NGS (Neste Generasjons Sekvensering) i

diagnostikk, erfaringer og resultater

Emiel Janssen

Seksjonsleder for Kvantitativ og Molekylær Patologi

Daglig leder for laboratoriet for molekylær biologi

Avdeling for Patologi

Stavanger Universitetssjukehus

Professor II, Biomedisin, UiS

Organisering på avdeling for patologi

Avdelingsoverlege

Seksjonsoverlege/ Seksjonsleder

Seksjon for obduksjon

Seksjonsoverlege/

Seksjonsbioingeniør

Seksjon for histologi

Stedfortred.

sek.bioingeniør/ Fagbioingeniør

Generell histlab.

Fagbioingeniør makro

Fagbioingeniør fersk frys/ biobank

Fagbioingeniør farge

Seksjonsoverlege/ Seksjonsbioingeniør

Seksjon for cytologi

Stedfortred. sek.bioingeniør/ Fagbioingeniør

lab.

Fagbioingeniør klinisk

Fagbioingeniør gyn.

Seksjonsoverlege/

Seksjonsbioingeniør

Seksjon for immunhistokjemi

Seksjonsoverlege/

Seksjonsbioingeniør

Seksjon for kvantitativ og molekylærpat.

5,3 personer både

diagnostikk og forskning

Adm. koordinator

Merkantil seksjon

Fagbioingeniør

system

Stedfortredende avdelingsoverlege

Leger

Sjefbioingeniør

Lunge kreft I Norge 2015

•3035 nye tilfeller I 2015

• Økende andel kvinner

• 5-års overlevelse ca 15-20%

• Bare 17% kan behandles med kirurgi

•Anbefaling er EGFR og ALK testing ifm terapi utvalg

•Sensitiv eller resistens

•Primair svulst/liquid biopsy/metastase??

Kreft –en genetisk sykdom

IHC

FISH

GENETISKE

ANALYSER EGFR

BRAF

NRAS

KRAS

Sequist et al: annals of oncology 22, 2616-2624, 2011

Sharma et al. Nature Reviews Cancer 7, 169–181 (March 2007)

Kuiper et al, BJC, 2016

Molekylær biologiske analyser ved

avd. for patologi, SUS

2007 2015

Antall genetiske tester 2 8

Antall analyser 103 537

Antall personer som

utfører disse testene 1 1

+ HPV screening, 10 649 analyser i 2015

Prosent tall fra Stavanger 2012-2015

Antall testet Antall positiv Positiv Uegnet

FISH-ALK 42 6 15% 2%

KRAS * 228 69 30% 0.5%

NRAS * 228 4 2% 0

EGFR 387 31 7% 0

BRAF * 144 59 40% 2%

* Flere organer inkludert i disse tallene

KRAS 59- G12 9- G13 1- K 117

NRAS 2- G12 1- Q61 1- K 117

Lungekreft biopsi

Mutasjonsanalyer

• Å teste hver gen for seg:

– En pasient som skal testes for KRAS/NRAS/BRAF

mha qPCR krever 200 ng DNA

– På grunn av økt forespørsel, økt antall mutasjoner for

hvert gen og økt antall gener trenges de flere 96-bunns

plater med analyser hver dag

– Mye pipettering

– Kostnader øker pga arbeidstid og reagenser

EGFR+KRAS+NRAS+BRAF=

1000+462+462+257=2181 NOK

Kan NGS være en løsning??

NGS= neste generasjons sekvensering

• Panel med gener eller hel genom/eksom

• Egne paneler eller kommersielle

• Massiv parallel sekvensering

• Mange millioner sekvenseringsreaksjoner samtidig

Illumina: measurement by imaging/sequecing by synthesis

Life: measurement by pH-difference/sequencing by

Qiagen: sequencing by ligation

NGS= next generation sequencing

• Spesifikke paneler eller hel genom

• minst 10 ng FFPE DNA

• Sekvensering via pH måling

• Ca. 115 bp per sekvens

• 11 million brønner per chip

https://www.thermofisher.com/no/en/home/clinical/preclinical-companion-diagnostic-development/oncomine-

oncology/oncomine-focus-assay.html

https://www.thermofisher.com/no/en/home/clinical/preclinical-companion-diagnostic-development/oncomine-

oncology/oncomine-focus-assay.html

https://www.thermofisher.com/no/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-

sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-run-sequence/ion-pgm-system-for-next-generation-

sequencing.html

Muligheter

https://www.thermofisher.com/no/en/home/clinical/preclinical-companion-diagnostic-development.html

IVD godkjent siden mars 2015

Oncomine fokus : • Har blitt validert i 300 prøver (100 lunge, 100

prostata, 100 blandet)

• 100% sensitivitet and spesifisitet for EGFR, BRAF,

KRAS in lunge

• >95 % sensitivitet and spesifisitet totalt

Ion Torrent, NGS

Hovelson et al, Neoplasia 2015 Apr; 17(4): 385–399.

Logistikk

• Manuell DNA-isolering – torsdag + fredag

• DNA-måling, kvantitet + kvalitet – fredag

• Bibliotek laging – mandag

• Bibliotek måling, kvantitet + kvalitet – mandag

• Ion Chef – tirsdag

• PGM – tirsdag/onsdag

• Ion torrent server - onsdag

Lokal validering

• Total antall 50 FFPE + 3 kommersielle kontroller

• 4 Celle linjer med multiple mutasjoner (BRAF, KRAS,

NRAS, EGFR)

• 100 % overenstemmelse

• Her2 CNV mha NGS: n=8 ikke-amplifisert, 7 amplifisert

• Her2 FISH 1.8 – 2.0 : Ikke amplifisert mha NGS n=4

PIK3CA BRAF KRAS NRAS EGFR 1 21 14 3 14

NGS resultater

NGS analysering

• Trenger minst 3.5 million reads av DNA og minst 250.000

per prøve

• Trenger minst 5000 reads av RNA per prøve

• Trenger helst minst 50% tumor celler for kopi antall

beregningen

• Noen ikke affiserte områder i de forskjellige gener blir

analysert også

• Kopi tall er en in silico beregning ift 500 analyserte

normale og tumor prøver.

• ALK, ROS, RET og NRTK1 bestemmes i begge lese

retninger (dette ifm mulige delesjoner) pluss en måling av

normal ekspresjon (i andre regioner av genene)

Kvalitetsrunder

• ESP kolorektal (KRAS/NRAS/BRAF)

– 100% Korrekt

– Ikke godkjent rapport

• ESP lunge (ALK, EGFR)

– ongoing

NGS utfordringer • CNVs og tumorprosent på>50%

• RNA kvalitet og positive kontroller

• Hva skal man rapportere (forskjellig for hver organ, eller

alt eller…??)

• Taksten?

• Hva skal man oppbevare, DNA/rådata filen, rapport

filen

• Hvilket system skal man bruke, standard for alle eller..?

• Fortsatt en del pipettering

• Trening/utdanning. Spesialister i molekylær patologi,

molekylære onkologi, molekylære kirurgi?

Forslag fra SUS, standardsvar på «lunge pakke» primærutredning:

Mutasjons informasjon

• EGFR

• KRAS

• NRAS

• BRAF

Ved re-biopsi grunnet behandlingssvikt på EGFR-hemmer

Mutasjons informasjon Translokasjon

• EGFR -ALK

• KRAS -ROS1

• NRAS -RET

• BRAF

• ALK

• ROS1

• RET

Amplifikasjons informasjon

• MET

• HER2

• PIK3CA

Lungekreft

Resistens mot EGFR TKI

Camidge et al. Nature Reviews Clinical Oncology Volume: 11, Pages:473–481:(2014)

Videre utviklinger

• Flere biopsier vil bli testet

• Tester man primaer svulsten eller metastaser (eller

begge to)?

• Liquid biopsier:

– Testing for mutasjoner i cell free DNA (plasma) hos

pasienter hvor annet prøvematerialet er for vanskelig

– Testing for bestemte, kjente mutasjoner under

behandlingen

• Digital PCR eller NGS

Norsk forening for Molekylær Patologi

NFMP

• Organisert under patologi foreningen

• Åpent for alle som jobber er interessert i molekylær

patologi

• Arbeidsgruppen startet med registrering og mandat

osv

• Patologi foreningen har gitt støtte

• Ideer for en logo er velkommen

• Første møte 16-17 november 2017 i Oslo

Takk for oppmerksomheten!!