NGS limfoproriferacijų diagnostikai ir minimalios liktinės ligos sekimui

E. Gineikienė

Funkciškai skirtingi BCR ir TCR yra panašiai pertvarkomi ir atitinkamai

įvairūs

• Antigeno receptoriaus segmentai – V, D ir J – yra atitinkamai organizuotai sudėliojami į seką rekombinacijos metu – pirmasis įvairovės etapas.

• Ties V, D ir J segmentų sandūra atsitiktinai prisintetinami ir/arba nukarpomi pavieniai nukleotidai – antrasis įvairovės etapas.

• Nors visas regionas (t.y. V,D,J) lemia receptoriaus funkciją, sandūros vietos su papildomais nukleotidais (CDR3) lemia receptoriaus specifiškumą.

• Pirmasis ir antrasis įvairovės etapai taip pat vyksta ir su antru receptoriaus subvienetu – tai prideda papildomo įvairumo (kai dimerizuojasi du skirtingi subvienetai).

• Teoriškai BCR turėtų būti 1013 skirtingų variantų, TCR – 1018.

• Toliau – B limfocitai praeidami germinacinį centrą, įgauna somatines mutacijas.

• Dar – B ląstelių receptoriai gali keisti savo klasę – t.y. geno segmentas, koduojantis konservatyvią receptoriaus dalį pakeičiamas kitu – IgM → IgG → IgE.

Receptorių įvairovė

Receptorių tyrimo metodai

• Sukurtos įvairios metodikos, leidžiančios metodo gebos ribose įvertinti receptorių įvairovę ar tam tikras receptorių repertuaro perturbacijas.

• Tradicinis – klonavimas + Sengerio sekoskaita – ribota metodo geba įvairovei įvertinti, mažas našumas.

• Kloniškumas (spectratyping) – receptorių VDJ (CDR3) regionų ilgio įvertinimas –išsamesnis bendro receptorių heterogeniškumo ir monokloninės ekspansijos įvertinimas. Suteikia informacijos tik apie vieną receptoriaus faktą – CDR3 ilgį, o informacijos apie receptoriaus specifiškumą (seką) – nėra.

• NGS – idealus metodas receptorių įvairovei įvertinti.

• Bet metodai pasirenkami pagal tai, koks tyrimo tikslas.

NGS receptorių repertuaro tyrimui

• Skirtingame imunologiniame kontekste (steady-state, infekcijos, imunizacijos, limfocitų vystymasis, autoimuninės ligos, kraujo ligos) metodas geba:

• 1. Pilnai įvertinti receptorių įvairovę

• 2. Nustatyti kloninę ekspansiją

• 3. Nustatyti receptoriaus savybes

• There is no ‘one size fits all’ approach to immune NGS

Ką sekvenuoti

1.• Dauguma tradicinių metodų tiria atskirus vienetus (BCR sunkiąsias grandines, TCR

a ar b grandines) – tai suteikia pakankamos informacijos imunologiniams parametrams įvertinti.

• Dauguma NGS paremtų metodų tiria tik CDR3, nes CDR3 yra trumpas fragmentas, todėl trumpos sekos yra perskaitomos daugiau kartų. Nustatytos BCR-ų ir TCR-ų CDR3 sekos tada gali rodyti kloninę limfocitų kilmę.

• Tačiau trumpi CDR3 skaitiniai netinka, jei reikia išsiaiškinti somatinių hipermutacijųbuvimą/profilį, ar mutacijas BCR-uose ŽIV atvejais.

2. • Kokia medžiaga naudojama bibliotekos konstravimui – genominė DNR ar RNR

(transkriptas).

• Jei genominė DNR – bendroje masėje tarp intronų ir „nepanaudotų“ V, D ar J genų reikia suamplifikuoti pertvarkytą VDJ variantą. Be to genominės DNR bibliotekoje, bendroje masėje yra visi pertvarkyti VDJ variantai, nepriklausomai, ar jie produktyvūs (duoda baltymą), ar neproduktyvūs (nesintetinami).

• Visų (produktyvių ir neproduktyvių) variantų nustatymas duoda informacijos apie receptoriaus įvairinimą limfocitų vystymosi metu, tačiau taip pat nuima dalį skaitinių, kuriais daugiau kartų būtų perskaityta ekspresuojamų receptorių sekos.

• Jei RNR (transkriptas) – neproduktyvūs transkriptai nematomi.

• Jei RNR (transkriptas) – stipriai ekspresuojami BCR ar TCR transkriptai yra žymiai skaitlingesni, nei jų genominis atitikmuo (viena receptoriaus kopija/vienai ląstelei). Ši tiriamoji medžiaga tiktų, jei genominės yra trūkumas.

• Bet tiriant genominę DNR, galima kiekybiškai įvertinti limfocitų kloninę ekspansiją polikloniniame fone (tariant, kad genominės DNR amplifikacija ir bibliotekos paruošimo neįnešė jokių variacijų, tai CDR3 skaitinių skaičius proporcingas skaičiui kloninių limfocitų, turinčių duotą CDR3 seką.

• RNR pagrindu sukonstruotos bibliotekos taip pat gali būti naudojamos apytiksliam klono kiekiui nustatyti, tačiau kiekybinis įvertinimas gali skirtis nuo realios situacijos, kadangi skirtingose ląstelėse BCR ir TCR transkriptai gali būti sintetinami nevienodai.

Bibliotekų konstravimas

• Kadangi BCR ir TCR sekų įvairovė yra išskirtinė, pagrindinis bibliotekų konstravimo tikslas – PGR strategija, užtikrinanti visą apimantį ir nevarijuojantį tiriamojo regiono pagausinimą labai skirtingų regionų mišinyje.

• Variacijos minimizavimas yra kritinis tuose eksperimentuose, kur limfocitų (receptorių) klonai turi būti suskaičiuojami, kadangi netolygus/nevienodas amplifikacijos efektyvumas gali iškreipti kloninio dažnio matmenis.

Bibliotekų paruošimo būdai

Genominė DNRMultiplexinis PCR, pradmenys komplementarūs daugumai (visiems) galimiems V segmentams + J segmentams. Inkorporuojami adapteriai. Ilgi skaitiniai -nustatyti daugumą variabilaus regiono sekų; trumpi skaitiniai – tik CDR3 sekoms.

RNR (trankriptas)Atvirkštinė transkripcija arba atvirkštinė transkripcija + adaptoriaus primontavimas. Amplifikacija nuo adaptoriaus arba multiplexinis PCR. Ilgi skaitiniai – abipusiai nuo adapterių – viso regiono sekos nustatymui. Trumpi – tik CDR3 sekai.

Gal dar tektų selektuoti informacinę RNR.

• Somatinės hipermutacijos gali apsunkinti amplifikaciją, jei atsiradusios pradmenų hibridizacijos vietose. Variacijas gali pamažinti kelių etapų PCR-u arba naudojant sintetines DNR kontroles.

• SHM problema taip pat sprendžiama per adaptorius (kai naudojama RNR), kurie įterpiami V amplikono pradžioje (seq paskui eina nuo adaptoriaus ir J srities pradmens, kuris dažniausiai būna nemutuotas). Taip sumažinamos bibliotekos kūrimo variacijos. Be to tokia biblioteka leidžia gauti ištisą variabilaus regiono geno seką, kad paskui tinka klonavimui (pvz., genų inžinerijos būdu įterpiamas visas TCR/BCR genas ir kokiose ląst. linijose stebima receptoriaus ekspresija)

NGS platformos

• Skiriasi instrumentų skaitinių ilgis, sekvenavimo gylis, paklaidų dažnis ir tipas.

• Skaitiniai turi būti pakankamos ilgio, kad apimtų tiriamuosius regionus (CDR3 trumpi, ištisas variabilus regionas – ilgi). Skaitinių turi būti pakankamai daug, kad įvertintų kuo daugiau besiskiriančių receptorių sekų. Gylis taip pat svarbus santykinai didelio paklaidų skaičiaus eliminavimui iš to regiono skaitinių sudarytos konsensusinės sekos. Kažkokios problemos su insercijų/delecijų pagavimu.

• Roche-454

• Ion Torrent

• Pacific Biosciences

• Illumina

• Illumina (MiSeq ilgesniems skaitiniams, HiSeq CDR3 trumpiems skaitiniams) šiuo metu optimaliausias variantas - optimalus skaitinių ilgis, skaitymo gylis, paklaidų profilis įvairios paskirties tyrimams.

Duomenų apdorojimas ir analizė

• Duomenų apdorojimas: pirminiai skaitiniai filtruojami, surenkami į vieną seką, koreguojamos paklaidos.

• Apdorojant duomenis didelis dėmesys kreipiamas į galimas NGS generuojamas paklaidas. Paklaidos nėra kritinis metodo trūkumas, tačiau kai kada gali sutrukdyti pilnai įvertinti receptorių įvairovę. Be tinkamų korekcijų tikros receptoriaus sekos nebus galima nustatyti, nes „įvairovę“ lems sekvenavimo klaidos.

• Pagrindinis paklaidų eliminavimo būdas – labai panašių skaitinių konsensusinėssekos nustatymas.

• Duomenų analizė: priklausomai nuo užduoties.

• A) V(D)J gemalinių segmentų klasifikacija. • IMGT/V-QUEST , IMGT/HighV-QUEST NGS duomenims• BLAST IgBLAST• Hidden Markov modelis• iHMMune-align• SODA2 • VDJsolver• Ab-origin• JOINSOLVER • VBASE2 • MiTCR (specializuota TCR CDR3 sekų ištraukimui.

• B) Receptorių įvairovės analizė. • Receptoriai gali būti vertinami pagal dydį (t.y. skaičius unikalių CD3 sekų) ir

skirtingų receptorių dažnį.

• C) Repertuaro palyginimai. • Dažnis tarp skirtingų individų, dažnis tarp skirtingų ląstelių populiacijų,...

• D) SHM įvertinimas.

Receptorių NGS tyrimas naudojamas...

• Receptorių repertuaro analizei

• A) Bendras BCR IgH repertuaras 0.5 - 5 x106/individe. TCRb repertuaras 0,5 – 3 x106/individe.

• B) BCR segmentų (V, J, ir D) panaudojimo pobūdis - dažnai koreliuoja tarp negiminingų individų. TCRb repertuare taip pat stebimos bendros segmentų panaudojimo tendencijos.

•

• C) Lyginamoji NGS analizė – limfocitų vystymosi, limfocitų linijos vystymosi tyrimui.

• D) Kaip įvairūs faktoriai lemia receptorių repertuarą (pvz., NGS metodais palyginus jaunų ir senyvų žmonių receptorių repertuarą, nustatyta, kad senuose TCR įvairovė yra sumažėjusi, o BCR CDR3 segmentų panaudojimas pakitęs. ARBA NGSu l vyresnio amžiaus žmonėse po vakcinacijos buvo nustatyti ženklūs SMH profilio ir CDR3 ilgio skirtumai. ARBA NGS-u nustatyti ženklios B limfocitų repertuaro perturbacijos CMV serologiškai teigiamuose.

• Antigenui-specifinių imuninių atsakų įvertinimui

• NGS metodu galima atsekti limfocitus, kurie dalyvauja atsake į tam tikrus antigenus. Pvz., NGS metodas pradedamas taikyti vertinant atsaką į vakcinaciją, jau yra nustatyti imuniniai atsakai į ŽIV ir Dengė virusus.

• Imuninės disfunkcijos įvertinimui

• Tiriant antigenų receptorių sekas galima: (i) identifikuoti potencialiai patogeniniu limfocitų klonus; (ii) sekti tuos patogeninius klonus prieš ir po gydymo.

NGS limfoproliferacijų diagnostikai ir minimaliai liktinei ligai

• Taikinys – BCR ir TCR (IgH/TCR klonai)

• Diagnostikai: ėminiai – solidinių navikų blokai (DNR kokybės problemos), kč, cirkuliuojanti DNR; MRD – kr, kč, cirkuliuojanti DNR (cirkuliuojanti standartiniam kloniškumui netinka, nes kloniškumo profilis gali būti atspindėtas nepilnai)

• Tiriamoji medžiaga – reikia nuspręsti, bet bus DNR.

• Bibliotekos paruošimas.

• Tyrimo metodas – NGS (ilgi/trumpi skaitiniai, MiSeq vs HiSeq?)

• Taikymas: NHL, HL, DDBCL, ŪLL, diagnostikai ir MRD

NHL• IgH gene rearrangements as plasma biomarkers in Non-Hodgkin’s Lymphoma patients Oncotarget

2011; 2: 178-185• Proof of principle:• 1. Panaudota cirkuliuojanti DNR.• 2. IgCap biblioteka• 3. Pademonstruoti, kad strategija veikia.• 4. Be jokių klinikinių tikslų.• 5. N=14

• IgCap principas: (i) naviko DNR randomly fragmentuojama ir liguojama su adapteriais. Tada amplifikuojama nuo adapterių; (ii) PGR fragmentai su IgH sekomis selektyviai izoliuojami ant kieto paviršiaus su imobilizuotais komplementariais zondais; (iii) selektuoti amplikonai amplifikuojaminormaliu PGR-u – gaunasi IgCap biblioteka su adapteriais fragmentų galuose, nuo kurių atliekamas NGS.

• Išvados:• 1. Keturiolikai pacientų, kuriems naviko bloko nebuvo, plazmos cirkuliuojančioje DNR buvo surasti

IgH pertvarkymai. Vadinasi tai galima padaryti.• 2. Pertvarkytas IgH sekas galima rutiniškai rasti NHL pacientų plazmoje pakankamais tyrimui

kiekiais. Plazmoje naviko cirkuliuojančios DNR yra žymiai daugiau, nei naviko cirkuliuojančių ląstelių. • 3. IgCap yra pakankamai veiksmingas metodas IgH pertvarkymų nustatymui, kai nėra naviko bloko.

Metodą galima panaudoti MRD.

HL

• Detection of classical Hodgkin lymphoma specific sequence in peripheral blood using a next-generation sequencing approach BJH 2015

• NGS ir LymphoSIGHTTM (Sequenta, Inc., South San Francisco, CA, USA) geba identifikuojant limfomai specifinius IgH pertvarkymus naviko mėginyje ir periferiniame kraujyje diagnozuojant ligą ar ligai atsinaujinus; ir sekimo periodu kraujyje (plazmoje ir mononuklearuose).

• Metodo jautrumas – 1 limfomos ląstelė/1mljn leukocitų, todėl gali būti taikomas skirtingų B proliferacijų MRD tyrimui.

• N=17

Naviko mėginiuose (biopsijose)

• IgH VDJ kloninis pertvarkymas nustatytas 10/17 pacientų (83%), IgH-DJ kloninis pertvarkymas nustatytas 6/17 pacientams (50%). IgK kloninis pertvarkymas nustatytas 4/17 pacientams(33%).

• Specifiniai limfomos klonotipai kraujyje: 8/11 pacientų (73%); serume 8/9 pacientų (89%), PBMC 3/9 pacienų (33%).

Cirkuliuojanti PBMC

Išvados: This is the first clinical assay that can be used to detect MRD in CHL. Lymphomaspecific sequence was more frequently detected in serum than in PBMC

DDBLL

• Circulating tumour DNA and CT monitoring in patients with untreated diff use large B-cell lymphoma: a correlative biomarker study

• www.thelancet.com/oncology Published online April 2, 2015 http://dx.doi.org/10.1016/S1470-2045(15)70106-3

Cirkuliuojančios DNR IgH NGS. Skaičiavimas – 1 IgH rearrangementas = 1 limfomos molekulė / 10⁶ genomo ekvivalentų

Iš 36 kliniškai progresavusių, 25 progresavo anksti (69%).11 pacientų (31%) progresavo vėlai. Po gydymo šitie 11 pacientų neturėjo naviko cDNR, bet 10 (91%) ji vėliau atsirado dar prieš klinikinį atsiradimą.

Iš 90 pacientų be klinikinės progresijos, 88 (98%) naviko cDNR niekada nebuvo rasta.

• Cirkuliuojančios naviko DNR koncentracija koreliuoja su IPI:

– 416 (range 0–2・4 × 10⁴) limfomos molekulių / 10⁶ diploidinio genomomažos rizikos (0–1) pacientuose

– 5095 (0–1 × 10⁶) limfomos molekulių / 10⁶ diploidinio genomotarpinės rizikos (2–3) pacientuose

– 7226 (3–1・6 × 10⁵) limfomos molekulių / 10⁶ diploidinio genomothose didelės rizikos (4–5) pacientuose (p<0・0001).

1. Prieš klinikinę progresiją naviko cDNR visada būna randama (n=10).

2. Prieš klinikinę progresiją gali būti laikinas naviko cDNR pradingimas, bet po to ji atsiranda (n=9).

3. Naviko cDNR pradingimas po klinikinės progresijos (n=6).

Pacientų, kuriuose naviko cDNRniekada neprapuola, laikas iki progresijos 3,8 mėn. (0·76–7·16),5,8 mėn. (4·0–9·9) kuriems būna laikinas cDNR pradingimas ir 5,3 mėn.(4·2–9·7) kuriems cDNR laikinai prapuola (p=0·0043 by the Kruskal-Wallis test).

Naviko klonotipai nustatyti 126/198. Tarpinis vertinimas po dviejų gydymo ciklų (n=108):5 metų laikas iki progresijos 41·7% (95% CI 22·2–60·1) su cDNR ir 80·2% (69·6–87·3) be cDNR(p<0·0001).

Visas vertinimas (n=107 pasiekę pilną remisiją): klinikinės ligos progresijos HR 228 (95% CI 51–1022) su naviko cDNR, lyginant su pacientais be naviko cDNR (p<0·0001).

Tarpinio vertinimo cDNR (yra) predikcinės vertės: teigiama 62·5% (95% CI 40·6–81·2), neigiama 79·8% (69·6–87·8).

Viso vertinimo cDNR (yra) predikcinės vertės: teigiama 88·2% (95% CI 63·6–98·5) neigiama 97·8% (92·2–99·7)Galima ligos atsinaujinimo rizika ~3,5 mėn. iki klinikinio ligos atsinaujinimo požymių.

• Non-invasive monitoring of diffuse large B-cell lymphoma by immunoglobulinhigh-throughput sequencing

• Blood First Edition Paper, prepublished online April 17, 2015; DOI 10.1182/blood-2015-03-635169

• 75 DDBLL pacientai (311 kraujo mėginiai, 105 naviko mėginiai).• IgH (LymphoSIGHT) iš leukocitų ir cirkuliuojančios DNR.• Koreliacija su klinikinėmis išeitimis ir palyginimas su FDG PET/CT (n=173).

• Rezultatai:• Kloniniai IgH pertvarkymai nustatyti 83% pacientų naviko mėginiuose. Vėliau šie klonotipai

buvo sekami periferiniame kraujyje.

• Plazmos cirkuliuojančioje DNR molekulinės ligos daugiau nei leukocituose ir geresnė koreliacija su radiografiškai įvertinta ligos mase.

• Prieš gydymą plazmoje IgH sekos buvo rastos 82% pacientų, kraujo ląstelėse 71%.

• Relapso metu IgH sekos žymiai dažniau randamos plazmoje nei kraujo ląstelėse (100% vs. 30%; p = 0.001).

• Plazmoje IgH sekos nustatomos anksčiau, nei PET/CT randamas relapsas tuose pacientuose, kurie buvo pasiekę remisiją.

• Sekimo periodu plazmos IgH NGS specifiškumas palyginus su PET/CT (100% vs. 56%, p<0.0001); jautrumas (31% vs. 55%, p=0.4).

• Kloniniai IgH pertvarkymai nustatyti 83% atvejų.

• Kloninių IgH pertvarkymų nustatymui geriau tinka šviežias nei šaldytas audinys; FFPĮ mėginiuose dėl galimos tiriamosios medžiagos degradacijos IgH nustatymas blogesnis (p = 0.007)

• Molekulinė ligos masė ir kokybiškai ir kiekybiškai geriau nustatoma cirkuliuojančioje DNR nei cirkuliuojančiose naviko ląstelėse.

• Palyginimui: jei liga randama cirkuliuojančioje DNR ir CTC, tai cirkuliuojančioje jos kiekis ~150x didesnis nei ląstelėse.

Molekulinis ligos nustatymas IgH NGS cirkuliuojančioje vs CTC.

• Tirti pacientų su aktyvia liga (dx ar relapsas) kraujo mėginiai + PET/CT detectable disease.

• Šiuose poriniuose (dx + PET/CT ar relapsas + PET/CT) mėginiuose LDH jautrumas buvo 59% (20/34), palyginus su 88% (30/34) plazmos IgH NGS (p=0.01)

Molekulinės ligos plazmoje koreliacija su LDH

Plazmos IgH NGS koreliacija su naviko mase

Ženkliai koreliavo (r=0,53) su metaboline naviko mase (pagal PET/CT) (p=0.002)

progressive disease

Ligos monitoravimas pagal IgH NGS gydymo metu

stable diseasecomplete response followed by progression

Kiekybinis molekulinis ligos išmatavimas plazmoje koreliuoja su ligos mase PET/CT.

• Deep-sequencing approach for minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia

• BLOOD, 20 DECEMBER 2012 VOLUME 120, NUMBER 26

• DeepSeq metodo tinkamumo MRD tyrimui į(pa)rodymas.• Jokių klinikinių tikslų, tik MRD metodikų – flow, PCR ir DeepSeq –

palyginimas.• B-linijos pediatriniai ŪLL diagnostiniai kč mėginiai (N=110)

• Keliamos sąlygos: • 1. Atrinkti tik tie atvejai, turintys identifikuotą IgH kloninį pertvarkymą. • 2. Tik tie atvejai, kuriems MRD buvo sekama PCR ir flow metodais ir kurie

turėjo MRD reikšmes 19, 26 ir 46 dieną; 7, 17 ir 48 sav. tęsiant gydymą ir po gydymo 120 ir 146 sav.

• 3. Tik tie atvejai, kuriems buvo išsaugotas didelis DNR kiekis.• MRD reikšmė – tai leukemijos molekulių skaičius, padalintas iš bendro

leukocitų skaičiaus mėginyje.

DeepSeq MRD vs tradiciniai MRD

95/105 (90%) 102/106 (96%)

Detection of Minimal Residual Disease in B Lymphoblastic Leukemia by High-Throughput Sequencing of IGH Clin Cancer Res; 20(17); 4540–8. 2014 AACR

N=99

ClonoSEQ platform (Adaptive Biotechnologies), CDR3 sritys

Palyginimas su flow.

IgH pertvarkytos sekos nustatytos 91/98 pacientų

29 dieną po gydymo buvo ieškomi diagnozės metu nustatyti „indeksiniai“ IgH pertvarkymai. Lyginama su multiparametrine flow-citometrija.

3 grupės:

(1) MRD neigiamas tiek NGS, tiek MPFC

(2) MRD NGS-u teigiama, FC – neigiama

(3) MRD teigiama tiek NGS-u, tiek FC.

Toliau MRD rezultatas gydymo išeitims nevertintas.

Our data suggest that NGS of IGH could significantly improve clinical prognostication in B-ALL.

IgH-V(D)J NGS-MRD measurement pre- and early post- allo-transplant defines very

low and very high risk ALL patients

Blood First Edition Paper, prepublished online April 10, 2015; DOI 10.1182/blood-2014-12-615757

N=41 Adaptive Biotechnologies ImmunoSeq IgH.Ar didelio jautrumo NGS MRD gali pagerinti relapso rizikos įvertinimą prieš po tx?Lyginta su FC.

NGS-MRD žymiai tiksliau numatė relapsą ir įvertino išgyvenamumą nei FC-MRD (p<0.0001), ypač MRD neigiamoje grupėje (NGS-MRD neigiamų vs FC-MRD neigiamų relapsas 0% vs. 16%; p=0.02, 2 metų OS 96% vs. 77%; p=0.003).

Po transplantacijos NGS-MRD teigiamumas geriau numatė relapsą nei FC-MRD (p<0.0001), ypač ankstyvame laikotarpyje po transplantacijos (30 dieną FC-MRD teigiamų relapso dažnis 35%, NGS-MRD teigiamų relapso dažnis 67%;p=0.004).

Multivariacinėje analizėje bet koks post-tx NGS-MRD teigiamumas ridina relapso riziką (HR 7.7; p=0.05).

Prieš transplantaciją NGS-MRD neigiamumas išskiria pacientų grupę, kuriai galima taikyti švelnesnį gydymą.

Po transplantacijos NGS-MRD teigiamumas didina relapso riziką ir blogina išgyvenamumą. Tokiems pacientams galima svarstyti gydymo taktikos modifikacijas.

Pre-tx NGS MRD for relapse and survival2 metų relapso tikimybė 0% vs 53% (p>0,0001)2 metų OS 96% vs 48% (p=0,003)

NGS MRD vs Multichannel FC MRDNGS MRD tiksliau numatė relapsą nei FC MRD (p>0,0001)2 metų relapso tikimybė 53% vs 0% MRD-NGD+ vsMRD-NGS-(p>0,0001)Ir 46% vs 16% (p=0,003) FC-MRD+ vs FC-MRD-

NGS-MRD geriau numatė 2y OS