NEOPLASIE MIELOIDI THERAPY-RELATED - siesonline · • Deregolazione dell’espressione genica di numerosi pathway coinvolti nei principali processi cellulari, probabilmente dovuta

NEOPLASIE MIELOIDI THERAPY-RELATED

Frequenze polimorfiche e analisi mutazionale

PhD. Emiliano Fabiani Istituto di Ematologia Universita’ Cattolica Sacro Cuore Rome, Italy

SIES, Firenze, Marzo 2013

Neoplasie Mieloidi therapy-related (t-MN)

•  Disordini mieloidi dovuti al trattamento con agenti chemio e/o radioterapici in pazienti affetti da precedenti tumori o malattie autoimmuni.

•  Rappresentano un modello di studio unico (in vivo) di leucemogenesi

indotta da esposizione ad agenti cancerogeni. •  Caratterizzate da un’alta incidenza di monosomie, cariotipi complessi e

mutazioni di p53. •  Mutazioni tipiche delle AML de novo, quali FLT3, NPM1, CEBPA, and

TET2 sono invece più rare. •  Deregolazione dell’espressione genica di numerosi pathway coinvolti nei

principali processi cellulari, probabilmente dovuta all’effetto sinergico di terapia e predisposizione individuale che induce la trasformazione leucemica.

Suscettibilità individuale

Solo una minima parte (<5%) dei soggetti esposti a trattamento chemio e/o radioterapico va incontro a leucemia therapy-related (t-MN).

Appare quindi evidente il ruolo svolto dalla suscettibilità individuale dei progenitori ematopoietici agli agenti citotossici.

  Detossificazione cellulare   Riparazione del DNA

  Apoptosi

Mutazioni Somatiche Polimorfismi

  Regolazione epigenetica   Controllo dello Splicing

Scopo dello studio

Polimorfismi

•  Sono variazioni genetiche presenti con una frequenza maggiore dell'1% nella popolazione.

•  Possono essere determinati da sostituzioni di singole basi (SNP), delezioni o inserzioni nel DNA.

•  Sono una possibile causa della suscettibilità individuale del paziente.

•  Possono influenzare il rischio di sviluppare una patologia.

•  Possono modulare la risposta al trattamento.

Terapia Citotossica

Antimetaboliti Agenti Alchilanti

Inibitori Topoisomerasi II

Radiazioni Ionizzanti

Det

ossi

ficaz

ione

(fa

se I

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)

Mod

ulaz

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DNA Riparato Riparazione Anomala Danno Irreversibile

Cellula Normale

Possibile clone t-MN

Induzione dell’Apoptosi

Danno al DNA • Singolo filamento • Doppio filamento

Terapia e suscettibilità individuale

Polimorfismi studiati

Detossificazione Riparazione del DNA Apoptosi

•  CYP3A4 (-A290G) •  NQO1 (Pro187Ser) •  GSTA1 (-C69T) •  GSTM1 (Delezione) •  GSTP1 (Ile105Val) •  GSTT1 (Delezione)

•  RAD51 (-G135C) •  XRCC3 (Thr241Met) •  ATM (F858L; P1054R; D1853N) •  MTHFR (C677T; A1298C)

•  BCL2L10 (Leu21Arg) (rs2231292)

Metodi di studio PCR-RFLP:

NQO1, GSTA1, GSTP1, RAD51, XRCC3, MTHFR e BCL2L10

PCR-TRIPLEX: GSTM1 e GSTT1 (gene di riferimento BCL2)

MisMATCH-PCR-RFLP: CYP3A4

SANGER SEQUENCING: ATM (F858L; P1054R; D1853N)

BCL2L10 un gene dalla funzione ambigua

Diva, a Bcl-2 homologue that binds directly to Apaf-1 and induces BH3-independent cell death. (Inohara N, et al. J Biol Chem 1998).

Ruolo Pro-apoptotico Boo, A novel negative regulator of cell death, interacts with Apaf-1. (Song Q, et al. EMBO J 1999).

Ruolo Anti-apoptotico

MOUSE Bcl-2 homology domain (BH1, BH2, BH3, and BH4)

The murine Boo (Diva) protein has been variably reported to either suppress or promote apoptosis. In transient transfection assays performed in four different human tumor cell lines,

we consistently observed an anti-apoptotic action of Bcl-B. (Ke N, J Biol Chem 2001).

HUMAN (Bcl-B, BCL2L10)

The pro-apoptotic effect of BCL2L10 and growth promotion by BCL2L10 siRNA in gastric cancer cells suggest that it may be a tumour suppressor. (Xu JD, et. al., J Pathol 2011).

Bcl2l10 is an antiapoptotic member of the Bcl-2 family that has evolved rapidly throughout the vertebrate lineage. (Guillemin Y, et al., Mol Biol Evol. 2011 ).

Ieri

O

ggi

Role of BCL2L10 methylation and TET2 mutations in higher risk myelodysplastic syndromes treated with 5-azacytidine. I pazienti che presentano una metilazione nel gene BCL2L10 superiore al 50% presentano una minore probabilità di risposta al trattamento (p=0.047) e una “Overall survival” ridotta (P=0.040).

Analysis of genome-wide methylation and gene expression induced by 5-aza-2'-deoxycytidine identifies BCL2L10 as a frequent methylation target in acute myeloid leukemia.

BCL2L10 dall’Epigenetica alla Genetica

In nessuno dei controlli il promotore di BCL2L10 è risultato metilato

Fabiani E, Voso MT, et al., Leuk Lymphoma 2010. Voso MT, Fabiani E, et al., Leukemia. 2011.

Popolazione di controllo n (range) 259

Età media Range

65

(19-92) Sesso Maschi Femmine

130 129

Neoplasie mieloidi therapy-related Popolazione di controllo

Popolazioni Analizzate

Controlli ospedalieri senza precedenti tumori o patologie ematologiche.

Pazienti n (range) 111

Età mediana (anni, mediana, range) 64 (16-88) Sesso (M/F) 42/69 Tipo t-NM secondo WHO: -  MDS -  AML

50 61

Neoplasia primitiva : -  Malattia linfoproliferativa -  Mammella -  Urogenital -  Gastro-intestinale -  Tiroide -  Polmone -  Altro

36 27 17 8 6 6 11

Terapia per neoplasia precedente -  Chemioterapia -  Radioterapia -  Chemioterapia + radioterapia

60 15 36

Cariotipo •  Normale •  Complesso •  Del 7 •  Altro •  Non valutabile

28 23* 11 30 19

* includenti alterazioni del cromosoma 7 in 3 casi

Popolazioni Analizzate


Età mediana (anni, mediana, range) 71 (30-93) Sesso (M/F) 84/62 Sottotipo SMD, classificazione WHO: -  AR -  Sindrome 5 q- -  ARSA -  RCMD -  AREB-1 -  AREB-2 -  MDS/MPL (CMML)

30 4 17 13 22 36

24 (17) Cariotipo (rischio): -  Basso -  Intermedio -  Alto -  Non valutabile

83 15 21 27

Rischio IPSS: - Basso/intermedio-1 - Intermedio-2 /alto - Non valutabile

71 58 17


Età mediana (anni, mediana, range) 66 (16-90) Sesso (M/F) 53/ 57 Sottotipo WHO •  AML, non altrimenti categorizzata (NOS): -  AML senza maturazione -  AML minimamente differenziata -  AML con maturazione -  Leucemia acuta mielomonocitica -  Leucemia acuta monoblastica/Monocitica -  Leucemia acuta eritroide -  NOS •  AML con alterazioni citogenetiche ricorrenti: -  APL con t(15;17)(q22;q12) -  AML con inv(16)(p13.1q22) -  AML con t(8;21)(q22;q22)

•  AML con displasia multilineare

68 7 6 15 12 5 4 19 21 16 3 2 21

Leucociti (109 /L ) (mediana, range) 8.9 (0.4-200) Blasti midollari (%) (mediana, range) 66 (16-90) Cariotipo: -  Favorevole -  Intermedio -  Sfavorevole -  Non valutabile

21 47 15 27

Sindromi mielodisplastiche Leucemie mieloidi acute

Polimorfismi della Detossificazione nelle t-MN

Polimorfismi dei geni della riparazione del DNA nelle t-MN

Polimorfismi della riparazione del DNA in corso di analisi

(MTHFR: C677T, A1298C)

MTHFR t-‐MN (86) Controls (218) Statistical Analysis C677T n (freq) n (freq) OR (95%Cl) p-‐Value CC 34 (39.5%) 72 (33%) 1.00(Ref) CT 46 (53.5%) 106 (48.6%) 0.92 (0.52-‐1.63) 0.86 TT 6 (7%) 40 (18.4%) 0.32 (0.10-‐0.86) 0.024 CT+TT 52 (60.5%) 46 (67%) 0.85 (0.44-‐1.31) 0.35

t-‐MN (74) Controls (219)

A1298C n (freq) n (freq) OR (95%Cl) p-‐Value AA 41 (55.4%) 108 (49.3%) 1.00(Ref) AC 27 (36.5%) 92 (42%) 0.77 (0.43-‐1.40) 0.45 CC 6 (8.1%) 19 (8.7%) 0.83 (0.25-‐2.37) 0.90 AC+CC 33 (44.6%) 111 (50.7%) 0.78 (0.45-‐1.37) 0.44

Frequenze aplotipiche della Metilene-tetraidrofolato reduttasi

(MTHFR)

t-‐MN (71) Controls (218)

Haplotype n (freq) n (freq) OR (95%CI) p-‐value

C-‐A * 59 (0,46) 145 (0,38) Ref T-‐A 46 (0,28) 161 (0,32) 0,70 (0,44-‐1,12) 0.12 C-‐C 34 (0,20) 105 (0,19) 0,80 (0,47-‐1,34) 0.36 T-‐C 3 (0,06) 25 (0,11) 0,29 (0,06-‐1,03) 0,04 ++ * wild-‐type ++ Fisher exact test

ATM t-‐MN (109) Controls (81) Statistical Analysis D1853N n (freq) n (freq) OR (95%Cl) p-‐Value GG 73 (67%) 62 (76.5%) 1.00(Ref) GA 31 (28.4%) 17 (21%) 1.55 (0.74-‐3.24) 0.27 AA 5 (4.6%) 2 (2.5) 2.12 (0.33-‐2.92) 0.45 GA+AA 36 (33%) 19 (23.5%) 1.61 (0.80-‐3.25) 0.20 t-‐MN (80) Controls (64) P1054R n (freq) n (freq) OR (95%Cl) p-‐Value CC 70 (87.5%) 63 (98.4%) 1.00(Ref) CG 9 (11.25%) 1 (1.6%) 8.10 (1.06-‐360.55) 0.023 GG 1 (1.25%) -‐ NA NA CG+GG 10 (12.5%) 1 (1.6%) 9.00 (1.21-‐396.64) 0.023 t-‐MN (110) Controls (0) F858L n (freq) n (freq) OR (95%Cl) p-‐Value TT 106 (96.4%) -‐ -‐ -‐ TC 4 (3.6%) -‐ -‐ -‐ CC -‐ -‐ -‐ -‐ TC+CC 4 (3.6%) -‐ -‐ -‐

Polimorfismi della riparazione del DNA in corso di analisi

(ATM: D1853N, P1054R, F858L)

Genotype

BCL2L10-Leu21Arg nelle t-MN

BCL2L10-Leu21Arg nelle MDS e AML de novo

Conclusioni Analisi dei polimorfismi

•  Le varianti polimorfiche dei geni della detossificazione cellulare non sembrano influenzare il rischio di t-MN.

•  Solo un trend è stato riscontrato in GSTP1 (p=0.052).

•  La variante polimorfica MTHFR C677T sembra ridurre il rischio di t-MN.

•  La variante polimorfica ATM P1054R sembra aumentare il rischio di t-MN. •  La variante polimorfica del gene BCL2L10 assume un ruolo protettivo nelle

MDS de novo (p=0.0003) e nelle t-MN (p=0.017). •  La variante polimorfica del gene BCL2L10 è più frequente nelle AML de

novo rispetto alle t-AML (p=0.034), suggerendo un ruolo protettivo nello sviluppo delle leucemie indotte dal trattamento farmacologico.

Analisi mutazionale Regolazione dell’espressione genica

Nelle AML de novo sono state individuate numerose mutazioni somatiche nei geni implicati nel controllo della metilazione (DNMT3A, IDH1, IDH2, TET2 e EZH2).

Nelle MDS sono state individuate numerose mutazioni somatiche nei geni implicati nel controllo dello splicing (U2AF1, SRSF2, SF3B1 e ZRSR2).

Adapted from Prensner & Chinnaiyan, Nature Medicine 2011

Metilazione del DNA e regolazione dell’espressione genica

Adapted from Yoshida K et. al., Nature 2011

Fattori di Splicing e regolazione dell’espressione genica

Componenti dello splicing mutati nelle MDS U2AF1 (U2 Small Nuclear RNA Auxiliary Factor 1)

SRSF2 (Serine/Arginine-Rich Splicing Factor-2) SF3B1 (Splicing Factor3b,Subunit-1)

PaGent CharacterisGcs n (range) Median age – years 65.5 (16-‐88) Sex (M/F) 32/45 Type of t-‐MN AML (BM Blasts > 20%) MDS

39 38

Primary diseases: -‐ Malignancies LymphoproliferaTve disease Breast Genito-‐Urinary Gastro-‐IntesTnal Thyroid Other solid tumor Acute leukemia -‐Autoimmune diseases

25 18 13 7 4 5 2 3

Treatment for Primary diseases Chemotherapy Radiotherapy Combined Unknown

34 10 23 10

Median latency between primary cytotoxic therapy and t-‐MN diagnosis – years

6.1 (0.7-‐32)

Karyotype (n=58) -‐ Normal -‐ Isolated chromosome 7 abnorm. -‐ Complex -‐ Balanced translocaTon -‐ Other abnormaliTes

19 7 16 6 10

Neoplasie Mieloidi Th-R (77) Leucemie Secondarie a Neoplasie Mieloproliferative Croniche (16)

Patient Characteristics n (range) Median age (years, median, range)

69.5 (54-81)

Sex (M/F) 8 / 8

Bone marrow blasts (%, median, range)

37.5 (10-76)

Primary MPN Polycytemia Vera Idiopatic Myelofibrosis Essential thrombocytemia Hypereosinophilic syndrome

8 6 1 1

Median latency between primary MPN and secondary leukemia diagnosis (median, range)

4.7 (1.4-15.5)

Karyotype - Normal - Isolated chromosome 5 and/or 7 deletion - Trisomy 8 - Complex karyotype *

5 2 1 8

*Of 5 patients with a complex karyotype, 2 had 11q23 abnormalities and 3 had a chromosome 5 and/or 7 deletion

Caratteristiche cliniche delle popolazioni studiate

Hot-spot mutations studiate mediante Sanger sequencing

Distribuzione delle mutazioni nelle t-MN

Neoplasie Mieloidi Therapy-related

IDH-1 R132

IDH-2 R140-R172

DNMT3A R882

SRSF2 P95-P96

U2AF1 S34-R35

SF3B1 K700

3/77 (3.9%) 2/76 (2.6%) 4/77 (5.2%) 8/77 (10.4%) 0/76 (0.0%) 3/74 (4.0%)

•  Nessuna mutazione degli enzimi epigenetici nelle t-MN secondarie a malattia linfoproliferativa e solo una mutazione nel gene SRSF2 (1/25, 4%).

•  Nelle t-MN successive a tumori solidi, abbiamo riscontrato mutazioni degli enzimi epigenetici solo nelle t-AML (7/29 t-AML vs 0/20 t-MDS, p=0.01).

•  Nelle t-MN successive a tumori dell’apparato uro-genitale abbiamo riscontrato una maggiore incidenza delle mutazioni di SRSF2 rispetto alle altre t-MN (4/13, 30.8% vs 4/64, 6.2%; p=0.02).

Voso MT, Fabiani E, et al., Leukemia 2012

Le leucemie evolute da MPN presentano una frequenza di mutazioni negli enzimi epigenetici e

dello splicing superiore a quella delle t-MN

•  IDH1-IDH-2 (5/15 MPN, 33.3% vs 5/76 t-MN, 6.6%; p=0.01). •  SRSF2 (5/15 MPN, 33.3% vs 8/77 t-MN, 10.4%; p=0.03).

Patient Characteristics IDH1/2 (n=5/15)

DNMT3A (n=2/16)

SRSF2 (n=5/15)

Age at leukemic transformation (LT)

> 60 yrs < 60yrs

5/11 0/4

2/12 0/4

5/11 0/4

Type of MPN Polycytemia Vera (PV) Idiopatic myelofibrosis HES or ET

2/7 3/6 0/2

1/8 1/6 0/2

2/7 2/6 1/2

Treatment of MPN Hydroxyurea (HU) alone HU + Radiotherapy (RT) HU+ Pipobroman +RT HU+ 6-mercaptopurine Cyclophosphamide RT + Chemotherapy for a previous solid tumor

4/10 1/1 0/1 0/1 0/1 0/1

1/10 1/1 0/1 0/1 0/1 0/2

5/10 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1

Maggiore incidenza delle mutazioni dei geni studiati in pazienti che hanno manifestato la trasformazione leucemica dopo i 60 anni di età


Months from MPN diagnosis

Prob

abili

ty (%

)

Time to Leukemic evolution

SRSF2-mutated SRSF2-wild type

p=0.04

Le mutazioni di SRSF2 sembrano influenzare il tempo di trasformazione leucemica delle MPN

Latency to leukemic transformation

IDH1/2 (n=5/15)

DNMT3A (n=2/16)

SRSF2 (n=5/15)

< 5 yrs > 5 yrs

3/8 2/7

0/9 2/7

5/8 0/7

•  Tempo di latenza da MPN a trasformazione leucemica (1.4-15.5 anni).

•  Tempo di latenza medio

4.7 anni. •  Al cut off di 5 anni


•  L’incidenza delle mutazioni negli enzimi epigenetici e dello splicing nelle t-MN varia in base al tipo di tumore primario.

•  Tali mutazioni sono rare o assenti nei pazienti con precedente malattia

linfoproliferativa, ma frequenti nelle t-MN derivate da tumori primari solidi ed evolute da MPN.

•  Il gene SRSF2, con le sue mutazioni in posizione P95 e P96, sembra

essere un nuovo candidato quale responsabile della leucemogenesi secondaria, sia nelle MPN che nelle t-MN secondarie a tumori solidi.

Conclusioni Analisi mutazionale

Ringraziamenti

Giulia Falconi Luana Fianchi Antonella La Brocca Marianna Criscuolo Silvia Betti Francesco D’Alo’ Patrizia Chiusolo Stefan Hohaus

Silvia Soldini Rosaria Santangelo

Istituto di Ematologia Istituto di Microbiologia

Maria Teresa Voso

Valerio De Stefano Giuseppe Leone

UCSC, Roma

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