Neutrófilo, MEV

Injetando DNA exógenos no núcleo de um ovo de camundongo, microscopia de luz polarizada

Monócitos do sangue, MEV

Bacilus anthracis

Células

Fermento, MET

Macrófago, MET

Trypanosoma brucei

Glóbulos vermelhos

Linfócito-T, METLinfócitos , microscopia óptica

Glóbulosvermelhos

Neurônios do córtex cerebral

Corte, microscopia óptica

Célula epitelial de rim de canguruMicroscopia de fluorescênciaVermelho: actinaVerde: microtúbulosAzul: DNA

Microscopia eletrônica de transmissão

Mitocôndria, TME

Tecido muscular estriado

Epitélio estratificado ceratinizado(pele)

Tecidos

Intestino delgado

Córtex renal e glomérulo

Ilhota pancreática

Uso de Células Troncona Terapia Celular:

Realidade ou Ilusão?Marco Antonio Zago

Instituto de Física São CarlosUSP

Agosto – 2011

Universidade de São Paulo

I have seen a medicineThat’s able to breathe life into a stone,Quicken a rock, and make you dance canaryWith spritely fire and motion, whose simple touchIs powerful to araise King Pippen, nay,To give great Charlemain a pen in 's handAnd write to her a love-line.

W. ShakespeareAll's Well That Ends Well

A Miraculous Medicine

Universidade de São Paulo

Terapia Celular

Terapia CelularConjunto de novas técnicas ou métodos para substituir células doentes ou disfuncionais com células sadias

Imunoterapia: células dendríticasAférese, criopreservação, imunosseleçãoTerapia gênica

Medicina regenerativa (substituição de tecidos, células e órgãos)Transplantes de células hematopoéticas

Universidade de São Paulo

Diabete melitoInfarto do miocárdioMiocardiopatiasCirrose hepáticaCâncerGrandes defeitos ósseosDoença de ParkinsonDoenças auto-imunesDistrofias muscularesDoenças ósteo-articularesDoenças hematológicasDoenças metabólicas

Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco

Fibrose pulmonarDefeitos da faceVasculopatia periféricaD. vascular cerebral

Universidade de São Paulo

Diabete melitoInfarto do miocárdioMiocardiopatiasCirrose hepáticaCâncerGrandes defeitos ósseosDoença de ParkinsonDoenças auto-imunesDistrofias muscularesDoenças ósteo-articularesDoenças hematológicasDoenças metabólicas

Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco

Universidade de São Paulo

Cientistas britânicos pretendem usar células tronco para tratar uma forma comum de cegueira

Pacientes cegos por queimaduras químicas recuperaram a visão após implante de células tronco em centro italiano

Células tronco para a cegueiraNotícias na Imprensa

Universidade de São Paulo

Degeneração Macular Relacionada à Idade

Forma “úmida” Proliferação vascular

Forma “seca” Atrofia

10% casos Mais graveVárias formas de tratamento

Não há tratamento90% casos

Universidade de São Paulo

Fibroblastos humanos

iPSOCT4, SOX2, NANOG, LIN28

Neural Cartilagem EpitélioIntestinal

iPS EPR

Epitélio Pigmentado Retiniano

Universidade de São Paulo

Fibroblastos humanos

iPS

iPS

OCT4, SOX2, NANOG, LIN28

EPR

Epitélio Pigmentado Retiniano

Neural Cartilagem EpitélioIntestinal

Royal College of Surgeonsdystrophic rats

Universidade de São Paulo

Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea

Córnea

ConjuntivaLimbo

Córnea e células tronco

Universidade de São Paulo

Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea

Córnea

ConjuntivaLimbo

Córnea e células tronco

Deficiência parcialDestruição (queimadura)

Invasão da córnea peloepitélio conjuntival

NeovascularizaçãoInflamaçãoCicatrização

Universidade de São Paulo

Limbal Stem-Cell Therapyand Long-Term Corneal Regeneration

Sucesso 82 (77%)Sucesso parcial 14 (13%)Insucesso 11 (10%)

p63-bright cells: holoclone forming cells in culture

Pacientes com perda de visão por queimadura da córneaCélulas do limbo contralateral obtidas por biópsia, cultivadas e implantadas

Antes Depois

NEJ Medicine 363:147, 2010

Universidade de São Paulo

Cientistas brasileiros testam o uso de células-tronco contra cegueira

PESQUISA

O Globo

RIO – O uso de células-tronco pode ser uma esperança para o tratamento de problemas graves de visão, como a retinose pigmentar, que leva à cegueria. .... Se der certo para retinose pigmentar – estima-se que no Brasil 40 mil pessoas sofrem desse mal – o tratamento poderá ser testado em outras doenças, como a degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) e a retinopatia diabética..... Daí a idéia de retirar as células da própria medula óssea desses pacientes, que em seguida foram processadas e injetadas no vítreo do globo ocular.

Células tronco hematopoéticasCélulas tronco mesenquimais

Universidade de São Paulo

Bone MarrowPeripheral BloodUmbilical Cord

Ficoll-Hypaque gradient

Metho-Cult GF-H4434 medium

14 days37o C 5% CO2

Colonies

Mono-nuclears

Universidade de São Paulo

CFU-GM

BFU-EBFU-E

Universidade de São Paulo

CFU-GEMM

CFU-GM

Universidade de São Paulo

- MEM20% Fetal Calf SerumMono-

nuclears

Bone MarrowUmbilical Vein

Ficoll-Hypaque gradient

Weekly

TrypsinDetach cells

14 days

72 hours

Removenon-adherent cells

InsulinaDexametasoneIndometacina

DiferenciaçãoAdipocítica

DexametasoneÁcido ascórbico

DiferenciaçãoOsteoblástica

Tecidos Adultos

Fontes de MSC em Humanos

Tecidos Fetais

Placenta

Medula ósseaTecido adiposoVeias e artériasMedula óssea fetalFígado fetalSague periférico fetalSangue de cordão umbilicalVeia de cordão umbilicalGônadasCélulas fetaisCélulas maternas

Universidade de São Paulo

MSC de veia umbilical

MSC Sudan II

Fosfatase Alcalina Von Kossa

H.E. Colágeno II

mammalian Target of Rapamycin

mTOR (FRAP1)

Serina/treonina proteino-cinase

Síntese Ciclina D1Proliferação celular

AngiogênseProteínas angiogênicas

TSC1 e TSC2Ativa metabolismo

Deleção de PTEN Síndrome mielodisplásicaLeucemias

Inibidores de mTORrapanalogs Tratamento de câncer

PTEN regulador (inibidor) de mTOR

mTOR

Inibidores de mTOR

Universidade de São Paulo

Universidade de São Paulo

Células-tronco:Propriedades e Fontes

Blastocisto

Todos os tecidosdo adulto

Universidade de São Paulo

Células-tronco Embrionárias

Lygia V. PereiraInstituto de BiologiaUSP

adipócitos epitélio

neurôniosfibras musculares

CT embrionáriosblastocisto

*

corpo embrióide corpo embrióide

Universidade de São Paulo

Propriedade Fundamental das Células-TroncoDivisão Assimétrica

Universidade de São Paulo

Universidade de São Paulo

Célula-tronco Instestinal

Universidade de São Paulo

Células-tronco: Papel de Oct-4 e Nanog

Universidade de São Paulo

TrofoectodermaEndoderma

Progenitores

Cels Maduras

Embrião

+Gata4/5 +Cdx2

Células B Macrófagos+Cebp

Célula Acinar Célula +Pdx1, Ng3n, Mafa

MúsculosFibroblastos

+Myod

ProgenitoresHematopoéticos

-Pax5

Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição

Massa InternaCT Embrionária

+Oct3/4+Sox2+Klf4

(+cMyc)

Massa InternaCT Embrionária

iPS

Universidade de São Paulo

Universidade de São Paulo

Takahashi & Yamanaka

Teratomas derivados de iPS

Universidade de São Paulo

TrofoectodermaEndoderma

Progenitores

Cels Maduras

Embrião

+Gata4/5 +Cdx2

Células B Macrófagos+Cebp

Célula Acinar Célula +Pdx1, Ng3n, Mafa

MúsculosFibroblastos

+Myod

ProgenitoresHematopoéticos

-Pax5

Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição

Massa InternaCT Embrionária

+Oct3/4+Sox2+Klf4

(+cMyc)

Massa InternaCT Embrionária

iPS

Universidade de São Paulo

Células TroncoCélulas tronco pluripotentes

• células tronco embrionárias (blastocisto 4-5 dias)• células embrionárias germinais (feto 5-9 semanas)• iPS (induced pluripotent stem cell)

Células tronco de adultos

• medula óssea• vasos• músculos esqueléticos• fígado• cérebro

• dentes• intestino• pele• coração

Universidade de São Paulo

Uso Terapêutico

Diabete melitoInfarto do miocárdioMiocardiopatiasCirrose hepáticaCâncerGrandes defeitos ósseosDoença de ParkinsonDoenças auto-imunesDistrofias muscularesCegueriaDoenças hematológicasDoenças metabólicas

Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco

Doenças ósteo-articularesFibrose pulmonarDefeitos da faceVasculopatia periféricaD. vascular cerebral

Universidade de São Paulo

Diabete melitoInfarto do miocárdioMiocardiopatiasCirrose hepáticaCâncerGrandes defeitos ósseosDoença de ParkinsonDoenças auto-imunesDistrofias muscularesCegueiraDoenças hematológicasDoenças metabólicas

Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco

Universidade de São Paulo

Células tronco embrionáriosCélulas iPS

Células tronco adultas tecido-específica

Estratégias de Terapia com Células Tronco

Células totipotentes

Isolamento Enriquecimento, culturaInjeção/transplante

Fonte de Células Estratégia

CulturaDiferenciação Injeção/transplante

Medula ósseaPeleOlhoS. nervoso

Universidade de São Paulo

Nature 410:701, 2000

Bone marrow cells regenerate infarcted myocardiumDonald Orlic, Jan Kajstura, Stefano Chimenti, Igor Jaloniuk, Stacie M. Anderson, Baosheng Li, James Pickel, Ronald McKay, Bernardo Nadal-Ginardi, David M. Bodline, Annarosa Leri & Piero Anversa

40

30

20

10

mm

Hg

LVEDP

Transplanted cells Infarcted myocardium

Unknown molecular signal(s)

Cell migration to damaged area

Proliferation anddifferentiation

Cytoplasmic proteinsCardiac myosin

-Sarcomeric actinConnexin 43

Nuclear proteinsCsx/Nkx2.5

MEF2GATA-4

Functional competence

C Infarction + BM cells

Universidade de São Paulo

Transdiferenciação:

Fusão

Contaminação

Transdiferenciação:

Fusão

Contaminação

Pesquisa Básica

Pesquisa Translacional

Pesquisa Clínica

Evidência Médica Sólida

Mudança da Abordagem Médica

Resultados

Avaliação

Universidade de São Paulo

Abordagem que modifica significativamente o desfecho clínio em relação aos tratamentos existentes estabelecidos

Resultados são obtidos consistentemente por diferentes observadores

Trials com resultados convincentes

Vantagem adicional é suficientemente grande para sobrepujar os riscos adicionais

Evidência Médica Sólida

Universidade de São Paulo

Não, não há evidência

Há evidência médica sólida, não controvertida, que qualquer outra forma de terapia celular com células-tronco adultas seja vantajosa em um ambiente clínico?

Exceto para os tratamentos com base em transplante de células tronco hematopoéticas, tratamento de lesões da córnea e o uso de MSC como imunomoduladora,

Evidência Médica Sólida

Universidade de São Paulo

Terapia Celular

Substituição do tecido doente ou destruídoCélulas tronco tecido-específicas

Transplante de medula óssea

Pele cultivada

Transplante de células pancreáticas

Células tronco embrionárias ou células iPSCélulas de m. óssea: regeneração de outros órgãos

Mesenquimais: osso e cartilagem

Universidade de São Paulo

Estratégias

S

Imunoterapia + Transplante autólogo

Efeito imuno-modulador

Diabete melito tipo I

Células tronco mesenquimais

Universidade de São Paulo

Terapia CelularEstratégias

Células modificadas (antitumorais)

Linfócitos T autólogos anti-CD19 na LLC

Precursores hematopoéticas não originam cardio-miócitosMSC não originam cardiomócitosDerivadas de tecido hematopoético (linhagem monocítica) fundem-se com hepatócitos, cardiomiócitos, células de Purkinje, CT intestinaisPrecursoras hematopoéticas podem se incorporar no endotélioMSC são imunossupressorasMSC poderiam reduzir reação inflamatóriaPrecursoras da medula óssea poderiam secretar substâncias bioativas localmente

Terapia Celular de Doenças CardíacasCélulas Hematopoéticas

Universidade de São Paulo

Heart DiseaseMyocardial IschemiaMyocardial InfarctionCoronary DiseaseHeart FailureCardiomyopathiesHypertension

127101

62443620

9

4.4892.010

6311.433

934218

2.218Peripheral Vascular DiseaseStrokeDiabetic AngiopathiesIntracranial Hemorrhages

1713

31

272887226119

CCCCNoNoNoNoNoNoNo

Condition Stem Cell All Evidence*Clinical Trials

*Evidence = published results of convincing double-blind trialsC = contradictory or non-reproducible results

Registered Clinical Trials with “Stem Cells”

Graft-versus-Host DiseaseHeart DiseaseMyocardial IschemiaHeart FailureAutoimmune DiseasesBone DiseasesDiabetes Mellitus 2

1515

87772

216127101

36512313

Peripheral Vascular DiseaseStrokeIntestinal DiseaseAll studies

115

82

171335

2.641

CNoNoNo No NoNo

Condition MSC Stem Cells Evidence*Clinical Trials

*Evidence = published results of convincing double-blind trialsC = contradictory or non-reproducible results

Registered Clinical Trials with MSC

Conclusion: In patients with AMI and impaired LVEF, treatment with BM cells does not lead to a significant improvement of LVEF or volumes.

Universidade de São Paulo

N= 20 N= 46 N= 51

Universidade de São Paulo

BOOST Janssens ASTAMI REPAIR-AMI

Follow-up (mos) 18 4 12 12Control/placebo 30 34 50 103Treatment 30 33 50 101

Improvement LVEF C/P 51-54% 47-49% 43-49% 47-50% Treatment 50-56% 49-52% 41-49% 48-54%

Mortality + Reinfarct C/P 3% 0% 0% 6% Treatment 3% 6% 2% 2%

Randomized Trials with BMC – Acute Myocardial Infarction

Universidade de São Paulo

Universidade de São Paulo

↑EF 3-4%Changes observed with cell-therapy are in the range observed with other therapies

Universidade de São Paulo

Captopril RamiprilCaptoprilValsantan Carvedilol

Universidade de São Paulo

Changes in functional and morphometric parameters of LVIn the range observed with:

Reperfusion therapyBeta-blockersInterventions in the renin-angiotensin pathway

Intracoronary Transplantation of PB or BM derived cellsIncrease in LVEF = 3-4%

Universidade de São Paulo

Efeito Mecânico da Destruição Ventricularno Infarto do Miocárdio

Choque cardiogênico40%

Insuficiência cardíaca1 bilhão miócitos25%

Destruição celular

Infarto

Ventrículo Esquerdo200 g = 4 x 109 miócitos

Universidade de São Paulo

Regeneração Cardíaca VerdadeiraRestauração 1 x 109 miócitosInserção nos sítios adequadosJunção eletromecânicaContração síncrona com o restante do miocárdio

Universidade de São Paulo

Células da medula óssea não substituem cardiomiócitos

Medula Óssea

a

Recipiente

Doador LacZ

Lesão

Purificação Células LacZ-positivasFibrose

Cardiomiócito(sem LacZ)

bDoador GFP

Recipiente

Transfusãodireta

Células GFP-positivasFibrose

Cardiomiócito(sem GFP)

CardiomiócitosMioblastos esqueléticosMúsculos lisosFibroblastosPrecursores endoteliaisMedula óssea (total ou frações)Células-tronco mesenquimais

Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas

Sem sucesso

Universidade de São Paulo

Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas

Perspectivas

Progenitores miocárdicos residentesCélulas-tronco embrionáriasInjeção de fatores de crescimentoTransplante de células modificadas (terapia gênica)iPS com diferenciação cardíaca

Universidade de São Paulo

iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero

Nelson et al, Circulation, 2009

Universidade de São Paulo

iPS restaura função do miocárdioapós infarto experimental

Nelson et al, Circulation, 2009

Universidade de São Paulo

Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis

Nuclear reprogramming offers a revolutionary strategy for embryo-independent derivation of pluripotent stem cells form an ordinary adult source. iPS reverse cell fate to reset embryonic-like potential of somatic tissue. In this way, iPS have attained functions of natural embryonic stem cells to produce all tissue types and develop the complete organism.

The proof-of-principle study here establishes the practical application of bioengineered stem cells to respond to the ischemic myocardium and heal the damaged areas with iPS-derived integrated functional tissue.

Nelson et al, Circulation, 2009

Universidade de São Paulo

Universidade de São Paulo

Bone marrow biopsy

CT scans

Universidade de São Paulo

Perspectivas

Células Tronco Tecido-específicas

Abordagens gerais

Perspectivas para Terapias Inovadoras

Reprogramação Nuclear (iPS)

Transdiferenciação

Manipulação Imunológica seguida de transplante de HSC

Deficiências Enzimáticas: Terapia Substitutiva

Manipulação Celular para Induzir ou Inibir a Expressão de Gene(s) Específico(s)

Células Tronco MesenquimaisAplicações Específicas ou Focalizadas

Transdiferenciação

Universidade de São Paulo

Isolamento em números significativos

Indução mais “fisiológica”Obter a diferenciação “correta”Excluir células pluripotenciais

Eficiência de indução

Células Tronco Tecido Específicas

iPS

Terapias Inovadoras: os Gargalos

Obter a célula ou a combinação “correta”

Universidade de São Paulo

Células-troncona natureza