel változásaira is. A QB redukciója (mind az elsı, mind a

második elektronnal) protonok felvételével jár együtt, amelyben fontos szerepet

játszanak a környezetében lévı protonálható aminosav oldalláncok.

Természetesen a fı célunk az, hogy megértsük, milyen a RC szerkezete

és hogyan mőködik az élı membránban. Az élı membrán összetettsége azonban

nagyon megnehezíti annak az eldöntését, hogy milyen komponensek, milyen

hatások befolyásolják a RC-szerkezetét és mőködést.

A különbözı foszfolipidek (1,2-Dimyrisroyl-sn-Glycero-3-Phophocholine

(DMPC), 1,2-Dipalmytoyl-sn-Glycero-3-Phophatydilcholine (DPPC), 1-Palmito-

yl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phophatydilcholine (POPC), szójabab, vagy tojássár-

gája lecitin) széles körben használtak a biológiai membránok funkciójának és

szerkezetének modellezésénél. A foszfatidilkolin (PC) és a foszfatidilglicerol

(PG) jelentıs mennyiségben megtalálható a fotoszintetikus baktériumok memb-

ránjaiban (Nagy és mtsai., 1999), a kardiolopidnek (CL) specifikus jelentısége

is lehet a fotoszintetikus apparátus mőködésében. Mivel a CL két foszfatidilgli-

cerol-molekulából áll, szerepének kiderítésében jelentısége lehet annak a megfi-

gyelésnek, hogy cianobaktériumokban a PG az elektronnak a QB-n történı stabi-

lizálódását befolyásolhatja (Gombos és mtsai., 2002;Hagio és mtsai., 2000).

A POPC speciális figyelmet kaphat, mert fiziológiai hımérsékleten

folyékony fázisba vihetı (fázisátmeneti hımérséklete -2.6±2.1 ºC). Ugyanakkor

az általunk alkalmazot rendszer fázissajátságait nehéz megjósolni az elég nagy

mennyiségben jelenlevı koleszterin, ubikinon és RC miatt. A (Thewalt és

mtsai., 1992a) által POPC/Chol rendszerre bemutatott fázisdiagram alapján

azonban valószínősíthetjük, hogy az általunk vizsgált rendszerben a gél és a

folyadékkristályos fázisok keveredése fordulhat elı.

105

A membrán protonáteresztı képessége függhet a membrán fizikai/kémiai

paramétereitıl (pl. fluiditásától), mikroszerkezetétıl (éppen melyik fázisban

található, milyen kompartmentek lehetnek benne), fehérjetartalomtól, és egyéb

molekulafajták (pl. szabad zsírsavak, koleszterin) jelenlététıl (Lande és mtsai.,

1995;Deamer és Nichols, 1989;Krishnamoorthy és Krishnamoorthy, 2001). A

koleszterinek kitüntetett szerepe van a protonáteresztıképesség befolyásolásában

(Lande és mtsai., 1995;Gensure és mtsai., 2006). A koleszterin jelenléte

csökkenti a protonáteresztıképességet, de egy bizonyos koncentráció fölött,

feltehetıen a koleszterin domének megjelenése miatt az ugrásszerően megnı. A

fehérjék jelenléte is növelheti a protonáteresztıképességet. Ennek valószínő oka

az, hogy jelenlétükben nı a membrán heterogenitása, megváltozik a

doménszerkezete, környezetükben megváltozik a mikrostruktúra (Barlic és

mtsai., 2004;Riegler és Mohwald, 1986).

A lipid környezeten kívül egyéb nanostrukrúták is befolyásolhatják a RC

mőködését. Mit is jelenthet a szén nanocsı környezet?

Mind az egyfalú, mind a többfalú szénnanocsövekbıl különbözı polime-

rekkel vagy szervetlen vegyületekkel kombinálva kompozitok hozhatók létre.

Ezeket az anyagokat igen széles körben használják fel: a szénnanocsövekkel

megerısített, fém-mátrixú kompozitoknak egyedülálló mechanikai tulajdonsága-

ik vannak; templátként alkalmazzák szervetlen nanoszerkezetek elıállítására;

ezen kívül felmerült annak lehetısége, hogy a nanocsöveket elektromos

egységként elemekben és szenzorokban is kompozit anyagként felhasználják.

Az elızıekben felsorolt alkalmazási területek mellett speciálisabb

felhasználást jelent a szénnanocsövek kompozitjainak elıállítása biológiai

anyagokkal, amelyre azok optimális fizikai tulajdonságain kívül megfelelı

elektronszerkezete miatt van lehetıség.

Kismérető proteinek nanocsı-felülethez való kötıdésével bioelektrokémi-

ai reakciók katalizálhatók (Britto és mtsai., 1996;Davis és mtsai., 1997), 7.

ábra). A nagymértékben rendezett szén nanocsövek immobilizációs mátrixként,

vagy mediátorként alkalmazhatók harmadik generációs amperometriás

bioszenzor készülékek kifejlesztésénél (Sotiropoulou és Chaniotakis, 2002). A

szénnanocsövek egydimenziós elektronszerkezete alkalmas lehet a heterogén

106

elektron transzfer reakciók tanulmányozására (pl. amikor különleges

biomolekulák képesek elektronikus kommunikációra a határfelületen). Már

vannak eredményes kísérletek, melyekben redox aktív fehérjék prosztetikus

csoportja és a nanocsövek felülete közötti elektrontranszfert tudtak kimutatni

(Davis és mtsai., 2003). A vizsgálatok azt mutatták, hogy a fehérje szerkezetét

és funkcióját nagymértékben befolyásolja a nanocsı környezet. A szójabab

peroxidáz aktivitásának 30%-a, az αkimotripszin aktivitásának csupán 1%-a

marad meg, ha ezek a proteinek az SWNT-höz kötıdnek (Karajanagi és mtsai.,

2004).

107

3. Célkitőzések

Lipid kettısréteg szerepének meghatározása

1) A fotoszintetikus RC foszfatidil-kolin (PC), foszfatidil-glicerol (PG) és

PC + kardiolipin (CL) lipidekbıl készített liposzómákba ültetése, és

annak a megmutatása, hogy

a) az így készített rendszerek nagy valószínőséggel lipid

kettısrétegbıl álló zárt vezikulák;

b) bennük a RC orientációja valószínőleg véletlenszerő.

2) A RC másodlagos kinonaktivitásának meghatározása PC és PG

liposzómákban (a P+Q- → PQ töltésrekombináció lassú

komponensének az amplitudója alapján).

3) A QA-QB → QAQB

- elıremenı elektrontranszport detergensben mért,

irodalomból ismert paramétereinek (gyors- és lassúfázis részaránya,

idıállandói) meghatározása mind a PC, mind a PG rendszerben.

4) Az anionikus lipidek RC-hoz való specifikus kötıdési helyeinek

meghatározása.

5) A többszörös gerjesztés során a RC többszörös átfordulásának

jellemzése különbözı membránkörnyezetekben.

A töltésstabilizálódás energetikája lipidekben

6) A P+Q- → PQ töltésrekombináció lassú komponensének kinetikájából

a QA és QB közötti szabadenergiakülönbségek meghatározása PC és

PG liposzómákban

7) A KAB hımérsékletfüggésébıl a QA/QB állapotok közötti standard

szabadentalpiakülönbségek és a két állapot közötti entrópiakülönbség

kiszámítása.

Transzmembrán protongradiens

8) Fluoreszkáló jelzımolekula (piranin) liposzómába való beépítésével a

transzmembrán protongrádiens kiépülésének, és fennmaradásának

kimutatása, kinetikájának meghatározása.

108

A fotoszintetikus RC és egyfalú szén nanocsövek kapcsolata

9) A fotoszintetikus reakciócentrumok egyfalú szén nanocsövekhez

kapcsolása és az így kapott bio-nanokompozit (SWNT/RC) anyag fı

spektroszkópiai tulajdonságainak meghatározása.

4. Anyagok és módszerek

RC fehérje tisztítása

Rhodobacter sphaeroides R-26 karotinoidmentes törzs, reakciócentrumának

izolálásánál és tisztításánál standard fehérje-tisztítási módszereket alkalmaztam:

a sejteket ultrahanggal törtem fel, a membrán-fragmentumokat (kromatoforát)

ultracentrifugálással nyertem, végül a RC-ot LDAO detergenssel oldottam ki, és

ammónium-szulfátos kicsapással, valamint DEAE-Sephacell ioncserélı

oszlopkromatográfiával tisztítottam.

Lipoproteid rendszerek preparálása

A tisztított RC-okat PC, illetve PG alapú vezikulákba helyeztem. PC/PG,

foszfatidilinozitol (PI), UQ10 (2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaisoprenol-p-benzo-

quinone) és koleszterin megfelelı mennyiségő és koncentrációjú kloroformos

oldatait kevertem össze. A keverés után lipideket nitrogénárammal Eppendorf-

csı falára szárítottam. (Ollivon és mtsai., 2000b;Trotta és mtsai., 2002).

Ezek után a csövekbe 500 µl Na-kolát-puffert (Ch) (5 mM KCl, 5 mM K-

foszfát, 1 mM piranin, pH:6.8, + 4% nátrium-kolát) mértem és 3*7 percig folya-

matos ultrahanggal kezeltem. Az így elkészített Ch/lipid alapú kevert micellák-

hoz adtam a fotoszintetikus reakciócentrum LDAO detergenses oldatát, majd

vortex-szel egy percig intenzíven kevertettem. A kevert micellákat tartalmazó

mintát elıször 5 mM foszfátot, 5 mM KCl-ot és 1 mM piranint tartalmazó

pufferrel (pH: 6.8) ekvilibrált Sephadex G-50 molekulaszőrıre vittem, és

ugyanezzel a pufferrel eluáltam. Az összegyőjtött frakcióban a RC már zárt

vezikulákba épült be, de a vezikulák mindkét oldalán levı térben (mind a veziku-

lák belsejében mind pedig azon kívül) megtalálható a piranin jelzımolekula a

kiindulási koncentráció szerint. A fıfrakciót újabb kromatográfiás eljárásnak

109

vetettem alá, mely az elsıtıl csupán abban különbözött, hogy a puffer nem

tartalmazott piranint. Ebben az esetben is jól el tudtunk különíteni egy központi

frakciót, melyben a számunkra fontos RC/lipid együttesek nagyobbik része

került. (Trotta és mtsai., 2002;Nagy és mtsai., 2004).

Fényindukált abszorpcióváltozás mérése:

A minták aktív RC-koncentrációját és a töltésrekombináció kinetikáját

abszorpcióváltozás alapján határoztam meg, házikészítéső egysugaras spektro-

fotométerrel. A flash-indukált abszorpcióváltozás az egyszeri töltésszétválasztás

kinetikájának spektrofotometriás vizsgálatainál rutinszerően használható

(Tandori és mtsai., 1995;Tandori és mtsai., 1991;Lakatos és mtsai., 2002). A

P/P+ BChl dimer elsıdleges elektrondonor és a Q/Q- akceptor komplex kinonjai

redoxállapotairól általában a 430, 450, 603, 860 nm-nél mért abszorpcióváltozás

kinetikái, illetve a BPheo 771 nm-nél mért elektrokróm eltolódásának a kinetik-

ája tájékoztat (Nagy és mtsai., 1999;Tandori és mtsai., 1995;Tiede és mtsai.,

1996)

Abszorpcióváltozás adatainak kiértékelése

A vizsgált reakciók többsége elsırendő folyamatként kezelhetı, így

exponenciális függvénnyel írható le. A kinetikák általában több fázist is

tartalmaznak (több exponenciális összegeként kezelhetık):

ahol At az amplitúdó idıfüggése, Ai az i-edik komponens amplitúdója a t = 0

idıpontban, ki pedig, a sebességi állandója.

A kinetikai paraméterekbıl a QA-QB → QAQB

- elektrontranszport ∆G0

szabadenergiaváltozása, azaz a töltés stabilzációs energiája is kiszámolható. A

folyamat KAB = [QAQB-]/[QA

-QB] egyensúlyi állandója a mért kAP és kBP

idıállandókból kiszámolható: KAB = kAP/kBP-1. Az egyensúlyi állandó ismeretében

pedig: ∆GAB0 = -kB⋅T⋅ln KAB, ahol kB a Boltzmann-állandó, T az abszolút

hımérséklet (Wraight és Stein, 1980;Kleinfeld és mtsai., 1985).

∑=

⋅−⋅=n

i

tk

iti

1

eAA

110

A szemikinon keletkezésének és eltőnésének bináris oszcillációja lénye-

gében két paraméterrel a Ke elektronegyensúlyi (Ke=[QAQB-]/[QA

-QB]) és Kq

kinonegyensúlyi állandóval (Kq = [QAQB]/[QA…] = [QA-QB]/[QA

-…]) kielégítıen

leírható (Tandori és mtsai., 1991;Nagy és mtsai., 1999;Halmschlager és mtsai.,

2002). Itt [QA…] és [QA-…] azt a RC-populációt jelenti, amelyben a másodlagos

kinon kötıhelye aktív maradt, de az a gerjesztés idıpontjában idılegesen üres.

A QB oldali kinon kötési egyensúlyi állandó, Kq = [QAQB]/[QA...] = [QA-

QB]/[QA-...], a RC gerjesztés utáni 450 nm-nél mért szemikinon jel

oszcillációjából határozható meg (Nagy és mtsai., 1999;Tandori és mtsai.,

1991;Halmschlager és mtsai., 2002). Itt a [QA...] és [QA-...] kifejezi az elsıdleges

kinon redukált és oxidált koncentrációját a RC-ban.

Fluoreszcencia vizsgálatok

A liposzómák belsejébe kötött piranin fluoreszcenciájának vizsgálatához

Perkin-Elmer MPF-44A típusú spektrofluorimétert használtam.

A gerjesztést 470 nm-rel végeztük, a fluoreszcenciát az emissziós

maximumnál. 510 nm-nél figyeltük meg. A fotomultiplier jelét megfelelı

kompenzáció és erısítés után digitális oszcilloszkópba (HITACHI VC-6025), és

a mérés után IBM számítógépbe vittük át tárolás és további feldolgozás céljából.

RC/karbon nanocsı kompozit elıállítása

Az egyfalú szénnanocsöveket Mikó Csilla tisztította Forró László

laboratóriumában (Institute of Physics of Complex Matter, Ecole Polytechnique

Fédérale de Lausanne, CH-1015 Lausanne, Svájc) és tıle szereztük be.

500 µl fotoszintetikus RC-hoz 25 µl SWNT-t adtunk és kb. 3 µl kinont

(UQ10-et). 10 ± 3 mg RC/mg SWNT tömegarányban. Ezt követıen 3 napig

dializáltuk 10 mM TRISZ és 100 mM NaCl pufferben. A mintát naponta rövid és

óvatos ultrahangozásnak vetettük alá (vízfürdıben, ELMA Transsonic 310 típusú

ultrahangozó készülékkel). A dialízis befejezése után a mintához 1 ml, az

elızıvel megegyezı összetételő puffert adtunk, majd ultracentrifugáltuk (4 °C,

10 perc, 20000 g). Ezután a felülúszót leöntöttük, a csapadékhoz pedig 1 ml

desztillált vizet adtunk és az elıbbi körülményeknek megfelelıen

111

ultracentrifugáltuk. A felülúszót ismét eltávolítottuk, a csapadékhoz 200 µl

desztillált vizet adtunk, majd ultrahangoztuk az elızıvel megegyezı paraméterek

mellett. Ezek után néhány cseppet N2-áramban üveglapra szárítottunk. A minta

egy részét szobahımérsékleten, a másik részét hőtıszekrényben 4 0C-on

tartottuk. Mértük az egyensúlyi abszorpciós spektrumokat, a minta aktivitását a

fényindukált abszorpcióváltozás mérésével jellemeztük.

112

4. Új tudományos eredmények

Lipid kettısréteg szerepe

1) A RC-ot PC, PG és PC+CL lipidekbıl készített liposzómákba beültettük, és megmutattuk, hogy

a) az így készített vezikulák nagy valószínőséggel lipid kettısrétegbıl álló zárt vezikulák;

b) bennük a RC orientáció véletlenszerő.

2) A RC másodlagos kinonaktivitása (a P+Q- - PQ töltésrekombináció lassú komponensének az amplitudója alapján értelmezve) a PC liposzómában nagyobb (84.4 %) az LDAO detergenshez (73.9 %) képest, PG liposzómában azonban kb 50%. Ez utóbbi valószínőleg a QB kötıhely hozzáférhetıségének csökkenésével magyarázható.

3) Megmértük és meghatároztuk a QA- - QB elıremenı elektrontranszport

irodalomból (detergensben) ismert mindkét komponensét mind a PC, mind a PG rendszerben.

a) A gyorsfázisnak sem a részaránya (amplitúdója), sem az idıállandója nem különbözött a liposzóma rendszerekben, jelezve, hogy az intrinsic elektrontranszfer valószínőleg hasonló mechanizmus alapján történik.

b) A lassú fázisban viszont lényeges különbség mutatkozott. A pozitív fejcsoportú PC-ban a sebességi állandó növekedett (gyorsabb elektrontranszport), a negatív töltéső PG-ban csökkent (lassabb elektrontranszport) az LDAO-hoz képest.

4) A negatív töltéső PG-ban a terbutrin csak részlegesen gátolja a QB oldal aktivitását.

5) Az anionikus lipidek specifikusan tudnak kötıdni a RC-hoz.

a) A PG kötıdése jól közelíthetı Michaelis-Menten kinetikával, jelezvén, hogy feltehetıen egy specifikus kötıhely lehet (vagy ha több van, azok kötési erıssége nem különbözik lényegesen).

b) A CL kötıdése az alacsony koncentrációknál eltér a Michaelis-Menten kinetikától. Alacsony koncentrációnál igen erıs (akár szubsztöchio-metrikus) kötıdés figyelhetı meg.

6) PC liposzómában nem csak az elsı elektrontranszfer sebességi állandója növekedett, hanem a másodiké (kAB(2)) is a detergenshez képest. Érdekes módon, a PG liposzómában is nıtt ez a sebességi állandó (az elsı elektrontranszferé jelentısen csökkent ebben a rendszerben).

7) A többszörös gerjesztés során a RC többszörös átfordulását a KAB (elektronegyensúlyi) és Kq kinonegyensúlyi állandó szabja meg. A membránkörnyezetben úgy tőnik, hogy a Kq a meghatározó tényezı, ami igen kicsi a PG liposzómákban.

113

A töltésstabilizálódás energetikája lipidekben

8) A P+Q- - PQ töltésrekombináció lassú komponensének kinetikájából meghatároztam a QA és QB közötti szabadenergiakülönbséget PC és PG liposzómákban (-62, -77, -89 mV LDAO, PC és PG rendszerekben rendre). Ez a tendencia az in vivo állapothoz való közeledést jelenti, jelezvén,hogy ezek a lipidek fontos szerepet töltenek be a RC-n belüli töltésstabilizálódásban az élı szervezetben.

9) A KAB hımérsékletfüggésébıl kiszámítottam a QA/QB állapotok közötti standard szabadentalpiakülönbségeket és a két állapot közötti entrópiakülönbséget a már ismert ∆GAB felhasználásával.

a) A folyamatokat lényegében az entalpiaváltozás vezérli,

b) a ∆H-t lényegesen a CL csökkentette,

c) az entrópia hozzájárulás mindegyik lipidben kisebb volt a detergenshez képest, de csak a detergensben volt nagyobb a termikus szintnél (k*T=25 mV/mol).

Transzmembrán protongrádiens

10) Sikerült fluoreszkáló jelzımolekulát (piranint) beépíteni liposzómába,

a) az így elkészített lipoproteid vezikulák hosszú ideig stabilak maradtak szobahımérsékleten is,

b) protonáteresztıképességük kb. 15-25%-ban sokáig megmaradt, ami további kalibrációk után alkalmas lehet arra, hogy membránpotenciált számolhassunk, illetve annak komponenseit szétválasszuk.

A fotoszintetikus RC és egyfalú szén nanocsövek kapcsolata 11) Sikerült a fotoszintetikus reakciócentrumokat egyfalú szén nanocsövekhez

kapcsolni és az így kapott bio-nanokompozit (SWNT/RC) anyag fı spektroszkópiai tulajdonságait meghatározni; a) Ez a kapcsolat a fehérjén belüli elektrontranszportot jellemzıen módosítja,

a fénygerjesztés által kiváltott pozitív és negatív töltések felhalmozódását eredményezi.

b) A fehérjén belüli töltésmozgást követı relaxációs folyamatokra is hatással van.

c) A SWNT és a RC között a fénnyel való gerjesztés után redoxkölcsönhatás lehetséges. Ez a jelenség különbözı gyakorlati alkalmazások modellje lehet.

114

5. Közlemények

a) A disszertáció alapjául szolgáló közlemények

1) Francesco Milano, Márta Dorogi, Kornélia Szebényi, László Nagy, Péter Maróti, György Váró, Livia Giotta, Angela Agostiano and Massimo Trotta (2007) Enthalpy/entropy driven activation of the first interquinone electron

transferin bacterial photosynthetic reaction centers embedded in vesicles of

physiologically important phospholipids, Bioelectrochemistry, 70, 1, 18-22 IF: 1.558

2) Márta Dorogi, Zoltán Bálint, Csilla Mikó, Klára Hernádi, László Forró, György Váró and László Nagy (2006) Stabilization effect of single-walled

carbon nanotubes on the functioning of photosynthetic reaction centers, Journal of Physical. Chemistry. B , 110, 43, 21473-21479 IF: 4.033

3) Márta Dorogi, Francesco Milano, Kornelia Szebényi, György Váró, Livia Giotta, Massimo Trotta, Angela Agostiano, Péter Maróti, László Nagy (2005) Reaction centers in lipids, Acta Biologica Szegediensis, 49(1-2), 195-197

4) László Nagy, Francesco Milano, Márta Dorogi, Massimo Trotta, Gábor Laczkó, Kornélia Szebényi, György Váró, Angela Agostiano and Péter Maróti (2004) Protein/lipid interaction in bacterial photosynthetic reaction

center: The role of phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol in charge

stabilization, Biochemistry, 43, 40, 12913-12923 IF: 4.224

5) Márta Dorogi, Francesco Milano, Massimo Trotta, Angela Agostiano, György Váró, Péter Maróti and László Nagy, (2002) Connection of charge

stabilization with proton translocation in photosynthetic reaction

center/liposome membranes, XIXth IUPAC Symposium on Photochemistry – Budapest, P51, 187-188.

6) Francesco Milano, Massimo Trotta, Márta Dorogi, Béla Fischer, Livia Giotta, Angela Agostiano, Péter Maróti, László Kálmán, and László Nagy, (2008) Measuring light generated transmembrane proton gradient in photosynthetic

reaction center/artificial lipid vesicles (in preparation)

b) Egyéb kölemények 1) Hiroko Ohmori, László Nagy, Márta Dorogi and Masahide Terazima (2008)

Charge stabilization in reaction center protein investigated by optical heterodyne detected transient grating spectroscopy, accepted to Eur. Biophys. J. with Biophys. Lett., 37, Pages: 1167-1174 IF: 1.857

2) László Nagy, Márta Dorogi, Hiroko Ohmori, Masahide Terazima and Smuel Malkin (2005) Photoacoustic and thermal grating investigations of charge stabilzation in reaction center protein, Proceedings of Forum Acusticum, Budapest, 2005, 790

c) Oktatási anyag: 1) Dorogi Márta, Szebényi Kornélia, Nagy László (2004) Abszorpciós kinetikai

mérések alkalmazása a fotoszintetikus reakciócentrumban végbemenı elektrontranszport-folyamatok jellemzésére, http://fotoszintezis.szbk.u-szeged.hu/fototan/fototan.htm

115

6. Irodalomjegyzék Allen, J. P., G. Feher, T. O. Yeates, H. Komiya, and C. D. Rees. 1987. Structure

of the reaction center from Rhodobacter sphaeroides R-26:The protein subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 84:6162-6166.

Aro, E. M., I. Virgin, and B. Andersson. 1993. Photoinhibition of Photosystem II. Inactivation, protein damage and turnover. Biochimica et Biophysica

Acta 1143:113-134.

Barlic, A., I. Gutierrez-Aguirre, J. M. M. Caaveiro, A. Cruz, M. B. Ruiz-Arguello, J. Perez-Gil, and J. M. Gonzalez-Manas. 2004. Lipid phase coexistence favors membrane insertion of equinatoxin-II, a pore-forming toxin from Actinia equina. Journal of Biological Chemistry 279:34209-34216.

Batterton, J. C. and C. Van Baalen. 1971. Growth responses of blue-green algae to sodium chloride concentration. Archives of Microbiology 76:151-165.

Baxter, R. H. G., N. Ponomarenko, V. Srajer, R. Pahl, K. Moffat, and J. R. Norris. 2004. Time-resolved crystallographic studies of light-induced structural changes in the photosynthetic reaction center. Proceedings of

the National Academy of Sciences of the United States of America 101:5982-5987.

Baxter, R. H. G., B. L. Seagle, N. Ponomarenko, and J. R. Norris. 2005a. Cryogenic structure of the photosynthetic reaction center of Blastochloris viridis in the light and dark. Acta Crystallographica Section D-Biological

Crystallography 61:605-612.

Baxter, R. H. G., B. L. Seagle, N. Ponomarenko, and J. R. Norris. 2005b. Cryogenic structure of the photosynthetic reaction center of Blastochloris viridis in the light and dark. Acta Crystallographica Section D-Biological

Crystallography 61:605-612.

Breton, J. 2007. Steady-state FTIR spectra of the photoreduction of Q(A) and Q(B) in Rhodobacter sphaeroides reaction centers provide evidence against the presence of a proposed transient electron acceptor X between the two quinones. Biochemistry 46:4459-4465.

Breton, J., M. C. Wakeham, P. K. Fyfe, M. R. Jones, and E. Nabedryk. 2004. Characterization of the bonding interactions of QB upon photoreduction via A-branch or B-branch electron transfer in mutant reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochimica et Biophysica Acta 1656:127-138.

116

Britto, P. J., K. S. V. Santhanam, and P. M. Ajayan. 1996. Carbon nanotube electrode for oxidation of dopamine. Bioelectrochemistry and

Bioenergetics 41:121-125.

Camara-Artigas, A., D. Brune, and J. P. Allen. 2002. Interactions between lipids and bacterial reaction centers determined by protein crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 99:11055-11060.

Clayton, R. K. 1978. Effects of dehydration on reaction centers from Rhodopseudomonas sphaeroides. Biochimica et Biophysica Acta 504:255-264.

Collins, P. C., M. S. Arnold, and P. Avouris. 2001. Engineering carbon nanotubes and nanotube circuits using electrical breakdown. Science 292:706-709.

Davis, J. J., K. S. Coleman, B. R. Ayamian, C. B. Bagshaw, and M. L. H. Green. 2003. Chemical and biochemical sensing with modified single walled carbon nanotubes. Chemistry-A European Journal 9:3732-3739.

Davis, J. J., R. J. Coles, and H. A. O. Hill. 1997. Protein electrochemistry at carbon nanotube electrodes. Journal of Electroanalytical Chemistry 440:279-282.

Deamer, D. W. and J. W. Nichols. 1989. Proton flux Mechanisms in model and biological-membranes. Journal of Membrane Biology 107:91-103.

Deisenhofer, J. and H. Michel. 1989. The Photosynthetic Reaction Center from the Purple Bacterium Rhodopseudomonas viridis. Science 245:1463-1473.

Dorogi, M., Z. Balint, Cs. Miko, B. Vileno, M. Milas, K. Hernadi, L. Forro, Gy. Varo, and L. Nagy. 2006. Stabilization Effect of Single-Walled Carbon Nanotubes on the Functioning of Photosynthetic Reaction Centers. Journal of Photochemistry and Photobiology 110:21473-21479.

Fathir, I., T. Mori, T. Nogi, M. Kobayashi, K. Miki, and T. Nozawa. 2001. Structure of the H subunit of the photosynthetic reaction center from the thermophilic purple sulfur bacterium, Thermochromatium tepidum Implications for the specific binding of the lipid molecule to the membrane protein complex. European Journal of Biochemistry 268:2652-2657.

Feher, G., J. P. Allen, M. Y. Okamura, and C. D. Rees. 1989. Structure and function of bacterial photosynthetic reaction centres. Nature111-116.

Feher, G. and M. Y. Okamura. 1978. Chemical composition and properties of reaction centers. The photosynthetic bacteria, Plenum, New York349-386.

117

Gallagher, M. J., D. Chen, B. P. Jacobsen, D. Sarid, L. D. Lamb, F. A. Tinker, J. Jiao, D. R. Huffman, S. Seraphin, and D. Zhou. 1993. Characterization of Carbon Nanotubes by Scanning Probe Microscopy. Surface Science 281:L335-L340.

Gensure, R. H., M. L. Zeidel, and W. G. Hill. 2006. Lipid raft components cholesterol and sphingomyelin increase H+/OH- permeability of phosphatidylcholine membranes. Biochemical Journal 398:485-495.

Gombos, Z., Zs. Varkonyi, M. Hagio, M. Iwaki, L. Kovacs, K. Masamoto, S. Itoh, and H. Wada. 2002. Phosphatidylglycerol Requirement for the Function of Electron Acceptor Plastoquinone QB in the Photosystem II Reaction Center. Biochemistry 41:3796-3802.

Graige, M. S., G. Feher, and M. Y. Okamura. 1998. Conformational gating of the electron transfer reaction QA

-QB --> QAQB- in bacterial reaction centers of

Rhodobacter sphaeroides determined by a driving force assay. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 95:11679-11684.

Hagio, M., Z. Gombos, Zs. Varkonyi, K. Masamoto, N. Sato, M. Tsuzuki, and H. Wada. 2000. Direct Evidence for Requirement of Phosphatidylglycerol in Photosystem II of Photosynthesis. Plant Physiology 124:795-804.

Halmschlager, A., M. Trotta, J. Tandori, L. Rinyu, I. Pfeiffer, and L. Nagy. 2002. A mathematical model for quinone-herbicide competition in the reaction centres of Rhodobacter sphaeroides. Functional Plant Biology 29:443-449.

Iijima, S. 1991. Helical microtubules of graphitic carbon. Nature 354:56-58.

Kalman, L., T. Gajda, P. Sebban, and P. Maroti. 1997. pH-Metric Study of Reaction Centers from Photosynthetic Bacteria in Micellular Solutions: Protonatable Groups Equilibrate with the Aqueous Bulk Phase. Biochemistry 36:4489-4496.

Kalman, L. and P. Maroti. 1994. Stabilization of Reduced Primary Quinone by Proton Uptake in Reaction Centers of Rhodobacter sphaeroides. Biochemistry 33:9237-9244.

Karajanagi, S. S., D. Y. Kim, R. S. Kane, and J. S. Dordick. 2004. Enzyme-nanotube conjugates as functional nanomaterials. Abstracts of Papers

American Chemical Society 227:U890.

Kleinfeld, D., M. Y. Okamura, and G. Feher. 1985. Electron transfer in reaction centers of Rhodopseudomonas sphaeroides. II. Free energy and kinetic relations between the acceptor states QA Qff and QAQB 2-. Biochimica et

Biophysica Acta 809:291-310.

118

Koepke, J., E. M. Krammer, A. R. Klingen, P. Sebban, G. M. Ullmann, and G. Fritzsch. 2007. pH modulates the quinone position in the photosynthetic reaction center from Rhodobacter sphaeroides in the neutral and charge separated states. Journal of Molecular Biology 371:396-409.

Krishnamoorthy, I. and G. Krishnamoorthy. 2001. Probing the link between proton transport and water content in lipid membranes. Journal of

Physical Chemistry B 105:1484-1488.

Kroto, H. W., J. R. Heath, S. C. Obrien, R. F. Curl, and R. E. Smalley. 1985. C-60 - Buckminsterfullerene. Nature 318:162-163.

Kruse, O. and G. H. Schmid. 1995. The role of phosphatidylglycerol as a functional effector and membrane anchor of the D1-core peptide from photosystem-II particles of the cyanobcterium oscillatoria-chalybea. Zeitschrift fur Naturforschung C-A Journal of Biosciences 50:380-390.

Lakatos, M., G. Groma, C. Ganea, J. K. Lanyi, and Gy. Varo. 2002. Characterization of the Azide-Dependent Bacteriorhodopsin-Like Photocycle of Salinarum Halorhodopsin. Biophysical Journal 82:1687-1695.

Lancaster, C. R. D. and H. Michel. 1997. The coupling of light-induced electron transfer and proton uptake as derived from crystal structures of reaction centres from Rhodopseudomonas viridis modified at the binding site of the secondary quinone, Q(B). Structure 5:1339-1359.

Lande, M. B., J. M. Donovan, and M. L. Zeidel. 1995. The relationship between membrane fluidity and permeabilities to water, solutes, ammonia, and protons. Journal of General Physiology 106:67-84.

Li, J., D. Gilroy, D. M. Tiede, and M. Gunner. 1997. Kinetic Phases in the Electron Transfer from P+QA

-QB to P+QAQB- and the Associated

Processes in Rhodobacter sphaeroides R-26 Reaction Centers. Biochemistry 37:2818-2829.

Mancino, L. J., D. P. Dean, and R. E. Blankenship. 1984. Kinetics and thermodynamics of the P870

+QA--]P870

+QB- reaction in isolated reaction

centers from the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas

sphaeroides. Biochimica et Biophysica Acta 764:46-54.

Maroti, P. 1991. Electron transfer and proton uptake of photosynthetic bacterial reaction centres reconstituted in phospholipid vesicles. Journal of

Photochemistry and Photobiology 8:263-277.

McAuley, K. E., P. K. Fyfe, J. P. Ridge, N. W. Isaacs, R. J. Cogdell, and M. R. Jones. 1999. Structural details of an interaction between cardiolipin and an integral membrane protein. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the U. S. A. 96:14706-14711.

119

Mezzetti, A., E. Nabedryk, J. Breton, M. Y. Okamura, M. L. Paddock, G. Giacometti, and W. Leibl. 2002. Rapid-scan Fourier transform infrared spectroscopy shows coupling of GLu-L212 protonation and electron transfer to QB in Rhodobacter sphaeroides reaction centers. Biochimica et

Biophysica Acta 1553:320-330.

Nagy, L., E. Fodor, J. Tandori, L. Rinyu, and T. Farkas. 1999. Lipids affect the charge stabilization in wild-type and mutant reaction centers of Rhodobacter sphaeroides R-26. Australian Journal of Plant Physiology 26:465-473.

Nagy, L., F. Milano, M. Dorogi, A. Agostiano, G. Laczko, K. Szebenyi, Gy. Varo, M. Trotta, and P. Maroti. 2004. Protein/Lipid Interaction in the Bacterial Photosynthetic Reaction Center: Phosphatidylcholine and Phosphatidylglycerol Modify the Free Energy Levels of the Quinones. Biochemistry 43:12913-12923.

Nagy, L., A. Puskas, J. Tandori, M. Droppa, and G. Horvath. 1991. Effect of DCMU on photosynthetic purple bacteria. Photosynthetica 25:167-171.

Nogi, T., I. Fathir, M. Kobayashi, T. Nozawa, and K. Miki. 2000. Crystal structures of photosynthetic reaction center and high-potential iron-sulfur protein from Thermochromatium tepidum: Thermostability and electron transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 97:13561-13566.

Ohmori, H., L. Nagy, M. Dorogi, and M. Terazima. 2008. Charge stabilization in reaction center protein investigated by optical heterodyne detected transient grating spectroscopy. European Biophysics Journal with

Biophysics Letters 37:1167-1174.

Ollivon, M., S. Lesieur, C. Grabielle-Madelmont, and M. Paternostre. 2000b. Vesicle reconstitution from lipid-detergent mixed micelles. Biochimica et

Biophysica Acta-Biomembranes 1508:34-50.

Ollivon, M., S. Lesieur, C. Grabielle-Madelmont, and M. Paternostre. 2000a. Vesicle reconstitution from lipid-detergent mixed micelles. Biochimica et

Biophysica Acta-Biomembranes 1508:34-50.

Paddock, M. L., G. Feher, and M. Y. Okamura. 1991. Reaction centers from three herbicide resistant mutants of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1: Kinetics of electron transfer reactions. Photosynthesis Research 27:109-119.

Paddock, M. L., S. H. Rongey, P. H. McPherson, A. Juth, G. Feher, and M. Y. Okamura. 1994. Pathway of Proton Transfer in Bacterial Reaction Centers: Role of Aspartate-L213 in Proton Transfers Associated with Reduction of Quinone to Dihydroquinone. Biochemistry 33:734-745.

120

Palazzo, G., A. Mallardi, M. Giustini, D. Berti, and G. Venturoli. 2000. Cumulant Analysis of Charge Recombination Kinetics in Bacterial Reaction Centers Reconstituted into Lipid Vesicles. Biophysical Journal 79:1171-1179.

Remy, A. and K. Gerwert. 2003. Coupling of light-induced electron transfer to proton uptake in photosynthesis. Nature Structural Biology 10:673-644.

Riegler, J. and H. Mohwald. 1986. Elastic interactions of photosynthetic reaction center proteins affecting phase-transitions and protein distributions. Biophysical Journal 49:1111-1118.

Rinyu, L., E. W. Martin, E. Takahashi, P. Maroti, and C. A. Wraight. 2004. Modulation of the free energy of the primary quinone acceptor (QA) in reaction centers from Rhodobacter sphaeroides: contributions from the protein and protein–lipid(cardiolipin) interactions. Biochimica et

Biophysica Acta 1655:93-101.

Sato, N., M. Hagio, H. Wada, and M. Tsuzuki. 2000. Requirement of phosphatidylglycerol for photosynthetic function in thylakoid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.

S. A. 97:10655-10660.

Sebban, P., P. Maroti, M. Schiffer, and D. K. Hanson. 1995. Electrostatic Dominoes: Long Distance Propagation of Mutational Effects in Photosynthetic Reaction Centers of Rhudubacter capsulatus. Biochemistry 34:8390-8397.

Sotiropoulou, S. and N. A. Chaniotakis. 2002. Carbon nanotube array-based biosensor. Analytical and Bioanalytical Chemistry 375:103-105.

Sturgis, N. J. and A. R. Niederman. 2008. Atomic force microscopy reveals multiple patterns of antenna organization in purple bacteria: implications for energy transduction mechanisms and membrane modeling. Photosynthesis Research 95:269-278.

Taly, A., L. Baciou, and P. Sebban. 2002. The DMPC lipid phase transition influences differently the first and the second electron transfer reactions in bacterial reaction centers. FEBS Letters 532:91-96.

Tandori, J., L. Nagy, and P. Maroti. 1991. Semiquinone oscillation as a probe of quinone herbicide binding in bacterial reaction centers. Photosynthetica 25:159-166.

Tandori, J., L. Nagy, A. Puskas, M. Droppa, G. Horvath, and P. Maroti. 1995. The IleL229 -> Met mutation impairs the quinone binding to the QB-pocket in reaction centers of Rhodobacter sphaeroides. Photosynthesis

Research 45:135-146.

121

Thewalt, J., N. Kitson, C. Araujo, A. Mackay, and M. Bloom. 1992b. Models of Stratum-Corneum Intercellular Membranes - the Sphingolipid Headgroup Is A Determinant of Phase-Behavior in Mixed Lipid Dispersions. Biochemical and Biophysical Research Communications 188:1247-1252.

Thewalt, J., N. Kitson, C. Araujo, A. Mackay, and M. Bloom. 1992a. Models of Stratum-Corneum Intercellular Membranes - the Sphingolipid Headgroup Is A Determinant of Phase-Behavior in Mixed Lipid Dispersions. Biochemical and Biophysical Research Communications 188:1247-1252.

Tiede, D. M., J. Vazquez, J. Cordova, and P. A. Marone. 1996. Time-resolved electrochromism associated with the formation of quinone anions in the Rhodobacter sphaeroides R26 reaction center. Biochemistry 35:10763-10775.

Trotta, M., F. Milano, L. Nagy, and A. Agostiano. 2002. Response of membrane protein to the environment: the case of photosynthetic Reaction Centre. Materials Science & Engineering C-Biometic and Supramolecular

Systems 22:263-267.

Wakeham, M. C., R. B. Sessions, M. R. Jones, and P. K. Fyfe. 2001. Is There a Conserved Interaction between Cardiolipin and the Type II Bacterial Reaction Center? Biophysical Journal 80:1395-1405.

Wraight, C. A. and R. R. Stein. 1980. Redox equilibrium in the acceptor quinone complex of isolated reaction centers and the mode of action of O-phenanthroline. FEBS Letters 113:73-77.

122

Summary

Summary

Introduction

Thanks to the structural (crystallography, Nobel prize to Michel, Deisenhofer,

Huber) and functional (theory, Nobel prize to Marcus) results together with the

works of molecular biology, computer- and electro- techniques, a wealth of

information made a relatively clear picture about the kinetics, energetics and

stabilization of electron transport within the bacterial photosynthetic reaction

center (RC) (see e.g. Sebban et al., 1995; Wraight, 2004). However, several

important questions can still be addressed. The physical parameters of the

electron transport essentially depend on the type of the RC and environmental

factors. From this point of view, the membrane environment is of special

interest.

The kinetics and thermodynamics of the electron transfer reactions in

RCs are mainly studied in detergents, and the basic processes are already known.

However, there are more and more pieces of evidences that these parameters

have different features in artificial and/or in vivo membranes. The reaction center

of Rhodobacter (Rb.) sphaeroides consists of three polypeptides, known as L, M

and H subunits. The electron transfer after light excitation is initiated by the

primary donor bacteriochlorophyll dimer, (P, BChl2) followed by transient

reduction of bacteriochlorophyll monomer (BChl) and bacteriopheophytine

(BPheo). Consequently, the electron is trapped by the primary, QA, and the

secondary quinone, QB electron acceptor. Absorbing of one photon in the

absence of secondary donor to P+ the electron is stabilized in the P+QaQb' state.

Depending on the free energy of the Qb/Qb redox couple the charge pair

recombines to the ground state PQaQb with characteristic reaction routes and

rates.

If secondary electron donor (e.g. cytochrome in vivo, or ferrocene, DAD,

TMPD etc. in vitro) is present, a second electron can be stabilized on the

secondary quinone by accepting two protons in the state of PQAQBH2. The

doubly reduced and protonated quinone then leaves the RC and is replaced by a

fully oxidized quinone, Q, from the membrane pool. This cycle can be repeated

until one of the reaction components, the donor or the quinone acceptor, is

exhausted. The function of the quinone acceptor complex of the RCs depends

both on the redox and binding properties of the quinone molecules (Nagy et al.,

2004). If the quinones are bound to the reaction center, their redox properties are

determined by the environment and the chemical identity of the molecule. In this

work I offer direct evidence for the role of characteristic native phospholipids -

phosphatidylcholine (PC), phosphatidylglycerol (PG), and cardiolipin (CL) - of

the membrane in charge stabilization in RC.

The one-dimensional structural and electronic properties of carbon

nanotubes have made them suitable candidates for the promotion of

heterogeneous electron transfer studies, in which delicate biomolecules

“communicate” with the interface of electric circuits. There are convincing

pieces of evidences that nanotubes are very efficient components in devices

based on biomatter. For example, bioelectrochemical reactions can be driven by

attaching small proteins to the surface of carbon nanotubes (Davis et al., 1997;

Britto et al., 1996). Well-controlled aligned carbon nanotubes can be applied as

immobilization matrices and as mediators for the development of third-

generation amperometric biosensor devices (Sotiropoulou and Chaniotakis,

2002). It was found that the protein structure and function were highly

influenced by the nanoscale environment. Thirty percent of the activity of the

soybean peroxidase and only 1% of the activity of the R-chymotrypsin remained

if these proteins were bound to single-walled carbon nanotubes (SWNT)

(Karajanagi et al., 2004). The present work is the first to show experiments

carried out with photosynthetic RC pigment protein complex, the well-known

redox-active enzyme in which light energy initiates a chain of intraprotein electron transport reactions attached to SWNT.

Aim s

Determining the role of the lipid bilayer

1) Building RCs into liposomes prepared from PC, PG and PC+CL lipids and

showing that the liposomes are probably closed bilayer vesicles and the

orientation of the RCs are probably random.

2) Determining the secondary quinone activity in PC and PG liposomes in terms

of the P+Q' — PQ charge recombination.

3) Determining the parameters of components of the Qa'Qb —* QaQb’ forward

electron transport in PC and PG liposomes.

4) Characterizing the binding properties of the anionic lipids (PG and CL) to the

RC.

Characterizing the energetics of charge stabilization in lipids

5) Determining the free energy difference between the QA and Qb populations in

RCs reconstituted in different lipids.

6) Characterising the thermodynamic requirements (enthalpy and entropy

contribution) of the Qa'Qb -♦ QaQb' forward electron transport in PC and PG liposomes.

Determining the transmembrane proton gradient

7) Incorporating fluorescent dye, pyranine, into the internal compartment of the

liposomes and characterising the light induced proton gradient across the lipoprotein bilayer.

Connection RCs to SWNTs

11) Preparing SWNT/RC bionanocomposite material and determining the spectral characteristics of this complex.

Materials and methods

Cell cultivation and RC preparations:

Carotenoidless Rb. sphaeroides R-26 cells were grown

photoheterotrophically under anaerobic conditions in medium supplemented with

potassium succinate. Chromatophores and RCs were prepared as described

earlier (Tandori et al., 1995). RCs were solubilized by LDAO (N,N-

dimethyldodecylamine A-oxide; Fluka) and purified by ammonium sulfate

precipitation followed by DEAE-Sephacel (Sigma) anion-exchange

chromatography. The fractions of OD28o/OD8o3 ratio between 1.27 and 1.50 were

collected and used for further experiments.

Proteoliposome preparation:

RC-proteoliposomes were prepared by gel filtration micelle-to-vesicle

transition technique. Calculated amount of phospholipid (POPC, Cholesterol,

PG, PI) is solved in chloroform and dried on the wall of conical tube under

nitrogen stream forming a thin film. The film is dissolved with 0.5 ml of Na-

cholate (1.4% solution) or OG (4%) in phosphate buffer (10 pM KPi, 10 mM

KC1, 150 pM pyranine, pH 7.2). The solution is sonicated in order to form mixed

phospholipid/detergent micelles. Small volume of the RC solution is added and

is vigorously shaken to allow the phospholipid/protein/ detergent micelles

formation than loaded on Sephadex G-50 column, previously equilibrated with

phosphate buffer (10 pM KPi, 10 mM KC1, 150 pM pyranine, pH 7.2). The

fraction containing the liposomes was collected and loaded on a second column

equilibrated with pyranine free K-phosphate buffer (10 pM KPi, 10 mM KC1, pH

7.2) in order to remove the external pyranine (Trotta et al, 2002).

Fluorescence measurements:

Pyranine is a water-soluble fluorescent dye which is very sensitive to pH

in the interval close to the pKa = 7.2 of the ionization of the hydroxyl group of

the molecule in aqueous solution. The ratio between the excitation peaks at 404

and 456 nm can be calibrated and used as an internal pH-indicator regardless the

absolute value of the emission peak, allowing to estimate the initial and final pH

values in the liposome. The steady state fluorescence excitation spectra were

measured by a Perkin Elmer MPF-44A spectrofluorimeter, which was supplied

with a home made sample holder assuring continuous stirring during pH

adjustment.

Kinetic absorption spectrophotometry.

Excitation-induced absorption changes were measured routinely by a

single-beam kinetic spectrophotometer of local design (Tandori et al. 1995;

Lakatos et al. 2002). The P/P+ and Q/Q' redox changes of the primary

bacteriochlorophyll dimer and the quinones at the acceptor complex (Nagy et al.,

1999; Tandori et al., 1995) and the electrochromic response of the absorption of

bacteriopheophytins to the Qa'Qb and QaQb' states (Tiede et al., 1996) were

detected at 603, 450, and 771 nm, respectively. The apparent one-electron

equilibrium constant in the quinone acceptor complex, KAB = [QaQb’]/[Qa'Qb],

was determined from the rate constants of the fast (kf) and slow (ks) components

of the P+(QaQb) — PQaQb charge recombination in the dark: KAS = - 1.

The free energy gap between Qa’Qb and QaQb' states is AG°Ab=-^bT In KAB,

where kn and T are the Boltzmann constant and the absolute temperature,

respectively (Wraight and Stein, 1980; Kleinfeld et al., 1985). The quinone

binding equilibrium constant of the QB site, Kq = [QaQb]/[Qa- ] = [Qa’Qb]/[Qa

...], was obtained from the model of the oscillation pattern of the semiquinone

signal measured at 450 nm upon subsequent flash excitation of the RC (Nagy et

al., 1999; Halmschlager et al., 2002). Here [QA...] and [QA\..] denote the

concentrations of the RC in oxidized and reduced states of the primary quinone,

respectively. These species are able to bind quinone to the temporarily empty Qb

site.

Binding RC to SWNT:

Commercially available SWNTs, produced by a high-pressure CO

process (HiPco), have been purchased from Carbon Nanotechnologies

Incorporated Company and were purified by wet oxidation technique in the

laboratory of László Forró (Institute of Physics of Complex Matter, Ecole

Polytechnique Fédérale de Lausanne, Switzerland). In order to bind RCs to

SWNTs purified RCs were incubated with the suspension of SWNT and

subjected to intensive dialysis against distilled water for three days. The RC

concentration was kept as high as possible, routinely 80-100 pM. The mass to

mass ratio was routinely 10+3 mg RC/mg SWNT. After the dialysis the sample

was sedimented by ultracentrifuge (100,000 x g, 20 min, SORVALL ULTRA

Pro, A-1256 rotor) and the precipitate was suspended in distilled water by

sonication for 10-20 seconds. Few drops of sample was dried onto a glass surface

under N2 stream then the optical characteristics were measured.

Data evaluation:

The standard free energy difference of the quinones, AGAb° was

determined from the apparent one-electron equilibrium constant, A:ab, in the

quinone acceptor complex. The standard enthalpy difference of the quinone

states were determined from the slope of the van't Hoff plot of the temperature

dependence of the equilibrium constant: d(\nK^o)/dT= AH0/RI2. The

thermodynamic parameters of activation related to the interquinone ET were

determined assuming the transition state theory (Eyring's equation):

AS*~R~

AH* J_ R T

where k is the observed rate constant, k is the transmission coefficient (usually

equals to 1, Andreasson et al, 2003), h is the Planck constant, R is the universal

gas constant and AH* and AS* are the enthalpy and entropy changes of activation,

respectively. AH* is calculated from the slope and AS? is determined from the

intercept of the best-fit of straight lines through the measured data.

New results

The role of the lipid bilayer1) The RCs were built in liposomes prepared from PC, PG and PC+CL lipids,

and we have shown thata) the liposomes are probably closed bilayer vesicles;

b) the orientation of the RCs are probably random.

2) The secondary quinone activity (in terms of the P+Q' - PQ charge

recombination) is larger in PC liposomes (84.4 %) compared to the LDAO

detergent (73.9 %), however, this value is only 50 % in PG liposomes. This

latter effect can be explained by the accessibility of the QB site.

3) We determined the components of the QA' -»• Qb electron transport in PC and

PG liposomes.a) There was no difference in the parameters of the fast phases indicating

that the mechanism of the intrinsic electron transfer is probably the same

in these systems.

b) There was large difference in the parameters of the slow components.

The rate of the electron transport was facilitated in PC (with positive head

group) and reduced in PG (negative head group) compared to the LDAO.

4) There was only a limited inhibition of the QB site by terbutryn in PG

environment.

5) The lipids with anionic head groups bound to specific sites of the RC.

a) The binding of PG can be well described by Michaelis-Menten kinetics

indicating the probably there is only one sepcific binding site.

b) The binding of CL at low concentration does not follow the Michaelis-

Menten kinetics.

6) The rate of the second electron transfer is also increased both in PC and PG. It

is interesting to note that the rate of the first electron transfer is decreased in

this latter system.

7) The multiple turnover of the RC is determined by the KAB electron

equilibrium constant and the Kq quinone equilibrium constant. It seems that

Kq is the determining parameter in the membrane environment and it is the

smallest in PG.

The energetics of the charge stabilization in lipids

8) By measuring the kinetics of the P+Q' -» PQ charge recombination I have

determined the free energy difference between the QA and QB populations.

It was -62, -77, -89 mV in LDAO, PC and PG, respectively.

9) By using the temperature dependence of KAb I calculated the enthalpy change

of the Qa' —» Qb electron transport and the entropy contribution to this

reaction. I have found that

a) the forward electron transport is driven by the enthalpy change in lipids;

b) the enthalpy change is reduced considerably by CL;

c) the entropy contribution was small in every lipids compared to the case

of the LDAO detergent. It was larger than thermal level (k*T=25

mV/mol) only in LDAO.

Transmembrane proton gradient

10) I managed to incorporate fluorescent dye into the internal compartment of

the liposomes.

a) The liposomes prepared this way were stable for long time also at room

temperature.

b) The proton conductivity remained at the level of about 15-25%, which

can be suitable for calculating the different components of the proton

motive force after careful calibration.

Connection of RCs to SWNTs

1 1 ) We prepared SWNT/RC bionanocomposite material and the spectral characteristics of this complex were determined.

a) The interaction between RCs and SWNTs modifies the electron transport

in the RCs specifically resulting the accumulation of positive and

negative charges.b) This interaction affects the charge relaxation processes which

accompany the electron transport as well.

c) There is a redox communication between the SWNT and RC after the light

excitation, which phenomenon can be a model for several possible practical

applications.

References

Andreasson U, Carlsson T, Andreasson LE (2003) Spectroscopic

characterization of a semi-stable, charge-separated state in Cu2+-substituted

reaction centers from Rhodobacter sphaeroides. Biochimica et Biophysica

Acta-Bioenergetics 1607, 45-52.

Britto PJ, Santhanam KSV, Ajayan PM (1996) Carbon nanotube electrode for

oxidation of dopamine. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 41, 121-125.

Davis JJ, Coles RJ, Hill HAO (1997) Protein electrochemistry at carbon

nanotube electrodes. Journal o f Electroanalytical Chemistry 440, 279-282.

Halmschlager A, Trotta M, Tandori J, Rinyu L, Pfeiffer I, Nagy L (2002) A

mathematical model for quinone-herbicide competition in the reaction

centres of Rhodobacter sphaeroides. Functional Plant Biology 29, 443-449.

Kalman L, Gajda T, Sebban P, Maroti P (1997) pH-Metric Study of Reaction

Centers from Photosynthetic Bacteria in Micellular Solutions: Protonatable

groups equilibrate with the aqueous bulk phase. Biochemistry 36, 4489-4496.

Karajanagi SS, Kim DY, Kane RS, Dordick JS (2004) Enzyme-nanotube

conjugates as functional nanomaterials. Abstracts o f Papers American

Chemical Society 227, U890.Kleinfeld D, Okamura MY, Feher G (1985) Electron transfer in reaction centers

of Rhodopseudomonas sphaeroides. II. Free energy and kinetic relations

between the acceptor states Qa Qff and QaQb 2'. Biochimica et Biophysica

Acta 809, 291-310.Lakatos M, Groma G, Ganea C, Lanyi JK, Varo Gy (2002) Characterization of

the azide-dependent bacteriorhodopsin-like photocycle of salinarum

halorhodopsin. Biophysical Journal 82, 1687-1695.

Nagy L, Fodor E, Tandori J, Rinyu L, Farkas T (1999) Lipids affect the charge

stabilization in wild-type and mutant reaction centers of Rhodobacter

sphaeroides R-26. Australian Journal o f Plant Physiology 26, 465-473.

Nagy L, Milano F, Dorogi M, Agostiano A, Laczko G, Szebenyi K, Varo Gy,

Trotta M, Maroti P (2004) Protein/lipid interaction in the bacterial

photosynthetic reaction center: phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol

modify the free energy levels of the quinones. Biochemistry 43, 12913-

12923.Palazzo G, Mallardi A, Giustini M, Berti D, Venturoli G (2000) Cumulant

analysis of charge recombination kinetics in bacterial reaction centers

reconstituted into lipid vesicles. Biophysical Journal 79, 1171-1179.

Sebban P, Maroti P, Schiffer M, Hanson DK (1995) Electrostatic dominoes: long

distance propagation of mutational effects in photosynthetic reaction centers

of Rhudubacter capsulatus. Biochemistry 34, 8390-8397.

Sotiropoulou S, Chaniotakis NA (2002) Carbon nanotube array-based biosensor.

Analytical andBioanalytical Chemistry 375, 103-105.

Tandori J, Nagy L, Maroti P (1991) Semiquinone oscillation as a probe of

quinone herbicide binding in bacterial reaction centers. Photosynthetica 25,

159-166.Tandori J, Nagy L, Puskas A, Droppa M, Horvath G, Maroti P (1995) The

IleL229 -> Met mutation impairs the quinone binding to the Qe'pocket in

reaction centers of Rhodobacter sphaeroides. Photosynthesis Research 45,

135-146.

Tiede DM, Vazquez J, Cordova J, Marone PA (1996) Time-resolved

electrochromism associated with the formation of quinone anions in the

Rhodobacter sphaeroides R26 reaction center. Biochemistry 35, 10763-

10775.

Trotta M, Milano F, Nagy L, Agostiano A (2002) Response of membrane protein

to the environment: the case of photosynthetic Reaction Centre. Materials

Science & Engineering C-Biometic and Supramolecular Systems 22, 263-

267.

Wraight CA (2004) Is the midpoint redox potential of Qa in bacterial reaction

centers pH dependent or independent? Biophysical Journal 86, 12A.

Wraight CA, Stein RR (1980) Redox equilibrium in the acceptor quinone

complex of isolated reaction centers and the mode of action of O-

phenanthroline. FEBS Letters 113, 73-77.