ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-------o0o-------

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

LOÀI CẦU GAI DIADEMA SAVIGNYI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2014

ĐẶNG NGỌC BÁCH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

ĐẶNG NGỌC BÁCH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

LOÀI CẦU GAI DIADEMA SAVIGNYI

Chuyên ngành : Hóa hữu cơ

Mã số : 60440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hoài Nam

PGS.TS. Phan Minh Giang

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện tại phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong khuôn khổ Đề tài nghiên

cứu cơ bản định hướng ứng dụng: “Nghiên cứu quy trình phân lập các hoạt chất có

tác dụng diệt tế bào ung thư, kháng viêm và kháng khuẩn từ một số loài thuộc lớp

Sao biển (Asteroidea), Hải sâm (Holothuroidea), Cầu gai (Echinoidea) thuộc ngành

Da gai (Echinodermata) ở biển Việt Nam”.

Trước tiên, với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS. Nguyễn Hoài Nam, Viện Hóa Sinh Biển và PGS. TS. Phan Minh Giang,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tận tình hướng

dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đặc biệt là tập

thể cán bộ phòng Dược liệu biển đã tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt

quá trình thực hiện luận văn.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa hoc - Trường

ĐHKHTN, ĐHQGHN đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại

trường. Xin cảm ơn tất cả các bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong quá trình học

tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng

nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy kính mong nhận

được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô.

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Học viên

Đặng Ngọc Bách

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn “Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học

loài cầu gai Diadema savignyi”. là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Hoài Nam và PGS. TS. Phan Minh Giang.

Tôi xin cam đoan Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực, không

trùng lặp và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu khác.

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Học viên

Đặng Ngọc Bách

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ

LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ..................................................................................... 3

1.1. Những nghiên cứu tổng quát về cầu gai ............................................................... 3

1.1.1. Động vật học ..................................................................................................... 3

1.1.2. Phân bố sinh thái .............................................................................................. 3

1.1.3. Các loài cầu gai dùng làm thực phẩm .............................................................. 4

1.1.4. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai ................................... 5

1.2 Steroit từ một số loài sinh vật biển Việt Nam ....................................................... 8

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 12

2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 12

2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất .................................................................. 13

2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC) ................................................................................... 13

2.2.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế ............................................................................... 13

2.2.3. Sắc kí cột (CC) ............................................................................................... 13

2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ................................ 13

2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học .......................................................... 14

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 16

3.1. Kết quả .............................................................................................................. 16

3.1.1. Xử lý mẫu và tạo dich chiết tổng ..................................................................... 16

3.1.2. Phân lập các hợp chất ..................................................................................... 17

3.2. Thảo luận ............................................................................................................ 20

3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ......................................................... 20

3.2.1.1. Hợp chất DS1: 5α,8α-epiđioxi-cholest-6-en-3β-ol ...................................... 20

3.2.1.2. Hợp chất DS2: Cholest-5-en-3β,7α-điol ...................................................... 25

3.2.1.3. Hợp chất DS3: Cholest-5-en-3β,7β-điol ...................................................... 28

3.2.1.4. Hợp chất DS4: 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol ............................................... 32

3.2.1.5. Hợp chất DS5: cholest-5-en-3β-ol ............................................................... 36

3.2.1.6. Hợp chất DS6: Natri cholest-5-en-3β-sunfat ............................................... 40

3.2.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất ..................................... 45

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 48

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ

1 CC Column Chromatography

2 COSY Correlation Spectroscopy

3 DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer

4 SKLM Sắc kí lớp mỏng

5 TLC Thin Layer Chromatography

6 NMR Nuclear Magnetic Resonance

7 13

C-NMR Cacbon-13-Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy

8 1H-NMR

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

9 1H-

1H COSY

1H-

1H Chemical Shift Correlation

Spectroscopy

10 HMQC Heteronuclear Multiple Quantum

Coherence

11 HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Connectivity

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Cầu gai S. droebachiensis 4

Hình 1.2. Cầu gai D. setosum 5

Hình 2.1 Cầu gai Diadema savignyi 12

Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài Cầu gai Diadema savignyi 19

Hình 3.1.a. Phổ 1H-NMR của DS1 20

Hình 3.1.b. Cấu trúc hóa học của DS1 20

Hình 3.1.c. Phổ 13

C-NMR của DS1 21

Hình 3.1.d. Phổ HMQC của DS1 21

Bảng 3.1. Các số liệu phổ NMR của DS1 22

Hình 3.1.e. Phổ HMBC của DS1 23

Hình 3.1.f. Phổ COSY của DS1 24

Hình 3.1.g. Các tương tác COSY (▬) và HMBC () chính của DS1 24

Hình 3.2.a. Phổ 1H-NMR của DS2 25

Hình 3.2.b. Cấu trúc hóa học của DS2 25

Hình 3.2.c. Phổ 13

C-NMR của DS2 26

Hình 3.2.d. Phổ HMQC của DS2 26

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của DS2 27

Hình 3.2.e. Phổ HMBC của DS2 28

Hình 3.2.f. Các tương tác HMBC chính của DS2 28

Hình 3.3.a. Phổ 1H-NMR của DS3 29

Hình 3.3.b. Cấu trúc hóa học của DS3 29

Hình 3.3.c. Phổ 13

C-NMR của DS3 30

Hình 3.3.d. Phổ HMQC của DS3 30

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của DS3 31

Hình 3.3.e. Phổ HMBC của DS3 32

Hình 3.3.f. Các tương tác HMBC chính của DS3 32

Hình 3.4.a. Phổ 1H-NMR của DS4 33

Hình 3.4.b. Cấu trúc hóa học của DS4 33

Hình 3.4.c. Phổ 13

C-NMR của DS4 34

Hình 3.4.d. Phổ HMQC của DS4 34

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của DS4 35

Hình 3.4.e. Phổ HMBC của DS4 36

Hình 3.4.f. Các tương tác HMBC chính của DS4 36

Hình 3.5.a. Phổ 1H-NMR của DS5 37

Hình 3.5.b. Cấu trúc hóa học của DS5 37

Hình 3.5.c. Phổ 13

C-NMR của DS5 38

Hình 3.5.d. Phổ HMQC của DS5 38

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của DS5 39

Hình 3.5.e. Phổ HMBC của DS5 40

Hình 3.5.f. Các tương tác HMBC chính của DS5 40

Hình 3.6.a. Phổ 1H-NMR của DS6 41

Hình 3.6.b. Cấu trúc hóa học của DS6 41

Hình 3.6.c. Phổ 13

C-NMR của DS6 42

Hình 3.6.d. Phổ HMQC của DS6 42

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của DS6 43

Hình 3.6.e. Phổ HMBC của DS6 44

Hình 3.6.f. Các tương tác HMBC chính của DS6 44

Bảng 3.7. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 46

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 1 Hóa hữu cơ

LỜI MỞ ĐẦU

Diện tích bề mặt trái đất vào khoảng 510.072.000 km2 trong đó đại dương

bao phủ hơn 3/4 tổng diện tích bề mặt. Đại dương không chỉ là nơi sinh sống của

hàng ngàn loài động vật biển khác nhau mà còn ẩn chứa trong đó vô vàn điều bí ẩn

chờ đợi con người tìm hiểu và khám phá.

Việc nghiên cứu khai thác và sử dụng các nguồn lợi từ biển luôn là chủ đề

nóng bỏng đối với các nhà khoa học trên khắp thế giới. Trong những năm gần đầy

Việt Nam đã và đang có các công trình khoa học nghiên cứu về sinh vật biển, một

trong các xu hướng mới mở ra là tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính

sinh học cao từ sinh vật biển. Từ đó nghiên cứu thành phần, cấu trúc và tổng hợp

nên các hợp chất có giá trị y học cao. Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới,

có điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều

loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Hơn thế với bờ biển kéo dài và

thềm lục địa rộng lớn đó là nơi cất giấu kho nguyên liệu khoáng vật khổng lồ dưới

dạng hòa tan, nắng đọng dưới đáy và vùi kín dưới đại dương. Trong sự đa dạng của

sinh vật biển thì loài cầu gai là một trong những loài nhận được sự quan tâm đặc

biệt của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Ở Việt Nam cầu gai không những

có giá trị ẩm thực mà con mang giá trị y học. Các công trình khoa học nghiên cứu

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới cho thấy các hợp chất tách ra

từ cầu gai có hoạt tính sinh học cao như kháng khuẩn kháng nấm, kháng viêm đặc

biệt là khả năng ức chế các tế bào gây ung thư. Tuy nhiên ở nước ta những thông tin

khoa học về loài này vẫn còn nhiều hạn chế, chưa có các nghiên cứu cụ thể làm

sáng tỏ giá trị dược dụng của dược liệu quý này. Do đó, nội dung nghiên cứu của đề

tài nhằm phát hiện các thành phần hóa học và hoạt tính sinh học quý báu góp phần

minh chứng giá trị dược dụng của loài. Kết quả nghiên cứu sẽ làm tăng giá trị khoa

học và thực tiễn góp phần khai thác và bảo tồn một cách có hợp lý nguồn tài nguyên

cầu gai phong phú của đất nước.

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 48 Hóa hữu cơ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Châu Văn Minh, Nguyên Xuân Cường, Nguyễn Hải Đăng, Nguyễn Phương

Thảo, Trần Hồng Quang, Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Hoài Nam, Nguyễn

Văn Hùng, Pham Văn Kiệm (2012), “Điểm lại các nghiên cứu hóa học và

hoạt tính sinh học một số loài sinh vật biển Việt Nam trong giai đoạn 2006-

2012”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 50(6), tr. 827-829.

2. Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Hoài Nam, Phạm

Văn Cường (2012), Dược liệu biển Việt Nam – Thực trạng và cơ hội phát

triển, NXB Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr. 55-56.

3. Phạm Thị Thùy (2010), Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất sản

phẩm trứng cầu gai lên men tự nhiên, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nha

Trang.

4. Nguyễn Đình Triệu (2013), Các phương pháp vật lý hiện đại ứng dụng trong

hóa học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.

Tiếng Anh

5. http://animaldiversity.org/accounts/Diadema_savignyi/.

6. Dictionary of Natural Products on DVD, version 18.1, Copyright® 1982-2009

CRC Press.

7. http://gophuquoc.vn/vn/article_detail.aspx?mid=5&aid=294.

8. Kol'tsova EA, Maksimov OB (1981), “Pigments of sea urchins Diadema

setosum and Diadema savignije”, Quinoid pigments of echinoderms,

Khimiya Prirodnykh Soedinenii, 1, p. 115.

9. Minh CV, Kiem PV, Huong le M, Kim YH (2004), “Cytotoxic constituents of

Diadema setosum”, Arch Pharm Res, 27(7), pp. 734-737.

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 49 Hóa hữu cơ

10. Yamada K, Tanabe K, Miyamoto T, Kusumoto T, Inagaki M, Higuchi R

(2008), “Isolation and structure of a monomethylated ganglioside possessing

neuritogenic activity from the ovary of the sea urchin Diadema setosum”,

Chem Pharm Bull (Tokyo), 56(5), pp. 734-737.

11. Mishchenko NP, Fedoreyev SA, Van TTT, Hieu VMN, Ly BM (2013),

Identification of polyhydroxylated naphoquinone pigments from Nha Trang

Bay sea urchins, The 2nd international workshop on marine bioresources of

Vietnam, Hanoi, pp. 18-24.

12. Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB (1987),

“Evaluation of a Tetrazolium-based Semiautomated Colorimetric Assay:

Assessment of Radiosensitivity”, Cancer Research, 47(4), pp. 943-946.

13. Ioannou E, Abdel-Razik AF, Zervou M, Christofidis D, Alexi X, Vagias C,

Alexis MN, Roussis V (2009), “pidioxysterols from the gorgonian Eunicella

cavolini and the ascidian Trididemnum inarmatum: isolation and evaluation

of their antiproliferative activity”, Steroids, 74(1), pp. 73-80.

14. Carvalho JF, Cruz Silva MM, Moreira JN, Simoes S, Sa EMML (2009),

“Efficient chemoenzymatic synthesis, cytotoxic evaluation, and SAR of

epoxysterols”, J Med Chem, 52(13), pp. 4007-4019.

15. Tian X-R, Tang H-F, Li Y-S, Lin H-W, Chen X-L, Ma N, Yao M-N, Zhang P-

H(2011), “New cytotoxic oxygenated sterols from the marine bryozoan

Cryptosula pallasiana”, Marine Drugs, 9(2), pp. 162-183.

16. J. Buchanan H, J. Cox P, M. S. V. Doidge-Harrison S, Alan Howie R, Jaspars

M, L. Wardell J (1997), “Syntheses and structures of 3-stannylcholest-5-ene

species”, Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1, (24), pp.

3657-3664.

17. D'Auria MV, Finamore E, Minale L, Pizza C, Riccio R, Zollo F, Pusset M,

Tirard P (1984), “Steroids from the starfish Euretaster insignis: a novel

Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ

Đặng Ngọc Bách 50 Hóa hữu cơ

group of sulphated 3β,21- dihydroxysteroids”, Journal of the Chemical

Society, Perkin Transactions 1, pp. 2277-2282.