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Neutrófilo, MEV
Injetando DNA exógenos no núcleo de um ovo de camundongo, microscopia de luz polarizada
Monócitos do sangue, MEV
Bacilus anthracis
Células
Fermento, MET
Macrófago, MET
Trypanosoma brucei
Glóbulos vermelhos
Linfócito-T, METLinfócitos , microscopia óptica
Glóbulosvermelhos
Neurônios do córtex cerebral
Corte, microscopia óptica
Célula epitelial de rim de canguruMicroscopia de fluorescênciaVermelho: actinaVerde: microtúbulosAzul: DNA
Microscopia eletrônica de transmissão
Mitocôndria, TMEMitocôndria, TME
Tecido muscular estriado
Epitélio estratificado ceratinizado(pele)
Tecidos
Intestino delgado
Córtex renal e glomérulo
Ilhota pancreática
Uso de Células Troncona Terapia Celular:
Realidade ou Ilusão?Marco Antonio Zago
Instituto de Física São CarlosUSP
Agosto – 2011
Universidade de São Paulo
I have seen a medicineThat’s able to breathe life into a stone,Quicken a rock, and make you dance canaryWith spritely fire and motion, whose simple touchIs powerful to araise King Pippen, nay,To give great Charlemain a pen in 's handAnd write to her a love-line.
W. ShakespeareAll's Well That Ends Well
A Miraculous Medicine
Universidade de São Paulo
Terapia Celular
Terapia CelularConjunto de novas técnicas ou métodos para substituir células doentes ou disfuncionais com células sadias
Imunoterapia: células dendríticas
Aférese, criopreservação, imunosseleção
Terapia gênica
Medicina regenerativa (substituição de tecidos, células e órgãos)
Transplantes de células hematopoéticas
Universidade de São Paulo
Diabete melitoInfarto do miocárdioMiocardiopatiasCirrose hepáticaCâncerGrandes defeitos ósseosDoença de ParkinsonDoenças auto-imunesDistrofias muscularesDoenças ósteo-articularesDoenças hematológicasDoenças metabólicas
Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco
Fibrose pulmonarDefeitos da faceVasculopatia periféricaD. vascular cerebral
Universidade de São Paulo
Diabete melitoInfarto do miocárdioMiocardiopatiasCirrose hepáticaCâncerGrandes defeitos ósseosDoença de ParkinsonDoenças auto-imunesDistrofias muscularesDoenças ósteo-articularesDoenças hematológicasDoenças metabólicas
Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco
Universidade de São Paulo
Cientistas britânicos pretendem usar células tronco para tratar uma forma comum de cegueira
Pacientes cegos por queimaduras químicas recuperaram a visão após implante de células tronco em centro italiano
Células tronco para a cegueiraNotícias na Imprensa
Universidade de São Paulo
Degeneração Macular Relacionada à Idade
Forma “úmida” Proliferação vascular
Forma “seca” Atrofia
10% casos Mais graveVárias formas de tratamento
Não há tratamento90% casos
Universidade de São Paulo
Fibroblastos humanos
iPSOCT4, SOX2, NANOG, LIN28
Neural CartilagemEpitélio
IntestinaliPS EPR
Epitélio Pigmentado Retiniano
Universidade de São Paulo
Fibroblastos humanos
iPS
iPS
OCT4, SOX2, NANOG, LIN28
EPR
Epitélio Pigmentado Retiniano
Neural CartilagemEpitélio
Intestinal
Royal College of Surgeonsdystrophic rats
Universidade de São Paulo
Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea
CórneaCórnea
ConjuntivaConjuntivaLimbo
Córnea e células tronco
Universidade de São Paulo
Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea
CórneaCórnea
ConjuntivaConjuntivaLimbo
Córnea e células tronco
Deficiência parcialDestruição (queimadura)
Invasão da córnea peloepitélio conjuntival
NeovascularizaçãoInflamaçãoCicatrização
Universidade de São Paulo
Limbal Stem-Cell Therapyand Long-Term Corneal Regeneration
Sucesso 82 (77%)Sucesso parcial 14 (13%)Insucesso 11 (10%)
p63-bright cells: holoclone forming cells in culture
Pacientes com perda de visão por queimadura da córneaCélulas do limbo contralateral obtidas por biópsia, cultivadas e implantadas
Antes Depois
NEJ Medicine 363:147, 2010
Universidade de São Paulo
Cientistas brasileiros testam o uso de células-tronco contra cegueira
PESQUISA
O Globo
RIO – O uso de células-tronco pode ser uma esperança para o tratamento de problemas graves de visão, como a retinose pigmentar, que leva à cegueria. .... Se der certo para retinose pigmentar – estima-se que no Brasil 40 mil pessoas sofrem desse mal – o tratamento poderá ser testado em outras doenças, como a degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) e a retinopatia diabética.
.... Daí a idéia de retirar as células da própria medula óssea desses pacientes, que em seguida foram processadas e injetadas no vítreo do globo ocular.
Células tronco hematopoéticasCélulas tronco mesenquimais
Universidade de São Paulo
Bone MarrowPeripheral BloodUmbilical Cord
Ficoll-Hypaque gradient
Metho-Cult GF-H4434 medium
14 days37o C 5% CO2
Colonies
Mono-nuclears
Universidade de São Paulo
- MEM20% Fetal Calf Serum
Mono-nuclears
Bone MarrowUmbilical Vein
Ficoll-Hypaque gradient
Weekly
TrypsinDetach cells
14 days
72 hours
Removenon-adherent cells
InsulinaDexametasoneIndometacina
DiferenciaçãoAdipocítica
DexametasoneÁcido ascórbico
DiferenciaçãoOsteoblástica
Tecidos Adultos
Fontes de MSC em Humanos
Tecidos Fetais
Placenta
Medula ósseaTecido adiposoVeias e artériasMedula óssea fetalFígado fetalSague periférico fetalSangue de cordão umbilicalVeia de cordão umbilicalGônadas
Células fetaisCélulas maternas
Universidade de São Paulo
MSC de veia umbilical
MSCMSC Sudan IISudan II
Fosfatase AlcalinaFosfatase Alcalina Von KossaVon Kossa
H.E.H.E. Colágeno IIColágeno II
mammalian Target of Rapamycin
mTOR (FRAP1)
Serina/treonina proteino-cinase
Síntese Ciclina D1Proliferação celular
AngiogênseProteínas angiogênicas
TSC1 e TSC2Ativa metabolismo
Deleção de PTEN Síndrome mielodisplásica
Leucemias
Inibidores de mTORrapanalogs Tratamento de câncer
PTEN regulador (inibidor) de mTOR
mTOR
Inibidores de mTOR
Universidade de São Paulo
Células-tronco:Propriedades e Fontes
Blastocisto
Células-tronco Embrionárias
Lygia V. PereiraInstituto de BiologiaUSP
adipócitosadipócitos epitélioepitélio
neurôniosneurôniosfibras muscularesfibras musculares
CT embrionáriosCT embrionáriosblastocistoblastocisto
**
corpo embrióidecorpo embrióide corpo embrióidecorpo embrióide
Universidade de São Paulo
Propriedade Fundamental das Células-TroncoDivisão Assimétrica
Universidade de São Paulo
Células-tronco: Papel de Oct-4 e Nanog
Universidade de São Paulo
TrofoectodermaEndoderma
Progenitores
Cels Maduras
Embrião
+Gata4/5 +Cdx2
Células B Macrófagos+Cebp
Célula Acinar Célula +Pdx1, Ng3n, Mafa
MúsculosFibroblastos
+Myod
ProgenitoresHematopoéticos
-Pax5
Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição
Massa InternaCT Embrionária
+Oct3/4+Sox2+Klf4
(+cMyc)
Massa InternaCT Embrionária
iPS
Universidade de São Paulo
Takahashi & Yamanaka
Teratomas derivados de iPS
Universidade de São Paulo
TrofoectodermaEndoderma
Progenitores
Cels Maduras
Embrião
+Gata4/5 +Cdx2
Células B Macrófagos+Cebp
Célula Acinar Célula +Pdx1, Ng3n, Mafa
MúsculosFibroblastos
+Myod
ProgenitoresHematopoéticos
-Pax5
Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição
Massa InternaCT Embrionária
+Oct3/4+Sox2+Klf4
(+cMyc)
Massa InternaCT Embrionária
iPS
Universidade de São Paulo
Células TroncoCélulas tronco pluripotentes
• células tronco embrionárias (blastocisto 4-5 dias)• células embrionárias germinais (feto 5-9 semanas)• iPS (induced pluripotent stem cell)
Células tronco de adultos
• medula óssea• vasos• músculos esqueléticos• fígado• cérebro
• dentes• intestino• pele• coração
Universidade de São Paulo
Uso Terapêutico
Diabete melitoInfarto do miocárdioMiocardiopatiasCirrose hepáticaCâncerGrandes defeitos ósseosDoença de ParkinsonDoenças auto-imunesDistrofias muscularesCegueriaDoenças hematológicasDoenças metabólicas
Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco
Doenças ósteo-articularesFibrose pulmonarDefeitos da faceVasculopatia periféricaD. vascular cerebral
Universidade de São Paulo
Diabete melitoInfarto do miocárdioMiocardiopatiasCirrose hepáticaCâncerGrandes defeitos ósseosDoença de ParkinsonDoenças auto-imunesDistrofias muscularesCegueiraDoenças hematológicasDoenças metabólicas
Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco
Universidade de São Paulo
Células tronco embrionáriosCélulas iPS
Células tronco adultas tecido-específica
Estratégias de Terapia com Células Tronco
Células totipotentes
Isolamento Enriquecimento, culturaInjeção/transplante
Fonte de Células Estratégia
CulturaDiferenciação Injeção/transplante
Medula ósseaPeleOlhoS. nervoso
Universidade de São Paulo
Nature 410:701, 2000
Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium
Donald Orlic, Jan Kajstura, Stefano Chimenti, Igor Jaloniuk, Stacie M. Anderson, Baosheng Li, James Pickel, Ronald McKay, Bernardo Nadal-Ginardi, David M. Bodline, Annarosa Leri & Piero Anversa
40
30
20
10
mm
Hg
LVEDP
Transplanted cells Infarcted myocardium
Unknown molecular signal(s)
Cell migration to damaged area
Proliferation anddifferentiation
Cytoplasmic proteinsCardiac myosin
-Sarcomeric actinConnexin 43
Nuclear proteinsCsx/Nkx2.5
MEF2GATA-4
Functional competence
C Infarction + BM cells
Universidade de São Paulo
Transdiferenciação:
Fusão
Contaminação
Transdiferenciação:
Fusão
Contaminação
Pesquisa Básica
Pesquisa Translacional
Pesquisa Clínica
Evidência Médica SólidaEvidência Médica Sólida
Mudança da Abordagem Médica
Resultados
Avaliação
Universidade de São Paulo
Abordagem que modifica significativamente o desfecho clínio em relação aos tratamentos existentes estabelecidos
Resultados são obtidos consistentemente por diferentes observadores
Trials com resultados convincentes
Vantagem adicional é suficientemente grande para sobrepujar os riscos adicionais
Evidência Médica Sólida
Universidade de São Paulo
Não, não há evidência
Há evidência médica sólida, não controvertida, que qualquer outra forma de terapia celular com células-tronco adultas seja vantajosa em um ambiente clínico?
Exceto para os tratamentos com base em transplante de células tronco hematopoéticas, tratamento de lesões da córnea e o uso de MSC como imunomoduladora,
Evidência Médica Sólida
Universidade de São Paulo
Terapia Celular
Substituição do tecido doente ou destruídoCélulas tronco tecido-específicas
Transplante de medula óssea
Pele cultivada
Transplante de células pancreáticas
Células tronco embrionárias ou células iPSCélulas de m. óssea: regeneração de outros órgãos
Mesenquimais: osso e cartilagem
Universidade de São Paulo
Estratégias
S
Imunoterapia + Transplante autólogo
Efeito imuno-modulador
Diabete melito tipo I
Células tronco mesenquimais
Universidade de São Paulo
Terapia CelularEstratégias
Células modificadas (antitumorais)
Linfócitos T autólogos anti-CD19 na LLC
Precursores hematopoéticas não originam cardio-miócitosMSC não originam cardiomócitosDerivadas de tecido hematopoético (linhagem monocítica) fundem-se com hepatócitos, cardiomiócitos, células de Purkinje, CT intestinaisPrecursoras hematopoéticas podem se incorporar no endotélioMSC são imunossupressorasMSC poderiam reduzir reação inflamatóriaPrecursoras da medula óssea poderiam secretar substâncias bioativas localmente
Terapia Celular de Doenças CardíacasCélulas Hematopoéticas
Universidade de São Paulo
Heart DiseaseMyocardial IschemiaMyocardial InfarctionCoronary DiseaseHeart FailureCardiomyopathiesHypertension
127101
62443620
9
4.4892.010
6311.433
934218
2.218Peripheral Vascular DiseaseStrokeDiabetic AngiopathiesIntracranial Hemorrhages
1713
31
272887226119
CCCCNoNoNoNoNoNoNo
Condition Stem Cell All Evidence*Clinical Trials
*Evidence = published results of convincing double-blind trialsC = contradictory or non-reproducible results
Registered Clinical Trials with “Stem Cells”
Graft-versus-Host DiseaseHeart DiseaseMyocardial IschemiaHeart FailureAutoimmune DiseasesBone DiseasesDiabetes Mellitus 2
1515
87772
216127101
36512313
Peripheral Vascular DiseaseStrokeIntestinal DiseaseAll studies
115
82
171335
2.641
CNoNoNo No NoNo
Condition MSC Stem Cells Evidence*Clinical Trials
*Evidence = published results of convincing double-blind trialsC = contradictory or non-reproducible results
Registered Clinical Trials with MSC
Conclusion: In patients with AMI and impaired LVEF, treatment with BM cells does not lead to a significant improvement of LVEF or volumes.
Universidade de São Paulo
BOOST Janssens ASTAMI REPAIR-AMI
Follow-up (mos) 18 4 12 12Control/placebo 30 34 50 103Treatment 30 33 50 101
Improvement LVEF C/P 51-54% 47-49% 43-49% 47-50% Treatment 50-56% 49-52% 41-49% 48-54%
Mortality + Reinfarct C/P 3% 0% 0% 6% Treatment 3% 6% 2% 2%
Randomized Trials with BMC – Acute Myocardial Infarction
Universidade de São Paulo
↑EF 3-4%Changes observed with cell-therapy are in the range observed with other therapies
Universidade de São Paulo
Captopril RamiprilCaptoprilValsantan Carvedilol
Universidade de São Paulo
Changes in functional and morphometric parameters of LVIn the range observed with:
Reperfusion therapyBeta-blockersInterventions in the renin-angiotensin pathway
Intracoronary Transplantation of PB or BM derived cellsIncrease in LVEF = 3-4%
Universidade de São Paulo
Efeito Mecânico da Destruição Ventricularno Infarto do Miocárdio
Choque cardiogênico40%
Insuficiência cardíaca1 bilhão miócitos25%
Destruição celular
Infarto
Ventrículo Esquerdo200 g = 4 x 109 miócitos
Universidade de São Paulo
Regeneração Cardíaca VerdadeiraRestauração 1 x 109 miócitos
Inserção nos sítios adequados
Junção eletromecânica
Contração síncrona com o restante do miocárdio
Universidade de São Paulo
Células da medula óssea não substituem cardiomiócitos
Medula Óssea
a
Recipiente
Doador LacZ
Lesão
Purificação Células LacZ-positivasFibrose
Cardiomiócito(sem LacZ)
bDoador GFP
Recipiente
Transfusãodireta
Células GFP-positivasFibrose
Cardiomiócito(sem GFP)
CardiomiócitosMioblastos esqueléticosMúsculos lisosFibroblastosPrecursores endoteliaisMedula óssea (total ou frações)Células-tronco mesenquimais
Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas
Sem sucesso
Universidade de São Paulo
Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas
Perspectivas
Progenitores miocárdicos residentesCélulas-tronco embrionáriasInjeção de fatores de crescimentoTransplante de células modificadas (terapia gênica)iPS com diferenciação cardíaca
Universidade de São Paulo
iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero
Nelson et al, Circulation, 2009
Universidade de São Paulo
iPS restaura função do miocárdioapós infarto experimental
Nelson et al, Circulation, 2009
Universidade de São Paulo
Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis
Nuclear reprogramming offers a revolutionary strategy for embryo-independent derivation of pluripotent stem cells form an ordinary adult source. iPS reverse cell fate to reset embryonic-like potential of somatic tissue. In this way, iPS have attained functions of natural embryonic stem cells to produce all tissue types and develop the complete organism.
The proof-of-principle study here establishes the practical application of bioengineered stem cells to respond to the ischemic myocardium and heal the damaged areas with iPS-derived integrated functional tissue.
Nelson et al, Circulation, 2009
Universidade de São Paulo
Perspectivas
Células Tronco Tecido-específicas
Abordagens gerais
Perspectivas para Terapias Inovadoras
Reprogramação Nuclear (iPS)
Transdiferenciação
Manipulação Imunológica seguida de transplante de HSC
Deficiências Enzimáticas: Terapia Substitutiva
Manipulação Celular para Induzir ou Inibir a Expressão de Gene(s) Específico(s)
Células Tronco MesenquimaisAplicações Específicas ou Focalizadas
Transdiferenciação
Universidade de São Paulo
Isolamento em números significativos
Indução mais “fisiológica”
Obter a diferenciação “correta”
Excluir células pluripotenciais
Eficiência de indução
Células Tronco Tecido Específicas
iPS
Terapias Inovadoras: os Gargalos
Obter a célula ou a combinação “correta”
Universidade de São Paulo
Células-troncona natureza
