NATALY MACARENA SAN MARTIN SILVA

Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia

“ESTUDIO SOBRE LA ACTIVIDAD DE CARRAGENASA DE BACTERIAS EPÍFITAS DEL ALGA ANTÁRTICA Georgiella confluens”

NATALY MACARENA SAN MARTIN SILVA

VALDIVIA-CHILE

2016

Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al título de Químico Farmacéutico

PROFESOR PATROCINANTE: Dr. Sergio Leiva P. INSTITUTO: Bioquímica y Microbiología FACULTAD: Ciencias

A mi hijo Agustín y a mi tío Checho QEPD

AGRADECIMIENTOS

A Dios principalmente por haberme permitido llegar a esta instancia, a mi hijo

Agustín, por ser quien ilumina y da un completo sentido a mi vida, a mi abuelita madre

Natalia Salas, por su dedicación y sacrificio constante a lo largo de toda su vida en educar

primero a sus hijos y luego a mis hermanos, a mí y por habernos inculcado siempre la

importancia de la educación.

A mi madre Nancy Silva por su apoyo incondicional, sacrificio, trabajo y esfuerzo

para sacar adelante a sus hijos, a mi padre Juan Carlos San Martín por su constante apoyo

durante todos estos difíciles años de educación superior.

A mis tíos José Silva y Elizabeth Schlegel por estar a mi lado siempre, por su apoyo

incondicional y cariño, a mi tía Virginia Riquelme y en mención especial a Sergio Silva,

“tío Checho” quien me entregó un cariño y apoyo que jamás olvidaré y aún que no esté

presente físicamente, su recuerdo y presencia siempre está conmigo.

Al padre de mi hijo, Gonzalo Castel, por su apoyo y compañía a pesar de todas las

dificultades y situaciones adversas, por ser un padre responsable y dedicado.

A mi abuelito Mirciades Silva, por su gran cariño y por haber guiado mis primeros

pasos en la educación, a pesar de habernos dejado muy pronto, siempre está presente en mi

corazón.

A mis queridos hermanos Ignasio, Nancy, Daniela, Ágata, a mis primos hermanos

Marcelo, Diego, Jose Luis, Fernanda, Matías, Constanza, Nicolás y sobrinos Ashley,

Tomás y Luquitas, gracias a ustedes por formar parte de mi vida, por su enorme apoyo, su

cariño incondicional durante todo este proceso y por haber contribuido en mi desarrollo

profesional. Gracias a Ricardo Castro, por su apoyo, ayuda y amistad.

Agradecida enormemente de la Sra. Ismini Anastassiou, por aportar con grandes

valores humanitarios a mi vida, por ser una persona que ha apoyado a toda mi familia, en

especial a mi hijo Agustín y por colaborar a que pudiera terminar mi carrera.

Infinitamente agradecida de mi profesor patrocinante Dr. Sergio Leiva, por que hizo

posible que haya podido realizar esta tesis, gracias por su paciencia, comprensión y apoyo

constante, tanto en lo pedagógico como personal.

A mis profesores de pregrado, Dr. Humberto Dölz, Dr. Guido Ruiz y Dr. Alejandro

Jerez, a mi tía Patricia Filún, gracias por creer y confiar en mí, por contribuir en mi

desarrollo profesional y personal, por brindarme apoyo y comprensión cuando más lo he

necesitado, gracias por ser personas muy humanas, de aquellas que poco se encuentran.

1

ÍNDICE DE CONTENIDOS

1. RESUMEN ....................................................................................................................... 5

ABSTRACT .......................................................................................................................... 6

2. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 7

2.1 Comunidades bacterianas epífitas asociadas a algas ................................................. 7

2.2 Bacterias marinas productoras de carragenasas ......................................................... 9

2.3 Propiedades químicas y físicas de los carragenanos ................................................ 11

2.4 Características de los tipos de carragenanos ............................................................ 13

2.5 Aplicaciones de las carragenasas y carragenanos .................................................... 14

2.6 Bacterias epífitas Antárticas: una fuente de nuevas carragenasas ........................... 15

HIPÓTESIS ........................................................................................................................ 17

OBJETIVOS ....................................................................................................................... 17

3. MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................................... 18

3.1 Material .................................................................................................................... 18

3.1.1 Material biológico ........................................................................................... 18

3.1.2 Reactivos y medios de cultivo ........................................................................ 18

3.1.3 Equipos............................................................................................................ 18

3.1.4 Otros ................................................................................................................ 19

3.2 Métodos .................................................................................................................... 19

3.2.1 Detección de bacterias con actividad de carragenasa ..................................... 19

3.2.2 Análisis filogenético de bacterias epífitas con actividad de carragenasa ........ 19

4. RESULTADOS .............................................................................................................. 21

2

4.1 Actividad de carragenasa de cepas bacterianas epífitas de G. confluens ................. 21

4.2 Taxonomía de cepas bacterianas epífitas ................................................................. 26

5. DISCUSIÓN ................................................................................................................... 32

6. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 36

7. ANEXOS ......................................................................................................................... 37

7.1 Glosario de términos ................................................................................................ 37

7.2 Secuencia 16s rRNA de la cepa GC G5.2 ............................................................... 40

7.3 Secuencia 16s rRNA de la cepa GC G6.2 ................................................................ 41




7.7 Secuencia 16s rRNA de la cepa GC G10.2 .............................................................. 45

7.8 Secuencia 16s rRNA de la cepa GC H1.2 ................................................................ 46

7.9 Secuencia 16s rRNA de la cepa GC H2.2 ................................................................ 47

7.10 Secuencia 16s rRNA de la cepa GC H3.2 .............................................................. 48



8. LITERATURA CITADA .............................................................................................. 51

3

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructura química de los carragenanos de importancia comercial .................... 12

Figura 2. Proporción de cepas bacterianas con actividad de carragenasas ......................... 21

Figura 3. Detección de actividad de ʎ-carragenasa de bacterias epífitas de G. confluens en

un medio mineral con ʎ-carragenano como única fuente de carbono ................................. 24

Figura 4. Detección de actividad de -carragenasa de bacterias epífitas de G. confluens en

un medio mineral con -carragenano como única fuente de carbono .................................. 25

Figura 5. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la cepa GC G5.2 aislada desde la

superficie de la macroalga G. confluens .............................................................................. 27

Figura 6. Árbol filogenético Neighbor-Joining de las cepas GC H1.2, GC G8.2, GC H5.2,

GC H3.2, GC G10.2 y GC G6.2 aislada desde la superficie de la macroalga G. confluens.28

Figura 7. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la cepa GC H4.2 aislada desde la


Figura 8. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la cepa GC G9.2 y GC G7.2 aislada

desde la superficie de la macroalga G. confluens ................................................................ 30

Figura 9. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la cepa GC H2.2 aislada desde la


4

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Especies de bacterias productoras de carragenasas .............................................. 10

Tabla 2. Clasificación de carragenanos según la presencia de 3,6 Anhidro Galactosa y a la

posición y número de grupos de éster sulfato ...................................................................... 11

Tabla 3. Actividad de carragenasa de bacterias epífitas de G. confluens ........................... 22

Tabla 4. Identificación de las cepas epífitas con actividad de carragenasa ........................ 26

5

1. RESUMEN

Se investigó la presencia de enzimas carragenasas en cepas bacterianas epífitas del

alga antártica Georgiella confluens. Se analizaron un total de 33 cepas bacterianas, las

cuales fueron cultivadas en un medio mineral que contenía como única fuente de carbono -

o ʎ-carragenano. Los resultados indican que 11 cepas crecieron en este medio de cultivo, de

las cuales un 35% exhibieron actividad de ʎ-carragenasa y casi un 20% con actividad

enzimática degradadora de ambos polisacáridos.

El análisis filogenético de las secuencias parciales del gen 16s rRNA de las 11 cepas

activas reveló que éstas comparten un alto porcentaje de identidad con representantes de los

géneros Pseudoalteromonas, Cellulophaga, Lacinutrix, Colwellia y Polaribacter.

Se concluye que la macroalga roja antártica Georgiella confluens es una fuente de

bacterias epífitas productoras de enzimas con actividad de carragenasa.

6

ABSTRACT

The carrageenase activity of epiphytic bacteria of the Antarctic macroalgae

Georgiella confluens was investigated. The ability of the epiphytic isolates to degrade -

and ʎ-carrageenan was tested in 33 bacterial strains, in a mineral growth media containing

carrageenan as sole carbon source. The results showed that 11 strains were able to grow in

this growth media, with 35 % exhibiting ʎ-carrageenase activity, and almost 20 % of the

isolates were able to utilize both polysacarides.

The phylogenetic analysis of the 11 active strains based on the partial sequences of

the 16S rRNA gene showed that they shared high similarities with representatives of the

genera Pseudoalteromonas, Cellulophaga, Lacinutrix, Colwellia and Polaribacter.

In is concluded that the red algae Georgiella confluens is source of carrageenan-

degrading bacteria.

7

2. INTRODUCCIÓN

La Naturaleza ha constituido por miles de años una fuente de agentes medicinales

para el ser humano. Un gran número de fármacos se han aislado desde fuentes naturales,

especialmente plantas terrestres, las que han formado la base de un sistema de medicina

durante milenios (Cragg y Newman, 2001).

Sin embargo, los organismos marinos han sido mucho menos explorados en la

búsqueda de productos naturales y de enzimas. Muchas de las moléculas aisladas desde

bacterias marinas poseen cualidades extraordinarias, como su halogenación, siendo notable

la presencia de átomos de Cloro o Bromo. Esta halogenación rara vez se encuentra en

metabolitos de origen terrestre. Este universo de moléculas marinas biológicamente activas,

de extremada sutileza estructural, forman un armamento tan fascinante que no es de

extrañar que sean calificadas como las medicinas del futuro (Barbeyron et al, 2000).

Aunque los océanos contienen una biodiversidad superior a la de la tierra, su

exploración desde el punto de vista de búsqueda de nuevos compuestos químicos apenas se

ha iniciado y se conocen en la actualidad únicamente unos quince mil productos naturales

de origen marino, una décima parte de los terrestres. A pesar de su reciente exploración, ya

hay productos naturales marinos que han mostrado actividad hacia la mayoría de las dianas

celulares y moleculares (De la Calle, 2007).

2.1 Comunidades bacterianas epífitas asociadas a algas

Durante las últimas cuatro décadas, numerosos nuevos compuestos han sido

aislados de organismos marinos y muchas de estas sustancias han demostrado poseer

actividades biológicas interesantes (Faulkner, 2002).

El medio marino favorece la colonización y el desarrollo de microorganismos sobre

superficies inertes y vivas (Weinberger et al, 2007). Las bacterias son dominantes entre los

colonizadores de las superficies de algas, seguido de diatomeas y hongos (Qian et al, 2007).

Las superficies de algas proporcionan un hábitat rico en nutrientes, donde las macroalgas

8

liberan grandes cantidades de carbono orgánico a las bacterias, proporcionando además un

hábitat protegido y más estable que el agua de mar circundante (Lane y Kubanek, 2008).

Por lo tanto, la superficie de una macroalga proporciona un micronicho protegido

favorablemente para la colonización y reproducción bacteriana. (Englebert et al, 2008).

Macroalgas y bacterias marinas establecen una amplia diversidad de asociaciones,

que van desde beneficiosas (mutualismo), dañinas (parasitismo) y neutras (comensalismo).

Se ha demostrado que algunas bacterias influyen en el ciclo de vida de las algas en varias

maneras, incluyendo la estimulación del crecimiento, morfogénesis, germinación de

esporas y la colonización. Estas interacciones son de importancia ecológica y biogenómica,

y fundamentales en la conformación de las comunidades acuáticas (Lam et al, 2008).

El intercambio de nutrientes ha sido considerado el tipo más común de interacción.

Las algas excretan una parte de los compuestos orgánicos fotosintetizados como el carbono

orgánico disuelto (COD) y las bacterias heterótrofas descomponen porciones significativas

de éste. Las macroalgas son capaces de controlar la colonización bacteriana en sus

superficies y pueden existir mecanismos que inhiben el crecimiento excesivo de bacterias

que, a su vez, reduce la accesibilidad a los nutrientes y luz. Además, algunos grupos de

algas también producen partículas de materia orgánica, por ejemplo, partículas exopolímero

transparentes (PTE) y se ha demostrado que los PTE determinan las especies y las

actividades de bacterias heterótrofas epífitas (Van Oostende et al, 2013).

La transducción de señales es otra forma de interacción entre alga y bacteria.

Productos químicos bacterianos activan o inhiben la expresión de genes y/o actividades

fisiológicas, modificando así sus comportamientos y el crecimiento. Se ha sabido que las

bacterias secretan señales químicas que inducen morfogénesis de algas (Matsuo et al,

2005). Además, las macroalgas sanas suprimen la formación de biopelículas en exceso en

sus superficies y los estudios han revelado que las algas son capaces de excretar productos

químicos específicos que inhiben la detección de quórum bacteriano, un mecanismo

esencial para la formación de biopelículas maduras (Kavita et al, 2013). Las algas marinas

también son conocidas por excretar compuestos volátiles halogenados y ácidos grasos,

9

algunos de los cuales tienen actividades antibacterianas (Twigg et al, 2014). Además,

diferentes taxones de bacterias, por ejemplo, Shewanella, Streptomyces y Bacillus, son

conocidos por producir metabolitos algicidas.

Desde una perspectiva ecológica, la liberación de metabolitos secundarios

antimicrobianos es un tipo de defensa química que poseen las macroalgas marinas ya que

esto ayuda a reducir epibiosis, inhibir la descomposición prematura y directamente

proporcionar resistencia contra patógenos. La presencia de propiedades antibacterianas

pueden conferir a las bacterias epífitas una ventaja competitiva frente a otros colonizadores

de superficie con los cuales compiten por espacio y nutrientes (Engel et al, 2006).

Por su parte, Taylor et al, (2005) demostraron que la asociación invertebrado-

microorganismo varía entre sitios geográficos. Por ejemplo, la esponja marina Cymbstela

concentrica posee comunidades bacterianas distintas en las regiones tropicales respecto a

ejemplares que habitan aguas templadas en la costa este de Australia. Sin embargo, el

mecanismo exacto de esta especificidad geográfica se desconoce. A su vez, Long y Azam

(1996) y Mearns-Spragg et al (1998) han demostrado que un número significativamente

mayor de bacterias adheridas a superficie de organismos marinos produce una mayor

cantidad de compuestos inhibidores en comparación con las bacterias que se encuentran en

forma libre en el agua. Un claro ejemplo de bacterias epibiontes bioactivas son las que se

encuentran en las esponjas marinas, las cuales son una rica fuente de metabolitos bioactivos

con actividad antimicrobiana, citotóxica, antitumoral, que son de interés farmacéutico y

biotecnológico.

2.2 Bacterias marinas productoras de carragenasas

Bacterias y otros microorganismos capaces de degradar los polisacáridos

estructurales de macroalgas marinas (incluyendo agar, carragenato y alginato), son

comunes en el medio marino, tanto de forma libre, como asociados a algas e incluso en los

sistemas digestivos de algunos herbívoros marinos (Bull et al, 2000; Donia y Hamann,

2003; Kin, 2006; Stach, 2010). Las macroalgas marinas sintetizan una gran diversidad de

10

polisacáridos, que constituyen su pared celular y son fuente de almacenamiento de energía.

Al igual que las plantas terrestres, las algas producen polisacáridos neutros tales como

almidón y celulosa. Sin embargo, las algas marinas se caracterizan por su abundancia de

polisacáridos sulfatados, que no tienen equivalente en las plantas terrestres (Kloareg y

Quatrano, 1988). Las algas rojas (Rhodophyta) producen galactanos sulfatados, agares y

carragenanos, que son los principales componentes de su pared celular (Craigie, 1990).

Estos polisacáridos son bien conocidos por sus propiedades de gelificación, lo que permite

su utilización en una variedad de aplicaciones de laboratorio e industrias (Mc Hugh, 2003).

El carragenano es una importante fuente de carbono para las bacterias heterótrofas

marinas, las que degradan las paredes celulares de las algas rojas mediante la secreción de

glucósido hidrolasas específicas (GHS denominadas carragenasas) (Flores et al, 2007;

McKim, 2014 y Weiner, 2014). La primera descripción de una carragenasa fue realizada

por Mori (1943). Las carragenasas se han aislado a partir de Pseudomonas carrageenovora,

Klebsiella pneumoniae (Knutsen, 1994) y de diferentes cepas de Cytophaga (Potin et al,

1991). Pseudoalteromonas carrageenovora es la bacteria más estudiada que degrada

carragenano (McLean y Williamson, 1981). En la tabla 1 se muestran algunas bacterias a

partir de las cuales se han caracterizado carragenasas.

Tabla 1. Especies de bacterias productoras de carragenasas.

Especie bacteriana Enzima Referencia Pseudoalteromonas carragenovora

k-carragenasa

-carragenasa

Michel, 2001

Zovellia galactanivorans k-carragenasa -carragenasa

Barbeyron et al, 1998

Alteromonas fortis -carragenasa Michel, 2001

Pseudomonas carragenovora -carragenasa Barbeyron et al, 1994

Klebsiella pneumoniae -carragenasa Ochuba y Von Riesen, 1980

11

Sólo un pequeño número de enzimas relacionadas con la degradación de

carragenano se han identificado y caracterizado hasta la fecha, se han reportado las

propiedades enzimáticas y las secuencias de genes de algunas κ-carragenasas, ι-

carragenasas y λ- carragenasas (Barbeyron et al, 2000).

2.3 Propiedades químicas y físicas de los carragenanos

Carragenano es un nombre genérico para una familia de polisacáridos formadores

de geles y aumentadores de la viscosidad, que se obtienen por extracción a partir de ciertas

especies de algas rojas. El carragenano es derivado de un número de algas marinas de la

clase Rhodophyceae.

Fennema (2000) define los carragenanos como cadenas lineales de unidades

repetitivas de D-galactosa y 3,6 anhidro D-galactosa (3,6 AG), unidas a través de enlaces

glicosídicos α-1,3 y β-1,4, a excepción del carragenano lambda, que sólo está compuesta de

unidades de D-galactosa (Fig.1). También contienen grupos de éster sulfato en diferentes

proporciones, de acuerdo al tipo de carragenano.

Tabla N°2. Clasificación de carragenanos según la presencia de 3,6 Anhidro Galactosa y a

la posición y número de grupos de éster sulfato, (Van de Velde et al, 2005).

Tipo de carragenano

Peso molecular (kDa)

Ester sulfato (%) 3,6 Anhidro Galactosa (%)

k I 100 – 300 24 – 25 34 – 36

k II 300 – 500 25 – 28 32 – 34

500 – 700 30 – 32 28 – 32

ʎ > 700 35 0

12

Estos componentes determinan las características y propiedades de los diferentes

extractos de carragenanos. De acuerdo a lo anterior, existen los tipos kappa-I (κ-I), kappa-II

(κ -II), iota (ι) y lambda (λ), que son los de interés comercial, y otros tipos denominados mu

(μ), un (ν), xi (ζ), theta (θ) y pi (π), que se pueden encontrar a menudo en los carragenanos

nativos o cuando se utilizan métodos de extracción suaves (Tabla 2).

Figura1. Estructura química de los carragenanos de importancia comercial (Gelymar,

2007).

k-I carragenano

k-II carragenano

-carragenano

ʎ-carragenano

13

2.4 Características de los tipos de carragenanos

Según Gelymar (2007) los distintos tipos de carragenanos difieren en sus

propiedades físico-químicas.

Kappa I (κI), es el carragenano de mayor poder de gelificación, debido al alto

contenido de 3,6 anhidro galactosa, este tipo de carragenano produce geles firmes y

quebradizos en agua con alta sinéresis, requiere de alta temperatura para su completa

disolución (aproximadamente 75ºC), impartiendo baja viscosidad al sistema en el cual es

aplicada. Kappa II (κII), es el carragenano con mayor reactividad con la leche, forma geles

firmes y elásticos en agua y leche con moderada sinéresis, posee una muy alta reactividad

con las proteínas lácteas requiere de temperatura para su completa disolución

(aproximadamente 71ºC). Su viscosidad es un poco mayor comparada con el carragenano

Kappa I, dado su mayor peso molecular. Iota (ι), forma un gel muy elástico en agua y leche,

resistente a ciclos de congelado y descongelado, requiere de temperatura para su completa

disolución, aproximadamente 60ºC. Lambda (λ), es el carragenano más soluble en agua y

leche, posee un contenido de alrededor de un 35% de éster sulfato y un 0% de 3,6 anhidro

galactosa, lo que imposibilita la gelificación, es soluble en agua y leche fría, impartiendo

alta viscosidad a los sistemas en que es aplicada.

14

2.5 Aplicaciones de las carragenasas y carragenanos

Los carragenanos se utilizan ampliamente en la estabilización de una emulsión, para

el control de la sinéresis y para dar cuerpo, unión y dispersión a una solución. En la

industria farmacéutica, de los alimentos, cosméticos y sus aplicaciones, dependen de

algunas propiedades físico-químicas tales como su peso molecular, la ocurrencia de

anhidrogalactosa y contenido de sulfato (De Ruiter y Rudolph, 1997).

Está bien establecido que los niveles más altos de sulfato de éster inducen una

disminución de la resistencia del gel, por lo tanto el uso de enzimas específicas modifican

el patrón de sulfato de carragenanos, lo que ofrece un enfoque biotecnológico para

controlar su contenido de sulfato y de ese modo permitir afinar las propiedades reológicas

de estos hidrocoloides o para adaptarse a diferentes condiciones industriales (McHugh,

2003).

En la industria alimentaria, los carragenanos son ampliamente utilizados debido a

sus excelentes propiedades funcionales físicas, tales como espesante, gelificante y

capacidades de estabilización. También se utilizan en diversos productos no alimenticios,

como farmacéuticos, cosméticos, impresión y formulaciones textiles (Imeson, 2000). Estos

polisacáridos han demostrado ser útiles como excipientes en la formación de comprimidos

debido a su buena compatibilidad, alta robustez y viscoelasticidad persistente del

comprimido durante la compresión. Estas interesantes propiedades han permitido su

aplicación como excipientes de formulaciones de liberación sostenida (De Ruiter y

Rudolph, 1997). El mercado total de carragenanos se ha estimado en US $ 300 millones por

año (McHugh, 2003).

Además sus actividades biológicas están relacionadas con respuesta inflamatoria e

inmunológica, los carragenanos son potentes inhibidores de herpes y los virus VPH (virus

del papiloma humano) y hay indicios de que estos polisacáridos pueden ofrecer cierta

protección contra la infección por el VIH (Virus de la inmunodeficiencia humana) (De

Ruiter y Rudolph, 1997).

15

En pastas de dientes funcionan como un "aglutinante" para impartir las propiedades

reológicas deseadas a la pasta y para proporcionar la calidad cosmética de brillo. Las pastas

de dientes se componen de ingredientes que interactúan de manera compleja y los

carragenanos a menudo deben adaptarse cuidadosamente para lograr un desempeño

satisfactorio en una formulación particular. Asimismo el carragenano se utiliza en

combinación con el grano de guar y galactomananos de langostas como un agente

gelificante en alimentos para mascotas (Badui, 2006).

2.6 Bacterias epífitas Antárticas: una fuente de nuevas carragenasas

El continente Antártico se caracteriza por su larga historia de aislamiento y por las

condiciones climáticas extremas. Estas severas condiciones pueden haber ejercido fuertes

presiones selectivas que favorecen la evolución de bacterias con rutas metabólicas únicas,

capaces de producir enzimas y compuestos de interés biotecnológico, con características

inusuales (Lavin et al, 2013). En este sentido las bacterias de la Antártica, poseen

características fisiológicas adaptativas que habrían evolucionado para permitir su

supervivencia y funcionamiento dentro de las condiciones adversas de ese ecosistema. Por

lo tanto, bacterias aisladas desde algas antárticas podrían tener la capacidad de degradar

enzimáticamente azúcares complejos a temperaturas inferiores que aquellas aisladas desde

zonas más cálidas, lo que potencialmente podría tener aplicaciones en procesos industriales

que utilizan enzimas.

La Antártica posee una rica biodiversidad de macroalgas, registrándose 113 especies

mayoritariamente algas rojas (74 especies) presentando además un alto endemismo (55

especies) (Ramirez, 2010). Sin embargo, la diversidad de las poblaciones microbianas

asociadas a la superficie de macroalgas antárticas es muy poco conocida y mucho menos lo

son sus propiedades bioactivas y capacidades enzimáticas.

En el curso de un proyecto cuyo objetivo fue investigar la diversidad filogenética y

potencial bioactivo de bacterias epifitas de macroalgas Antárticas, se aislaron bacterias

heterotróficas desde la superficie de la macroalga submareal Georgiella confluens. Según

16

nuestro conocimiento, no existe información sobre la diversidad de bacterias epifitas de

esta macroalga y sobre su potencial enzimático. El estudio de estas cepas puede llevar al

hallazgo de no solo nuevas especies bacterianas sino que también al descubrimiento de

nuevas enzimas degradadoras de polisacáridos con interesantes y prometedoras

aplicaciones industriales, como por ejemplo, enzimas adaptadas a bajas temperaturas. Los

procesos industriales en los que se utilizan reacciones mediadas por enzimas se caracterizan

por ser energética y económicamente costosos. Así, la obtención de enzimas que presenten

actividad hidrolítica a baja temperatura podría permitir un ahorro económico y un aumento

en la eficiencia para obtener los productos finales (Georlette et al, 2004).

17

HIPÓTESIS

Algunas bacterias epifitas del alga antártica Georgiella confluens son una fuente de

enzimas con actividad de carragenasa.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Investigar la presencia de enzimas carragenasas en cepas bacterianas epífitas del

alga Antártica Georgiella confluens.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Determinar la actividad de - y -carragenasas en bacterias epífitas del alga

Georgiella confluens.

2. Determinar la identidad filogenética de las bacterias epífitas que poseen actividad

de carragenasa.

18

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1 Material

3.1.1 Material biológico

Se utilizaron 33 cepas de bacterias aisladas desde la superficie del alga antártica

Georgiella confluens. Las cepas fueron aisladas en Enero de 2014 desde Isla Rey Jorge,

Archipiélago Shetland del Sur. Estas cepas están almacenadas como cultivos puros en el

cepario del Dr. Sergio Leiva en el Instituto de Bioquímica y Microbiología.

3.1.2 Reactivos y medios de cultivo

Los reactivos empleados en esta investigación son: agar marino 2216 (DIFCO),

Platinum TAQ polimerasa (Invitrogen), Buffer TAE (MoBio), Agarosa grado biología

molecular (Invitrogen), MiniElute Gel Extraction Kit (QIAGEN), Sea Salts (SIGMA), -

carragenano (SIGMA), -carragenano (SIGMA).

3.1.3 Equipos

Los equipos empleados en esta investigación son: agitador termorregulado, agitador

orbital termorregulado (MRC), autoclave Huxley HL 341, balanza analítica AMD

GR-200 (IKA), bomba de vacío, cámara UV CC-10, centrifuga ROTINA 420R, estufa de

cultivo FOC 225E 28±1°C y 37±1°C, horno Pasteur Binder FD 240, medidor de pH

Orion 3 star (Thermo Scientific), platina calefactora, refrigerador LG a 4°C, rotavapor

Eyela Rotary Evaporator, Termociclador Personal Cycler (Eppendrof), vortex manual

Labnet, vortex VELP Scientific.

19

3.1.4 Otros

Agua destilada estéril, asa de siembra calibrada, botellas de vidrio estériles de 250 y

500 mL, filtros de membrana CA diámetro 30 nm y porosidad 0.2 μm, (Orange

scientific), guantes quirúrgicos, lápiz marcador, mechero, micropipetas de 10, 100 y

1000μL (Biopette), Parafilm, placas Petri de 90 mm de diámetro, puntas estériles para

micropipetas, probetas (Isolab) de 50 y 100 mL, rastrillo de siembra, tórulas estériles, tubos

de ensayo, tubos Falcon (ORANGE) de 10 y 50 mL, vasos precipitados de 500 y 1000 mL.

3.2 Métodos

3.2.1 Detección de bacterias con actividad de carragenasa

Todas las cepas epífitas de G. confluens fueron cultivadas en medio marino 2216

por 4 días a 20 °C con agitación permanente (100 rpm). A partir de estos cultivos, 100 μL

fueron inoculados en el siguiente mínimo: Sea salts (Sigma) 32 g/L, -carragenano (0,2 %)

o -carragenano (0,2 %). Ya que la única fuente de carbono de este medio es o -

carragenano, todas aquellas cepas que crecieron en este medio se consideraron como

activas en degradar estos polisacáridos.

3.2.2 Análisis filogenético de bacterias epífitas con actividad de carragenasa

Para el análisis filogenético se seleccionaron aquellas cepas que exhibieron

crecimiento en el medio mineral con carragenano como única fuente de carbono. El ADN

genómico de las cepas se aisló utilizando el kit de aislamiento de ADN genómico GeneJet

(ThermoScientific). Para amplificar el rRNA 16S se utilizaron los partidores universales

1492r (5´-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3´) y 27f (5´-

AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´). Para la amplificación mediante PCR se utilizó la

Platinum ® Taq DNA Polimerasa Alta Fidelidad (Invitrogen), un termociclador Personal

Cycler (Eppendorf), y un programa de amplificación que consistió de: una denaturación

inicial de 94°C por 3 min y 30 ciclos de 94°C por 30 seg, seguidos por 56°C por 30 seg y

una extensión de 72°C por 2 min, y posteriormente una extensión final de 74°C por 10 min.

20

Los fragmentos amplificados fueron visualizados mediante geles de agarosa al 2 %

teñidos con SYBR. El ADN amplificado fue extraído desde los geles y purificado por

medio del kit MinElute Gel Extraction (QIAGEN). El ADN purificado se envió a

secuenciar al Departamento de Ecología de la Pontificia Universidad Católica de Chile en

Santiago. Las secuencias resultantes fueron comparadas mediante un análisis BLAST con

las secuencias de 16S rARN contenidas en la librería de nucleótidos del GenBank.

Alineamientos múltiples con las secuencias 16S rDNA de las especies y cepas más

cercanas fueron realizados con el programa ClustalW. Arboles filogenéticos fueron

construidos mediante el método Neighbor-Joining y el programa MEGA5. La topología del

árbol filogenético se evaluó mediante 1000 repeticiones de “bootstrap”.

21

4. RESULTADOS

4.1 Actividad carragenasa de cepas bacterianas epífitas de G. confluens

En este trabajo se analizó la presencia de dos tipos de carragenasas ( y ) en 33

cepas bacterianas aisladas desde la superficie del alga antártica G. confluens. En un estudio

anterior con estas mismas cepas se reportó que el 88 % correspondían a bacterias Gram

negativas, mientras que sólo el 12 % a bacterias Gram positivas (Rebolledo, 2016). El

cultivo de las 33 cepas en un medio mineral que contenía solamente - o -carragenano

como única fuente de carbono muestra que un tercio de las cepas epífitas demostró

actividad de carragenasa, principalmente degradando -carragenano (Fig. 2). Casi un 20 %

de las cepas bacterianas demostró capacidad para degradar ambos polisacáridos. Todas las

bacterias que demostraron esta actividad degradativa de este polisacárido fueron Gram

negativas (Tabla 3).

Figura 2. Proporción de cepas bacterianas con actividad de carragenasa; A) degradación de

-carragenano. B) degradación de -carragenano. C) cepas que degradan - y -

carragenano.

Con actividad Sin actividadCon actividad Sin actividadCon actividad Sin actividad

A B C

81%

19% 35%

65%

19%

81%

22

Tabla 3. Actividad de carragenasa de bacterias epífitas de G. confluens. (+) degrada - o -

carragenano, (-) sin actividad degradativa.

1 Información obtenida de Rebolledo (2016).

Código cepa epifita

Gram1 Actividad -carragenasa

Actividad -carragenasa

GC E9.2 + - - GC G5.2 - + - GC G6.2 - + - GC D8.2 - - - GC D6.2 - - - GC H6.2 - - - GC G7.2 - + + GC I8.3 - - - GC H7.2 - - - GC G8.2 - + - GC H8.2 - - - GC H9.2 - - - GC G9.2 - + + GC G10.2 - + + GC H10.2 - - - GC I1.2 - - - GC H1.2 - + + GC I2.2 - - - GC H2.2 - + - GC I3.2 - - - GC I4.2 - - - GC H3.2 - + - GC I5.2 - - - GC H4.2 - + + GC I6.2 - - - GC H5.2 - + + GC I7.2 - - - GC F1.2 + - - GC F2.2 + - - GC I8.2 - - - GC D7.2 - - - GC D9.2 - - - GC E5.2 + - -

23

En la figuras 3 y 4 se muestran fotografías representativas de los ensayos realizados

para determinar la actividad de carragenasa. En ambos casos, se consideró como positivas

aquellas cepas que mostraron crecimiento en los medios minerales, los cuales contenían

como única fuente de carbono ya sea - o -carragenano. Después de 2 semanas de cultivo

a 20°C las cepas bacterianas que se consideraron activas mostraron un claro pellet celular al

fondo del tubo, indicativo de crecimiento y, por ende, de haber sido capaces de degradar

carragenanos. En contraste, las cepas sin actividad degradativa de carragenanos,

representadas en ambas figuras por las cepas GC F1.2 y GC D7.2, no mostraron un pellet

celular, indicativo de ausencia de crecimiento debido a su incapacidad de utilizar como

única fuente de carbono este polisacárido.

24

Figura 3. Detección de actividad de ʎ-carragenasa de bacterias epífitas de G. confluens en

un medio mineral con ʎ-carragenano como única fuente de carbono. La cepa GC F1.2 se

incluye como control negativo.

25

Figura 4. Detección de actividad de -carragenasa de bacterias epífitas de G. confluens en

un medio mineral con -carragenano como única fuente de carbono. La cepa GC D7.2 se

incluye como control negativo.

GC H1.2 GC G10.2 GC H9.2 GC G7.2 GC H5.2 GC H4.2 GC D7.2

26

4.2 Taxonomía de cepas bacterianas epífitas.

El análisis BLAST de las secuencias del gen 16S rRNA de las 11 cepas aisladas de

G. confluens reveló que pertenecen a los géneros Pseudoalteromonas, Cellulophaga,

Lacinutrix, Colwellia y Polaribacter (tabla 4). Las 11 bacterias comparten un alto

porcentaje de identidad con especies reconocidas, siendo todas Gram negativas. Los

respectivos árboles filogenéticos de las cepas degradadoras de carragenanos se muestran en

las figuras 5, 6, 7, 8 y 9.

Tabla 4. Identificación de las cepas epífitas con actividad de carragenasa.

Código cepa

Carragenano que degrada

Cepa tipo más cercana de una especie

bacteriana

N° acceso Similitud %

GC G5.2

Polaribacter irgensii

AAOG01000005

98,49

GC G6.2 Pseudoalteromonas arctica

DQ787199 99.93

GC G7.2 Cellulophaga algicola CP002453

99,71

GC G8.2 Pseudoalteromonas nigrifaciens

X82146

99,93

GC G9.2 e Cellulophaga algicida CP002453 99,79 GC G10.2 e Pseudoalteromonas

arctica DQ787199 99,86

GC H1.2 e Pseudoalteromonas arctica

DQ787199 99,93

GC H2.2 Lacinutrix himadriensis FN377744 99,28 GC H3.2 Pseudoalteromonas

translucida AY040230 99,65

GC H4.2 e Colwellia aestuarii DQ055844 98,10 GC H5.2 e Pseudoalteromonas

elyakovii AFO82562 99,93

27

Figura 5. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la cepa GC G5.2 (en negrita) aislada

desde la superficie de la macroalga G. confluens. El árbol se construyó usando la secuencia

parcial y alineada del gen 16s rRNA (1396 pb) de GC G5.2. La secuencia del gen 16S

rRNA de Cytophaga hutchinsonii M58768 se utilizó como grupo externo para enraizar el

árbol. Los valores de bootstrap (>60%) basados en 1000 remuestreos se muestra en los

nodos respectivos.

28

Figura 6. Árbol filogenético Neighbor-Joining de las cepas GC H1.2, GC G8.2, GC H5.2,

GC H3.2, GC G10.2 y GC G6.2 (en negrita) aislada desde la superficie de la macroalga G.

confluens. El árbol se construyó usando la secuencia parcial y alineada del gen 16s rRNA

(1.412 a 1421 pb) de GC H1.2, GC G8.2, GC H5.2, GC H3.2, GC G10.2 y GC G6.2. La

secuencia del gen 16S rRNA de Vibrio cholerae ATCC 14035T se utilizó como grupo

externo para enraizar el árbol. Los valores de bootstrap (>50%) basados en 1000

remuestreos se muestra en los nodos respectivos.

29

Figura 7. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la cepa GC H4.2 (en negrita) aislada


parcial y alineada del gen 16s rRNA (1.425 pb) de GC H4.2. La secuencia del gen 16S

rRNA de Escherichia coli V00348 se utilizó como grupo externo para enraizar el árbol.

Los valores de bootstrap (>60%) basados en 1000 remuestreos se muestra en los nodos

respectivos.

30

Figura 8. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la cepa GC G9.2 y GC G7.2 (en negrita)

aislada desde la superficie de la macroalga G. confluens. El árbol se construyó usando la

secuencia parcial y alineada del gen 16s rRNA (1.396 y 1.397 pb) de GC G9.2 y GC G7.2.

La secuencia del gen 16S rRNA de Bacteroides fragilis ATCC 25285T (X83935) se utilizó

como grupo externo para enraizar el árbol. Los valores de bootstrap (>60%) basados en

1000 remuestreos se muestra en los nodos respectivos.

31

Figura 9. Árbol filogenético Neighbor-Joining de la cepa GC H2.2 (en negrita) aislada


parcial y alineada del gen 16s rRNA (1.396 pb) de GC H2.2. La secuencia del gen 16S

rRNA de Flexibacter aggregans IFO 15977 (AB078042) se utilizó como grupo externo

para enraizar el árbol. Los valores de bootstrap (>60%) basados en 1000 remuestreos se

muestra en los nodos respectivos.

32

5. DISCUSIÓN

Se estima que alrededor de tres cuartas partes de la biósfera de la Tierra se

encuentra en la forma de ambientes fríos perennemente. A pesar de las condiciones

ambientales extremas de desecación y frío, los microorganismos pueden colonizar estos

hábitats a través de la adaptación de sus funciones metabólicas y la síntesis de enzimas

estructural y funcionalmente adaptadas. Sin embargo, la biodiversidad microbiana de los

ecosistemas antárticos es aún, desconocida, lo que ofrece además la oportunidad de

descubrir variados y prometedores compuestos bioactivos y enzimas.

En la actualidad existen escasos reportes sobre el potencial biotecnológico de G.

confluens y su microbiota asociada. Se cuentan solo dos investigaciones, uno de Kolender y

Matulewicz (2002) quienes investigaron sobre los polisacáridos que constituyen esta

macroalga y otro reporte trata del aislamiento de una proteína con propiedades aglutinantes

extraída desde esta macroalga (Souza et al, 2010).

En el estudio de Kolender y Matulewicz (2002) se lograron aislar polisacáridos y

propusieron sus estructuras. Se reportó la presencia de una cadena principal de agar,

altamente metilada y con un bajo contenido de 3,6-anhidrogalactosa con un patrón de

sustitución inusual, sulfatación principalmente en la posición 3 de las unidades L-galactosa

y la presencia de cadenas laterales de xilosa en la posición 4 de los residuos D-galactosa. Se

concluyó que la pared celular de G. confluens está compuesta principalmente por cadenas

de agar y carragenanos.

En los últimos años se han descrito especies bacterianas antárticas degradadoras de

polisacáridos. Se han reportado especies tales como Roseobacter algicola que degrada

almidón (Cragg et al, 2001), Flavobacterium flevense que degrada agar, carragenanos y

celulosa, Halobacter litoralis que degrada Gelatina (Barbeyron, 2000), Cytophaga

marinoflava que degrada carragenanos y almidón, y Cytophaga lítica que degrada agar,

carragenanos, celulosa y almidón (Engel, 2006).

33

Especies de bacterias marinas que degradan carragenanos incluyen a Zovellia

galactanivorans, aislada desde el alga marina Delesseria sanguínea, la cual produce

enzimas de tipo k-carragenasa e -carragenasa, además de agarasa (Barbeyron et al, 1998),

Alteromonas fortis, productora de -carragenasa (Michel et al, 2010), Pseudomonas

carragenovora, productora de - y k-carragenasa y agarasa (Weigl y Yaphe, 1966),

Microbulbifer Thermotolerans que produce -carragenasa, Klebsiella pneumoniae y

Klebsiella oxytoca, que produce -carragenasa (Knutsen, 1994). Asimismo Liu et al,

(2011) purificaron y caracterizaron una κ-carragenasa desde la bacteria marina

Pseudoalteromonas porphyrae aislada desde algas recogidas del mar Amarillo, China. En

otro reporte, Zhou et al (2008) describen una cepa bacteriana capaz de producir κ-

carragenasa, designada WZUC10, aislado desde el alga roja Plocamium telfainae, las

pruebas fenotípicas y filogenéticas características indican que esta cepa pertenece al género

Pseudoalteromonas.

En el presente estudio y sobre la base de las secuencias del gen 16s rRNA, las 11

cepas que mostraron actividad enzimática degradadora de carragenanos ʎ- y - se afiliaron a

5 géneros de bacterias Gram negativas: Pseudoalteromonas, Cellulophaga, Lacinutrix,

Colwellia y Polaribacter. Estas cepas bacterianas comparten un alto porcentaje de similitud

con especies reconocidas. Para ninguna de las especies aisladas se ha descrito actividad de

carragenasa.

La cepa GC G5.2 posee un alto porcentaje de similitud con Polaribacter irgensii,

originalmente aislada en la península Barton de la Isla Rey Jorge, Antártica (Gosink et al,

1998). Otro reporte indica que P. irgensii fue aislada a partir de agua de mar en la península

Antártica (Kim et al, 2013). Según la literatura, no se ha reportado para esta especie la

producción de carragenasas u otras enzimas degradadoras de polisacáridos.

Las cepas GC G7.2 y GC G9.2 obtuvieron un porcentaje de identidad del 99,71 y

99,79%, respectivamente, con Cellulophaga algicola, bacteria originalmente aislada desde

algas Antárticas. (Bowman, 2000). Esta bacteria posee actividad degradadora de polímeros

34

tales como gelatina, quitina, elastina, fibrinógeno y caseína, no así actividad enzimática

degradadora de carragenanos (Srinivas et al, 2007). Sin embargo, se han encontrado

reportes de otras especies de este mismo género que presentan actividad de carragenasa.

Según Souza et al (2010) Cellulophaga lytica, presenta actividad de k-carragenasa.

La cepa GC G8.2 presenta un alto porcentaje de similitud (99,95%) con

Pseudoalteromonas nigrifaciens, bacteria aislada desde aguas litorales y mar abierto

(Barbeyron, 2000), según la literatura, no se ha reportado actividad enzimática

degradadora de carragenanos y /o degradación de otros polisacáridos complejos para esta

especie.

La cepa GC H3.2 exhibió como pariente más cercano Pseudoalteromonas

translucida (96,65% de similitud), esta especie se ha aislado desde el coral Gorgonia

paragorgia arbórea y desde una muestra de agua de mar de Japón. Se reporta que

P. translucida degrada polímeros tales como gelatina, elastina y Tween 80 (Ivanova et al,

2002).

GC H5.2 obtuvo un porcentaje de similitud del 99.93% con Pseudoalteromonas

elyakovii. Esta bacteria originalmente fue aislada desde el mejillón Crenomytilus grayanus

en Rusia y desde el alga Laminaria japonica, en Japón se ha reportado que esta bacteria

hidroliza almidón, laminarina, gelatina, Tween 80 y alginato (Sawabe et al, 2000).

Las cepas GC H1.2, GC G10.2 y GC G6.2 tienen un alto porcentaje de similitud

(sobre el 99.6%) con la bacteria Pseudalteromonas arctica, especie aislada por primera vez

a partir de muestras de hielo y agua de mar del Ártico en la zona de Spitzbergen, Noruega

(Ivanova et al, 2002). Además Kim et al (2007) aislaron esta especie desde sedimentos

obtenidos en la Isla Rey Jorge, Antártica para esta especie se ha descrito actividad

enzimática de amilasa, alginasa y agarasa.

La cepa GC H2.2 demostró un porcentaje de similitud del 99.28% con la bacteria

Lacinutrix himadriensis, la cual ha sido aislada a una profundidad de 276 m en el Océano

35

Ártico (Srinivas et al, 2007). No hay reportes que Lacinutrix himadriensis produzca

enzimas que degraden carragenanos u otros polisacáridos complejos.

La cepa GC H4.2 presentó un porcentaje de similitud del 98.10% con Colwellia

aestuarii, esta especie fue aislada desde un sedimento intermareal en Corea y degrada los

polímeros caseína y tween 80 (Jung, 2006).

Los resultados de la presente investigación revelan que bacterias asociadas al alga

G. confluens son una fuente prometedora de metabolitos con actividad enzimática

degradativa de carragenanos.

Futuros estudios deberían orientarse a investigar cinética de la actividad enzimática

de las cepas positivas, lo cual llevará a seleccionar aquellas con una mayor actividad, para

posteriormente intentar su purificación. Asimismo, sería interesante estudiar si las bacterias

epífitas exhiben actividad de carragenasa a bajas temperaturas. Enzimas activas a este tipo

de temperatura tienen prometedoras aplicaciones en la industria debido a su alta eficiencia

catalítica bajo estas características, a las cuales, enzimas de organismos mesófilos, no son

activas (Kuddus, 2015).

36

6. CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en la presente investigación apoyan la hipótesis de trabajo.

Se concluye que la macroalga roja Antártica Georgiella confluens es una fuente de

bacterias productoras de enzimas con actividad de carragenasa.

Se aislaron representantes de 5 géneros con capacidad de crecer en un medio con

carragenano como única fuente de carbono, indicativo de su capacidad degradativa de este

polisacárido.

Este es el primer estudio que reporta el aislamiento de bacterias que producen

enzimas con capacidad degradativa de polisacáridos desde esta macroalga Antártica.

Así mismo es primera vez que se reporta la actividad de carragenasa desde los

representantes de Colwellia, Polaribacter y Lacinutrix.

37

7. ANEXOS

7.1 Glosario de términos:

Árbol filogenético: muestra la evolución de las relaciones de parentesco entre especies o

variantes genéticas dentro de una especie (genealogía).

Bacterias epífitas: microbiota que crece sobre los vegetales.

Bacterias exopolimero: El exopolímero es producido por los microorganismos, forma una

matriz adherente en donde estos quedan atrapados y comienzan a organizarse en colonias

con diferentes requerimientos metabólicos.

Bacterias heterótrofas: son bacterias netamente dependientes de otros seres para

sobrevivir, al no poseer Clorofila son incapaces de sintetizar sus propios alimentos, obtiene

la energía química a partir de la incorporación de los alimentos que poseen otros seres

vivos.

Biopelículas: Las biopeliculas son una serie de microorganismos agregados en un

exopolimero compuesto de glicocalix y que viven adheridas a las superficies. Tienen

características como la adhesión, heterogeneidad, comunicación intercelular, entre otras

más.

Comensalismo: es una forma de interacción biológica en la que uno de los intervinientes

obtiene un beneficio, mientras que el otro no se perjudica ni se beneficia.

Compuestos halogenados: son compuestos ya sean sintéticos o naturales, que en su

composición participa algún elemento halógeno.

38

Diatomeas: es una clase de algas unicelulares que constituye uno de los tipos más comunes

de fitoplancton.

Epibiosis: es la relación permanente o no, que se establece entre dos especies diferentes en

la que una sirve de sustrato de fijación para la otra.

Glicósido hidrolasas (GH): son una subclase de las hidrolasas, que actúan sobre los

enlaces glicosídicos (α y β) de di, oligo y polisacáridos con el fin de obtener unidades de

monosacáridos bajo dos mecanismos: inversión o retención. Las GH están involucradas en

diferentes procesos biológicos como la degradación de la biomasa y el reconocimiento

viral.

Halogenación: proceso químico mediante el cual se adicionan uno o varios átomos de

elementos del grupo de los halógenos (grupo 7 de la tabla periódica) a una

molécula orgánica. Una de las halogenaciones más simples es la halogenación de alcanos.

En estas reacciones los átomos de hidrógeno de los alcanos resultan sustituidos total o

parcialmente por átomos del grupo de los halógenos.

Hidrocoloides: Los hidrocoloides son un grupo de compuestos químicos que se caracteriza

por un elevado peso molecular, debido a que están constituidos por grupos de moléculas

que se repiten formando polímeros. Su origen puede ser vegetal, animal, microbiano y

sintético. Lo que caracteriza a los hidrocoloides es que contienen un elevado número de

grupos hidroxilo, a través de los cuales se hidratan y retienen mucha agua por formación de

puentes de hidrógeno.

Hidrolasas: son una clase de enzimas que catalizan las reacciones de hidrólisis de

diferentes sustratos como ésteres de ácidos carboxílicos y de ácidos fosfóricos, éteres,

péptidos y carbohidratos utilizando agua en el proceso.

39

Macroalga: son un tipo de alga marina multicelular y por lo tanto se diferencia de

las algas microscópicas en su tamaño. Las macroalgas son generalmente algas de tipo

marrón o rojo que se encuentran entre otros tipos de alga, como el alga verde.

Metabolitos algicidas: compuestos específicos destinados a eliminar las algas de las aguas

superficiales.

Morfogénesis: es el proceso biológico que lleva a que un organismo desarrolle su forma.

Mutualismo: es una interacción biológica, entre individuos de diferentes especies, en

donde ambos se benefician y mejoran su aptitud biológica.

Organismos mesófilos: se refiere a un organismo cuya temperatura de crecimiento óptima

está entre los 15 y los 35 °C (un rango considerado moderado). Por el contrario, los

organismos que prefieren temperaturas frías se denominan psicrófilos, y los que crecen de

forma óptima a altas temperaturas son llamados termófilos.

Parasitismo: es un tipo de simbiosis, una estrecha relación en la cual uno de los

participantes, (el parásito o huésped) depende del otro (hospedador o anfitrión) y obtiene

algún beneficio

40

7.2 Secuencia 16s rRNA de la cepa GC G5.2

ACACATGCAGTCGAGGGGTAACATTGTAGCTTGCTACAGATGACGACCGGCGC

ACGGGTGCGTAACGCGTATAGAACCTACCTTTTACAGGGGAATAGCCTTTAGA

AATGAAGATTAATGCCCCATGGTATTGAGAGTTGGCATCAACTTTTAATTAAAG

ATTTATCGGTAAAAGATGGCTATGCGTCCTATTAGTTAGTTGGTAAGGTAACGG

CTTACCAAGACAGCGATAGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGG

TACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGAC

AATGGAGGAGACTCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTAGGAAGAATGCCCTATGG

GTTGTAAACTACTTTTATACAGGAAGAAACACTGGTATGTATACCAGCTTGACG

GTACTGTAAGAATAAGGACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG

GAGGGTCCGAGCGTTATCCGGAATCATTGGGTTTAAAGGGTCCGCAGGCGGTC

AATTAAGTCAGAGGTGAAATCCCATAGCTTAACTATGGAACTGCCTTTGATACT

GGTTGACTTGAGTCATATGGAAGTAGATAGAATGTGTAGTGTAGCGGTGAAAT

GCATAGATATTACACAGAATACCGATTGCGAAGGCAGTCTACTACGTATGTAC

TGACGCTGAGGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTA

GTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGTTGTTGGGATTTATCTCAGTGACTAAG

CGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAA

AGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGA

TACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGTAGTCTGACAGCTTTAGAGATAG

AGTTTTCTTCGGACAGATTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCG

TGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTGTCGTTAGTTGCCAG

CATGTTATGATGGGGACTCTAACGAGACTGCCTACGCAAGTAGAGAGGAAGGT

GGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCCACACACGTGCTA

CAATGGTATGGACAATGAGCAGCCATCTGGCAACAGAGAGCGAATCTATAAAC

CATATCACAGTTCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGCTGGAATCG

CTAGTAATCGGATATCAGCCATGATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA

CACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCTGGGAGTGCCTGAAGTCGGTCACCGCAAG

GAGCCGCCTAG

41


ACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGGAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGC

GGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACAGT

TGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGC

TCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTC

ACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGAC

TGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAAT

GGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTG

TAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAACGGTTAATACCCGTTAGCTGTG

ACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT

ACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCG

GTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTCG

AACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTG

AAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTCA

ACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCCG

GTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAGCCTCGGTTCTGTTT

TTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAA

AACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT

TCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCAG

AGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCA

GCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCT

TAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAACC

GGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTAC

ACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGA

ATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAA

GTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCGG

GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGA

TAGTCTAACCCTCGGGAGGACGTTTACCA

42


ACACATGCAAGTCGAGGGGTAACAGGGAGCTTGCTCTGCTGACGACCGGCGCA

CGGGTGCGCAACGCGTATGCAATCTACCTCTTACTAAGGGATAGCCCAGAGAA

ATTTGGATTAATATCTTATGTGGTATATGACTGGCATCAGTTATATATTAAAGG

TTACGGTAAGAGATGAGCATGCGTCCCATTAGTTAGTTGGTGTGGTAACGGCA

CACCAAGACTTCGATGGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGGTA

CTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACA

ATGGACGGAAGTCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTAGGAAGACTGCCCTATGGG

TTGTAAACTACTTTTATACAGGAAGAATAAGATCTACGTGTAGATTGATGACGG

TACTGTAAGAATAAGGACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG

AGGGTCCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGGCT

GTTAAGTCAGAGGTGAAATGCTGCGGCTCAACCGTATGCACTGCCTTTGATACT

GGCGGTCTTGAGTTATAGTGAAGTGGCTAGAATAAGTAGTGTAGCGGTGAAAT

GCATAGATATTACTTAGAATACCGATTGCGAAGGCAGGTCACTAACTATACAC

TGACGCTGATGGACGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG

TCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGCTGTTCGGATTTCGGTCTGAGCGGCCAA

GCGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCA

AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATG

ATACGCGAGGAACCTTACCAGGGCTTAAATGTAGATTGACAGGTTTAGAGATA

GACTTTTCTTCGGACAATTTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCC

GTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTGTCGTTAGTTGCCA

GCATGTTATGATGGGGACTCTAACGAGACTGCCGGTGCAAACCGTGAGGAAGG

TGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCCACACACGTGCT

ACAATGGCCGGTACAGAGAGCAGCCATCTGGCAACAGAGAGCGAATCTATAA

AACCGGTCACAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGCTGGAAT

CGCTAGTAATCGGATATCAGCCATGATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA

CACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCCGGGAGTGCCTGAAGTCCGTCACCGTA

AGGAGCGGCCTAGG

43


ACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGC


TGGAAACGACTGCTAATACCGCATAACGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCGGC





TAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATACCTGCTAGCTGTG















ACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACCTGCGAAGGTAAGCGA




TAGTCTAACCCTCGGGAGGACGTTACCACGGA

44


ACACATGCAGTCGAGGGGTAACAGGGAGCTTGCTCCGCTGACGACCGGCGCAC

GGGTGCGCAACGCGTATGCAATCTACCTCTTACTAAGGGATAGCCCAGAGAAA

TTTGGATTAATATCTTATGTGGTATATGACTGGCATCAGTTATATATTAAAGGT

TACGGTAAGAGATGAGCATGCGTCCCATTAGTTAGTTGGTGTGGTAACGGCAC

ACCAAGACTTCGATGGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGGTAC

TGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGACAAT

GGACGGAAGTCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTAGGAAGACTGCCCTATGGGTT

GTAAACTACTTTTATACAGGAAGAATAAGATCTACGTGTAGATTGATGACGGT

ACTGTAAGAATAAGGACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGA

GGGTCCGAGCGTTATCCGGAATTATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGCGGGCTG

TTAAGTCAGAGGTGAAATGCTGCGGCTCAACCGTATGCACTGCCTTTGATACTG

GCGGTCTTGAGTTATAGTGAAGTGGCTAGAATAAGTAGTGTAGCGGTGAAATG

CATAGATATTACTTAGAATACCGATTGCGAAGGCAGGTCACTAACTATACACT

GACGCTGATGGACGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT

CCACGCCGTAAACGATGGATACTAGCTGTTCGGATTTCGGTCTGAGCGGCCAA

GCGAAAGTGATAAGTATCCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCA



GACTTTTCTTCGGACAATTTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCC

GTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTGTCGTTAGTTGCCA

GCATGTTATGATGGGGACTCTAACGAGACTGCCGGTGCAAACCGTGAGGAAGG

TGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCCACACACGTGCT

ACAATGGCCGGTACAGAGAGCAGCCATCTGGCAACAGAGAGCGAATCTATAA

AACCGGTCACAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGCTGGAAT

CGCTAGTAATCGGATATCAGCCATGATCCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA

CACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCCGGGAGTGCCTGAAGTCCGTCACCGTA

AGGAGCGGCCTAGG

45









TAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGCTTAACGGTTAATACCCGTCAGCTGTG















ACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCGA




TAGTCTAACCCTCGGGAGGACGTTTACCA

46

7.8 Secuencia 16s rRNA de la cepa GC H1.2








TAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAAGTGGTTAATACCCGTTAGCTGT

GACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA

TACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGC

GGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTC

GAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGT

GAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTC

AACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCC

GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAGCCTCGGTTCTGTT

TTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTA

AAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAA

TTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCA

GAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTC

AGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCC

TTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAAC

CGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTA

CACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCG

AATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGA

AGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCG

GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAG

ATAGTCTAACCCTCGGGAGGACGTTTACCACGGA

47


GCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGTAACATTGTGCTTGCACAGATGACGACCG

GCGCACGGGTGCGTAACGCGTATAGAATCTACCTTATACTAGGGAATAGCCTTT

GGAAACGAAGATTAATGCCCTATAGTATATTGTTTTGGCATCAAGACAATATTA

AAGGTTACGGTATAAGATGACTATGCGTTCTATTAGCTAGATGGTGTGGTAACG

GCACACCATGGCAACGATAGATAGGGGCCCTGAGAGGGGGATCCCCCACACTG

GTACTGAGACACGGACCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGGA

CAATGGAGGCAACTCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCAGGATGACTGCCCTATG

GGTTGTAAACTGCTTTTATACAGGAAGAAACCTTTTCACGTGTGAGAAGCTGAC

GGTACTGTAAGAATAAGGATCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC

GGAGGATCCAAGCGTTATCCGGAATCATTGGGTTTAAAGGGTCCGTAGGTGGA

TAATTAAGTCAGGGGTGAAAGTCTGCGGCTCAACCGTAGAATTGCCTTTGATAC

TGGTTATCTTGAATTATTGTGAAGTGGTTAGAATATGTAGTGTAGCGGTGAAAT

GCATAGATATTACATAGAATACCAATTGCGAAGGCAGATCACTAACAATATAT

TGACACTGATGGACGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAG

TCCACGCCGTAAACGATGGTCACTAGCTGTTCGAACTTCGGTTTGAGTGGCTAA

GCGAAAGTGATAAGTGACCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCA



GACTTTTCTTCGGACAATCTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCC

GTGAGGTGTCAGGTTAAGTCCTATAACGAGCGCAACCCCTGTTGTTAGTTGCCA

GCGAGTCATGTCGGGAACTCTAACAAGACTGCCAGTGCAAACTGTGAGGAAGG

TGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCCTGGGCTACACACGTGCTA

CAATGGTAGGGACAGAGAGCAGCCACTGGGCGACCAGGAGCGAATCTATAAA

CCCTATCACAGTTCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGCTGGAATCG

CTAGTAATCGCATATCAGCCATGATGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACA

CACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGCTGGGAGTGCCTGAAGTCCGTCACCGTAAG

GAGCGGC

48


GCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAGAGTAGCTTGCTACTTTGCTGA

CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACA

ACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCT

TCGGCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAT

GGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACT

GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC

ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCG

GGTTGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTGGTGGTTAATACCCGTTAG

GTGTGACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG

GTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGC

AGGCGGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCA

TTTCGAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAG

CGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTG

GGTCAACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATA

CCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAGCCTCGGTTC

TGTTTTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAG

GTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGT

TTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTT

ACCAGAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGT

CGTCAGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCT

ATCCTTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGAT

AAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGG

GCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACCTGCGAAGGTA

AGCGAATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCC

ATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTT

CCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAA

GTAGATAGTCTAACCCTCGGGAGGACGTTACCACGGAG

49


TAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAGATAGCTTGCTATCTGCTGACGAGC

GGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAATATGCCTTTGAGTGGGGGACAACAGT

TGGAAACGACTGCTAATACCGCATAACGTCTACGGACCAAAGAGGGGGACGCT

TCGGCACCTCTCGCTCATTGATTAGCCCAAGTGAGATTAGCTAGTTGGTAAGGT

AATGGCTTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCAC

ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT

TGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCT

TCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAAGGTTAGTAGTTAATAACTGC

TAGCTGTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCC

GCGGTAATACGAGGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTG

CGTAGGTGGTTTGTTAAGCAAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACT

GCATTTTGAACTGGCAAGCTAGAGTTTTGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCAGTGT

AGCGGTGAAATGCGTAGAGATTGGAAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGGCTAC

CTGGACAAAGACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTA

GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTCTGTGGTCTTG

AACCGTGGGTGGCGTAGCTAACGCGCTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCC

GCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCAT

GTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCATCCCTTGACATCCAGAGA

AGAGACTAGAGATAGACTTGTGCCTTCGGGAACTCTGTGACAGGTGCTGCATG

GCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA

CCCCTATCCTTATTTGCCAGCGAGTTATGTCGGGAACTCTAAGGAGACTGCCGG

TGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGG

ATGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAAGTACAGAGGGCAGCAATACCGCGAG

GTGGAGCGAATCCCACAAAGCTTGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCG

ACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAAT

ACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAA

AAGAAGTGGCTAGTTTAACCCTTCGGGGAGGACGGTCACCACT

50


TAACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGA

GCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTGGGAACATGCCTTGAGGTGGGGGACAACA

GTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAATGTCTACGGACCAAAGGGGGCTTCG

GCTCTCGCCTTTAGATTGGCCCAAGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGC

TCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGG

ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACA

ATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGT

TGTAAAGCACTTTCAGTCAGGAGGAAAGGTTAATAGTTAATACCTGCTAGCTGT

GACGTTACTGACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA

TACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGC

GGTTTGTTAAGCGAGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTC

GAACTGGCAAACTAGAGTGTGATAGAGGGTGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGT

GAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCACCTGGGTC

AACACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGGATTAGATACCCC

GGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTACTAGAAGCTCGGAGCCTCGGTTCTGTT

TTTCAAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTA

AAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAA

TTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACACTTGACATACAGAGAACTTACCA

GAGATGGTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTC

AGCTCGTGTTGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCC

TTAGTTGCTAGCAGGTAATGCTGAGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGATAAAC

CGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGTGTAGGGCTA

CACACGTGCTACAATGGCGCATACAGAGTGCTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCG

AATCACTTAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGA

AGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTATCAGAATGACGCGGTGAATACGTTCCCG

GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAG

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NATALY MACARENA SAN MARTIN SILVA