NOS1AP als Kandidatengen für endogene Psychosen · Aus der Klinik und Poliklinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie der Universität Würzburg Direktor: Prof. Dr

Aus der Klinik und Poliklinik für Psychiatrie, Psyc hosomatik und Psychotherapie

der Universität Würzburg

Direktor: Prof. Dr. Jürgen Deckert

NOS1AP als Kandidatengen für endogene Psychosen

Inaugural - Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Alexandra Kramer

aus Göttingen

Würzburg, Dezember 2010

Referent:

Prof. Dr. Andreas Reif

Korreferent:

Priv.-Doz. Dr. Christoph Kleinschnitz

Dekan:

Prof. Dr. Matthias Frosch

Tag der mündlichen Prüfung: 18.07.2011

Die Promovendin ist Ärztin

Für meine Eltern

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

1 Einleitung ................................................................................................................ 1

1.1 Schizophrenie ................................................................................................... 1

1.1.1 Diagnostik und Klinik .............................................................................. 1

1.1.2 Epidemiologie ........................................................................................... 3

1.1.3 Ätiologie ................................................................................................... 3

1.1.4 Neuropathologie ....................................................................................... 4

1.2 Bipolar-affektive Erkrankung ........................................................................... 5

1.2.1 Diagnostik und Klinik .............................................................................. 5

1.2.2 Epidemiologie ........................................................................................... 7

1.2.3 Ätiologie ................................................................................................... 8

1.2.4 Neuropathologie ....................................................................................... 8

1.3 Pathophysiologie endogener Psychosen ........................................................... 9

1.3.1 Schizophrenie ........................................................................................... 9

1.3.1.1 Theorie der neuronalen Entwicklungsstörung ...................................... 9

1.3.1.2 Neurotransmitterhypothesen ............................................................... 10

1.3.2 Bipolar-affektive Erkrankung ................................................................. 15

1.3.2.1 Monoaminhypothese .......................................................................... 15

1.3.2.2 Dysfunktion der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse ... 16

1.3.2.3 Veränderungen der synaptischen Plastizität ....................................... 16

1.3.2.4 Hinweise auf Beteiligung des Glutamatsystems ................................ 17

1.4 Genetik ........................................................................................................... 18

1.4.1 Vererbung ............................................................................................... 18

1.4.2 Kopplungsanalysen ................................................................................. 19

1.4.3 Assoziationsstudien ................................................................................ 20

1.4.4 Vulnerabilitätsgene endogener Psychosen ............................................. 21

1.4.4.1 Suszeptibilitätsregionen - Ergebnisse aus Kopplungsanalysen .......... 21

1.4.4.2 Suszeptibilitätsgene - Schizophrenie .................................................. 22

1.4.4.3 Suszeptibilitätsgene - Bipolar-affektive Störung ................................ 24

1.4.4.4 Hinweise auf Überlappung der Ätiologie ........................................... 24

Inhaltsverzeichnis

1.5 Das Kandidatengen NOS1AP ......................................................................... 25

1.5.1 Definition und Funktion ......................................................................... 25

1.5.2 Neuronale NO-Synthase als Zielstruktur von NOS1AP......................... 28

1.5.3 NOS1AP als Kandidatengen: bisherige Studienergebnisse.................... 30

2 Fragestellung ......................................................................................................... 33

3 Material und Methoden ......................................................................................... 34

3.1 Probanden ....................................................................................................... 34

3.2 Material ........................................................................................................... 35

3.2.1 Reagenzien.............................................................................................. 35

3.2.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien ......................................................... 37

3.3 Methoden ........................................................................................................ 38

3.3.1 Methodischer Überblick ......................................................................... 38

3.3.2 DNA-Extraktion ..................................................................................... 39

3.3.3 Polymerase-Kettenreaktion .................................................................... 39

3.3.4 Agarose-Gelelektrophorese .................................................................... 41

3.3.5 Amplifizierung nach dem iPlex®-Protokoll ............................................ 42

3.3.6 Verdau mit Alkalischer Phosphatase ...................................................... 42

3.3.7 iPlex® Reaktion ...................................................................................... 42

3.3.8 Reinigung durch Ionenaustauschharz ..................................................... 43

3.3.9 MALDI-ToF Massenspektrometrie ........................................................ 43

3.3.10 Statistische Analyse ................................................................................ 44

3.3.11 Qualitätssicherung .................................................................................. 44

4 Ergebnisse .............................................................................................................. 46

4.1 Schizophrenie ................................................................................................. 46

4.1.1 Kopplungsungleichgewicht .................................................................... 46

4.1.2 Assoziationsanalyse ................................................................................ 47

4.2 Bipolar-affektive Störung ............................................................................... 48

4.2.1 Kopplungsungleichgewicht .................................................................... 48

4.2.2 Assoziationsanalyse ................................................................................ 48

4.3 Tabellarische Übersicht der Ergebnisse ......................................................... 49

5 Diskussion ............................................................................................................. 60

5.1 Stärken und Schwächen von Assoziationsstudien .......................................... 60

Inhaltsverzeichnis

5.2 Vergleich mit anderen Studien ....................................................................... 62

5.3 Ursachen für Unterschiede zu anderen Assoziationsstudien .......................... 65

5.4 Andere Kandidatengene auf 1q22 .................................................................. 67

5.5 Bedeutung des nitrinergen Systems ................................................................ 69

5.6 Funktionelle Studien ....................................................................................... 70

5.7 Neue Studienansätze ....................................................................................... 73

5.8 Sozioökonomische Folgen und Ausblick ....................................................... 76

6 Zusammenfassung ................................................................................................. 78

7 Literaturverzeichnis ............................................................................................... 80

8 Abbildungsverzeichnis .......................................................................................... 91

9 Tabellenverzeichnis ............................................................................................... 92

10 Anhang .................................................................................................................. 93



Abb. Abbildung AMDP Arbeitsgemeinschaft für Methodik und Dokumentation in der

Psychiatrie AMP Adenosinmonophosphat AMPA Alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-Propionat AMPAR Alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-Propionat-

Rezeptor BDNF brain derived neurotrophic factor bp Basenpaare bzw. beziehungsweise C Celsius ca. circa Ca2+ Calcium CAPON carboxy-terminal PDZ ligand of neuronal NO synthase cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat COMT Catechol-O-Methyltransferase CREB cyclic AMP response element-binding protein CRH Corticotropin-releasing hormone CYP Cytochrom P450 d. h. das heißt D2-Rezeptor Dopamin-2-Rezeptor DAAO D-amino acid oxidase DAOA D-amino acid oxidase activator DAT Dopamintransporter dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat ddNTP Didesoxyribonukleosidtriphosphat dex Dexamethason Dexras dexamethasone-induced Ras-related protein dGTP Desoxyguanosintriphosphat DISC disrupted in schizophrenia DLPFC dorso-lateraler präfrontaler Cortex DNA deoxyribonucleic acid dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DSM Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders dTTP Desoxythymidintriphosphat DTNBP1 Dysbindin EAAT excitatory amino acid transporter EDTA Ethylendiamintetraacetat g Gramm GABA gamma-aminobutyric acid GDP Guanosindiphosphat ges. gesamt Glx Glutamat/Glutamin GTP Guanosintriphosphat


GTPase Guanosintriphosphatase HCl Chlorwasserstoff HDAC Histondeacetylase HHN-Achse Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse HLA-DQB1 major histocompatibility complex, class II, DQ beta 1 H-MRS Protonen-Magnetresonanz-Spektroskopie H2O Wasser 5-HTT 5-Hydroxytryptamintransporter ICD International Statistical Classification of Diseases and Related

Health Problems K+ Kalium kb Kilobase KCl Kaliumchlorid kDa Kilodalton KHCO3 Kaliumhydrogencarbonat l Liter LD linkage disequilibrium LOD logarithm of odds LTD long-term depression LTP long-term potentiation M molar MAGUK membrane-associated guanylate kinase MALDI-ToF matrix-assisted laser disorption ionisation-time of flight MAP-Kinase mitogenaktivierte Proteinkinase Mb Megabase Met Methionin mg Milligramm Mg2+ Magnesium MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute ml Milliliter mM millimolar mRNA messenger ribonucleic acid MRT Magnetresonanztomographie MS Massenspektrometer µg Mikrogramm µl Mikroliter Na+ Natrium NaCl Natriumchlorid NANC nonadrenerg noncholinerg NET norepinephrine transporter neg. negativ NF-L light neurofilament NH4Cl Ammoniumchlorid nl Nanoliter nm Nanometer NMDA N-Methyl-D-Aspartat NMDAR N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor


NO Stickstoffmonoxid nom. nominell NOS NO-Synthase NOS1AP NOS1 adaptor protein Nr. Nummer NR1 N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor Untereinheit 1 NR2A-D N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor Untereinheit 2A-D NR3 N-Methyl-D-Aspartat Rezeptor Untereinheit 3 p p-Wert PCR polymerase chain reaction PDZ Postsynaptic Density 95/Disc-Large/Zona Occludens Perm. Permutation PET Positronenemissionstomographie PFC präfrontaler Cortex pH potentia hydrogenii pmol Pikomol pos. positiv P-p p-Wert im Permutationstest PRODH Prolindehydrogenase PSD post synaptic density PTB-Domäne Phosphotyrosin-bindende Domäne Ras rat sarcoma RGS4 regulator of G-protein 4 RNA ribonucleic acid rpm revolutions per minute SADS-L Schedule for Affective Disorders and Schizophrenia-lifetime SAP Shrimp alkalische Phosphatase SAP102 synapse-associated protein of 102 kDa SDS sodium dodecyl sulphate sec Sekunde sGC soluble guanylyl cyclase SNP single nucleotide polymorphism sog. sogenannt Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA U unit u. a. unter anderem UHMK1 U2AF homology motif kinase 1 UTR untranslated region UV ultraviolett v. a. vor allem Val Valin vs. versus WHO World Health Organization z. B. zum Beispiel ZNS zentrales Nervensystem ZO-1 Zonula occludens Protein 1

1 Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Schizophrenie

1.1.1 Diagnostik und Klinik

Schizophrenie ist eine schwerwiegende psychiatrische Erkrankung, die weltweit zu den

zehn häufigsten Gründen für eine krankheitsbedingte Beeinträchtigung der

Lebensqualität gehört und hohe ökonomische und soziale Kosten verursacht (Mueser

und McGurk 2004; Tandon et al. 2008b).

Es existieren mehrere wissenschaftliche Theorien darüber, wie lange es die Krankheit

Schizophrenie schon gibt. Traditionell geht man jedoch davon aus, dass sie so alt ist wie

der Homo sapiens selbst, was durch über 1000 Jahre alte Beschreibungen von

Psychosen unterstützt wird (wiedergegeben in Adityanjee et al. 1999; Tandon et al.

2009). Im ausgehenden 19. Jahrhundert teilte Emil Kraepelin die funktionellen

Psychosen in zwei Kategorien ein, die sich bezüglich ihrer Prognose unterschieden. Er

grenzte das „manisch-depressive Irresein“ mit fluktuierendem Verlauf und kompletter

Genesung zwischen den Episoden von der Dementia praecox ab. Unter diesem

Überbegriff vereinte er die Katatonie, die Hebephrenie, zuvor beschrieben von Karl

Ludwig Kahlbaum bzw. Ewald Hecker, und die von ihm beschriebene paranoide

Demenz. Kraepelin bemerkte Unterschiede hinsichtlich Ersterkrankungsalter,

Familiengeschichte und prämorbider Persönlichkeit zwischen beiden Krankheiten und

fand Hinweise auf Vererblichkeit der Dementia praecox (Adityanjee et al. 1999; Naqvi

2008). Am Anfang des 20. Jahrhunderts wurde dann der Begriff Schizophrenie

(altgriechisch: schizein, „abspalten“ und phrēn, „Zwerchfell, Seele“) von Eugen Bleuler

eingeführt. Er betrachtete die Symptomatik im Querschnitt und formulierte sogenannte

Grund- (Assoziationslockerung, Affektstörung, Autismus, Ambivalenz) und

Nebensymptome (Wahrnehmungsstörungen, inhaltliche Denkstörungen, Katatonie),

wobei er die Grundsymptome allein als charakteristisch für die Schizophrenie ansah

(Adityanjee et al. 1999; Naqvi 2008). Später formulierte Kurt Schneider die Symptome

ersten und zweiten Ranges, die Wahrnehmungsstörungen, inhaltliche Denkstörungen

und Ich-Störungen beschreiben. Seiner Meinung nach wiesen die Symptome ersten

Ranges eindeutig auf Schizophrenie hin, allerdings weiß man heute, dass sie auch bei

1 Einleitung

2

anderen Zuständen auftreten können. Schneiders Kriterien wurden zum Inhalt vieler

strukturierter Interviews und trugen entscheidend zu den heutigen diagnostischen

Klassifikationssystemen bei.

Heute wird die Diagnose entweder nach ICD-10 oder DSM-IV gestellt. Beide Systeme

definieren Symptome und Beeinträchtigungen auf ähnliche Art und Weise und haben

die Diagnostik zuverlässiger gemacht (Mueser und McGurk 2004). Bei ICD-10 müssen

die notwendigen Diagnosekriterien für den Zeitraum von mindestens einem Monat

bestehen, während bei DSM-IV ein Auftreten der charakteristischen Merkmale von

mindestens sechs Monaten gefordert wird. Schizoaffektive und andere transiente

psychotische Störungen werden ebenfalls in der Gruppe der Schizophrenie klassifiziert

(Adityanjee et al. 1999; Mueser und McGurk 2004). Nach ICD-10 erfolgt eine

Subtypisierung in die paranoide, hebephrene, katatone und undifferenzierte

Schizophrenie, die postpsychotische Depression, das schizophrene Residuum und die

Schizophrenia simplex, welche jeweils unterschiedliche Prognosen haben (Brunnhuber

et al. 2005).

Die Schizophrenie zeichnet sich durch zwei große Symptomenkomplexe aus: positive

bzw. psychotische Symptome und negative Symptome. Zudem spielen kognitive

Beeinträchtigungen eine wichtige Rolle. Zu den psychotischen Symptomen gehören der

Verlust des Realitätsbezuges, Wahnvorstellungen, Halluzinationen und absonderliches

Verhalten. Typischerweise kommt es zu auditorischen Halluzinationen, es können

jedoch auch visuelle, olfaktorische, gustatorische und taktile Halluzinationen auftreten.

Wahnvorstellungen zeigen sich besonders in Form von Verfolgungswahn,

Kontrollwahn, Größenwahn und somatischem Wahn und haben häufig einen bizarren

Charakter. Unter negativen Symptomen versteht man defizitäre Zustände, in denen es

zu einer Einschränkung oder einem Verlust grundlegender Emotionen und

Verhaltensprozesse kommt. Dazu gehören Affektverflachung, Anhedonie, Apathie,

Verarmung von Sprache, Mimik und Gestik sowie sozialer Rückzug. Während die

psychotischen Symptome meist episodisch auftreten, sind Negativsymptome

überwiegend konstant vorhanden und beeinträchtigen die psychosoziale Funktion des

Betroffenen schwer. Zu den kognitiven Beeinträchtigungen werden Einschränkungen

von Aufmerksamkeit und Konzentration, psychomotorischer Geschwindigkeit, Lernen,

1 Einleitung

3

Gedächtnis und exekutiven Funktionen wie abstraktem Denken und Problemlösung

gezählt (Mueser und McGurk 2004).

Erkrankte leiden oft unter Komorbiditäten, darunter besonders kardiovaskuläre

Krankheiten. Das Risiko für Alkohol- und Drogenprobleme, Nikotinabusus, infektiöse

Krankheiten oder Obdachlosigkeit ist groß und führt zu einer erhöhten Mortalität durch

Suizid, Unfälle und Krankheitsfolgen (Mueser und McGurk 2004).

1.1.2 Epidemiologie

Schizophrenie hat eine Lebenszeitprävalenz von ca. 1%, die jährliche Inzidenz liegt bei

0,2-0,4/1000 (Brzustowicz et al. 2004; Mueser und McGurk 2004; Tandon et al. 2008b).

Bisher ist man davon ausgegangen, dass die Krankheit bei beiden Geschlechtern

ungefähr gleich häufig auftritt, allerdings wurde in neueren Metaanalysen ein häufigeres

Auftreten beim männlichen Geschlecht festgestellt, das Verhältnis betrug 1,4:1 (Tandon

et al. 2008a). Das Ersterkrankungsalter liegt bei Frauen zwischen 25 und 30 Jahren, bei

Männern tritt die Krankheit im Durchschnitt fünf Jahre früher auf. Dieser Unterschied

ist möglicherweise auf die protektive Wirkung von Östrogen und die reduzierte

Sensitivität von D2-Rezeptoren im ZNS von Frauen zurückzuführen. Frauen zeigen

zudem meistens einen milderen Verlauf (Mueser und McGurk 2004). Die Inzidenz und

die klinischen Symptome sind laut einer WHO-Studie in verschiedenen Kulturen und

Ländern, unabhängig vom Entwicklungsgrad, relativ konstant (Mueser und McGurk

2004; Naqvi 2008).

1.1.3 Ätiologie

Familien-, Zwillings- und Adoptionsstudien geben deutliche Hinweise auf einen

genetischen Hintergrund, die Heritabilität, also der genetisch bedingte Anteil für die

Krankheitsanfälligkeit, ist sehr hoch und wird auf bis zu 80% geschätzt (Brzustowicz et

al. 2004; Tandon et al. 2008a; Tandon et al. 2008b; Zheng et al. 2005). Die

Konkordanzrate bei monozygoten Zwillingen liegt bei 31-78%, bei dizygoten nur bei 6-

28%. Aus Adoptionsstudien weiß man, dass das Erkrankungsrisiko eines adoptierten

1 Einleitung

4

Kindes, dessen biologische Mutter an Schizophrenie erkrankt ist, so hoch bleibt wie das

eines Verwandten ersten Grades und nicht das allgemeine Risiko seiner

Adoptionsfamilie annimmt (Lewis und Levitt 2002). Dies lässt den Einfluss des

familiären Umfeldes auf die Krankheitsentstehung eher gering erscheinen. Während das

Erkrankungsrisiko in der Allgemeinbevölkerung bei ca. 1% liegt, haben Angehörige

ersten Grades eines Betroffenen ein ca. zehnfach erhöhtes Risiko, welches mit der

Anzahl an betroffenen Verwandten steigt (Lewis und Levitt 2002; Mueser und McGurk

2004). Sind beide Elternteile betroffen, beträgt das Risiko für das Kind 40% (Tsuang

2000). Allerdings können Schizophrenien auch sporadisch auftreten.

Obwohl die Genetik einen großen Beitrag zur Entstehung der Schizophrenie liefert,

spielen auch andere Faktoren eine wichtige Rolle. Hinweise dafür sind die erwähnte

unvollständige Konkordanz bei eineiigen Zwillingen und die Tatsache, dass das Risiko

der Kinder eines betroffenen und eines nicht betroffenen Zwillings an Schizophrenie zu

erkranken jeweils gleich groß ist. Dies bedeutet, dass die genetische Prädisposition bei

beiden Zwillingen vorhanden ist, die Erkrankung jedoch nur bei einem, möglicherweise

durch Umweltfaktoren oder aber auch durch epigenetische Mechanismen, ausgelöst

wird (Craddock und Jones 1999; Tsuang 2000). Zu den bekannten Risikofaktoren

gehören prä- und perinatale Probleme wie maternale Infektionen, Unterernährung und

Rauchen während der Schwangerschaft sowie Entbindungskomplikationen, besonders

im Zusammenhang mit fetaler Hypoxie. Geburt im späten Winter oder frühen Frühling

ist mit einem 5-10% höheren Erkrankungsrisiko assoziiert. Auch soziodemographische

Faktoren wie Armut oder Geburt in städtischer Gegend spielen statistisch gesehen eine

Rolle (Mueser und McGurk 2004; Tandon et al. 2008a; Tsuang 2000).

1.1.4 Neuropathologie

Auffällig ist ein erweitertes Ventrikelsystem mit einer Reduktion von Gehirnvolumen

und grauer Substanz sowohl bei Erkrankten als auch bei gesunden Angehörigen. Zu den

Regionen mit vermindertem Volumen gehören Frontallappen, Amygdala,

Hippokampus, Parahippokampus, Thalamus, Gyrus temporalis superior und medius

sowie Gyrus cinguli. In PET-Studien zeigte sich bei Erkrankten, die Aufgaben

1 Einleitung

5

bezüglich exekutiver Funktion, Gedächtnis und Aufmerksamkeit durchführten,

außerdem ein abnormaler Blutfluss in frontalem Kortex, Kleinhirn und Thalamus

(Mueser und McGurk 2004). Ein weiterer wichtiger neuropathologischer Befund ist das

Fehlen einer Gliose, die typisch für neurodegenerative oder inflammatorische Prozesse

ist. Generell lassen MRT-Studien eher eine Unterbrechung funktionaler Schaltkreise als

eine Dysfunktion einzelner Gehirnregionen vermuten (Mueser und McGurk 2004).

1.2 Bipolar-affektive Erkrankung

1.2.1 Diagnostik und Klinik

Die bipolar-affektive Erkrankung wurde in der Geschichte in vielen verschiedenen

Kulturen beschrieben (Belmaker 2004). Kraepelin vereinigte Ende des 19. Jahrhunderts

verschiedene Formen der Manie und Depression unter dem Begriff „Manisch-

depressives Irresein“ und grenzte sie im Sinne der von ihm propagierten Dichotomie

von der Dementia praecox ab (Angst und Gamma 2008; Cookson 2005; Erfurth und

Arolt 2003). Karl Leonhard und Jules Angst etablierten später aufgrund

epidemiologischer, klinischer und prognostischer Unterschiede die „bipolar vs. unipolar

Dichotomie“ (Brieger 2007; Cookson 2005; Oswald et al. 2007). Im amerikanischen

Klassifikationssystem wurde in den 70er Jahren die bipolar-affektive Störung, gestützt

durch genetisch-epidemiologische Untersuchungen, wiederum in Bipolar I und Bipolar

II untergliedert (Brieger 2007; Cookson 2005; Erfurth und Arolt 2003). Als klassische

bipolar-affektive Erkrankung gilt die Bipolar-I-Störung (Belmaker 2004). Nach DSM-

IV bezeichnet die Bipolar-I-Störung Episoden der Manie mit oder ohne Depression,

wobei hier bereits eine Episode der Manie ausreichend für die Diagnose ist, wohingegen

bei ICD-10 zwei Episoden notwendig sind, von denen eine manisch, hypomanisch oder

gemischt sein muss (Belmaker 2004; Cookson 2005). Als Bipolar-II-Störung bezeichnet

man rekurrente depressive Phasen mit hypomanen Episoden, welche vom Betroffenen

nicht unbedingt als krankhaft erkannt werden und ohne psychotische und selbst- bzw.

fremdgefährdende Symptome einhergehen. Sie fällt bei ICD-10 unter „sonstige bipolar-

affektive Störungen“ (Cookson 2005; Belmaker 2004; Brieger 2007; Erfurth und Arolt

2003). Die Dauer der einzelnen Episoden ist individuell oft stabil (Cookson 2005).

1 Einleitung

6

Zwischen den Episoden kommt es in der Regel zu einer Remission, ca. 20% der

Erkrankten leiden jedoch auch im Intervall unter Stimmungslabilität (Angst 2007;

Belmaker 2004; Oswald et al. 2007). Eine besondere Form ist das rapid cycling, bei der

mindestens vier Episoden innerhalb eines Jahres auftreten. Diese Form ist besonders

schwer zu behandeln und hat eine schlechte Prognose (Cookson 2005; Belmaker 2004;

Erfurth und Arolt 2003; Oswald et al. 2007).

Klinisch ist die Störung durch zwei entgegengesetzte Pole gekennzeichnet. In der

depressiven Episode sind eine Störung der Affektivität im Sinne eines

Nichtfühlenkönnens und ein massiv gehemmter Antrieb, dessen maximale Form der

depressive Stupor darstellt, charakteristisch. Zudem kommt es zu eingeschränktem und

unproduktivem Denken. Oft besteht in der Depression auch ein Wahnerleben, typisch

sind Schuldwahn, Verarmungswahn, Krankheitswahn und nihilistischer Wahn. Zudem

treten vegetative Störungen mit verändertem Schlaf-Wach-Rhythmus und Schlafmangel

auf. Charakteristisch sind auch tageszeitliche Schwankungen mit dem sogenannten

Morgentief.

In der manischen Phase ist eine Hochstimmung, oft verbunden mit Begeisterung oder

Reizbarkeiz ein essentielles Kriterium. Charakteristischerweise kommt es zu

Ideenflucht, Gedankenrasen und einem Rededrang, in abgeschwächter Form fällt eine

weitschweifige Sprache auf. Außerdem hat der Betroffene eine exzessive Energie und

ein deutlich überhöhtes Selbstbewusstsein, was zu einem Gefühl der Grandiosität mit

überhöhter Einschätzung der eigenen Fähigkeiten und übersteigertem Ehrgeiz führen

kann. Daraus können auch psychotische Wahnvorstellungen und Halluzinationen

resultieren, wie z. B. die Überzeugung von großem Reichtum, einem speziellen Auftrag,

Verfolgungswahn oder unterstützenden und bestärkenden Stimmen. Auf kognitiver

Ebene ist der Betroffene leicht ablenkbar und hat Konzentrationsschwierigkeiten, bleibt

aber stets zeitlich und örtlich orientiert. Auch in der manischen Phase treten vegetative

Symptome in Form von vermindertem Schlafbedürfnis, verstärktem Appetit und

vermehrtem Interesse an Sexualität auf (Cookson 2005; Tölle und Windgassen 2006).

Generell kommt es oft zu einem Hochrisikoverhalten durch Verlust der Urteilskraft.

Charakteristisch für die manische Episode sind eine fehlende Krankheitseinsicht und ein

1 Einleitung

7

nicht mit der normalen Persönlichkeit kongruentes Verhalten des Patienten (Belmaker

2004; Cookson 2005; Shastry 2005).

Erschwert wird die Krankheit durch eine hohe Rate an Komorbiditäten wie Alkohol-,

Drogen- oder Medikamentenmissbrauch sowie Angst- und Persönlichkeitsstörungen,

die zu einem schlechteren Verlauf und einem erhöhten Selbstmordrisiko führen (Angst

2007; Angst und Gamma 2008; Cookson 2005; Oswald et al. 2007). Die bipolar-

affektive Störung ist außerdem mit somatischen Krankheiten wie Diabetes mellitus,

Hypertonie und anderen kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert, woraus auch die

höhere Mortalitätsrate im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung resultiert, die nicht

alleine auf Suizid zurückzuführen ist (Angst 2007; Brieger 2007; Shastry 2005).

1.2.2 Epidemiologie

Die weltweite Lebenszeitprävalenz der bipolar-affektiven Störung wird auf 1,0-1,5%

geschätzt, nach einer neueren Studie liegt sie mit 3,3% sogar noch höher (Bauer und

Pfennig 2005; Brieger 2007). Zur Prävalenz der Bipolar-II-Störung gibt es nur wenige

valide Studien, sie wird aber mit 2-6% höher eingeschätzt (Bauer und Pfennig 2005;

Belmaker 2004; Brieger 2007; Oswald et al. 2007). Die verschiedenen Prävalenzzahlen

zur bipolaren Störung schwanken im Wesentlichen nach den jeweils verwendeten

Kriterien zur Einordnung einer Erkrankung in das sog. „bipolare Spektrum“. Die

bipolar-affektive Störung generell tritt, anders als die unipolare Depression, bei

Männern und Frauen gleich häufig auf (Angst und Gamma 2008; Shastry 2005).

Dagegen kommt die Bipolar-II-Störung bei Frauen öfter vor (Brieger 2007). Die

Erkrankung tritt meistens erstmals in der Adoleszenz auf, der erste Gipfel des

Ersterkrankungsalters liegt im Durchschnitt zwischen 16 und 20 Jahren (Oswald et al.

2007; Sanacora et al. 2008; Shastry 2005). Es versterben 5-20% aller bipolar-affektiv

Erkrankten an einem Suizid, was einem ca. 30-fach erhöhten Risiko gegenüber der

Allgemeinbevölkerung entspricht (Brieger 2007; Guze und Robins 1970; Jamison 1986;

McIntyre et al. 2008).

1 Einleitung

8

1.2.3 Ätiologie

Auf die hauptsächlich genetische Komponente der bipolar-affektiven Störung weisen

diverse Zwillings- und Familienstudien hin (Le Hellard et al. 2007; Segurado et al.

2003). In der Hälfte der Fälle kommen affektive Krankheiten in der Familie des

Erkrankten vor (Belmaker 2004). Die Erkrankungswahrscheinlichkeit liegt bei

Verwandten ersten Grades von bipolar-affektiv Erkrankten um ein Zehnfaches höher als

in der Allgemeinbevölkerung (Bauer und Pfennig 2005). Das Erkrankungsrisiko eines

Kindes mit einem betroffenen Elternteil beträgt 20%, wenn beide erkrankt sind, steigt es

auf 50-60% (Tölle und Windgassen 2006). Zwillingsstudien zeigen bei monozygoten

Zwillingen eine Konkordanz von 40-80%, bei dizygoten liegt sie bei 10-20% (Belmaker

2004; Kato 2001; Shastry 2005). In Adoptionsstudien ist das Erkrankungsrisiko für die

biologischen Eltern eines betroffenen Patienten signifikant höher als für die

Adoptiveltern (Craddock und Jones 1999).

Wie schon für Schizophrenie beschrieben, weist die unvollständige Konkordanz

monozygoter Zwillinge auf die Bedeutung nicht-genetischer Faktoren hin. Bei einer

statistischen Heritabilität von 85% bleiben demnach ca. 15% Varianz für individuelle

Umweltfaktoren (Bauer und Pfennig 2005; Craddock und Jones 1999). Dabei spielen

unter anderem life-events und das soziale Umfeld eine Rolle (Alloy et al. 2005).

1.2.4 Neuropathologie

Neuropathologische Abnormalitäten betreffen vor allem den präfrontalen Kortex, hier

finden sich ein reduzierter Blutfluss und ein vermindertes Volumen der grauen

Substanz. Morphometrisch fällt eine reduzierte Größe und Dichte von Neuronen und

Gliazellen sowohl präfrontal als auch temporal auf (Belmaker 2004; Duman 2002;

Harrison 2002; Shastry 2005; Zarate et al. 2003). Auch der Hippokampus ist

größengemindert und in seiner Formation verändert, übereinstimmend mit der

hippokampalen Stress-Atrophie-Hypothese, ebenso besteht eine Atrophie in limbischen

Strukturen (Duman 2002; Harrison 2002; Shastry 2005). Des Weiteren wurden

Veränderungen in subkortikalen Strukturen, synaptischen Endigungen und Dendriten

beobachtet (Harrison 2002). Neben den oben beschriebenen Pathologien wurden in

1 Einleitung

9

bildgebenden und postmortalen Studien Abnormalitäten in Striatum, Kleinhirn,

anteriorem Cingulum, Basalganglien, subgenualen Raphekernen und Amygdala

festgestellt (Bauer und Pfennig 2005; Zarate et al. 2003). Wie bei der Schizophrenie

kommt es bei der bipolar-affektiven Störung nicht zu einer Gliose. Es ist nicht

zweifelsfrei geklärt, ob die neuropathologischen Veränderungen auf eine Störung der

neuronalen Entwicklung zurückgehen, kompensatorische Veränderungen anderer

pathogener Prozesse sind oder Folgekomplikationen von affektiven Episoden darstellen

(Zarate et al. 2003).

Es gibt ähnliche neuropathologische Veränderungen bei Schizophrenie und bipolar-

affektiver Erkrankung. So sind beispielsweise die neuronale Größe im präfrontalen

Kortex und die neuronale Dichte im anterioren Cingulum vermindert sowie synaptische

und dendritische Marker im PFC und Hippokampus reduziert. Zudem besteht bei beiden

Krankheiten ein Gliadefizit. Trotzdem gibt es auch spezifische Veränderungen

(Harrison 2002).

1.3 Pathophysiologie endogener Psychosen

1.3.1 Schizophrenie

1.3.1.1 Theorie der neuronalen Entwicklungsstörung

Wahrscheinlich liegen dem klinischen Bild der Schizophrenie verschiedene

pathogenetische Ursachen zu Grunde. So gibt es zum einen die Theorie der neuronalen

Entwicklungsstörung. Sie basiert darauf, dass eine zeitliche Differenz zwischen

ätiologisch relevanten Umgebungsfaktoren und dem klinischen Auftreten der Krankheit

besteht. Viele Faktoren, die im Verdacht stehen, einen Einfluss auf die

Krankheitsentstehung zu haben, sind Ereignisse des frühen Lebens, wie beispielsweise

Geburt im Winter oder frühen Frühling, Geburt und Aufwachsen in urbanen Gegenden

oder prä- und perinatale Komplikationen. Auch fallen bei Individuen, die später eine

Schizophrenie entwickeln, in Kindheit und früher Jugend motorische Abnormalitäten

und Störungen des Sozialverhaltens auf. Damit übereinstimmend sind strukturelle

neuropathologische Veränderungen schon in den frühesten Phasen der Schizophrenie

1 Einleitung

10

vorhanden und im Verlauf nicht progredient. Sie könnten also Folgeschäden von frühen

Störungen der neuronalen Entwicklung sein (Murray und Lewis 1987; Tsuang 2000).

Außerdem ist das Fehlen einer Gliose ebenfalls hinweisend auf eine neuronale

Entwicklungsstörung. Eventuell liegt eine fehlerhafte Migration der Neurone in der

Entwicklung vor, welche in abnormalen neuronalen Verbindungen und Schaltkreisen

resultiert (Mueser und McGurk 2004; Naqvi 2008).

Insgesamt gibt es diverse Hinweise darauf, dass Störungen der Gehirnfunktion,

zumindest bei einigen Betroffenen, schon früh im Leben vorhanden sind, bevor es

später zu ersten Symptomen der Krankheit kommt (Lewis und Levitt 2002).

1.3.1.2 Neurotransmitterhypothesen

Es wird außerdem die Beteiligung verschiedenster Neurotransmittersysteme an der

Ätiologie der Schizophrenie angenommen, darunter neben Dopamin und Glutamat,

welche im Folgenden ausführlicher beschrieben werden, auch GABA, Serotonin sowie

das cholinerge und das opioide System (Laruelle et al. 2003).

Die älteste und am längsten überdauernde Neurotransmitterhypothese ist die sog.

Dopaminhypothese. Sie gründet auf der Feststellung, dass dopaminfreisetzende

Stimulantien wie Amphetamin Psychosen auslösen können und antipsychotische

Medikamente wie Chlorpromazin dopaminerge D2-Rezeptoren blockieren und ihre

Affinität zum D2-Rezeptor mit ihrer klinischen Potenz korreliert (Burt et al. 1976;

Coyle et al. 2003; Creese et al. 1976; Seeman et al. 1975; Seeman und Lee 1975). Im

Rahmen dieser Theorie wird angenommen, dass negative und kognitive Symptome

durch eine verminderte Dopaminfunktion im präfrontalen Kortex und Positivsymptome

durch eine subkortikale und mesolimbische dopaminerge Überfunktion verursacht

werden (Abi-Dargham und Moore 2003; Andreasen 1999; Belsham 2001; Knable und

Weinberger 1997). Die Grenzen dieser Hypothese bestehen darin, dass negative und

kognitive Symptome nicht durch antipsychotische Medikation gebessert werden und

Amphetamine nur eine Positivsymptomatik auslösen (Belsham 2001; Coyle et al. 2003).

Trotzdem geht man heute davon aus, dass Veränderungen der dopaminergen Aktivität -

wahrscheinlich in Kombination mit anderen Transmittersystemen - eine wichtige

pathogenetische Rolle spielen (Benes 2009).

1 Einleitung

11

Die Glutamathypothese ist ein alternatives Erklärungsmodell, welches auch die

wichtigen Negativsymptome integriert (Stone et al. 2007). 1980 wurde erstmals von

Kim et al. vorgeschlagen, dass eine verminderte Glutamataktivität ursächlich an

Schizophrenie beteiligt sein könnte, als sie eine reduzierte Glutamatkonzentration im

Liquor schizophrener Patienten entdeckten (Kim et al. 1980). Glutamat ist im Gehirn

ubiquitär vorhanden und der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter. Glutamaterge

Neurone projizieren innerhalb des Kortex sowie in subkortikale Regionen wie Locus

coeruleus, Raphekerne und Substantia nigra, wo monoaminerge Signalwege moduliert

werden (Kugaya und Sanacora 2005). Grundlage der Hypothese ist die Feststellung,

dass Phencyclidin und Ketamin, zwei nicht-kompetitive Antagonisten am NMDA-

Rezeptor, die den Ionenkanal blockieren, bei Gesunden zu schizophrenietypischen

Symptomen wie Halluzinationen, Wahnvorstellungen, kognitiven Störungen und vor

allem auch zu Negativsymptomen führen (Goff und Coyle 2001; Javitt 2004; Schosser

und Aschauer 2004; Stone et al. 2007; Toro und Deakin 2005). Bei Schizophrenen, die

sich in einem stabilen Zustand befinden, können diese Antagonisten einen Rückfall

auslösen (Stone et al. 2007). Die Glutamathypothese wird auch als NMDA-Rezeptor-

Hypofunktionshypothese bezeichnet.

Es gibt insgesamt acht verschiedene Glutamatrezeptoren, darunter die ionotropen

NMDA-, AMPA- und Kainatrezeptoren sowie verschiedene metabotrope Rezeptoren

(Belsham 2001). Sie sind auf Synapsen und Gliazellen lokalisiert (Kugaya und

Sanacora 2005). Der NMDA-Rezeptor ist eine heteromere Struktur aus vier bzw. fünf

Untereinheiten, darunter mindestens eine Kopie der obligatorischen NR1-Untereinheit

und verschiedene NR2A-D- und NR3-Untereinheiten, die unterschiedliche Kanäle in

Bezug auf physiologische und pharmakologische Eigenschaften bilden (Kristiansen und

Meador-Woodruff 2005; Lau und Zukin 2007).

Die Anzahl und Zusammensetzung der Rezeptoren ist dynamisch und hängt von der

neuronalen Aktivität ab (Lau und Zukin 2007). Bei Ruhemembranpotential ist der

NMDAR durch Mg2+-Ionen blockiert. Um aktiviert zu werden, muss Glutamat nicht nur

an den NMDAR, sondern auch an den AMPAR binden, so dass es zu einer

Depolarisation durch Na+-Einstrom kommt, welche zur Freigabe des NMDAR-

Ionenkanals führt (Javitt 2004; Lau und Zukin 2007). Der Rezeptor wird also dual

reguliert, einerseits über das Potential, andererseits über Ligandenbindung (Kugaya und

1 Einleitung

12

Sanacora 2005). Am NMDAR gibt es zudem eine modulierende Glycin-Bindestelle,

welche mit den endogenen Liganden Glycin oder D-Serin besetzt sein muss, damit

Glutamat den Kanal öffnen kann (Coyle et al. 2003; Javitt 2004). Der Kanal ist

hochpermeabel für Ca2+- und zu einem geringeren Grad auch für Na+- und K+-Ionen,

wobei der Calciumeinstrom zu einer Aktivierung von Proteinkinasen und Phosphatasen

führt (Belsham 2001; Coyle et al. 2003; Lau und Zukin 2007). Der Vorgang wird

primär durch die Aufnahme des Transmitters aus der Synapse durch EAATs (excitatory

amino acid transporters) auf Neuronen und Gliazellen beendet (Javitt 2004; Sanacora et

al. 2008).

Abb. 1.1: Schematische Darstellung des NMDA-Rezeptors (nach Albensi 2007)

Synaptische NMDAR sind an den postsynaptischen Verdichtungen lokalisiert, wo sie

Teil eines makromolekularen Komplexes von Glutamatrezeptoren, Gerüst-, Signal- und

Adaptorproteinen sind (Lau und Zukin 2007; Sanacora et al. 2008). Die

Adaptorproteine verankern die Rezeptoren an der postsynaptischen Membran, indem sie

direkt an PDZ-Erkennungsmotive der NR2-Untereinheit binden (Lau und Zukin 2007).

Zu diesen sogenannten MAGUKs (membrane-associated guanylate kinases) gehören

PSD95, PSD93, SAP102 und NF-L (Kristiansen und Meador-Woodruff 2005; Toro und

Deakin 2005). Neben ihrer Funktion als Ankerproteine modulieren sie die Aktivität des

Rezeptors, koppeln ihn an Kinasen, Phosphatasen und andere nachgeschaltete

intrazelluläre Signalwege und beeinflussen das Targeting zur Membran (Clinton und

Meador-Woodruff 2004; Lau und Zukin 2007). PSD-Proteine stellen somit eine Brücke

1 Einleitung

13

zwischen extrazellulären synaptischen Signalen und intrazellulärer Signalübermittlung

dar (Toro und Deakin 2005).

Der NMDAR hat eine spezielle Bedeutung bei der Langzeitpotenzierung (LTP) und

Langzeitdepression (LTD), welche eine wichtige Rolle bei der Bildung des

Gedächtnisses und beim Lernen spielen (Kugaya und Sanacora 2005; Lau und Zukin

2007). Entscheidend für die Langzeitpotenzierung ist eine hohe präsynaptische

Glutamataktivität, die zu einer Rekrutierung von NMDA-Rezeptoren und konsekutivem

Calciumeinstrom führt (Coyle et al. 2003; Lau und Zukin 2007). Des Weiteren führt die

Aktivierung des NMDAR zu erhöhter Expression von BDNF (brain derived

neurotrophic factor) und, vermittelt durch CREB (cyclic AMP response element binding

protein), zu verstärkter Genexpression (Kugaya und Sanacora 2005). NMDAR-

Aktivierung hat dementsprechend trophische Effekte, während Inaktivierung zu

Apoptose führt (Coyle et al. 2003). Die chronische Einnahme von NMDAR-

Antagonisten induziert beispielsweise die Degeneration von Pyramidenneuronen (Javitt

2004). Bei Überaktivität des NMDAR kommt es zu einer Exzitotoxizität, die Folge

einer zu starken Aktivierung calciumabhängiger Enzyme und der Generierung freier

Radikale ist. Daher ist eine exakte Kontrolle des Glutamatsystems besonders wichtig

(Sanacora et al. 2008; Zarate et al. 2003).

Prädiktive Validität erhielt die NMDAR-Hypofunktionshypothese durch die

Entdeckung, dass die Co-Agonisten Glycin und D-Cycloserin in Kombination mit

konventionellen Antipsychotika zu einer Verbesserung der Negativsymptomatik führen

(Belsham 2001; Coyle et al. 2003; Javitt 2004; Laruelle et al. 2003). In einigen Studien

konnte dabei eine Korrelation der Höhe des basalen Glycinspiegels mit einer

Verbesserung der Negativsymptomatik festgestellt werden (Javitt 2004). Doch auch die

vielfältigen Funktionen des NMDAR, insbesondere sein Einfluss auf Lern- und

Gedächtnisprozesse, die bei Schizophrenie betroffen sind, und seine Rolle bei

synaptischer und neuronaler Plastizität, sprechen für seine Beteiligung an der

Pathophysiologie (Javitt 2004; Sanacora et al. 2008). Die Hypofunktion des NMDAR

ist vermutlich mit einer exzessiven Glutamatausschüttung und konsekutiver

Überstimulation von postsynaptischen Neuronen assoziiert (Belsham 2001). In

Übereinstimmung mit dieser Theorie stimulieren NMDAR-Antagonisten akut die

präfrontale Glutamatausschüttung (Javitt 2004). Eine enthemmte Glutamataktivität

1 Einleitung

14

würde auch ein aberrantes LTP auslösen, was in veränderten Gedächtnisleistungen und

möglicherweise auch Wahnvorstellungen resultieren könnte (Belsham 2001).

Davon ausgehend, dass Veränderungen in der Funktion des gesamten NMDAR-

Komplexes eine Rolle in der Pathophysiologie spielen könnten, wurden funktionelle

Studien durchgeführt, die die Expression einzelner NMDAR-Untereinheiten und

assoziierter Moleküle an der Synapse untersuchten (Toro und Deakin 2005). Dabei

fanden sich eine verminderte Expression von PSD95 im hippokampalen Gyrus dentatus

und eine reduzierte Expression von SAP102 im Striatum (Kristiansen und Meador-

Woodruff 2005; Toro und Deakin 2005). Im Thalamus zeigte sich eine signifikante

Erhöhung von NR2B- und eine verminderte Expression von NF-L-, PSD95- und

SAP102- Transkripten (Clinton und Meador-Woodruff 2004). Allerdings gibt es auch

Studien, die diesen Ergebnissen widersprechen und von reduzierter Expression von

NR1- und 2C-Untereinheiten sowie erhöhter Expression von NF-L-, PSD95- und

SAP102-Transkripten im Thalamus berichten (Clinton und Meador-Woodruff 2004).

Obwohl sich aus diesen Befunden keine eindeutige Schlussfolgerung ziehen lässt, kann

man davon ausgehen, dass eine veränderte Expression der mit dem NMDAR

assoziierten Proteine, insbesondere PSD95, zu einer abnormen Lieferung und

Verankerung des Rezeptors in der Synapse sowie veränderter intrazellulärer

Signaltransduktion führen könnte. Dies würde im weiteren Sinne mit einer gestörten

NMDAR-Funktion übereinstimmen (Clinton und Meador-Woodruff 2004; Kristiansen

und Meador-Woodruff 2005; Toro und Deakin 2005).

Die NMDAR-Hypofunktionshypothese wäre auch kongruent mit der Theorie der

neuronalen Entwicklungsstörung, da eine eingeschränkte Funktion des NMDAR aus

gestörten Abläufen in der neuronalen Entwicklung resultieren könnte (Belsham 2001).

Eventuell sind Abnormalitäten der NMDAR-Funktion schon früh vorhanden, führen

aber erst nach Ausreifung der neuronalen Verbindungen zu psychotischen Symptomen

(Stone et al. 2007).

Wahrscheinlich ist, dass die Veränderungen nicht nur ein Transmittersystem betreffen,

sondern dass es zu Interaktionen kommt, besonders mit Dopamin und GABA (Belsham

2001; Howes et al. 2009). Eine veränderte Funktion des NMDAR könnte z. B. eine

verstärkte Dopaminausschüttung zur Folge haben (Coyle et al. 2003). Vorstellbar ist,

dass eine NMDAR-Hypofunktion negative und kognitive Symptome auslöst, während

1 Einleitung

15

eine verstärkte dopaminerge Neurotransmission die Positivsymptomatik hervorruft

(Coyle et al. 2003; Stone et al. 2007).

1.3.2 Bipolar-affektive Erkrankung

1.3.2.1 Monoaminhypothese

Die Monoaminhypothese basiert auf Erkenntnissen über die neurobiologische

Wirkungsweise von Antidepressiva, welche die Verfügbarkeit von monoaminergen

Neurotransmittern im synaptischen Spalt erhöhen (Baumann et al. 2003). Auch die

Beobachtung, dass das Antihypertensivum Reserpin, welches die Konzentration von

Monoaminen in den synaptischen Vesikeln vermindert, gelegentlich eine depressive

Symptomatik auslöst, trug zu dieser Theorie bei (Ackenheil 2001). Heute gibt es diverse

Hinweise, die für eine ätiologische Beteiligung von Dopamin, Noradrenalin und

Serotonin nicht nur an der Depression, sondern auch an der bipolar-affektiven

Erkrankung sprechen. Die Entdeckung, dass Patienten mit bipolar-affektiven

Erkrankungen durch direkte oder indirekte Dopaminagonisten eine Manie entwickeln

können, deutet auf eine ursächliche Beteiligung des dopaminergen Systems hin (Minton

et al. 2009). Möglicherweise liegt in depressiven Episoden ein reduzierter und in

manischen Episoden ein normaler oder sogar erhöhter dopaminerger Tonus vor (Brugue

und Vieta 2007). Damit übereinstimmend weist der Dopaminmetabolit

Homovanillinsäure im Liquor von Erkrankten phasenspezifische Veränderungen auf, er

ist während depressiver Episoden vermindert und während manischer Phasen erhöht

(Brugue und Vieta 2007). Weiterhin gibt es Hinweise auf funktionelle Defizite im

noradrenergen und serotonergen System. Beispielsweise finden sich ein erhöhter

Noradrenalinumsatz in verschiedenen kortikalen Regionen und im Thalamus sowie eine

Verminderung des Serotoninmetabolits 5-Hydroxyindolessigsäure und des Serotonin-

Transporters im Kortex (Vawter et al. 2000).

1 Einleitung

16

1.3.2.2 Dysfunktion der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse

Auch eine gestörte Funktion der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HHN)-

Achse, welche eine maßgebliche Rolle bei der Stressantwort spielt, steht im Verdacht,

an der Entstehung affektiver Störungen beteiligt zu sein. Man geht davon aus, dass eine

Überaktivität der HHN-Achse zu einer Hyperkortisolämie führt, was toxische Effekte

auf hippokampale Neuronen hat (McEwen 1999; Sapolsky 2000; Vawter et al. 2000).

Während nicht eindeutig geklärt ist, ob bei bipolar-affektiv Erkrankten die basalen

Kortisolwerte verändert sind, konnte wiederholt festgestellt werden, dass sowohl in

depressiven als auch in manischen Phasen eine gesteigerte Antwort auf den dex/CRH-

Test besteht. Uneinheitliche Ergebnisse gibt es hinsichtlich der Frage, ob eine

abnormale Antwort auf den dex/CRH-Test auch bei Patienten in Remission bestehen

bleibt (Rybakowski und Twardowska 1999; Schmider et al. 1995; Watson et al. 2004).

1.3.2.3 Veränderungen der synaptischen Plastizität

Eine weitere Theorie geht davon aus, dass Beeinträchtigungen der neuronalen Plastizität

der Pathophysiologie affektiver Störungen zugrunde liegen könnten und dass

Antidepressiva und Stimmungsstabilisatoren hauptsächlich auf Signalwege wirken, die

Neuroplastizität und Zellüberleben regulieren (Shastry 2005; Zarate et al. 2003).

Wichtig für die Vermittlung langfristiger Neuroplastizität ist die MAP-Kinase-

Signalkaskade, über die viele endogene Wachstumsfaktoren wie BDNF ihre Effekte

vermitteln (Zarate et al. 2003). BDNF ist wichtig für die Differenzierung von Neuronen

während der Entwicklung, hat auch im adulten Gehirn neuroprotektive Wirkungen und

trägt zur synaptischen Plastizität bei (Duman 2002). Ein nachgeschalteter Effekt der

MAP-Kinase ist die Phosphorylierung von CREB, was zu vermehrter Genexpression

führt (Zarate et al. 2003). Diese beiden Faktoren tragen eventuell zur Störung der

synaptischen Plastizität bei affektiven Störungen bei. Man geht davon aus, dass ihre

Expression und Funktion bei Erkrankten vermindert sind und Medikamente wie

Noradrenalin- und Serotonin-Wiederaufnahmehemmer dem entgegenwirken (Duman

2002).

1 Einleitung

17

1.3.2.4 Hinweise auf Beteiligung des Glutamatsystems

Eine Beteiligung von Glutamat an der Ätiologie affektiver Störungen wurde schon in

den 60er Jahren postuliert, als man beobachtete, dass Tuberkulosepatienten, die mit D-

Cycloserin, einem Antibiotikum mit partialagonistischer Wirkung am NMDAR,

behandelt wurden, eine klinische Verbesserung ihrer depressiven Symptomatik zeigten

(Crane 1961). Bei Personen mit affektiven Störungen wurden außerdem Abnormalitäten

des Glutamatspiegels in Plasma, Serum, Liquor und Gehirngewebe gefunden, wobei

diese Ergebnisse teilweise nicht repliziert werden konnten (Sanacora et al. 2008; Zarate

et al. 2003). Auch pharmakologische Ergebnisse stützen die Hypothese einer

Beteiligung des Glutamatsystems. Klinischen Studien zufolge haben NMDAR-

Antagonisten antidepressive Effekte, die möglicherweise auf eine Erhöhung des

extrazellulären Glutamatlevels zurückgehen. Ketamin z. B. hat als Einzeldosis eine ca.

72 Stunden andauernde antidepressive Wirkung, die wahrscheinlich durch eine erhöhte

präsynaptische Ausschüttung von Glutamat, eventuell vermittelt über GABAerge

Interneurone, zustande kommt (Javitt 2004; Kugaya und Sanacora 2005; Sanacora et al.

2008). Dieser erhöhte Glutamatausstrom wirkt vermutlich auf glutamaterge AMPA-

Rezeptoren (Kugaya und Sanacora 2005; Sanacora et al. 2008). Ähnlich wie bei

Schizophrenie könnten auch bei Depression Zusammenhänge mit Störungen des

hippokampalen LTP und der Neurogenese bestehen, die durch eine NMDAR-Blockade

oder einen nachfolgenden Reboundeffekt verändert werden könnten (Javitt 2004).

Auch Antidepressiva haben Auswirkungen auf das Glutamatsystem. Ihre chronische

Applikation wirkt modifizierend und regulierend auf die Aktivität glutamaterger

Neurone sowie die NMDAR-Expression und -Funktion (Sanacora et al. 2008; Zarate et

al. 2003). Einige stimmungsstabilisierende Medikamente, z. B. das Antikonvulsivum

Lamotrigin, wirken wahrscheinlich inhibierend auf die Glutamataktivität (Belsham

2001; Sanacora et al. 2008). Auch Valproat und Lithium reduzieren den synaptischen

Glutamatspiegel (Sanacora et al. 2008; Zarate et al. 2003). Lithium schützt außerdem in

Nagerneuronzellen vor glutamatinduzierter Exzitotoxizität, wahrscheinlich indem es

glutamaterge Überstimulation und den damit verbundenen NMDAR-vermittelten

Calciumeinstrom verhindert (Sanacora et al. 2008; Zarate et al. 2003).

1 Einleitung

18

H-MRS Studien geben ebenfalls Hinweise auf Abnormalitäten des glutamatergen

Systems, so ließen sich Veränderungen des Glutamat/Glutamin (Glx)-Levels in

verschiedenen Hirnarealen nachweisen (Michael et al. 2003; Zarate et al. 2003).

Hinweise auf eine Beteiligung des NMDAR stammen auch aus Studien, die

Untereinheiten des NMDAR und assoziierte Proteine an der Synapse funktionell

untersucht haben (Toro und Deakin 2005). Teilweise ergaben sich dabei ähnliche

Ergebnisse für die bipolar-affektive Störung wie für Schizophrenie. So war auch hier

die Expression von PSD95 in speziellen Regionen des Hippokampus vermindert,

während die Expression von NR1 unverändert war (Toro und Deakin 2005). Ebenso

war wie bei Schizophrenie die SAP102-Expression im Striatum vermindert, zusätzlich

die von PSD95 (Kristiansen und Meador-Woodruff 2005). Die Ergebnisse einer Studie

im Thalamus zeigten, wiederum übereinstimmend mit Schizophrenie, eine

Verminderung von NF-L-, PSD95- und SAP102-Transkripten (Clinton und Meador-

Woodruff 2004). Dies könnten Hinweise auf eine Beteiligung des NMDAR-Komplexes

und seinen assoziierten Proteinen an der Pathophysiologie von affektiven Störungen

sein. Ob die teilweise überschneidenden Befunde auf einen gemeinsamen

Pathomechanismus hindeuten, ist allerdings unklar (Clinton und Meador-Woodruff

2004; Kristiansen und Meador-Woodruff 2005; Toro und Deakin 2005).

Wie oben beschrieben besteht der Verdacht, dass Störungen der synaptischen Plastizität

eine Rolle bei affektiven Störungen spielen. Da das Glutamatsystem die synaptische

Plastizität, Zellwachstum und –atrophie beeinflusst, könnte hier ein Zusammenhang

zwischen beiden Theorien bestehen (Sanacora et al. 2008). Auch die Reduktion von

Gliazellen könnte über eine verminderte Aufnahme aus der Synapse zu einem erhöhten

extrazellulären Glutamatlevel führen und sich so auf das glutamaterge System

auswirken (Kugaya und Sanacora 2005).

1.4 Genetik

1.4.1 Vererbung

Bei vielen neuropsychiatrischen Erkrankungen, die sich erst im Erwachsenenalter

manifestieren, tragen sowohl genetische als auch nicht-genetische Faktoren zur

1 Einleitung

19

Entstehung bei. Aus Familien-, Zwillings- und Adoptionsstudien weiß man, dass die

genetischen Faktoren bei endogenen Psychosen die wichtigere Rolle spielen (Kennedy

et al. 2003). Der genaue molekulargenetische Mechanismus der Vererbung ist heute

noch immer nicht geklärt, allerdings stimmt man darin überein, dass kein mendelsches

Vererbungsmuster vorliegt (Belmaker 2004; Schosser und Aschauer 2004). Für eine

komplexe Genetik spricht die große klinische Heterogenität und das Fehlen

pathognomonischer Phänotypen (Brzustowicz et al. 2004). Sowohl für Schizophrenie

als auch für die bipolar-affektive Störung geht man heute von einem multifaktoriellen

Modell aus, also von einer Interaktion mehrerer Gene und nicht-genetischer

Umweltfaktoren (Berrettini 2000; Craddock und Jones 1999; Pulver 2000; Schosser und

Aschauer 2004; Shastry 2005). Bei einer solchen Vererbung kommen die

Suszeptibilitätsallele in der Population häufig vor, also auch bei gesunden Individuen,

wobei der Beitrag eines einzelnen Gens zur Anfälligkeit relativ klein ist (Brzustowicz

2008; Gershon 2000; Kennedy et al. 2003; Schosser und Aschauer 2004). Die

Suszeptibilitätsallele erhöhen also das Risiko zu erkranken, sind für eine Manifestation

der Störung jedoch weder notwendig noch können sie die Krankheit alleine auslösen

(Berrettini 2000; Schosser und Aschauer 2004). Die Krankheit entwickelt sich nur,

wenn genetische und umweltbedingte Risikofaktoren in Kombination einen gewissen

Schwellenwert überschreiten (Brzustowicz 2008). Alternativ hierzu kann auch eine

Vielzahl seltener Risikoallele zur Erkrankung beitragen; vermutlich sind beide

Vererbungsmuster von Bedeutung. Auch epigenetische Faktoren spielen wahrscheinlich

eine wichtige Rolle (Petronis 2004; Shastry 2005).

1.4.2 Kopplungsanalysen

Genkopplung bedeutet, dass Gene, die auf einem Chromosom liegen, häufiger

gemeinsam vererbt werden, als es zu erwarten wäre, wenn sie unabhängig voneinander

vererbt werden würden (Buselmaier und Tariverdian 2007). Man beschreibt damit also

eine Beziehung zwischen verschiedenen Loci (Strachan und Read 2005). Je weiter die

Gene voneinander entfernt liegen, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie durch

Crossing over in der Meiose getrennt werden. Als Maß für die Entfernung zweier Gene

dient die Rekombinationshäufigkeit, die angibt, wie häufig zwei Gene gemeinsam

1 Einleitung

20

vererbt werden. Die statistische Wahrscheinlichkeit für Genkopplung wird mit dem

LOD-Score ausgedrückt (Lander und Kruglyak 1995).

In Kopplungsanalysen werden genetische Marker bekannter genomischer Position bei

betroffenen und nicht betroffenen Familienmitgliedern untersucht. Ist nun ein Marker

mit dem krankheitsauslösenden Polymorphismus gekoppelt, kann dieser häufiger bei

den erkrankten Familienmitgliedern nachgewiesen werden. Auf diese Weise kann die

Lage eines krankheitsverursachenden Gens oder Polymorphismus bestimmt werden.

Typischerweise werden dabei Regionen von 10-20 Mb identifiziert, in denen

durchschnittlich 75 Gene lokalisiert sind (Berrettini 2000; Brzustowicz 2008; Tandon et

al. 2008a).

1.4.3 Assoziationsstudien

Assoziationsanalysen testen die Hypothese, dass eine bestimmte Sequenzvariante das

Risiko erhöht, eine Krankheit zu entwickeln. Ist diese Hypothese wahr, sollte die

Sequenzvariante in einer Gruppe nicht verwandter betroffener Erkrankter häufiger

vorkommen als in einer gesunden Kontrollgruppe (Berrettini 2000; Brzustowicz 2008).

Es handelt sich hierbei also nicht um ein spezifisches genetisches Phänomen, sondern

um eine statistische Feststellung über die Häufigkeit des gemeinsamen Auftretens von

Allel und Phänotyp. Ein wichtiger Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, auch

Gene mit kleinem Effekt zu entdecken (Craddock und Jones 1999; Pulver 2000). Neben

dem direkten Zusammenhang kann eine Assoziation jedoch auch auf

Populationsstratifizierung, Typ-I-Fehler oder Kopplungsungleichgewicht zurückgehen

(Buselmaier und Tariverdian 2007). Assoziationsstudien basieren auf der

Voraussetzung, dass die für die Anfälligkeit verantwortliche DNA-Veränderung

erstmals vor langer Zeit in einem gemeinsamen Vorfahren aufgetreten ist und sich im

Laufe der Zeit unter den Betroffenen ausbreiten konnte (Brzustowicz 2008).

Voraussetzung für ein valides Ergebnis ist daher, dass Fälle und Kontrollen aus

derselben Subpopulation stammen (Buselmaier und Tariverdian 2007).

Das HapMap-Projekt hat eine neue Generation genetischer Assoziationsstudien möglich

gemacht. In der Genomsequenz gibt es vermutlich ca. 10 Millionen single nucleotide

polymorphisms, kurz SNPs. Dies sind Orte, an denen die interindividuelle

1 Einleitung

21

Basensequenz differiert. Die meisten SNPs treten in biallelischer Form auf. Es gibt ca.

einen SNP pro 100 – 300 Basen, die Frequenz für jedes Allel beträgt per Definition

mindestens 1%. In den letzten Jahren wurde herausgefunden, dass nahe beieinander

gelegene SNPs häufiger, als es der Zufall vorgeben würde, miteinander vererbt werden.

Dies nennt man Kopplungsungleichgewicht. Eine Region stark miteinander assoziierter

SNPs nennt man Haploblock (Manolio et al. 2008). Diese Blöcke variieren in ihrer

Größe von wenigen bis zu mehr als hundert Kilobasen (Slatkin 2008). Zwischen den

Haploblöcken liegen Rekombinationshotspots, an denen fast die gesamte meiotische

Rekombination geschieht. Bei hohem Kopplungsungleichgewicht ist die Kenntnis

einiger bestimmter SNP-Allele (tagSNPs) ausreichend, um auf die Varianten der

restlichen SNPs eines Blocks schließen zu können (Manolio et al. 2008). Auf diese

Weise können genomweite Assoziationsstudien, in denen 500.000 bis 1 Million SNPs

erfasst werden, mit relativ geringem Aufwand durchgeführt werden (Slatkin 2008).

1.4.4 Vulnerabilitätsgene endogener Psychosen

1.4.4.1 Suszeptibilitätsregionen - Ergebnisse aus Kopplungsanalysen

In diversen Kopplungsanalysen wurden verschiedene Suszeptibilitätsloci für endogene

Psychosen identifiziert, wobei eine Replikation der Ergebnisse selten gelang (Berrettini

2001). In einer Metaanalyse genomweiter Kopplungsstudien wurden deutliche Hinweise

auf die Regionen 13q und 22q als Suszeptibilitätsorte für Schizophrenie und bipolar-

affektive Störung gefunden, zudem wurde für Schizophrenie 8p als

Suszeptibilitätsregion identifiziert. Weniger starke Hinweise gab es für 1q, 2q, 6q und

15q als Suszeptibilitätsloci für Schizophrenie, eventuell hervorgerufen durch Ergebnisse

einzelner Analysen (Badner und Gershon 2002). Zwei andere Metaanalysen

genomweiter Kopplungsstudien konnten oben genannte Regionen nicht bestätigen. So

zeigte sich in der Metaanalyse für die bipolar-affektive Störung für keine Region eine

genomweite Signifikanz, die signifikantesten p-Werte lagen in den Regionen 9p, 10q

und 14q und auf Chromosom 18 (Segurado et al. 2003). Die Metaanalyse für

Schizophrenie ergab genomweite Signifikanz für Kopplung auf Chromosom 2q.

Weitere Regionen konnten als Kandidatenregionen in Betracht gezogen werden,

insbesondere 5q, 3p, 11q, 6p, 1q, 22q, 8p, 6p, 20q und 14p (Lewis et al. 2003).

1 Einleitung

22

1.4.4.2 Suszeptibilitätsgene - Schizophrenie

In den letzten Jahren wurden durch Assoziationsstudien in chromosomalen Regionen,

die in Kopplungsanalysen identifiziert wurden, die ersten Suszeptibilitätsgene für

Schizophrenie entdeckt.

Ein vielversprechendes Vulnerabilitätsgen ist Neuregulin 1 auf Chromosom 8p21-22,

das wiederholt signifikante Assoziation mit Schizophrenie zeigte (Harrison und Owen

2003; Kennedy et al. 2003). Obwohl ein assoziierter Haplotyp, der sogenannte HapICE,

in verschiedenen Populationen nachgewiesen werden konnte, ist bisher noch keine

ursächliche funktionelle Variante identifiziert (Stefansson et al. 2002; Tosato et al.

2005). Neuregulin 1 fördert die Proliferation von Oligodendrozyten sowie neuronale

Migration und Zelldifferenzierung und ist auf diese Weise an neuronaler Entwicklung

beteiligt (Harrison und Owen 2003; Schosser und Aschauer 2004). Außerdem wird es

im ZNS in Synapsen exprimiert und ist an Expression und Aktivierung von

Neurotransmitterrezeptoren, z. B. dem NMDAR, beteiligt (Harrison und Owen 2003;

Schosser und Aschauer 2004). Damit übereinstimmend exprimieren Mäuse, die eine

Mutation im Neuregulingen haben, weniger funktionale NMDA-Rezeptoren (Schosser

und Aschauer 2004; Stefansson et al. 2002). Aufgrund seiner Funktionen in

Synaptogenese, Gliadifferenzierung, Myelinisierung und Neurotransmission ist es ein

interessantes Kandidatengen (Craddock et al. 2005).

Auf 6p22.3 wurde DTNBP1 (Dysbindin) als Suszeptibilitätsgen für Schizophrenie

identifiziert. Dysbindin ist Bestandteil synaptischer Systeme und vor allem

postsynaptisch im Zytoskelett vorhanden. Man nimmt an, dass es zu einer verminderten

Glutamataktivität führt (Kennedy et al. 2003; Schosser und Aschauer 2004).

Weitere Suszeptibilitätsgene sind G72, auch DAOA (D-Aminosäure-Oxidase-

Aktivator) genannt, auf 13q34 und DAAO (D-Aminosäure-Oxidase) auf 12q24

(Schosser und Aschauer 2004), in denen jeweils SNPs bzw. Haplotypen mit

Schizophrenie assoziiert sind (Craddock et al. 2005; Harrison und Owen 2003). Die

Interaktion von G72 und DAAO führt zu einer Aktivierung von DAAO (Craddock et al.

2005), welches dann D-Serin, einen allosterischen Aktivator des NMDAR, oxidiert und

konsekutiv zu herabgesetzter Aktivität des NMDAR führt. Auf diese Weise kann die

1 Einleitung

23

NMDAR-vermittelte glutamaterge Wirkung reguliert werden (Schosser und Aschauer

2004).

Auf 22q11 führt eine Deletion zum velokardiofazialen Syndrom, bei dem eine hohe

Inzidenz an Psychosen besteht, die manchmal nicht von Schizophrenie unterschieden

werden können (Kennedy et al. 2003). Hier liegt das Gen PRODH

(Prolindehydrogenase), in dem mehrere SNPs mit Schizophrenie assoziiert sind. Das

Enzym ist an der Bildung von Glutamat aus Prolin beteiligt (Craddock et al. 2005;

Schosser und Aschauer 2004).

Ein anderes Kandidatengen auf 22q11 ist COMT (Catechol-O-Methyltransferase),

welches ebenfalls mit Schizophrenie assoziiert ist. COMT ist für den Abbau von

Katecholaminen wie Dopamin verantwortlich und hat besonders im präfrontalen Kortex

eine wichtige Funktion, da die Katecholaminwirkung an anderen Orten über Aufnahme

aus dem synaptischen Spalt in Nervenendigungen beendet wird (Harrison und Owen

2003; Kennedy et al. 2003; Schosser und Aschauer 2004). Der Val158Met-SNP führt zu

einer veränderten Aminosäuresequenz, was Auswirkungen auf die Enzymaktivität hat

und Frontallappenfunktion sowie präsynaptische Dopaminaktivität beeinflusst

(Craddock et al. 2005; Harrison und Owen 2003).

Auch das RGS4-Gen auf 1q21-22 ist mit Schizophrenie assoziiert. Seine Funktion

besteht darin, dass es als negativer Regulator die Effekte von Agonisten an G-Protein-

gekoppelten Rezeptoren abschwächt, indem es die GTPase-Aktivität und damit die

Umwandlung in die inaktive GDP-bindende G-Proteinform beschleunigt (Craddock et

al. 2005). Somit wird die G-Protein-gekoppelte synaptische Signaltransduktion verkürzt

(Schosser und Aschauer 2004). Im Gehirn von Schizophrenen hat man post mortem eine

verminderte Expression von RGS4 festgestellt (Craddock et al. 2005; Schosser und

Aschauer 2004).

In einer Familie mit häufigen Fällen von Schizophrenie und affektiven Störungen wurde

eine balancierte Translokation auf Chromosom 1 entdeckt, durch die das Kandidatengen

DISC1 (disrupted in schizophrenia) unterbrochen wird. Es gibt Hinweise, dass DISC1

an Neuritenarchitektur und neuronaler Migration beteiligt ist und die Anzahl an

NMDAR an der postsynaptischen Membran beeinflusst. Zudem ist es an der

Ausbildung des LTP an der glutamatergen Synapse beteiligt (Craddock et al. 2005;

Stahl 2007).

1 Einleitung

24

Die Gemeinsamkeit dieser Vulnerabilitätsgene ist ein Zusammenhang mit der

Glutamathypothese, da sie in Verbindung zur glutamatergen Synapse stehen, an der sie

Formation, Plastizität und Signalvermittlung beeinflussen (Harrison und Owen 2003;

Schosser und Aschauer 2004).

1.4.4.3 Suszeptibilitätsgene - Bipolar-affektive Störung

Für bipolar-affektive Störungen wurden bisher deutlich weniger Suszeptibilitätsgene

identifiziert. Im Folgenden werden zwei Kandidatengene, für die replizierte Assoziation

besteht, beschrieben.

In mehreren Fall-Kontroll-Studien zeigten sich Assoziationen von SNPs und

Haplotypen im DAOA-Gen auf 13q34, jedoch wurden nicht immer dieselben SNPs

reproduziert. Eine pathologische Variante wurde dementsprechend ebenfalls noch nicht

identifiziert (Craddock und Forty 2006; Kennedy et al. 2003). Ein weiteres

Kandidatengen ist BDNF aus der Neurotrophinfamilie auf 11p13. Die Funktionen von

BDNF wurden oben bereits beschrieben. Durch seine Beteiligung an neuronaler

Plastizität ist es mit der Hypothese der synaptischen Plastizität affektiver Störungen

vereinbar. In zwei Studien, die dieses Gen untersuchten, zeigte sich ein

krankheitsassoziierter SNP, welcher mit einer veränderten Aminosäuresequenz

einhergeht. Auch in einer kürzlich veröffentlichen Metaanalyse konnte eine Assoziation

des Risikoallels mit der bipolaren Erkrankung, v. a. in asiatischen Populationen, belegt

werden. Allerdings gibt es auch hier Studien, die diese Assoziation nicht bestätigten

(Craddock et al. 2005; Craddock und Forty 2006; Kennedy et al. 2003).

1.4.4.4 Hinweise auf Überlappung der Ätiologie

Die Frage, ob es eine Überlappung in der Ätiologie von Schizophrenie und bipolar-

affektiver Erkrankung gibt, wird kontrovers diskutiert. Hinweise dafür liefern ähnliches

Ersterkrankungsalter, Lebenszeitrisiko, Suizidrisiko, Geschlechterverhältnis und die

geschätzte Heritabilität (Berrettini 2001). Klinisch werden Individuen, die Merkmale

beider Krankheiten zeigen, häufig unter der Diagnose „schizoaffektive Störung“

klassifiziert. Auch Familienstudien geben Anhaltspunkte für die Theorie einer

1 Einleitung

25

überlappenden Ätiologie (Craddock und Forty 2006). So haben Verwandte ersten

Grades von Schizophrenen und bipolar-affektiv Erkrankten ein erhöhtes Risiko, an

schizoaffektiven Störungen oder unipolar affektiven Störungen zu erkranken (Berrettini

2000; Berrettini 2003; Gershon 2000). Schizophrenie und bipolar-affektive Erkrankung

treten wiederum gehäuft in Familien von Patienten mit schizoaffektiver Störung auf

(Craddock und Forty 2006). Allerdings erhöht Schizophrenie nicht das Risiko für

erstgradige Verwandte, an bipolar affektiver Störung zu erkranken und umgekehrt

(Berrettini 2003).

In Kopplungsanalysen wurden 13q, 22q, 8p, 18q, 10p sowie 6p als überlappende

Suszeptibilitätsregionen beschrieben, wobei in diesen Regionen einige

Suszeptibilitätsgene für Schizophrenie liegen (Berrettini 2003; Maier 2008). In einem

Genomscan, in dem Familien von schizoaffektiv Erkrankten untersucht wurden,

ergaben sich genomweite Signifikanz für 1q24 und weniger eindeutige Ergebnisse für

22q11 (Craddock und Forty 2006).

Der beste Kandidat für ein gemeinsames Vulnerabilitätsgen ist G72 (DAOA), welches

sowohl mit bipolar-affektiver Erkrankung als auch mit Schizophrenie assoziiert ist.

Auch im Neuregulingen sind einige Marker mit bipolar-affektiver Störung assoziiert

(Maier 2008) und es wurde Assoziation eines COMT-Allels mit dem Endophänotyp

„ rapid cycling“ festgestellt (Kato 2001). Ferner gibt es auch für DISC1 aus Kopplungs-

und Assoziationsanalysen Hinweise für eine Verbindung zu Schizophrenie, bipolar-

affektiver und schizoaffektiver Störung (Craddock und Forty 2006).

Diese Daten lassen eine gemeinsame genetische Grundlage möglich erscheinen. Auf der

anderen Seite gibt es auch viele Allele mit krankheitsspezifischer Assoziation (Maier

2008).

1.5 Das Kandidatengen NOS1AP

1.5.1 Definition und Funktion

NOS1AP (NOS1 adaptor protein), früher als CAPON (carboxy-terminal PDZ ligand of

neuronal NOS) bezeichnet, ist auf Chromosom 1q22 lokalisiert (Eastwood 2005). Das

Gen hat eine Länge von 30 Kilobasen, von denen nur 1,5 Kilobasen kodieren (Xu et al.

1 Einleitung

26

2005). Das Protein wurde erstmals im Gehirn von Ratten entdeckt, wo die höchste

Expression im Kortex und in der Medulla oblongata vorlag und Kolokalisierungen mit

der neuronalen NO-Synthase festgestellt wurden (Jaffrey et al. 1998). NOS1AP ist ein

55 kDa großes zytoplasmatisches Protein, dessen C-Terminus an die PDZ-Domäne der

NOS-I binden kann, dabei konkurriert es mit PSD95 und PSD93 um diese Bindestelle.

Außerdem besitzt es eine N-terminale Phosphotyrosin-bindene Region (Fang et al.

2000; Jaffrey et al. 2002).

Es gibt beim Menschen mindestens zwei Isoformen von NOS1AP. Die lange Isoform ist

ein Protein aus 501 Aminosäuren, welches aus allen zehn Exons gebildet wird. Das

kürzere Protein besteht nur aus 211 Aminosäuren und entsteht aus den letzten zwei

Exons (Xu et al. 2005). Es beinhaltet nicht den N-Terminus, sondern nur die PDZ-

bindende Domäne (Brzustowicz 2008).

Abb. 1.2: Genomische Konfiguration der langen (oben) bzw. kurzen Isoform (unten) von NOS1AP. Darstellung der Exons durch nummerierte Balken (nach Xu et al. 2005)

NOS1AP bindet die NOS-I hochspezifisch, nicht hingegen die anderen Isoformen der

NO-Synthase NOS-II und NOS-III (Jaffrey et al. 1998). Die NOS-I ist normalerweise

über PDZ-PDZ-Interaktionen mit PSD95 an den NMDA-Rezeptor der postsynaptischen

Membran gebunden und somit unmittelbar dem Calciumeinstrom in die Zelle durch den

NMDAR-assoziierten Kationenkanal ausgesetzt (Jaffrey et al. 1998). Dieser

Calciumeinstrom aktiviert die NOS-I, welche dann Stickoxid (NO) bildet. Durch

Bindung von NOS1AP an die NOS-I wird diese ins Zytosol transloziert, sodass es

weniger NMDAR/PSD95/NOS-I-Komplexe gibt und die Verfügbarkeit von Calcium

für die NOS-I reduziert ist. Folglich ist ein größerer Anteil des Enzyms katalytisch

inaktiv und es entsteht weniger Stickoxid. Somit ist NOS1AP ein negativer Regulator

der NO-Produktion (Boehning und Snyder 2003; Jaffrey et al. 1998; Nedvetsky et al.

2002).

1 Einleitung

27

Die letzten 125 Aminosäuren von NOS1AP binden neben der PDZ-Domäne von NOS-I

auch direkt eine PDZ-Domäne von PSD95 und blockieren so die Bindestelle für NOS-I

(Brzustowicz 2008).

Neben der NOS-I bindet NOS1AP auch weitere Proteine, dabei fungiert es als

Adaptorprotein für NOS-I und bindet diese an spezifische physiologische Zielproteine

(Jaffrey et al. 2002). Da diese Bindung durch den N-Terminus, welcher der kurzen

Isoform fehlt, vermittelt wird, kann die kurze Isoform von NOS1AP nicht als

Adaptorprotein fungieren (Brzustowicz 2008). Bindungspartner von NOS1AP sind die

Synapsine I, II und III. NOS1AP, NOS-I und Synapsin I bilden einen ternären

Komplex, bei dem die C-terminale PDZ-bindende Domäne von NOS1AP an NOS-I und

die N-terminale PTB-Domäne an Synapsin I bindet (Jaffrey et al. 2002). Da Synapsine

nur präsynaptisch vorkommen, ist diese Interaktion eventuell ein entscheidender Faktor

beim präsynaptischen Targeting der NOS-I (Jaffrey et al. 2002).

Abb. 1.3: Interaktion der NOS-I mit NOS1AP und weiteren Adaptorproteinen (nach Nedvetsky et al. 2002)

Ein anderer Bindungspartner ist das Protein Dexras1, ein Mitglied der Ras-Familie

kleiner monomerer G-Proteine. Es interagiert ebenfalls mit der N-terminalen PTB-

Domäne von NOS1AP und bildet zusammen mit NOS-I einen ternären Komplex. Auf

diese Weise kann Dexras1 durch Stickoxid S-nitrosyliert und aktiviert werden.

1 Einleitung

28

Wahrscheinlich moduliert Dexras1 in der aktivierten Form Signaltransduktionen (Fang

et al. 2000).

NOS1AP wird auch im Herzen exprimiert und interagiert dort ebenfalls mit NOS-I, eine

physiologische Funktion ist allerdings nicht bekannt. In einer großen Assoziationsstudie

in einem deutschen Sample wurde entdeckt, dass Polymorphismen im NOS1AP-Gen

signifikant mit Variationen des QT-Intervalls im EKG assoziiert sind. Dieses Ergebnis

wurde in verschiedenen Populationen repliziert (Aarnoudse et al. 2007; Arking et al.

2006; Lehtinen et al. 2008; Post et al. 2007). Der Mechanismus, durch den NOS1AP die

Länge des QT-Intervalls beeinflusst, ist noch nicht zweifelsfrei geklärt, man geht

allerdings von einer Veränderung des basalen Expressionslevels aus, die zu einer

beschleunigten kardialen Repolarisation durch Inhibition eines L-Typ Calciumkanals

führt (Chang et al. 2008). In einer weiteren Assoziationsstudie stellte sich zudem

heraus, dass ein SNP die Wirksamkeit von Sulfonylharnstoffen beeinflusst und zu

veränderten Mortalitätsraten bei damit behandelten Patienten führt (Becker et al. 2008).

1.5.2 Neuronale NO-Synthase als Zielstruktur von NOS1AP

Es gibt drei verschiedene NO-Synthase-Isoformen, die endotheliale NOS (NOS-III), die

induzierbare oder mitochondriale NOS (NOS-II) und die neuronale NOS, auch NOS-I

genannt. Die Isoformen sind auf drei verschiedenen Genen kodiert (Bernstein et al.

2005), die neuronale und endotheliale NOS werden konstitutiv exprimiert (Calabrese et

al. 2007).

Die NOS-I ist mit 160 kDa größer als die anderen Isoformen, da sie eine N-terminale

PDZ-Domäne besitzt, mit der sie Proteininteraktionen eingeht (Bernstein et al. 2005;

Fang et al. 2000). Im ZNS ist das Enzym für über 90% der NO-Synthese verantwortlich.

Die NOS-I kommt hauptsächlich in Kleinhirnrinde, Nucleus accumbens, Hippocampus,

Präfrontalcortex, Hypothalamus und Subthalamus vor, dabei ist die Dichte von NOS-I-

exprimierenden Neuronen von der Region abhängig (Bernstein et al. 2005; Blum-Degen

et al. 1999). Peripher wird sie in nichtadrenergen und nichtcholinergen (NANC)

Neuronen, welche glatte Muskelzellen in Gastrointestinaltrakt, Corpora cavernosa,

Uterus und Prostata innervieren, exprimiert (Calabrese et al. 2007).

1 Einleitung

29

Die NOS-I wird durch Erhöhung des Calciumspiegels und anschließende

Komplexierung mit Calmodulin aktiviert (Calabrese et al. 2007; Jaffrey et al. 1998). Die

Regulation erfolgt außerdem über Phosphorylierung und Veränderung der Expression,

auf subzellulärer Ebene ist die NO-Produktion auch von Bindung an Proteine abhängig

(Nedvetsky et al. 2002). So können Proteininteraktionen zu einer Destabilisierung der

Homodimere der NOS-I führen und sie so inhibieren (Nedvetsky et al. 2002).

Die Hauptfunktion von NOS-I ist die Bildung von NO durch die Konversion von L-

Arginin zu L-Citrullin in Anwesenheit von Sauerstoff (Bernstein et al. 2005; Calabrese

et al. 2007). Wie oben beschrieben ist die NOS-I über PSD-Proteine an den NMDAR

gekoppelt und beeinflusst über Proteininteraktionen zytosolische

Signaltransduktionswege (Bernstein et al. 2005). Derartige Proteininteraktionen führen

auch zu einer Kopplung der Stickoxidsynthese durch NOS-I an die Zielstruktur lösliche

Guanylatcyclase (sGC) (Nedvetsky et al. 2002). Des Weiteren kann die NOS-I durch S-

Nitrosylierung den NMDA-Rezeptor direkt negativ regulieren (Bernstein et al. 2005;

Hata und Takai 1999).

Stickoxid (NO), das Produkt der NOS-I, ist ein wichtiger autokriner und parakriner

Botenstoff mit diversen Funktionen in Immunsystem, kardiovaskulärem und

neuronalem System (Calabrese et al. 2007; Jaffrey et al. 2002). NO ist ein flüchtiger,

hochreaktiver Stoff, der Membranen passieren und intrazellulär von Metallionen,

Glutathion und Superoxid schnell abgebaut werden kann (Bernstein et al. 2005; Jaffrey

et al. 2002). Daher ist eine durch Proteininteraktionen vermittelte räumliche Nähe der

NOS-I zu den Zielstrukturen von NO wichtig (Jaffrey et al. 2002). Die wichtigste

Zielstruktur von NO ist die sGC, die bei Aktivierung den second messenger cGMP

bildet, welcher wiederum Kinasen aktiviert (Bernstein et al. 2005; Boehning und Snyder

2003; Calabrese et al. 2007). Ein weiterer Wirkmechanismus ist die S-Nitrosylierung

durch kovalente Bindung an Thiolgruppen (Boehning und Snyder 2003; Calabrese et al.

2007). Mittels dieser nachgeschalteten Reaktionen beeinflusst NO synaptische

Plastizität, Relaxation des glatten Muskels, Zellsignalisierung sowie Kontrolle von

Schlaf, Appetit und Körpertemperatur (Calabrese et al. 2007). Des Weiteren führt NO

zu Gefäßdilatation und Zerstörung von Tumorzellen und Bakterien durch

Makrophagenaktivierung (Boehning und Snyder 2003; Fang et al. 2000). NO

1 Einleitung

30

beeinflusst außerdem die Ausschüttung der „klassischen“ Transmitter wie GABA,

Dopamin, Serotonin, Glutamat und Noradrenalin in vielen Gebieten des Gehirns und ist

an der Regulation der neurosekretorischen Aktivität des Hypothalamus beteiligt

(Calabrese et al. 2007). Ein neuroprotektiver Effekt besteht in der Beendigung einer

verlängerten Stimulation des NMDA-Rezeptors, die zu exzitotoxischem Zelltod führen

kann, durch Nitrosylierung der NR1- und NR2-Untereinheit. Auf diese Weise wird der

Calciumeinstrom, welcher den Zelltod verursacht, vermindert. Auch eine verlängerte

NOS-Aktivierung, die zur Produktion von toxischen Superoxidradikalen führt, wird

durch NO-vermittelte Nitrosylierung beendet. Darüber hinaus reguliert NO einige

Faktoren, die neuroprotektive Effekte haben, darunter CREB (Calabrese et al. 2007).

Allerdings kann NO als freies Radikal in höheren Konzentrationen auch zytotoxische

Effekte haben, vor allem durch das aus der Konjugation mit Superoxid entstehende

Peroxynitrit (ONNO). Dieses wirkt oxidierend und nitrierend und kann zu

Lipidperoxidation und Zerstörung von Proteinen, Aminosäuren und Nukleinsäuren

führen (Bernstein et al. 2005). Eine überschießende NO-Bildung ist möglicherweise

auch an neurodegenerativen Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson beteiligt

(Calabrese et al. 2007; Guix et al. 2005).

1.5.3 NOS1AP als Kandidatengen: bisherige Studienergebnisse

Es gibt sowohl aus Kopplungs- und Assoziationsanalysen als auch aus funktionellen

Studien diverse Anhaltspunkte, die NOS1AP zu einem interessanten Kandidatengen für

endogene Psychosen machen. Dabei haben sich die Studien bisher auf Schizophrenie

konzentriert.

Der stärkste Hinweis auf Kopplung im Bereich 1q21-22 stammt von Brzustowicz et al.

aus dem Jahr 2000. Diese parametrische Kopplungsstudie in einem kanadischen Sample

von Familien, in denen gehäuft Schizophrenie und schizoaffektive Störung vorkommen,

zeigte eine signifikante Kopplung mit einem maximalen LOD-Score von 6,5

(Brzustowicz et al. 2000). In einer nachfolgenden fine-mapping Analyse wurde die

Region auf eine Länge von ca. 1 Mb eingegrenzt (Brzustowicz et al. 2002). Unterstützt

wurde dieses Ergebnis durch weitere Studien. So wurden in einer genomweiten

Kopplungsanalyse schwach positive LOD-Scores für verschiedene Regionen, darunter

1 Einleitung

31

1q22-23 gefunden (Shaw et al. 1998). In einer anderen genomweiten Kopplungsstudie

fand sich ein signifikanter Wert für den Marker D1S196 im Bereich 1q22.1-23 (Gurling

et al. 2001). Aus einer Kopplungsstudie in einem taiwanesischen Sample gibt es

ebenfalls Hinweise auf eine Kopplung für Marker D1S1679 im Bereich 1q21-31 (Hwu

et al. 2003). Auch eine Metaanalyse weist auf einen Suszeptibilitätsort auf 1q hin

(Lewis et al. 2003). Allerdings gibt es auch diverse Studien, die diese Ergebnisse nicht

bestätigen (Faraone et al. 2006; Suarez et al. 2006). Dies ist nicht verwunderlich, da die

Replikation bei einer genetisch komplexen Krankheit sehr schwierig ist (Brzustowicz

2008).

Auch Assoziationsstudien liefern Hinweise auf ein Suszeptibilitätsgen für

Schizophrenie im Bereich von NOS1AP. In der ersten Assoziationsstudie in dieser

genomischen Region wurden sechs Mikrosatellitenmarker in einem Sample spanischer

Kernfamilien untersucht. Dort zeigte sich signifikante allelische Assoziation zu dem

Marker D1S1679, welcher 25 kb von NOS1AP entfernt liegt. Um klinische,

pathophysiologische und ätiologische Heterogenität zu vermindern, wurde die gleiche

Analyse mit dem Endophänotyp „Realitätsdistortionssyndrom“ durchgeführt, dabei

zeigte sich wiederum eine bevorzugte Transmission einiger Allele des D1S1679-

Polymorphismus. Hieraus lässt sich schließen, dass ein Affinitätsgen an dieser Stelle an

der Pathophysiologie dieses Syndroms beteiligt sein könnte (Rosa et al. 2002). Auch in

einem Sample kolumbianischer Trios wurde signifikante Assoziation zu dem Marker

D1S1679 gefunden (Miranda et al. 2006). In einer Studie des oben genannten

kanadischen Samples waren sechs SNPs und zwei Mikrosatellitenmarker signifikant mit

Schizophrenie assoziiert, diese Marker lagen alle im genomischen Bereich von

NOS1AP (Brzustowicz et al. 2004). Eine Studie in der chinesischen Han-Bevölkerung

fand signifikante Assoziation zu einem SNP und daraus hervorgehenden Haplotypen,

wobei dieser SNP in der kanadischen Studie unauffällig gewesen war. Die Ergebnisse

der kanadischen Studie konnten hingegen nicht reproduziert werden (Zheng et al. 2005).

Auch in einem südamerikanischen Patientenkollektiv konnte eine Assoziation von acht

SNPs innerhalb des NOS1AP-Gens mit Schizophrenie festgestellt werden (Kremeyer et

al. 2009). Kürzlich wurde außerdem herausgefunden, dass eine Deletion von 1,38 Mb

im Bereich 1q21.1 signifikant mit Schizophrenie assoziiert ist, allerdings ist diese sehr

1 Einleitung

32

selten und wahrscheinlich nicht für die positiven Kopplungsbefunde verantwortlich. Es

waren keine SNPs in diesem Bereich signifikant mit Schizophrenie assoziiert

(Stefansson et al. 2008).

Der Versuch einer Reproduktion der Ergebnisse von Brzustowicz et al. in einem

britischen Sample gelang nicht. Keiner der im kanadischen Sample assoziierten Marker

zeigte hier Assoziation mit Schizophrenie (Puri et al. 2006). Auch eine familienbasierte

Assoziationsstudie in der chinesischen Hanbevölkerung fand keine Assoziation von

Einzelmarkern oder Haplotypen mit Schizophrenie (Fang et al. 2008).

Die Rolle von NOS1AP als Kandidatengen wird auch von funktionellen Studien

unterstützt. Eine Sequenzierung der kodierenden Regionen von NOS1AP deckte keine

Mutationen auf, die mit der Krankheit assoziiert sind, jedoch gibt es Hinweise auf

veränderte Expression bei Schizophrenie und bipolar-affektiver Erkrankung (Xu et al.

2005).

2 Fragestellung

33

2 Fragestellung

NOS1AP ist ein interessantes Kandidatengen für endogene Psychosen. Diverse

Kopplungs- und Assoziationsstudien unterstreichen vor allem seine Bedeutung bei

Schizophrenie. Insbesondere bei Betrachtung seiner physiologischen Funktion zeigt sich

eine mögliche Beteiligung an der Krankeitsentstehung. NOS1AP steht im

Zusammenhang mit dem NMDAR und spielt durch seine Verbindung zur NOS-I eine

wichtige Rolle bei der NO-Synthese. Somit ist es im weiteren Sinne mit neuronaler

Signaltransduktion und synaptischer Plastizität verbunden (Brzustowicz et al. 2004;

Hata und Takai 1999).

Wie oben beschrieben, gibt es auch diverse Hinweise auf eine Beteiligung des

Glutamatsystems und des NMDAR-Komplexes an der Ätiologie der bipolar-affektiven

Störung. Daher ist es möglich, dass NOS1AP auch bei dieser Erkrankung eine Rolle

spielt.

Für komplexe genetische Krankheiten wie Schizophrenie und die bipolar-affektive

Erkrankung sind Assoziationsstudien mit Fall-Kontroll-Samples besonders geeignet, um

Suszeptibilitätsgene mit geringem Effekt zu identifizieren (Brzustowicz 2008).

Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob eine Assoziation von 14 SNPs und den

daraus entstehenden Haplotypen im NOS1AP-Gen mit Schizophrenie und der bipolar-

affektiven Störung besteht. Dazu wurde eine Fall-Kontroll-Studie in einem

unterfränkischen Kollektiv durchgeführt.

3 Material und Methoden

34


3.1 Probanden

Für die Studie wurden 335 nicht miteinander verwandte Patienten aus Unterfranken

rekrutiert, darunter 174 Frauen und 161 Männer. Das mittlere Alter betrug 42,6 ± 13,9

Jahre. Im Verlauf ihrer Erkrankung waren alle Patienten mindestens einmal in der

Klinik und Poliklinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des

Universitätsklinikums Würzburg hospitalisiert. Zur Diagnosestellung wurde ein

ausführliches, semi-strukturiertes klinisches Interview analog dem AMDP-Interview

(Arbeitsgemeinschaft für Methodik und Dokumentation in der Psychiatrie 2000) durch

einen erfahrenen Psychiater vorgenommen, außerdem erfolgte eine Durchsicht der

Krankenakte und auswärtiger Arztbriefe und es wurden Angehörigeninterviews

durchgeführt. Erfasst wurden zudem Familienanamnese, Suchtmittelabusus und

Ersterkrankungsalter. Die Diagnosestellung erfolgte nach den ICD-10-Kriterien.

Dementsprechend litten 245 Patienten an einer schizophrenen Störung, darunter 135

Männer und 110 Frauen. Alle Patienten wiesen einen chronischen Verlauf der

Erkrankung ohne dauerhafte Remissionen auf. Außerdem nahmen 90 Patienten mit

einer bipolar-affektiven Störung an der Studie teil, darunter waren 64 Frauen und 26

Männer. Es wurden nur Patienten mit mindestens einer klinisch manifesten manischen

und einer depressiven Episode, die zu einer Behandlung führte, eingeschlossen, das

heißt es wurden strenge Bipolar-I-Kriterien angewandt.

Keiner der Patienten hatte signifikante neurologische Komorbiditäten wie beispielweise

Epilepsie, Retardierung oder somatische Störungen, die zu einer organischen Psychose

führen könnten. Patienten mit substanzinduzierter Psychose wurden nicht in die Studie

aufgenommen.

Die Kontrollproben wurden von 360 gesunden Blutspendern (188 Männer, 172 Frauen)

gewonnen, die aus derselben Gegend stammten wie die Patienten und den gleichen

genetischen Hintergrund wie die Patienten aufwiesen. Die Kontrollpersonen wurden

nicht hinsichtlich psychiatrischer Störungen überprüft, jedoch nahm keine der

Kontrollpersonen Medikamente ein und die Studie wurde ausführlich erklärt, so dass


35

die Wahrscheinlichkeit einer schweren psychiatrischen Krankheit unwahrscheinlich ist

(Reif et al. 2006). Das mittlere Alter der Kontrollgruppe lag bei 33,0 ± 10,5 Jahren.

Patienten und Kontrollen waren kaukasischer Abstammung.

Entsprechend den Regeln der Deklaration von Helsinki wurden nur Patienten und

Freiwillige, die nach ausführlicher Information schriftlich ihre Zustimmung gaben, in

die Studie aufgenommen. Vor Beginn der Studie wurde die Untersuchung durch die

Ethik-Kommission der Universität Würzburg genehmigt.

3.2 Material

3.2.1 Reagenzien

Primer:

SNP 4 (rs1415263)

Primer-forward 5’-TGT CAA CTG CTT CTG GGT TG- 3’

Primer-reverse 5’-GTT TGG TTG ATA CCA CGC TC- 3’

Produktgröße: 150 bp

SNP 7 (rs4145621)

Primer-forward 5’- AGT CTT CGG GGA CCC ATC- 3’

Primer-reverse 5’- CAA GGG GTG ATG GAC AAT AGA- 3’


SNP 13 (rs348624)

Primer-forward 5’- ACC AGT TGG CTG CTG AGG- 3’

Primer-reverse 5’- GCA AGA GCT GGA ACT GAA GC- 3’


Hersteller sämtlicher Primer: MWG-Biotech AG, Ebersberg


36

Enzyme und Oligonukleotide:

dNTP (100 mM dGTP, dATP, dCTP, dTTP) Promega GmbH, Mannheim

Hotstar-Taq-Polymerase Qiagen, Hilden

iPlex® Enzym Sequenom, San Diego, USA

Pronase E AppliChem, Darmstadt

Shrimp Alkalische Phosphatase (1U/l) Sequenom, San Diego, USA

Taq-DNA-Polymerase Biorad, München

Chemikalien:

Agarose Biozym, Rockland, USA

Bromphenolblau Merck, Darmstadt

100 bp DNA-Leiter Peqlab Biotechnologie GmbH,

Erlangen

Ethidiumbromid 10 mg/ml Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Steinheim

Glycerol Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Steinheim

H2O Nanopure, Klagenfurt

Isopropylalkohol AppliChem, Darmstadt

iPlex®-Puffer 10x Sequenom, San Diego, USA

iPlex®-Extension Primer Mix Sequenom, San Diego, USA

iPlex®-Termination Mix Sequenom, San Diego, USA

iPlex®-Ionenaustauschharz Sequenom, San Diego, USA

KCl AppliChem, Darmstadt

MgCl2 AppliChem, Darmstadt

MgCl2, 25mM Qiagen, Hilden

NaCl 6M AppliChem, Darmstadt

Na2EDTA AppliChem, Darmstadt

SAP-Reaktionspuffer Sequenom, San Diego, USA

SDS 10% Sigma, Steinheim


37

Tris-Acetat AppliChem, Darmstadt

Tris-HCl AppliChem, Darmstadt

Tween-20 AppliChem, Darmstadt

Lichrosolv Merck, Darmstadt

Xylen Cyanol FF Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Steinheim

Puffer aus eigener Herstellung:

1x TAE-Puffer 40 mM Tris-Acetat

1 mM EDTA (pH = 8,0)

Blaupuffer 0,25% Bromphenolblau

0,25% Xylen Cyanol FF

30% Glycerol in Wasser

TE-Puffer (pH = 8,0) Tris-EDTA in wässriger Lösung

SE-Puffer (pH = 8,0) 75 mM NaCl

0,5 M EDTA

Lysispuffer (pH = 7,4) 155 mM NH4Cl

10 mM KHCO3

0,1 mM EDTA

PCR-Puffer mit MgCl2 500 mM KCl

100 mM Tris-HCl (pH = 8,3)

0,25% Tween-20

0,25 mg/ml BSA

15 mM MgCl2

3.2.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien

Biometra T-Gradient Thermocycler Biometra, Göttingen

Biometra UNOII Thermoblock Biometra, Göttingen

Chemie Doc Biorad, München

Chip Sequenom, San Diego, USA


38

Filterspitzen Sarstedt, Nümbrecht

Gelkammern, Kämme, Spacer, Spatel Peqlab Biotechnologie GmbH,

Erlangen

Glaskolben Schott-AG, Mainz

MALDI-ToF Autoflex 1-Massenspektrometer Bruker Daltonik, Bremen

Nano Dispenser Sequenom, San Diego, USA

Personal Spin-Vortex, Microspin FV-2400 lab-4-you GmbH, Berlin

Pipetten Eppendorf AG, Hamburg

Reaktionsgefäße:

8er Ketten 0,2 ml PCR-Gefäße Brand GmbH & Co. KG, Wertheim

Safe Lock 1,5 ml Eppendorf AG, Hamburg

Software: TYPER 3,4 Sequenom, San Diego, USA

Spannungsgerät: Power Supply LKB, Bromma, Schweden

Thermo fast 384er-Platten ABgene, Hamburg

Tischzentrifuge Mikroliter Hettich GmbH& Co. KG, Tuttlingen

Ultraviolet Transilluminator UVP, Upland CA, USA

Waage Toledo Mettler, Gießen

3.3 Methoden

3.3.1 Methodischer Überblick

In dieser Arbeit wurde die Genotypisierung der SNPs mittels einer Primerextension und

anschließender Analyse in der MALDI-ToF (matrix-assisted laser desorption

ionization-time of flight) Massenspektrometrie durchgeführt. Bei SNP 4 (rs1415263), 7

(rs4145621) und 13 (rs348624) wurde zunächst eine PCR und anschließende

Gelelektrophorese durchgeführt, während SNP 1 (rs1572495), 2 (rs1538018), 3

(rs945713), 5 (rs4306106), 6 (rs3924139), 8 (rs2661818), 9 (rs1508263), 10

(rs3751284), 11 (rs7521206), 12 (rs905721) und 14 (rs1964052) mittels des iPlex®-

Protokolls amplifiziert wurden.

Danach folgten jeweils die Primerextension und die Analyse mit MALDI-ToF. Die

Primerextension ist eine häufig angewandte Methode um die Allele von SNPs zu


39

genotypisieren. Nach Amplifikation der DNA-Zielfrequenz mittels PCR dient das PCR-

Produkt als Vorlage für die Primerverlängerung. Übrige Nukleotide und

Primerrückstände werden entfernt. Der Primer für die Primerextension bindet mit seiner

3’-terminalen Base direkt oberhalb des SNPs an die Zielsequenz. Die

Primerverlängerung mit einem Nukleotid (ddNTP) führt nun zu Produkten

unterschiedlicher Masse, die sich in der Spektrometrie unterscheiden lassen (Tost und

Gut 2002; Tost und Gut 2005).

3.3.2 DNA-Extraktion

Es wurde eine DNA-Extraktion aus dem Vollblut der Probanden entsprechend der

Methode nach Miller durchgeführt (Miller et al. 1988). Hierfür wurden die Leukozyten

durch Zentrifugieren abgetrennt und anschließend durch hypotone Lösung, Pronase E

und SDS-Detergenz lysiert. Peptide und andere Zellbestandteile wurden durch

Erhöhung der Salzkonzentration ausgefällt und abzentrifugiert. Die DNA konnte dann

mit Isopropanol aus dem wässrigen Überstand präzipitiert werden. Danach erfolgte eine

photometrische Konzentrationsbestimmung bei einer Wellenlänge von 260 nm. Hierbei

entsprach eine Konzentration von 50 µg/ml doppelsträngiger DNA einer optischen

Dichte von 1.

3.3.3 Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion, kurz PCR, wurde 1985 von Kary B. Mullis erfunden

(Garcia und Ma 2005). Sie ist eine in vitro Methode, die die Produktion großer Mengen

spezifischer DNA-Fragmente einer definierten Länge und Frequenz aus einer kleinen

Menge Vorlage (Template) erlaubt (White et al. 1989).

Die PCR beruht auf enzymatischer Amplifikation eines DNA-Fragments, welches von

zwei Oligonukleotidprimern flankiert wird. Zunächst erfolgt die Denaturierung, das

heißt die DNA-Vorlage wird auf 90-95°C erhitzt, damit sich die Einzelstränge

voneinander trennen. Im zweiten Schritt, dem Annealing, wird das Gemisch auf eine

primerabhängige Temperatur von 50-60°C heruntergekühlt, sodass sich die


40

Oligonukleotidprimer an die Einzelhelices binden können. Im dritten Schritt, der

Extension, wird die Temperatur auf ca. 73°C erhöht, sodass die DNA-Polymerase aus

den Desoxynukleotiden einen komplementären DNA-Strang aufbauen kann. Das

Extensionsprodukt jedes Primers fungiert dann wiederum als Vorlage für eine weitere

Amplifikation. Die drei Schritte - Denaturierung, Annealing und Extension - werden ca.

30-40-mal wiederholt. Dabei entsteht eine exponentielle Menge des DNA-Segments,

ungefähr 2n, wobei n für die Anzahl der Zyklen steht.

Als DNA-Polymerase wird die thermostabile Taq-Polymerase des Thermus aquaticus

benutzt.

Zur Amplifizierung der SNPs 4, 7 und 13 wurden folgende PCR-Ansätze angewendet:

SNP 4 (rs1415263): DNA-Template 1,5 µl

Nukleotide 2,5 mM 1,5 µl

Primer forward (10 pmol/µl) 1,5 µl

Primer reverse (10 pmol/µl) 1,5 µl

Taq-Polymerase 0,15 µl

PCR-Puffer mit 15 mM MgCl2 3,75 µl

Destilliertes Wasser 27,6 µl

Es wurden 45 Zyklen mit einer Annealing-Temperatur von 56,4°C durchgeführt.








Es wurden 45 Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 62,2°C durchgeführt.


41








Es wurden 45 Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 59,8°C durchgeführt.

Um eine Verunreinigung ausschließen zu können, wurde bei jeder PCR eine

Negativkontrolle, in der alle Reagenzien außer der DNA enthalten waren, mitgeführt.

3.3.4 Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese ist der gängigste Weg, um das PCR-Produkt zu

analysieren. Durch Variation des Agaroseanteils kann der Trennbereich der Matrices

verändert werden. Je höher das Agarosegel konzentriert ist, desto weiter wird der

optimale Trennbereich in Richtung kleinerer DNA-Fragmente verschoben.

Mithilfe von Ethidiumbromid, einem Stoff, der fest an die DNA bindet, indem er

zwischen den Basen interkaliert, kann das amplifizierte Produkt durch Fluoreszenz

sichtbar gemacht werden, da Ethidiumbromid unsichtbares ultraviolettes Licht in

sichtbares Licht konvertieren kann. Auf diese Weise lässt sich sofort feststellen, ob das

PCR-Produkt die erwartete Größe hat und ob ebenfalls amplifizierte Fremd-DNA

enthalten ist.

Bei der Herstellung der Gele und der Gelelektrophorese wurde folgendermaßen

vorgegangen: Die Gele wurden aus 100 ml TAE-Puffer und 2 g Agarose hergestellt.

Das Gemisch wurde in der Mikrowelle ca. drei Minuten erwärmt. Nach Abkühlen auf

50-60°C wurden 3 µl Ethidiumbromid hinzugefügt und das Gel wurde in eine mit

Kämmen versehene Gelkammer gegossen. Nach Erkalten wurden jeweils 10 µl PCR-

Produkt, versetzt mit 5 µl Blaupuffer, in die Kammern pipettiert und eine Spannung von


42

110 Volt für 30 Minuten angelegt. Dadurch wanderten die negativ geladenen DNA-

Fragmente zur Anode, je nach Länge unterschiedlich schnell. Eine 100 bp Leiter wurde

mitgeführt, um später die Größe der PCR-Produkte bewerten zu können. Die

Negativkontrolle der PCR wurde ebenfalls untersucht. Unter UV-Licht wurden die

Größe des PCR-Produkts und die Negativkontrolle begutachtet.

3.3.5 Amplifizierung nach dem iPlex®-Protokoll

Die Amplifikationen von SNP 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12 und 14 wurden nach dem

iPlex®-Protokoll angefertigt. Es erfolgte eine initiale Denaturierung bei 94°C für 15

min. Danach schlossen sich 44 Zyklen mit einer Denaturierung bei 95°C für 20 sec,

einem Annealing bei 56°C für 30 sec und einer Extension bei 72°C für 1 min an. Nach

dem letzten Zyklus erfolgte eine finale Elongation bei 72°C für 3 min.

3.3.6 Verdau mit Alkalischer Phosphatase

Nach der PCR erfolgte ein enzymatischer Verdau mit Shrimp Alkalischer Phosphatase

(SAP), um Reste von Desoxynukleotidtriphosphaten durch Dephosphorylierung zu

entfernen. Je Probe wurden 10x SAP-Puffer (0,17 µl), 1,53 µl H2O und 0,30 µl SAP

(1U/µl) verwendet. Die Reaktion wurde im Thermocycler auf 384 well Platten für 40

min bei 37°C durchgeführt. Um die SAP zu inaktivieren folgten 5 min bei 85°C.

3.3.7 iPlex® Reaktion

Für die auf den SAP-Verdau folgende Einzelbasenextension wurde folgender iPlex®

Reaktionsmix erstellt: 412 µl Nanopure H2O wurden mit jeweils 109 µl iPlex®-Puffer

Plus (10x) und iPlex®-Termination Mix, außerdem 438 µl Extension Primer Mix (mit

steigender Konzentration und Masse) und 21,8 µl iPlex®-Enzym gemischt. Zu den

gereinigten PCR-Produkten wurden jeweils 2 µl Mix pipettiert. Daraufhin erfolgten

nachstehende Schritte der Primer-Extensionsreaktion im Thermocycler: Nach einer

initialen Denaturierung für 30 sec bei 94°C erfolgten 40 Zyklen mit jeweils 5 sec bei


43

94°C, dann ein Annealing bei 52°C für 5 sec. Die Elongation, d. h. die Verlängerung

des Primers um eine Base, erfolgte bei 80°C. In jedem der 40 Zyklen wurden letztere

zwei Schritte fünfmal wiederholt. Abschließend folgten 3 min bei 72°C.

3.3.8 Reinigung durch Ionenaustauschharz

Um die MALDI-Analyse nicht zu beeinflussen, wurden Salze aus dem iPlex®

Reaktionsprodukt folgendermaßen entfernt: In jeden Ansatz wurden 16 µl H2O

pipettiert. Daraufhin wurden 6 mg Ionenaustauschharz hinzugefügt, die Platten wurden

verschlossen und 20 min gewendet. Als nächster Schritt folgte eine Zentrifugation

(3000 rpm) von 5 min. Danach wurden 25 nl des gereinigten iPlex® Ansatzes mittels

eines Nano Dispensers auf einen SpectroChip® aufgebracht, es folgte die weitergehende

Analyse mittels eines Bruker Autoflex MALDI-ToF Massenspektrometers.

3.3.9 MALDI-ToF Massenspektrometrie

Die MALDI-Methode wurde 1988 von Tanaka, Karas und Hillenkamp entwickelt, um

große Biomoleküle zu ionisieren und ihre Masse zu analysieren (Griffin und Smith

2000; Tost und Gut 2002). Sie kann zur Analyse von Proteinen, Peptiden und

Nukleinsäuren benutzt werden. Die MALDI-ToF Massenspektrometrie ist mittlerweile

eine häufig angewandte Methode, um SNPs zu genotypisieren. Große Vorteile sind die

extrem kurze Analysezeit sowie die absoluten Ergebnisse, welche als Verhältnis

zwischen Masse und Ladung der jeweiligen Moleküle dargestellt werden können

(Griffin und Smith 2000).

Bei der MALDI-ToF wird der zu analysierende Stoff (z. B. DNA) mit einer Matrix

vermischt, dieses Gemisch kristallisiert dann aus. Durch Laserbeschuss mit einer

Wellenlänge von ca. 337 nm wird das Analysat ionisiert und gasförmig. Es liegt eine

gewisse Spannung an, welche die Ionen beschleunigt. Dabei erreichen Ionen mit

kleinerem Verhältnis von Masse zu Ladung den Detektor schneller als solche mit

größerem Quotienten. Die jeweilige Flugzeit wird gemessen und darüber das Masse-

Ladungs-Verhältnis berechnet (Griffin und Smith 2000).


44

Abb. 3.1: Schematische Darstellung eines MALDI-ToF Massenspektrometers (nach Sauer 2007)

3.3.10 Statistische Analyse

Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm Haploview (Barrett et al.

2005). Zunächst wurde das Kopplungsungleichgewicht zwischen den untersuchten

SNPs ermittelt. Eine mögliche Assoziation einzelner Allele bzw. Haplotypen mit

Schizophrenie und bipolar-affektiver Erkrankung wurde mittels Chi2-Test berechnet.

Zur genaueren Beurteilung signifikanter Ergebnisse wurde weiterhin ein

Permutationstest mit 10.000 Permutationen durchgeführt. Die Signifikanzgrenze wurde

bei einem p-Wert von 0,05 festgelegt.

3.3.11 Qualitätssicherung

Es wurden 14 verschiedene SNPs im NOS1AP-Gen im Bereich von Intron 1, 2, 3, 4, 8

und 9 sowie Exon 6 und 9 untersucht. Für SNP 8 (rs2661818) wurde in allen Fällen nur

das Allel C gefunden, es handelt sich daher für das vorliegende Patienten- und

Kontrollkollektiv nicht um einen polymorphe Variante, so dass er von den weiteren

Analysen ausgeschlossen wurde.

Bei Schizophrenie betrug die beobachtete Heterozygotenrate 16,3% bis 52,5%. Die

minore Allelfrequenz lag zwischen 9,6% und 45,4%. Die call rate der 13 untersuchten

SNPs lag zwischen 87,1% und 99,6%. SNP 13 befand sich nicht im Hardy-Weinberg-


45

Gleichgewicht (p = 0,0065), was am ehesten auf einen Genotypisierungsfehler

zurückzuführen ist, weshalb er ebenfalls von weiteren Analysen ausgeschlossen wurde.

Bei der bipolar-affektiven Erkrankung lag die beobachtete Heterozygotenrate zwischen

15,1% und 54,9%. Die minore Allelfrequenz betrug 9,4% bis 45,1%. Die call rate lag

bei 87,0% bis 99,5%. Außer SNP 13 befanden sich alle SNPs im Hardy-Weinberg-

Gleichgewicht.

4 Ergebnisse

46

4 Ergebnisse

4.1 Schizophrenie

4.1.1 Kopplungsungleichgewicht

Das Kopplungsungleichgewicht wurde nach der solid spine-Methode berechnet. Dabei

ergab sich in der Gesamtstichprobe für die 13 untersuchten SNPs eine Struktur mit zwei

Haploblöcken. Block 1 bestand aus SNP 4-7, die sich mit D’-Werten zwischen 0,87 und

1,0 im Kopplungsungleichgewicht befanden. Der zweite Block bestand aus den SNPs

11-14 mit D’-Werten von 0,98 bis 1,0.

Abb. 4.1: LD Struktur Schizophrenie Gesamtstichprobe (D’)

4 Ergebnisse

47

4.1.2 Assoziationsanalyse

Acht Individuen wurden von der Analyse ausgeschlossen, weil weniger als 85% der

Allele bestimmt werden konnten. Zunächst wurde eine Assoziation der einzelnen Allele

untersucht (Tab. 4.1), dabei ergab sich für SNP 2 (rs1538018) ein p-Wert von 0,0085,

für SNP 3 (rs945713) ein p-Wert von 0,0072 und für SNP 5 (rs4306106) ein p-Wert von

0,0466 im Chi²-Test. Somit zeigte sich bei diesen drei SNPs eine signifikante

Assoziation zu Schizophrenie.

Darüber hinaus wurde eine mögliche Assoziation der korrespondierenden Haplotypen

untersucht (Tab. 4.2). Dabei zeigte sich jedoch kein signifikant mit Schizophrenie

assoziierter Haplotyp. Nach Vergrößerung des Haplotypblocks 1 auf SNP 3-7 ergab

sich allerdings eine signifikante nominelle Assoziation des Haplotyps CTAGC mit

einem p-Wert von 0,0172 (Tab. 4.3). Dieser Haplotyp kam bei 18% der Erkrankten und

13% der Kontrollen vor.

Zur weiteren Analyse der signifikant assoziierten Allele bzw. des Haplotyps wurde ein

Permutationstest mit 10.000 Permutationen durchgeführt. Danach fand sich weder für

die Allele noch für den Haplotyp eine signifikante Assoziation. Allerdings zeigte sich

für SNP 2 mit einem p-Wert von 0,0924 und für SNP 3 mit einem p-Wert von 0,0788

immerhin noch ein statistischer Trend.

Anschließend wurde die Analyse geschlechtsspezifisch durchgeführt. Bei den Männern

wurden drei Individuen ausgeschlossen. In der Assoziationsanalyse der einzelnen SNP-

Allele mittels Chi²-Test zeigten SNP 2 (p = 0,0059) und SNP 3 (p = 0,005) signifikante

Assoziationen mit Schizophrenie (Tab. 4.4). In der Haplotypanalyse zeigten in Block 1

die Haplotypen TCGAT mit einem p-Wert von 0,0367 und CTAGC mit einem p-Wert

von 0,0467 nominelle Assoziation mit Schizophrenie (Tab. 4.5). Der Haplotyp TCGAT

kam bei 41% der Patienten und 50% der Kontrollen vor, CTAGC hatten 20% der

Patienten und 14% der Kontrollen. Im Permutationstest ergab sich eine grenzwertige

Signifikanz für SNP 3 mit einem p-Wert von 0,0588 und ein Trend für SNP 2 mit einem

p-Wert von 0,0706. Die Haplotypen waren im Permutationstest nicht mehr signifikant.

Bei den Frauen wurden fünf Individuen ausgeschlossen. In der Analyse der SNPs zeigte

sich keine signifikante allelische Assoziation (Tab. 4.6). In keinem der Haploblöcke

zeigte sich ein signifikant mit Schizophrenie assoziierter Haplotyp (Tab. 4.7).

4 Ergebnisse

48

4.2 Bipolar-affektive Störung

4.2.1 Kopplungsungleichgewicht

Nach Berechnung der Daten mit solid spine ergab sich eine Blockstruktur aus zwei

Haploblöcken (Abb. 4.2). Haploblock 1 beinhaltete SNP 4-7, es zeigte sich ein

Kopplungsungleichgewicht mit D’-Werten von 0,86 bis 1,0. Block 2 bestand aus SNP

11-14 mit D’-Werten von 0,98 bis 1,0.

Abb. 4.2: LD Struktur bipolar-affektive Störung Gesamtstichprobe (D’)

4.2.2 Assoziationsanalyse

Zwei Individuen wurden von der Assoziationsanalyse ausgeschlossen, da weniger als

85% der Allele bestimmt werden konnten. In der Assoziationsanalyse der SNPs mit

dem Chi²-Test zeigte sich keine signifikante allelische Assoziation mit der bipolar-

4 Ergebnisse

49

affektiven Störung (Tab. 4.8). Die Haplotypenanalyse ergab ebenfalls keine signifikante

Assoziation (Tab. 4.9). Auf eine nach Geschlechtern getrennte Assoziationsanalyse

wurde bei unzureichender Subgruppengröße verzichtet.

4.3 Tabellarische Übersicht der Ergebnisse

Tab. 4.1: Schizophrenie Gesamtstichprobe - Einzelmarker SNP Nr. Marker LD-Block Allele Fälle Kontrollen 1 rs1572495 T 45 (10%) 59 (9%) C 403 (90%) 575 (91%) χ

2 = 0,165 p = 0,6847 P-p = 0,9999

2 rs1538018 C 109 (32%) 152 (24%) G 233 (68%) 480 (76%) χ

2 = 6,919 p = 0,0085 P-p = 0,0924

3 rs945713 C 206 (46%) 248 (38%) T 244 (54%) 410 (62%) χ

2 = 7,228 p = 0,0072 P-p= 0,0788

4 rs1415263 1 T 190 (43%) 240 (37%) C 256 (57%) 406 (63%) χ

2 = 3,282 p = 0,07 P-p = 0,5074

5 rs4306106 1 A 109 (24%) 126 (19%) G 339 (76%) 526 (81%) χ

2 = 3,96 p = 0,0466 P-p = 0,3762

6 rs3924139 1 G 174 (39%) 205 (33%) A 270 (61%) 407 (67%) χ

2 = 3,624 p = 0,057 P-p = 0,4378

7 rs4145621 1 C 199 (48%) 279 (44%) T 217 (52%) 357 (56%) χ

2 = 1,598 p = 0,2062 P-p = 0,8946

4 Ergebnisse

50

9 rs1508263 A 205 (46%) 299 (45%) G 245 (54%) 365 (55%) χ

2 = 0,03 p = 0,8627 P-p = 1,0

10 rs3751284 G 289 (66%) 399 (64%) A 151 (34%) 229 (36%) χ

2 = 0,52 p = 0,4707 P-p = 0,9976

11 rs7521206 2 G 146 (35%) 216 (34%) C 274 (65%) 420 (66%) χ

2 = 0,072 p = 0,7887 P-p = 1,0

12 rs905721 2 T 146 (35%) 217 (34%) C 272 (65%) 419 (66%) χ

2 = 0,073 p = 0,7869 P-p = 1,0

13 rs348624 2 T 47 (11%) 55 (10%) C 385 (89%) 515 (90%) χ

2 = 0,407 p = 0,5235 P-p = 0,9988

14 rs1964052 2 T 56 (12%) 82 (12%) C 394 (88%) 582 (88%) χ

2 = 0,002 p = 0,9623 P-p = 1,0

Tab. 4.2: Schizophrenie Gesamtstichprobe - Haplotypen Haplotyp LD-Block Frequenz

(Gesamtkollektiv) Fälle pos.:neg. (ges.)

Kontrollen pos.:neg. (ges.)

CGAT 1 0,513 219:231 (450) (49%)

352:312 (664) (53%)

χ2 = 2,091

p = 0,1482 P-p = 0,9242

TAGC 1 0,212 107:343 (450) (24%)

129:535 (664) (19%)

χ2 = 3,065

p = 0,08 P-p = 0,7561

4 Ergebnisse

51

TGGC 1 0,114 53:397 (450) (12%)

75:589 (664) (11%)

χ2 = 0,057

p = 0,8107 CGAC 1 0,074 31:419 (450)

(7%) 52:612 (664) (8%)

χ2 = 0,406

p = 0,5242 TGAC 1 0,044 22:428 (450)

(5%) 27:637 (664) (4%)

χ2 = 0,431

p = 0,5114 TGGT 1 0,017 8:442 (450)

(2%) 11:653 (664) (2%)

χ2 = 0,0

p = 0,9975 CGGC 1 0,012 6:444 (450)

(1%) 8:656 (664) (1%)

χ2 = 0,045

p = 0,8313 CCCC 2 0,531 236:214 (450)

(52%) 355:307 (662) (54%)

χ2 = 0,19

p = 0,6631 GTCC 2 0,338 153:297 (450)

(34%) 223:439 (662) (34%)

χ2 = 0,019

p = 0,8918 CCTT 2 0,121 54:396 (450)

(12%) 81:581 (662) (12%)

χ2 = 0,008

p = 0,9297

Tab. 4.3: Schizophrenie Gesamtstichprobe – Haplotypen (vergrößerter Block 1) Haplotyp LD-Block Frequenz



TCGAT 1 0,451 188:262 (450) (42%)

314:348 (662) (47%)

χ2 = 3,592

p = 0,0581 CTAGC 1 0,148 80:370 (450)

(18%) 84:578 (662) (13%)

χ2 = 5,677

p = 0,0172

4 Ergebnisse

52

CTGGC 1 0,113 53:397 (450) (12%)

73:589 (662) (11%)

χ2 = 0,156

p = 0,6932 TTAGC 1 0,065 27:423 (450)

(6%) 46:616 (662) (7%)

χ2 = 0,419

p = 0,5174 CCGAT 1 0,062 31:419 (450)

(7%) 38:624 (662) (6%)

χ2 = 0,72

p = 0,396 TCGAC 1 0,058 24:426 (450)

(5%) 41:621 (662) (6%)

χ2 = 0,476

p = 0,4903 CTGAC 1 0,044 22:428 (450)

(5%) 27:635 (662) (4%)

χ2 = 0,449

p = 0,5027 CCGAC 1 0,016 7:443 (450)

(2%) 10:652 (662) (2%)

χ2 = 0,004

p = 0,951 CTGGT 1 0,015 7:443 (450)

(2%) 10:652 (662) (2%)

χ2 = 0,065

p = 0,7985 TCGGC 1 0,013 6:444 (450)

(1%) 9:653 (662) (1%)

χ2 = 0,0

p = 0,9995

Tab. 4.4: Schizophrenie Männer - Einzelmarker SNP Nr. Marker LD-Block Allele Fälle Kontrollen 1 rs1572495 T 25 (10%) 27 (9%)

C 223 (90%) 289 (91%) χ

2 = 0,392 p = 0,5313 P-p = 0,9996

2 rs1538018 C 65 (35%) 77 (24%) G 121 (65%) 249 (76%) χ

2 = 7,581 p = 0,0059 P-p = 0,0706

4 Ergebnisse

53

3 rs945713 1 C 121 (48%) 123 (37%) T 129 (52%) 211 (63%) χ

2 = 7,874 p = 0,005 P-p = 0,0588

4 rs1415263 1 T 111 (44%) 124 (38%) C 139 (56%) 206 (62%) χ

2 = 2,749 p = 0,0973 P-p = 0,639

5 rs4306106 1 A 60 (24%) 66 (20%) G 188 (76%) 266 (80%) χ

2 = 1,554 p = 0,2126 P-p = 0,9017

6 rs3924139 1 G 102 (41%) 109 (35%) A 146 (59%) 203 (65%) χ

2 = 2,257 p = 0,133 P-p = 0,7624

7 rs4145621 1 C 113 (50%) 138 (42%) T 115 (50%) 188 (58%) χ

2 = 2,83 p = 0,0925 P-p = 0,6256

9 rs1508263 G 136 (54%) 177 (52%) A 114 (46%) 163 (48%) χ

2 = 0,317 p = 0,5734 P-p = 1,0

10 rs3751284 G 159 (65%) 195 (61%) A 87 (35%) 127 (39%) χ

2 = 0,986 p = 0,3206 P-p = 0,979

11 rs7521206 2 C 157 (69%) 209 (64%) G 71 (31%) 117 (36%) χ

2 = 1,35 p = 0,2453 P-p = 0,9335

12 rs905721 2 C 154 (68%) 208 (64%) T 72 (32%) 118 (36%) χ

2 = 1,113 p = 0,2915 P-p = 0,9653

4 Ergebnisse

54

13 rs348624 2 T 26 (11%) 23 (8%) C 212 (89%) 273 (92%) χ

2 = 1,575 p = 0,2095 P-p = 0,8967

14 rs1964052 2 T 34 (14%) 37 (11%) C 216 (86%) 303 (89%) χ

2 = 1,005 p = 0,3161 P-p = 0,9778

Tab. 4.5: Schizophrenie Männer - Haplotypen Haplotyp LD-Block Frequenz



TCGAT 1 0,46 102:148 (250) (41%)

168:170 (338) (50%)

χ2 = 4,364

p = 0,0367 P-p = 0,4407

CTAGC 1 0,162 49:201 (250) (20%)

46:292 (338) (14%)

χ2 = 3,957

p = 0,0467 P-p = 0,5411

CTGGC 1 0,111 32:218 (250) (13%)

33:305 (338) (10%)

χ2 = 1,268

p = 0,2602 P-p = 0,9958

TTAGC 1 0,059 11:239 (250) (4%)

23:315 (338) (7%)

χ2 = 1,452

p = 0,2282 P-p = 0,9883

CCGAT 1 0,049 15:235 (250) (6%)

14:324 (338) (4%)

χ2 = 0,892

p = 0,3451 TCGAC 1 0,046 12:238 (250)

(5%) 15:323 (338) (4%)

χ2 = 0,048

p = 0,826 CTGAC 1 0,046 13:237 (250)

(5%) 14:324 (338) (4%)

χ2 = 0,294

p = 0,5877

4 Ergebnisse

55

CCGAC 1 0,022 6:244 (250) (2%)

7:331 (338) (2%)

χ2 = 0,015

p = 0,902 CTGGT 1 0,018 5:245 (250)

(2%) 5:333 (338) (1%)

χ2 = 0,184

p = 0,6676 TCGGC 1 0,011 3:247 (250)

(1%) 4:334 (338) (1%)

χ2 = 0,002

p = 0,9659 CCCC 2 0,539 136:114 (250)

(54%) 181:159 (340) (53%)

χ2 = 0,083

p = 0,7737 GTCC 2 0,337 78:172 (250)

(31%) 121:219 (340) (36%)

χ2 = 1,391

p = 0,2383 P-p = 0,992

CCTT 2 0,115 32:218 (250) (13%)

36:304 (340) (11%)

χ2 = 0,635

p = 0,4255

Tab. 4.6: Schizophrenie Frauen - Einzelmarker SNP Nr. Marker LD-Block Allele Fälle Kontrollen 1 rs1572495 C 180 (90%) 286 (90%)

T 20 (10%) 32 (10%) χ

2 = 0,001 p = 0,9815

2 rs1538018 C 44 (28%) 75 (25%) G 112 (72%) 231 (75%) χ

2 = 0,738 p = 0,3904

3 rs945713 1 C 85 (43%) 125 (39%) T 115 (57%) 199 (61%) χ

2 = 0,791 p = 0,3737

4 rs1415263 1 T 79 (40%) 116 (37%) C 117 (60%) 200 (63%) χ

2 = 0,664 p = 0,4152

4 Ergebnisse

56

5 rs4306106 2 A 49 (25%) 60 (19%) G 151 (75%) 260 (81%) χ

2 = 2,456 p = 0,1171

6 rs3924139 2 G 72 (37%) 96 (32%) A 124 (63%) 204 (68%) χ

2 = 1,186 p = 0,276

7 rs4145621 2 C 86 (46%) 141 (45%) T 102 (54%) 169 (55%) χ

2 = 0,003 p = 0,9548

9 rs1508263 A 91 (46%) 136 (42%) G 109 (54%) 188 (58%) χ

2 = 0,626 p = 0,4289

10 rs3751284 G 130 (67%) 204 (67%) A 64 (33%) 102 (33%) χ

2 = 0,006 p = 0,9366

11 rs7521206 3 G 75 (39%) 99 (32%) C 117 (61%) 211 (68%) χ

2 = 2,659 p = 0,1029

12 rs905721 3 T 74 (39%) 99 (32%) C 118 (61%) 211 (68%) χ

2 = 2,291 p = 0,1301

13 rs348624 3 C 173 (89%) 242 (88%) T 21 (11%) 32 (12%) χ

2 = 0,083 p = 0,7739

14 rs1964052 3 C 178 (89%) 279 (86%) T 22 (11%) 45 (14%) χ

2 = 0,926 p = 0,336

Tab. 4.7: Schizophrenie Frauen - Haplotypen Haplotyp LD Block Frequenz



TC 1 0,529 100:100 (200) (50%)

177:147 (324) (55%)

χ2 = 1,182

p = 0,277

4 Ergebnisse

57

CT 1 0,312 66:134 (200) (33%)

97:227 (324) (30%)

χ2 = 0,54

p = 0,4623 CC 1 0,089 19:181 (200)

(10%) 28:296 (324) (9%)

χ2 = 0,112

p = 0,7373 TT 1 0,07 15:185 (200)

(8%) 22:302 (324) (7%)

χ2 = 0,174

p = 0,6763 GAT 2 0,529 103:97 (200)

(52%) 175:151 (326) (54%)

χ2 = 0,208

p = 0,648 AGC 2 0,203 46:154 (200)

(23%) 60:266 (326) (18%)

χ2 = 1,627

p = 0,2021 GGC 2 0,132 24:176 (200)

(12%) 45:281 (326) (14%)

χ2 = 0,27

p = 0,6032 GAC 2 0,121 22:178 (200)

(11%) 42:284 (326) (13%)

χ2 = 0,479

p = 0,4889 CCCC 3 0,523 99:101 (200)

(50%) 176:148 (324) (54%)

χ2 = 1,125

p = 0,2888 GTCC 3 0,339 76:124 (200)

(38%) 102:222 (324) (31%)

χ2 = 2,473

p = 0,1158 CCTT 3 0,125 22:178 (200)

(11%) 44:280 (324) (14%)

χ2 = 0,696

p = 0,4043

Tab. 4.8: Bipolar-affektive Erkrankung Gesamtstichprobe - Einzelmarker SNP Nr. Marker LD-Block Allele Fälle Kontrollen 1 rs1572495 T 14 (10%) 59 (9%)

C 132 (90%) 575 (91%) χ

2 = 0,011 p = 0,9157

4 Ergebnisse

58

2 rs1538018 C 35 (28%) 152 (24%) G 91 (72%) 480 (76%) χ

2 = 0,785 p = 0,3755

3 rs945713 C 58 (40%) 248 (38%) T 88 (60%) 410 (62%) χ

2 = 0,21 p = 0,6467

4 rs1415263 1 T 57 (39%) 240 (37%) C 89 (61%) 406 (63%) χ

2 = 0,181 p = 0,6702

5 rs4306106 1 A 36 (25%) 126 (19%) G 110 (75%) 526 (81%) χ

2 = 2,096 p = 0,1476

6 rs3924139 1 G 51 (34%) 205 (33%) A 97 (66%) 407 (67%) χ

2 = 0,049 p = 0,824

7 rs4145621 1 C 65 (46%) 279 (44%) T 77 (54%) 357 (56%) χ

2 = 0,171 p = 0,6791

9 rs1508263 A 67 (45%) 299 (45%) G 81 (55%) 365 (55%) χ

2 = 0,003 p = 0,9577

10 rs3751284 G 97 (69%) 399 (64%) A 43 (31%) 229 (36%) χ

2 = 1,655 p = 0,1983

11 rs7521206 2 G 58 (39%) 216 (34%) C 90 (61%) 420 (66%) χ

2 = 1,443 p = 0,2297

12 rs905721 2 T 57 (39%) 217 (34%) C 89 (61%) 419 (66%) χ

2 = 1,264 p = 0,261

13 rs348624 2 T 14 (10%) 55 (10%) C 126 (90%) 515 (90%) χ

2 = 0,016 p = 0,9001

4 Ergebnisse

59

14 rs1964052 2 T 22 (15%) 82 (12%) C 126 (85%) 582 (88%) χ

2 = 0,686 p = 0,4076

Tab. 4.9: Bipolar-affektive Erkrankung Gesamtstichprobe - Haplotypen Haplotyp LD Bock Frequenz



CGAT 1 0,527 76:72 (148) (51%)

352:312 (664) (53%)

χ2 = 0,144

p = 0,7043 TAGC 1 0,203 36:112 (148)

(24%) 129:535 (664) (19%)

χ2 = 1,566

p = 0,2109 TGGC 1 0,102 9:139 (148)

(6%) 74:590 (664) (11%)

χ2 = 3,3

p = 0,0693 CGAC 1 0,079 12:136 (148)

(8%) 53:611 (664) (8%)

χ2 = 0,004

p = 0,9478 TGAC 1 0,045 9:139 (148)

(6%) 27:637 (664) (4%)

χ2 = 1,056

p = 0,304 TGGT 1 0,018 3:145 (148)

(2%) 12:652 (664) (2%)

χ2 = 0,118

p = 0,7312 CGGC 1 0,012 2:146 (148)

(1%) 8:656 (664) (1%)

χ2 = 0,04

p = 0,8417 CCCC 2 0,523 68:80 (148)

(46%) 357:307 (664) (54%)

χ2 = 2,97

p = 0,0848 GTCC 2 0,346 58:90 (148)

(39%) 223:441 (664) (34%)

χ2 = 1,674

p = 0,1957 CCTT 2 0,122 20:128 (148)

(14%) 79:585 (664) (12%)

χ2 = 0,257

p = 0,6121

5 Diskussion

60

5 Diskussion

5.1 Stärken und Schwächen von Assoziationsstudien

Das Ziel von genetischen Assoziationsstudien ist es, statistische Assoziation zwischen

genetischen Polymorphismen und einem Phänotyp nachzuweisen und so genetische

Risikofaktoren zu identifizieren, die später umfassender analysiert werden können

(Lunetta 2008).

Ein großer Vorteil von populationsbasierten Assoziationsstudien ist die einfache

Rekrutierung von Fall-Kontroll-Samples im Vergleich zu familienbasierten Daten. Auf

diese Weise kann man große Samples aufbauen, in denen die Frequenz des

Krankheitsallels und das ihm zuschreibbare Risiko gleichzeitig geschätzt werden

können. Auch wird es durch diese Art von Studien möglich, Krankheiten mit einem

späten Ersterkrankungsalter zu analysieren, bei denen familienbasierte Studien nicht

mehr möglich wären, da ältere Angehörige eventuell schon verstorben sind. Man kann

in Assoziationsstudien Krankheitsallele, vor allem auch häufig vorkommende Allele mit

geringem Einfluss auf die Krankheitsentstehung identifizieren. Durch den

technologischen Fortschritt sind mittlerweile kostengünstige Methoden mit hohem

Durchsatz verfügbar, sodass viele SNPs im Genom untersucht werden können

(Rodriguez-Murillo und Greenberg 2008). Inzwischen können Assoziationsstudien

einige große Erfolge nachweisen, die nicht nur psychiatrische Krankheiten betreffen. So

konnten beispielsweise SNPs identifiziert werden, die mit Multipler Sklerose,

Mammakarzinom und altersabhängiger Makuladegeneration assoziiert sind (Easton et

al. 2007; Hafler et al. 2007; Klein et al. 2005).

Assoziationsstudien haben jedoch auch einige Nachteile. Besonders schwierig ist es,

Assoziation eines bestimmten Gens in ethnisch verschiedenen Samples zu replizieren,

da diese aufgrund unterschiedlicher Herkunft genetisch differieren. Falls im Laufe der

Zeit in verschiedenen Populationen unterschiedliche anfälligkeitsvermittelnde

Veränderungen innerhalb eines Gens auftreten, ist es extrem schwer bis unmöglich,

Assoziation zu entdecken. Selbst wenn die gleichen Veränderungen geschehen sind,

jedoch zu unterschiedlichen Zeitpunkten, kann es kompliziert sein, Assoziation

nachzuweisen. Da sich in einem solchen Fall die flankierenden Regionen

5 Diskussion

61

wahrscheinlich unterscheiden, besteht unter Umständen kein

Kopplungsungleichgewicht zur kausalen Variante mehr, sodass man exakt die kausale

Variante untersuchen müsste, um Assoziation feststellen zu können (Brzustowicz 2008;

Rodriguez-Murillo und Greenberg 2008).

Es hat sich gezeigt, dass der Grad einer Assoziation in der ersten Studie meist viel höher

eingeschätzt wird als in nachfolgenden Replikationsstudien, ein Phänomen, das als

„winner’s curse“ bezeichnet wird. Dies kann zum einen darauf beruhen, dass die

originale Studie ein falsch positives Ergebnis präsentiert oder die Assoziation

überschätzt, andererseits ist es möglich, dass der Geneffekt in einer Subpopulation

größer ist als in anderen (Ioannidis et al. 2001). Selbst in scheinbar ähnlichen

Subpopulationen herrscht teilweise große Variabilität in der Stärke einer Assoziation,

was auf Differenzen in unbekannten Parametern wie ethnischen Unterschieden und

verschiedenen Gen-Umwelt-Interaktionen zurückzuführen ist. Die Bewertung solcher

Subgruppeneffekte ist schwierig und erfordert große Stichproben (Ioannidis et al. 2001).

Ein weiteres Problem ist, dass genetische Assoziation oft von geringem Ausmaß ist und

einzelne Studien nicht genug Power haben, um sie zu entdecken (Ioannidis et al. 2001).

Zudem haben einzelne assoziierte Allele im Vergleich zu Haplotypen eher eine geringe

Aussagekraft (Petronis 2004; Zheng et al. 2005). Durch die Analyse von Haplotypen

kann man die Datenmenge verkleinern, wodurch weniger Mehrfachtests nötig sind. Auf

diese Weise vergrößert sich die Power, seltene Allele zu entdecken (Malhotra et al.

2004). Was die Interpretation eines positiven Ergebnisses erschwert, ist die schon oben

beschriebene Tatsache, dass Assoziation keine genetische Beziehung, sondern lediglich

ein statistisches Phänomen beschreibt. Dementsprechend ist auch trotz eines statistisch

negativen Ergebnisses eine Assoziation nicht auszuschließen (Ioannidis et al. 2001).

Es ergeben sich bei vielen Assoziationsstudien Probleme mit dem Studiendesign,

insbesondere durch die fehlende Vergleichbarkeit von Fällen und Kontrollen. Ein

solches schlechtes Matchen von Fällen und Kontrollen erhöht die Gefahr eines Typ-1-

Fehlers und kann beispielsweise durch familienbasierte Studiendesigns verhindert

werden, die weniger anfällig für Stratifikation sind und den Einfluss nicht genetischer

Risikofaktoren stärker berücksichtigen. Nachteilig ist dabei wiederum die geringere

statistische Power und die eingeschränkte Verfügbarkeit ausreichend großer

Familiensamples im Vergleich zu Fall-Kontroll-Studien nicht verwandter Individuen

5 Diskussion

62

(Abou-Sleiman et al. 2006; Chanock et al. 2007; Craddock und Jones 1999; Kennedy et

al. 2003; Malhotra et al. 2004; Petronis 2004).

Trotz der genannten Probleme macht die Vielzahl von fraglichen Genotyp-Phänotyp-

Assoziationen gute Replikationsstudien notwendig, um die Aussagekraft von

Ergebnissen zu überprüfen (Chanock et al. 2007).

5.2 Vergleich mit anderen Studien

In dieser Arbeit wurde die Bedeutung von NOS1AP auf 1q22 als Kandidatengen bei

Schizophrenie und bipolar-affektiver Erkrankung untersucht. Der funktionelle

Zusammenhang zwischen NOS1AP und Schizophrenie wurde in der Einleitung

ausführlich beschrieben und basiert in erster Linie auf der Verbindung zu NMDA-

Rezeptor und NO-Synthese. Die Rolle von NOS1AP in der Pathogenese der bipolar-

affektiven Erkrankung ist hingegen weniger gut erforscht, es ist jedoch vorstellbar, dass

auch affektive Störungen auf Abnormalitäten des Glutamatsystems beruhen und eine

Beziehung zum NMDAR besteht.

Es gibt verschiedene Kopplungsstudien, die Hinweise auf den Genort 1q22 als

Kandidatenregion für Schizophrenie geben (Brzustowicz et al. 2000; Brzustowicz et al.

2002; Gurling et al. 2001; Hwu et al. 2003; Shaw et al. 1998). In insgesamt sechs

Assoziationsstudien wurden Marker innerhalb des NOS1AP-Gens bei Schizophrenen

untersucht. Ihre Ergebnisse sind allerdings eher widersprüchlich. Während in vier

Studien Assoziation von SNPs mit Schizophrenie nachgewiesen werden konnte

(Brzustowicz et al. 2004; Kremeyer et al. 2009; Wratten et al. 2009; Zheng et al. 2005),

zeigten die anderen zwei Studien negative Ergebnisse (Fang et al. 2008; Puri et al.

2006). Es gibt bisher also keine sicheren Hinweise auf eine Bedeutung von

Polymorphismen in diesem Gen für eine Krankheitsanfälligkeit. Die vorliegende Arbeit

stellt eine weitere Fall-Kontroll-Studie dar. Ursprünglich wurden 14 SNPs im NOS1AP-

Gen untersucht, die auch Gegenstand vorheriger Studien waren. Ein SNP (rs2661818)

wurde von der Analyse ausgeschlossen, da es sich in diesem Patienten- und

Kontrollkollektiv nicht um einen Polymorphismus handelte. Ein weiterer SNP

(rs348624) befand sich nicht im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht, sodass dieser SNP

ebenfalls von weiteren Analysen ausgeschlossen wurde.

5 Diskussion

63

Für die SNPs rs1538018 (p = 0,0085), rs945713 (p = 0,0072) und rs4306106 (p =

0,0466) ergab sich eine nominelle Assoziation mit Schizophrenie. Da es bei Fall-

Kontroll-Studien durch die Kombination vieler Einzeltests zu einem erhöhten Risiko für

falsch positive Ergebnisse kommt, wurde anschließend ein Permutationstest

durchgeführt (Lunetta 2008). Hierbei verfehlten die zuvor nominell assoziierten SNPs

rs1538018 (p = 0,0924) und rs945713 (p = 0,0788) das Signifikanzniveau von p = 0,05

knapp, was jedoch nicht ungewöhnlich ist und eine Assoziation dieser Varianten mit

Schizophrenie nicht ausschließt. Der Haplotyp CTAGC in Block 1, der das assoziierte

C-Allel von SNP rs945713 beinhaltet, war ebenfalls nominell assoziiert (p = 0,0172),

wobei sich auch hier kein signifikanter Wert im Permutationstest ergab. Dies

unterstreicht trotzdem eine mögliche Relevanz des C-Allels in SNP rs945713 als

Risikofaktor für Schizophrenie.

In der nach Geschlechtern unterteilten Analyse zeigten bei den Männern SNP

rs1538018 (p = 0,0059) und rs945713 (p = 0,005) eine nominelle Assoziation. Nach

dem Permutationstest wies SNP rs945713 noch eine grenzwertige Signifikanz auf (p =

0,0588) und auch rs1538018 verfehlte die Signifikanzgrenze nur sehr knapp (p =

0,0706). In Block 1 ergaben sich für zwei Haplotypen, TCGAT (p = 0,0367) und

CTAGC (p = 0,0467), nominell signifikante Ergebnisse, wobei der Haplotyp TCGAT

häufiger bei Gesunden vorkam, während CTAGC, welcher wiederum das assoziierte C-

Allel aus SNP rs945713 enthält, mit Schizophrenie assoziiert war. Allerdings hielten

erneut beide Haplotypen dem Permutationstest nicht stand. SNP rs1538018 steht nicht

im Kopplungsungleichgewicht mit den anderen untersuchten SNPs, sodass es keine

resultierenden Haploblöcke gibt. In der Analyse für Frauen ließen sich keine

signifikanten Assoziationen nachweisen.

Beim Vergleich der vorliegenden Ergebnisse mit den anderen Assoziationsstudien fällt

zunächst auf, dass die SNPs rs1538018 und rs945713, welche in der vorliegenden

Studie nominell mit Schizophrenie assoziiert waren, in der ursprünglichen Studie von

Brzustowicz et al. ebenfalls signifikant assoziiert waren, wobei sie nicht zu den drei

Markern gehörten, die genomweite Signifikanz erreichten (Brzustowicz et al. 2004).

Eine aktuelle Assoziationsstudie konnte ebenfalls eine signifikante Assoziation des

Markers rs945713 in einer kolumbianischen Population feststellen, der SNP rs1538018

war hingegen nicht assoziiert (Kremeyer et al. 2009). Der dritte nominell assoziierte

5 Diskussion

64

SNP dieser Arbeit, rs4306106, war lediglich Gegenstand einer weiteren Studie (Wratten

et al. 2009). In dieser aktuellen, mit einer neuen Methode durchgeführten Untersuchung

des kanadischen Samples, in welchem ursprünglich Assoziation festgestellt worden war,

zeigten sich für rs4306106, wie auch für rs1538018 und rs945713, keine deutlichen

Hinweise auf eine Assoziation mit Schizophrenie. In der Studie von Puri et al. wiesen

rs1538018 und rs945713 ebenfalls kein signifikantes Ergebnis auf, bei Zheng et al.

wurde nur SNP rs945713 untersucht, der ebenso negativ war. Keiner dieser beiden

SNPs wurde in der Assoziationsstudie von Fang et al. analysiert.

Abb. 5.1: Assoziation der untersuchten SNPs (rot) und SNPs anderer, ausgewählter Studien mit Schizophrenie. Umgekehrt logarithmische Auftragung (signifikant: -log(p;10) > 1,3)

Unterstützung der vorliegenden Ergebnisse findet man also im kanadischen und

kolumbianischen Sample, allerdings muss man erwähnen, dass bei Brzustowicz et al.

drei weitere Marker signifikante Ergebnisse aufwiesen, zwei davon sogar genomweite

Signifikanz (rs1415263 und rs4145621), die in dieser Untersuchung negativ waren.

Auch die Marker rs348624 bzw. rs1964052, die in der Studie von Zheng et al. im

5 Diskussion

65

kompletten Kopplungsungleichgewicht waren und signifikante Assoziation mit

Schizophrenie aufwiesen, waren in der vorliegenden Studie nicht signifikant assoziiert

bzw. bei fehlendem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht nicht auswertbar. Die

Assoziationsstudie im kolumbianischen Sample zeigte für acht SNPs nominell

signifikante Ergebnisse, darunter wiederum rs1415263 und rs4145621 sowie zwei

weitere SNPs (rs3924139, rs3751284), die in der vorliegenden Untersuchung ebenfalls

negativ waren (Kremeyer et al. 2009). Die Studie von Wratten et al. lieferte mit einer

anderen Methode erneut ein positives Ergebnis für die Marker rs1415263 und

rs4145621. Zudem wurde für den signifikant assoziierten SNP rs12742393, der nicht

Gegenstand der vorliegenden Arbeit war, eine funktionelle Variante identifiziert

(Wratten et al. 2009).

Insgesamt lassen sich aus den vorliegenden Ergebnissen keine eindeutigen Schlüsse

ziehen, jedoch weisen die nominell signifikanten Resultate für die SNPs rs1538018 und

rs945713 insbesondere bei Männern auf eine Assoziation von NOS1AP mit

Schizophrenie hin. Allerdings ist es möglich, dass die geschlechtergetrennten

Untergruppen zu klein sind, um ein aussagekräftiges Ergebnis zu liefern, sodass das

Ergebnis der Gesamtstichprobe im Vordergrund steht.

Im bipolar-affektiven Kollektiv wurden dieselben SNPs untersucht, jedoch ergab die

Assoziationsanalyse der einzelnen SNPs keine signifikanten Werte. Einschränkend

muss allerdings gesagt werden, dass das Kollektiv der Patienten relativ klein war. Da es

bisher keine Assoziationsstudien gibt, die NOS1AP bei einem Kollektiv bipolar-affektiv

Erkrankter untersucht haben, ist ein Vergleich nicht möglich.

5.3 Ursachen für Unterschiede zu anderen Assoziationsstudien

Beim Vergleich der Ergebnisse für Schizophrenie mit anderen Fall-Kontroll-Studien

fällt auf, dass die Studien nicht zu einem einheitlichen Ergebnis kommen und selbst in

den Studien, die Assoziation nachweisen konnten, unterschiedliche SNPs assoziiert

waren. Die Ursachen hierfür können vielfältig sein. Einen Hauptgrund stellen ethnische

Unterschiede in den verschiedenen Samples dar. Verschiedene Populationen weisen

auch unterschiedliche Verteilungen von Geno- und Phänotypen auf (Abou-Sleiman et

5 Diskussion

66

al. 2006; Lunetta 2008). Obwohl beispielsweise generell davon ausgegangen wird, dass

Europa und der mittlere Osten einen relativ homogenen Genpool darstellen, wurde

festgestellt, dass sogar innerhalb Europas erhebliche genetische Variation besteht

(Thomas und Witte 2002). In dieser Studie wurde ein Kollektiv kaukasischen Ursprungs

aus Unterfranken in Deutschland untersucht. Die bisherigen Assoziationsstudien

arbeiteten mit Samples Han-chinesischen, kolumbianischen, keltischen und britischen

(d. h. englischen, schottischen, walisischen und irischen) Ursprungs und differierten

somit zum Teil deutlich. Einen Hinweis auf unterschiedliche Allelfrequenzen zwischen

diesen Populationen liefert beispielsweise der im kolumbianischen und Han-

chinesischen Sample biallelische (C/G) SNP rs2661818 (Fang et al. 2008; Kremeyer et

al. 2009), der in der vorliegenden Studie auch untersucht wurde, jedoch nicht

polymorph war, weil in allen Fällen nur das Allel C gefunden wurde. Auch die

unterschiedliche Blockstruktur in verschiedenen Populationen kann differierende

Ergebnisse zur Folge haben, wenn man davon ausgeht, dass die Assoziation eines

Markers auf Kopplungsungleichgewicht zu der „echten“ Suszeptibilitäts-Variante

beruht. Falls dieses Kopplungsungleichgewicht in einer anderen Population nicht

auftritt, ist auch keine Assoziation des Markers zur Krankheit nachweisbar.

Ein weiteres Phänomen, welches den Vergleich unterschiedlicher Fall-Kontroll-Studien

bei so komplexen Krankheiten wie Schizophrenie und bipolar-affektiver Störung

erschwert, stellt die genetische Heterogenität dar. Da ein multifaktorielles,

polygenetisches Vererbungsmuster vorliegt, können in den betroffenen Individuen

verschiedene Gene für die Krankheitsentstehung ursächlich sein. Außerdem können

selbst im gleichen Gen unterschiedliche Varianten die Anfälligkeit vermitteln (Alaerts

und Del-Favero 2009; McClellan et al. 2007). Dies könnte erklären, warum in den

einzelnen Studien verschiedene Marker von NOS1AP mit der Krankheit assoziiert sind.

Allerdings sind die assoziierten SNPs überwiegend in einer Region, nämlich im Intron 2

lokalisiert. Sie stehen teilweise im Kopplungsungleichgewicht miteinander und

möglicherweise auch mit einem weiteren, bisher unbekannten Suszeptibilitätslocus

(Kremeyer et al. 2009). Somit ist es wahrscheinlicher, dass die differierenden

Haploblockstrukturen in den verschiedenen Studienpopulationen für die

unterschiedlichen Ergebnisse verantwortlich sind.

5 Diskussion

67

Des Weiteren besteht auch eine Heterogenität hinsichtlich des Phänotyps. Es ist

vorstellbar, dass unterschiedlichen Phänotypen auch unterschiedliche Gene bzw.

Polymorphismen zu Grunde liegen und viele der untersuchten Patientenkollektive zu

heterogen sind (Abou-Sleiman et al. 2006). So könnten auch die verschiedenen

Diagnosekriterien eine Ursache für die unterschiedlichen Ergebnisse sein. Die heutigen

Standard-Diagnosekriterien sind ICD-10 und DSM-IV. In der vorliegenden Studie

wurden die Diagnosen entsprechend ICD-10 gestellt, dabei wurden auch schizoaffektiv

Erkrankte in die Fall-Gruppe mit einbezogen. Alle Erkrankten wiesen jedoch einen

chronischen Verlauf auf. In der Assoziationsstudie von Brzustowicz war DSM-III-R

Grundlage der Diagnose, auch in dieser Studie beinhaltete die Patientengruppe

Schizophrenie und chronisch schizoaffektive Erkrankung. In den Studien von Zheng et

al., Fang et al. und Kremeyer et al. wurden DSM-III-R bzw. DSM-IV als

Diagnosekriterien verwendet. Puri et al. wiederum stellten die Diagnosen mit Hilfe der

Research Diagnostic Criteria und SADS-L Interviews. Letztere vier Studien schlossen

schizoaffektiv Erkrankte aus. Die Diagnosekriterien unterscheiden sich demnach nicht

erheblich und folgen den Standardkriterien. Dennoch ist es denkbar, dass die

Beschränkung einiger Studien auf die Diagnose „Schizophrenie“ im Gegensatz zur

Ausweitung der Fallgruppe mit Einbeziehung der schizoaffektiven Störung, wie in der

vorliegenden Studie, zu verschiedenen Ergebnissen führt.

Ein weiterer Faktor, der potentiell zu unterschiedlichen Ergebnissen führen kann, ist das

Studiendesign. In dieser Studie wurde eine populationsbasierte Fall-Kontroll-

Untersuchung nicht verwandter Individuen durchgeführt, dieselbe Methode wurde bei

Puri et al. gewählt. Hingegen waren die Studien von Brzustowicz et al., Wratten et al.,

Kremeyer et al. und Fang et al. familienbasiert. Somit hatte die vorliegende Studie eine

größere statistische Power, seltene Allele zu entdecken, gleichzeitig aber auch ein

erhöhtes Risiko für Populationsstratifikation (Malhotra et al. 2004).

5.4 Andere Kandidatengene auf 1q22

Es ist möglich, dass trotz der nominellen Assoziation von Markern innerhalb des

NOS1AP-Gens keine kausale Beziehung zu Schizophrenie besteht. Das positive

Kopplungssignal der Region 1q22 könnte demzufolge auf ein anderes Kandidatengen in

5 Diskussion

68

diesem Bereich hindeuten, insbesondere weil die Kopplungsregion nach dem fine-

mapping auf einen Bereich von 3 Mb eingegrenzt wurde, in welchem ca. 50 Gene

enthalten sind (Brzustowicz et al. 2002; Brzustowicz 2008). Selbst die positiven

Assoziationsergebnisse wären durch ein anderes Kandidatengen zu erklären, da sich

Assoziation über größere genomische Segmente erstrecken kann, die teilweise mehrere

Gene enthalten (Brzustowicz 2008). Sogar ein über 40 kb entfernt liegender SNP kann

im Kopplungsungleichgewicht mit einer funktionellen Variante stehen (Shinkai et al.

2002). Zudem können regulatorische DNA-Regionen über Distanzen von bis zu 1 Mb

wirken und sogar mehrere Gene beeinflussen. Dies zeigt die Möglichkeit auf, dass

krankheitsassoziierte Sequenzen in einem Gen die Expression eines oder mehrerer

anderer Gene regulieren, wodurch diverse Gene zur Krankheitsanfälligkeit beitragen

könnten (Brzustowicz 2008).

Tatsächlich wurden bisher zwei andere Kandidatengene in der Nähe von NOS1AP

entdeckt. Das eine Kandidatengen ist RGS4, welches 700 kb von NOS1AP entfernt

liegt und bereits in mehreren Assoziations- und Funktionsstudien untersucht wurde

(Erdely et al. 2006; Levitt et al. 2006; Mirnics et al. 2001). Seine Funktion wurde oben

bereits beschrieben. Da die Effekte vieler Neurotransmitter, die potentiell für die

Pathophysiologie von Schizophrenie relevant sind, über G-Protein-gekoppelte

Rezeptoren vermittelt werden, ist die Rolle von RGS4 interessant und eine Bedeutung

für die Krankheitsentstehung gut vorstellbar (Talkowski et al. 2006). Dementsprechend

zeigte sich in einer Studie, in der mehrere Populationen untersucht wurden (u. a.

kaukasischer, indischer und afroamerikanischer Herkunft), signifikante Assoziation von

verschiedenen SNPs mit Schizophrenie (Chowdari et al. 2002). Obwohl auch einige

weitere Studien Assoziation feststellten, waren die assoziierten SNPs und Haplotypen in

den verschiedenen Samples unterschiedlich. Bisher sind keine Polymorphismen in

kodierenden Regionen bekannt, sodass man auch bei RGS4 davon ausgehen kann, dass

die assoziierten SNPs zu veränderter Transkription oder Translation und weniger zu

strukturell veränderten Proteinen führen und so die Pathophysiologie beeinflussen

(Talkowski et al. 2006). So wurde beispielsweise festgestellt, dass eine signifikant

verminderte Expression von mRNA und Protein in betroffenen Individuen besteht

(Mirnics et al. 2001; Erdely et al. 2006). Einige SNPs sind darüber hinaus mit

5 Diskussion

69

funktionellen Veränderungen, wie dem veränderten Volumen des dorsolateralen

präfrontalen Kortex, assoziiert (Prasad et al. 2005).

Auch das Gen UHMK1 auf 1q23.3 ist ein potentielles Kandidatengen für Schizophrenie

und liegt 129 kb von NOS1AP entfernt. Es zeigte in zwei Studien allelische und

haplotypische Assoziation mit Schizophrenie (Puri et al. 2007; Puri et al. 2008).

UHMK1 kodiert für eine Proteinkinase, die in sich entwickelnden und adulten

Neuronen exprimiert wird und verschiedene Substrate wie beispielsweise Stathmin

phosphoryliert. Stathmin reguliert die Dynamik von Mikrotubuli und eine Ausschaltung

führt zu Verhaltensabnormalitäten. Beim Menschen wurde eine Assoziation von

Stathmin mit emotionsregulierter Schreckreaktion, Neurotizismus und Panikstörung

gefunden (Reif et al., in Vorbereitung). Es ist vorstellbar, dass ein Knock-out von

UHMK1 bei Mäusen ebenfalls zu derartigen Auffälligkeiten führen könnte (Puri et al.

2008). Die positiven Assoziationsergebnisse für SNPs in NOS1AP und RGS4 sowie für

den Marker D1S1679, der zwischen NOS1AP und UHMK1 liegt, könnten daher auch

auf ein Kopplungsungleichgewicht mit einer anfälligkeitsvermittelnden Variante im

UHMK1-Gen zurückgehen. Dies wird unterstützt durch die Entdeckung, dass D1S1679

ein starkes Kopplungsungleichgewicht zum Promotorbereich von UHMK1 aufweist,

was Auswirkungen auf die Expression des Gens haben könnte (Puri et al. 2007).

Die Erklärungen sind aber keinesfalls exklusiv: so kann es gut sein, dass Varianten in

allen drei Risikogenen zu dem Linkagepeak auf Chromosom 1 beitragen; generell

könnten solche Phänomene häufiger sein als gedacht und auch bei anderen

psychiatrischen Erkrankungen eine Rolle spielen.

5.5 Bedeutung des nitrinergen Systems

Das nitrinerge System ist an mehreren Signalkaskaden beteiligt, die im Verdacht stehen,

eine Rolle bei der Entstehung endogener Psychosen zu spielen. So agiert das NO-

generierende Enzym NOS-I als nachgeschaltetes Signalmolekül des NMDAR und ist

daher Bestandteil der glutamatvermittelten Neurotransmission. Möglicherweise führt

eine Unterfunktion des Glutamatsystems zu einer nachfolgend eingeschränkten NOS-I-

Funktion. Des Weiteren steht die NOS-I nicht nur mit dem Glutamatsystem, sondern

auch mit dem serotonergen und dopaminergen System in Verbindung. So inhibiert NO

5 Diskussion

70

über S-Nitrosylierung monoaminerge Transporter (5HTT, DAT, NET) und bedingt

dadurch eine größere Verfügbarkeit der Transmitter (Kiss und Vizi 2001). Es wurde

zudem festgestellt, dass ein NOS1-Knock-out in einer veränderten Serotoninfunktion

resultiert (Chiavegatto et al. 2001). Auch funktionelle Studien haben gezeigt, dass

nitrinerge Neurone bei Schizophrenie verändert sind. Darüber hinaus wurde Assoziation

von Schizophrenie mit einem funktionellen SNP in der Promotorregion von NOS1

festgestellt, der mit verschlechterter präfrontaler Gehirnfunktion in Verbindung steht

(Reif et al. 2006).

Insgesamt scheint das nitrinerge System eine Verbindung zwischen glutamatergem und

monoaminergem System darzustellen und könnte so eine Schlüsselfunktion in der

Pathogenese sowohl von schizophrenen als auch affektiven Störungen innehaben.

NOS1AP als Adaptorprotein der NOS-I mit einer direkten Auswirkung auf die

Produktion von NO steht damit im Mittelpunkt dieser Theorie (Reif et al. 2006).

5.6 Funktionelle Studien

Prinzipiell gibt es zwei Möglichkeiten, wie genetische Variation Krankheitsanfälligkeit

vermitteln kann. Zum einen kann die Struktur des kodierten Proteins durch den Einbau

einer falschen Aminosäure verändert werden und zum anderen kann die Expression und

somit die verfügbare Menge des betroffenen Proteins beeinflusst werden. Im Endeffekt

bewirken beide Mechanismen eine veränderte Funktion des Proteins und führen zu

einem veränderten Phänotyp (Harrison und Weinberger 2005; Kleinjan und van

Heyningen 2005). In dieser Arbeit wurde keine Assoziation zu kodierenden SNPs in

Exons festgestellt. Eine veränderte Aminosäurefrequenz, die zu einem Protein mit

eingeschränkter Funktion führt, ist also eher unwahrscheinlich, obwohl theoretisch

Kopplungsungleichgewicht zu einer kodierenden Variante bestehen könnte (Harrison

und Weinberger 2005). Dies ist jedoch keine überraschende Entdeckung, da es viele

potentielle Mechanismen gibt, die Auswirkungen auf die normale Genfunktion und

somit pathologische Folgen haben (Kleinjan und van Heyningen 2005). Auch bei den

meisten anderen Kandidatengenen sind die Auswirkungen der assoziierten SNPs noch

nicht bekannt, man geht jedoch davon aus, dass eine veränderte Genexpression der

5 Diskussion

71

genetischen Assoziation unterliegt (Harrison und Owen 2003; Harrison und Weinberger

2005).

Um zu verstehen, auf welche Art und Weise sich Polymorphismen in der DNA auf ein

Protein auswirken, sind funktionelle Studien wichtig. Diese untersuchen z. B. eine

veränderte Expression, welche auf unterschiedliche mRNA- und Proteinspiegel,

strukturelle Veränderungen der primären RNA bzw. Proteinsequenz oder abnorme

Proteinmodifikationen zurückgehen kann (Brzustowicz 2008).

Ein wichtiger Bestandteil der Regulationsmechanismen ist die transkriptionale

Kontrolle, bei der neben dem Promotor noch diverse andere regulatorische Elemente

komplex miteinander interagieren. Viele Gene benötigen für die korrekte Expression

diese sogenannten cis-regulatorischen Elemente, welche man auch als „enhancer“ oder

„ repressor“ bezeichnet und die Bindestellen für Transkriptionsfaktoren sind (de Laat

und Grosveld 2003; Kleinjan und van Heyningen 2005). Sie können bis zu 1 Mb in 5’-

oder 3’-Richtung entfernt liegen und sich z. B. in Introns benachbarter Gene befinden

(Kleinjan und van Heyningen 2005). Varianten im Promotorbereich oder aber auch

SNPs in Introns können also solche regulatorischen Elemente betreffen und die

Transkriptionsaktivität beeinflussen (Duan et al. 2003a; Greenwood und Kelsoe 2003;

Harrison und Weinberger 2005). Synonyme, d. h. „stille“ SNPs in kodierenden

Regionen und SNPs in Introns können darüber hinaus Splicing und mRNA-Stabilität,

zwei weitere wichtige Regulatoren der Genexpression, verändern und so die Expression

eines Gens beeinflussen. Auch SNPs in UTRs wirken sich auf mRNA-Stabilität aus und

können zu eingeschränkter Translationsinitiation führen (Duan et al. 2003b). Zudem

zeigen sich mitunter die Effekte einzelner Allele erst in Kombination miteinander und

unter Berücksichtigung der Haplotypen (Duan et al. 2003a; Duan et al. 2003b; Harrison

und Weinberger 2005).

Der Nachteil an funktionellen Studien ist, dass es wahrscheinlich nicht ausreicht, sie nur

in vitro oder als Tiermodelle durchzuführen, weil möglicherweise die Genregulation im

menschlichen Gehirn einzigartig ist und somit weitaus aufwändigere post mortem-

Studien erfordert. Ein weiteres Problem ist, dass veränderte Expression eines

Anfälligkeitsgens nicht nur auf eine genetische Variante im kodierenden Gen

zurückgehen kann, sondern auch Veränderungen in anderen Genen beteiligt sein

5 Diskussion

72

können, welche für Proteine kodieren, die am selben Signalweg bzw.

Pathomechanismus beteiligt sind.

Mehrere funktionelle Studien bestätigen die mögliche Bedeutung von NOS1AP

insbesondere für die Krankheitsentstehung von Schizophrenie und analysieren den

Mechanismus, über den sich genetische Polymorphismen auswirken könnten.

In einer post mortem-Studie wurde von signifikant erhöhter mRNA-Expression der

NOS1AP-Kurzform im dorsolateralen präfrontalen Kortex bei Patienten mit

Schizophrenie und bipolar-affektiver Störung berichtet. Darüber hinaus fand sich bei

den Varianten der SNPs, die im kanadischen Sample mit Schizophrenie assoziiert

waren, eine höhere Expression der Kurzform von NOS1AP. Für die lange Isoform

zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Interessanterweise war die Expression

der Kurzform-mRNA nicht veränderbar durch antipsychotische Medikation, die

Expression der langen Isoform hingegen schon, zumindest bei der bipolar-affektiven

Störung. Die Überexpression von NOS1AP und die damit verbundene vermehrte

Entkopplung der NOS-I vom NMDAR-Komplex wäre mit der NMDAR-

Hypofunktionshypothese vereinbar (Xu et al. 2005).

In einer weiterführenden Studie wurden bildgebende Untersuchungen an gesunden

Probanden, die entsprechend der DNA-Sequenz in einem NOS1AP-SNP unterteilt

wurden, durchgeführt. Dabei zeigten gesunde Träger des Risikoallels für Schizophrenie

eine stärkere Aktivierung des DLPFC während der Bearbeitung von Aufgaben, die das

Arbeitsgedächtnis involvierten. Möglicherweise deutet dies auf eine ineffektive

Informationsverarbeitung bei Trägern des krankheitsassoziierten Allels hin (Callicott et

al. 2007, wiedergegeben in Brzustowicz 2008). Wratten et al. analysierten in einer

weiteren Studie eine Vielzahl an SNPs und evaluierten die drei am stärksten assoziierten

SNPs, die miteinander in nahezu vollständigem Kopplungsungleichgewicht standen,

hinsichtlich ihrer Funktion. Dabei war ein SNP (rs12742393) mit einer erhöhten

Expression von NOS1AP im DLPFC und in neuronalen Zelllinien assoziiert, vermutlich

vermittelt durch eine erhöhte Bindungsaffinität von Transkriptionsfaktoren. Dieser

spezielle SNP wurde bisher noch nicht in anderen Studien untersucht.

Erstaunlicherweise führten die beiden anderen SNPs trotz des hohen

Kopplungsungleichgewichts nicht zu einer veränderten Genexpression (Wratten et al.

5 Diskussion

73

2009). Hinweise auf die Bedeutung einer solchen Überexpression liefert eine aktuelle

Studie, die darstellen konnte, dass eine erhöhte Expression von NOS1AP zu einer

reduzierten Anzahl und Verzweigung von Dendriten in kultivierten hippokampalen

Neuronen führt. Während der langen Isoform hierbei vermutlich eine langfristige

Bedeutung für Bildung, Wachstum und Erhalt der Dendriten zukommt, hat die kurze

Isoform wahrscheinlich eher eine regulative Funktion bezüglich der

Dendritenverzweigungen. Diese Entdeckung steht mit der Beobachtung verminderter

dendritischer Ausbreitung bei Schizophrenie in Einklang (Carrel et al. 2009). Ein

mögliches Modell wäre also eine Beeinflussung der dendritischen Verzweigungen

durch NOS1AP während der neuronalen Entwicklung.

5.7 Neue Studienansätze

Möglicherweise sind die klassischen, symptombasierten Krankheitsphänotypen zu

komplex und heterogen und die Diagnose nach standardisierten Methoden in binärer

Form, also betroffen vs. nicht-betroffen, zu simpel und mit zu großem

Informationsverlust verbunden, um Kandidatengene zu identifizieren. Bei komplexen

Krankheiten stellen Phänotypen die Zusammenfassung verschiedener Merkmale dar, die

wiederum die Effekte multipler kausaler und modifizierender Faktoren sind. Studien,

die mit sogenannten Endophänotypen arbeiten, versuchen, diesem Problem zu

begegnen.

Zu Grunde liegt die Annahme, dass die Dysfunktion in einem bestimmten neuronalen

System weniger komplex ist als der Krankheitsphänotyp insgesamt. Endophänotypen

stehen also unmittelbarer mit den genetisch basierten neurobiologischen Defiziten

(Genexpression, Störung neuronaler Kreisläufe) in Verbindung als die Krankheit selber,

da diese dem Einfluss vieler Kandidatengene und Dysfunktionen in verschiedenen

neuronalen Systemen unterliegt (Braff et al. 2008; Cannon und Keller 2006). Da

bestimmte Endophänotypen in mehreren Krankheiten vorkommen können, ist es

außerdem möglich, pleiotrope Gene mit Auswirkungen auf mehrere Störungen zu

identifizieren (Cannon und Keller 2006). Endophänotypen müssen gewisse Kriterien

erfüllen: das Merkmal muss in der Population kausal mit der Krankheit assoziiert und

nicht Folge einer Therapie sein, es muss erblich sein, darf nicht vom aktuellen

5 Diskussion

74

Krankheitszustand abhängig sein, muss in Familien mit der Krankheit kosegregieren

und bei nicht-betroffenen Familienmitgliedern häufiger vorkommen als in der übrigen

Bevölkerung (Kennedy et al. 2003; Naqvi 2008; Petronis 2004).

Als Endophänotyen für Schizophrenie eignen sich spezifische bildgebende sowie

neurophysiologische, -kognitive oder -chemische Merkmale, die zuverlässig und

objektiv messbar sind (Cannon und Keller 2006). Potentielle Kandidaten sind unter

anderem neurophysiologische Parameter wie zentral inhibitorische Defizite, z. B.

Abnormalitäten der Okulomotorik. Auf neurokognitiver Ebene kommen

Einschränkungen der Aufmerksamkeit und Vigilanz sowie des deklarativen und verbal

episodischen Gedächtnisses in Frage. Im Bereich der neuronalen Bildgebung sind

Abnormalitäten in polaren und dorsolateralen präfrontalen Regionen sowie die

Reduktion von temporalem kortikalen und hippokampalen Volumen interessante

Parameter (Braff et al. 2008; Cannon und Keller 2006; Naqvi 2008).

Einer der ersten Erfolge von Endophänotypenstudien in der Schizophrenieforschung ist

die Identifikation eines SNPs in der Promotorregion des alpha-7-nikotinergen Rezeptors

durch die Analyse der P50-Suppression, welche die Entwicklung spezifischer

Rezeptoragonisten ermöglichte (Braff et al. 2008).

Allerdings bringen Analysen von Endophänotypen auch Probleme mit sich. So muss

unbedingt vermieden werden, dass generell akzeptierte Diagnosekriterien umgangen

werden. Des Weiteren finden sich in vielen Studien unzureichende Beschreibungen der

Endophänotypen, was an ihrer Zuverlässigkeit zweifeln lässt (Chanock et al. 2007).

Ein anderer Forschungsschwerpunkt, der weitere wichtige Erkenntnisse verspricht, ist

die Epigenetik. Mit diesem Begriff bezeichnet man Veränderungen der Genexpression,

die nicht in der DNA selbst kodiert sind und dennoch sowohl meiotisch als auch

mitotisch vererbt werden. Drei verschiedene Mechanismen bewirken epigenetische

Regulation von Genen, nämlich DNA-Methylierung, RNA-vermitteltes „Ausschalten“

von Genen und Histonmodifikation (Egger et al. 2004). Sowohl für Schizophrenie als

auch für die bipolar-affektive Erkrankung hat dieser Ansatz viel Beachtung gefunden

(Petronis 2004). Epigenetische Faktoren im Zusammenspiel mit genetischer

Anfälligkeit wären eine Erklärung für einige Merkmale der Krankheiten, die bisher

nicht komplett verstanden sind. So ist die Rolle von Umweltfaktoren, die nicht immer

5 Diskussion

75

phänotypische Unterschiede erklären können, umstritten, da sogar in isogenen

Modellpopulationen trotz gleicher genetischer und äußerer Bedingungen eine

phänotypische Variation persistieren kann (Cho et al. 2004). Außerdem ist unklar,

warum sich das Krankheitsrisiko eines genetisch belasteten, adoptierten Kindes in

seiner neuen, „gesunden“ Umgebung nicht verringert (Petronis 2004). Möglicherweise

beruht auch die Diskordanz monozygoter Zwillinge, welche gleiches Erbmaterial

aufweisen und ähnlichen Umgebungsfaktoren ausgesetzt sind, auf epigenetischen

Mechanismen (Petronis 2003). Altersabhängige epigenetische Veränderungen wären

eine Erklärung für das späte Ersterkrankungsalter und die epigenetische Dynamik

könnte klinische Veränderungen wie Remission und Rückfälle begründen (Petronis

2003). Inzwischen gibt es Hinweise, dass epigenetische Mechanismen auf die

Genexpression Einfluss nehmen und andauernde Veränderungen der Gehirnfunktion

bewirken können (Tsankova et al. 2007). Besonders die Aktivität der Transkription ist

von einer Interaktion der Transkriptionsfaktoren mit dem Chromatin abhängig und kann

durch epigenetische Faktoren, wie Methylierung der Bindestellen oder

Histonmodifikation, beeinflusst werden (Petronis 2003; Tsankova et al. 2007).

Eine Hypothese zur Schizophrenie ist eine epigenetische Fehlfunktion, die zu

Hypermethylierung und konsekutiver verminderter Genexpression in GABAergen

Neuronen führt. Dies würde das Zusammenspiel mit anderen neuronalen Schaltkreisen

behindern (Tsankova et al. 2007).

Auch für einige andere Krankheiten, z. B. in der Krebsentstehung, sind epigenetische

Prozesse von Bedeutung. Dementsprechend wird viel Hoffnung in die Entwicklung und

Etablierung von Medikamenten gelegt, die epigenetische Faktoren beeinflussen. Durch

Inhibitoren der DNA-Methylierung ist es möglich, Gene, die durch epigenetische

Einflüsse ausgeschaltet sind, wieder zu induzieren. Auch HDACs (histone

deacetylases), die Histone deacetylieren und auf diese Weise Gene ausschalten, können

medikamentös inhibiert werden. So ist beispielsweise Valproat, welches bei bipolar-

affektiv Erkrankten als Stimmungsstabilisator eingesetzt wird, ein HDAC-Inhibitor und

kann die Transkription verschiedener Promotoren aktivieren (Göttlicher et al. 2001;

Phiel et al. 2001). Selbstverständlich ist es zunächst unbedingt notwendig, zu wissen,

welche Gene bei Schizophrenie und der bipolar-affektiven Erkrankung epigenetisch

modifiziert werden, bevor man sichere Mittel findet, sie therapeutisch zu beeinflussen.

5 Diskussion

76

5.8 Sozioökonomische Folgen und Ausblick

Schizophrenie und die bipolar affektive Erkrankung sind schwere mentale

Erkrankungen, die bei Menschen zwischen 15 und 44 Jahren weltweit der acht- bzw.

neunthäufigste Grund für behinderungsbedingt beeinträchtigte Lebensjahre sind. Sie

führen zu einer Reduktion der Lebenserwartung und gehen mit einer erhöhten

Suizidrate einher (World Health Organization 2001). Beide Erkrankungen führen zu

einer Stigmatisierung und stellen neben dem persönlichen Schicksal des Betroffenen

auch eine hohe sozioökonomische Bürde dar. In westlichen Ländern machen die

direkten, also mit Diagnose, Therapie und Rehabilitation verbundenen Kosten für

Schizophrenie mit 1,3-2,5% der gesamten Gesundheitsausgaben den größten Anteil an

direkten Kosten für eine mentale Störung aus. Dazu kommen hohe indirekte Kosten

durch Verlust an Produktivität des einzelnen Betroffenen bedingt durch Behinderung

und vorzeitigen Tod (Rössler et al. 2005; Serretti et al. 2009). Die totalen Kosten für die

bipolar-affektive Erkrankung werden in den USA auf 45 Mrd. $ pro Jahr (Zahlen für

1991) geschätzt (Wyatt und Henter 1995).

Trotz der großen Belastung des Einzelnen und der gesamten Gesellschaft durch

endogene Psychosen sind die Behandlungsmöglichkeiten teilweise eingeschränkt und

bei einigen Patienten unzureichend. So liegt die allgemeine Rezidivrate Schizophrenie-

Kranker im ersten Jahr nach Erstmanifestation trotz Behandlung bei ca. 40% (Müller

2004). Auch unter der Therapie mit Clozapin tritt eine Besserung der Symptome nur bei

30 - 60% der Betroffenen ein (Arranz et al. 2000). In Langzeitstudien zur bipolar-

affektiven Erkrankung haben weniger als 50% der Patienten einen guten

Behandlungserfolg gezeigt (Kleinman et al. 2003). Auch unter Dauertherapie mit

Lithium liegt das Rezidivrisiko bei ca. 40% (Geddes et al. 2004).

In einer jüngeren Studie über die Effektivität atypischer Neuroleptika und eines

klassischen Neuroleptikums brachen ca. 70% der Probanden die Studie vorzeitig ab

(Lieberman et al. 2005). Auch in einer älteren Metaanalyse lag die durchschnittliche

Compliance-Rate bei antipsychotischer Medikation nur bei 58% (Wahlbeck et al. 2001).

Dies betont die Notwendigkeit, das Ansprechen der Therapie und das Auftreten von

Nebenwirkungen besser vorhersagen zu können, was das Ziel der Forschung nach

spezifischen, auf genetischen Informationen basierenden Therapien ist (Nnadi und

5 Diskussion

77

Malhotra 2007). Die Entdeckung, dass Patienten individuelle Reaktionen auf

medikamentöse Behandlungen zeigen, ist die Grundlage der Pharmakogenetik.

Diesbezüglich gibt es verschiedene Kandidatengene, die zum einen auf dem

pharmakodynamischen und zum anderen auf dem pharmakokinetischen Ansatz

basieren. Bei ersterem stehen hauptsächlich Medikamentenrezeptoren und deren

nachgeschaltete Signalsysteme im Mittelpunkt, während letzterer vor allem

metabolisierende Enzyme oder Proteine der Blut-Hirn-Schranke betrachtet (Nnadi und

Malhotra 2007). Bisher wurden besonders Rezeptoren des dopaminergen und

serotonergen Systems, zu denen Clozapin eine hohe Affinität hat, und das Cytochrom-

Enzym CYP2D6 untersucht (Malhotra et al. 2004; Reynolds 2007). Nicht nur das

Ansprechen auf Medikamente ist individuell, auch das Auftreten von Nebenwirkungen

wird wahrscheinlich von genetischen Mechanismen beeinflusst. Zu den

Nebenwirkungen von Antipsychotika und Antidepressiva zählen Hyperprolaktinämie,

extrapyramidalmotorische Symptome und anticholinerge Effekte bzw. Sedierung und

Gewichtszunahme (Malhotra et al. 2004; Nnadi und Malhotra 2007; Reynolds 2007).

Ziel der Forschung ist es, vorhersagen zu können, welcher Patient unter solchen,

teilweise schweren Nebenwirkungen leiden wird und die Medikation dementsprechend

anzupassen (Malhotra et al. 2004). So wird es zukünftig z. B. einen Test geben, der das

Risiko von Clozapin-induzierter Agranulozytose durch den Nachweis des genetischen

Markers HLA-DQB1 einschätzt (Nnadi und Malhotra 2007).

Aufgrund des moderaten Effekts einzelner Gene auf die Medikamentenantwort sind

genomweite Assoziationsstudien, in denen viele Gene bzw. SNPs untersucht werden,

notwendig (Nnadi und Malhotra 2007). Die Replikation der Ergebnisse ist hier

wiederum der entscheidende Faktor, um in Zukunft spezifischere Therapien entwickeln

zu können (Malhotra et al. 2004).

6 Zusammenfassung

78

6 Zusammenfassung

Schizophrenie und die bipolar-affektive Erkrankung sind mit einer Lebenszeitprävalenz

von ca. 1% häufige psychiatrische Krankheitsbilder. Die genaue Ätiologie beider

Krankheiten ist bisher noch nicht eindeutig geklärt, allerdings ist aus Familien-,

Zwillings- und Adoptionsstudien bekannt, dass die genetische Komponente mit einer

Heritabilität von jeweils ca. 80% die entscheidende Rolle spielt. Generell nimmt man

für beide Krankheiten eine multifaktorielle Genese an, bei der eine genetische

Anfälligkeit im Zusammenspiel mit Umweltfaktoren zur Krankheitsentstehung führt.

Es bestehen für beide Krankheiten diverse pathophysiologische Modelle, besonders

interessant ist dabei eine Dysregulation der Neurotransmitter. Neben Dopamin und

GABA steht auch Glutamat, der häufigste exzitatorische Neurotransmitter im ZNS, im

Verdacht, eine entscheidende Rolle bei der Entstehung der Schizophrenie zu spielen.

Bei der bipolar-affektiven Erkrankung stehen besonders Veränderungen der

monoaminergen Neurotransmission im Vordergrund. Eine Beteiligung des

Glutamatsystems ist hier zwar weniger gut belegt, jedoch auch vorstellbar.

Inzwischen sind sowohl für Schizophrenie als auch für die bipolar-affektive Erkrankung

verschiedene Kandidatengene gefunden worden, die möglicherweise an der

Krankheitsentstehung beteiligt sind. In dieser Arbeit wurde das Kandidatengen

NOS1AP untersucht. NOS1AP interagiert mit der NOS-I und führt zu einer

Translokation dieses Enzyms ins Zytosol, wodurch es dem Calciumeinstrom durch den

NMDAR entzogen wird. Auf diese Weise ist es zu einem geringeren Grad aktiv und

produziert weniger NO. NOS1AP ist also ein negativer Regulator der NOS-I. Diese

funktionelle Verbindung mit dem NMDAR und der NOS-I, die beide im Verdacht

stehen, an der Pathogenese der Schizophrenie beteiligt zu sein, machen NOS1AP zu

einem interessanten Kandidatengen. Bestärkt wird dies durch positive

Kopplungsbefunde für den Genlocus 1q22, auf dem das Gen für NOS1AP liegt. Auch in

Assoziationsstudien konnte allelische und haplotypische Assoziation mit Schizophrenie

innerhalb des NOS1AP-Gens nachgewiesen werden. Nicht zuletzt stammen auch aus

funktionellen Studien Hinweise, die eine mögliche pathogenetische Bedeutung von

NOS1AP untermauern. Bisher wurden keine Assoziationsstudien bezüglich NOS1AP

bei Patienten mit bipolar-affektiver Erkrankung durchgeführt, allerdings wies eine

6 Zusammenfassung

79

funktionelle Studie auf eine erhöhte Expression von NOS1AP bei betroffenen Patienten

hin.

In der vorliegenden Arbeit wurden 14 SNPs im Bereich des NOS1AP-Gens und daraus

resultierende Haplotypen in einem unterfränkischen Fall-Kontroll-Sample untersucht.

Dabei konnte für rs1538018, rs945713 und rs4306106 jeweils eine nominelle

Assoziation mit Schizophrenie festgestellt werden. Auch nach Durchführung eines

Permutationstestes blieb für rs1538018 und rs945713 mit p-Werten von 0,0924 bzw.

0,0788 ein statistischer Trend bestehen. Bei Betrachtung der Haplotypen ließ sich

lediglich eine nominelle Assoziation des Haplotyps CTAGC (SNP 3–7) mit

Schizophrenie nachweisen. Die geschlechtsspezifische Analyse ergab für die

männlichen Patienten im Permutationstest eine grenzwertig signifikante Assoziation

von rs1538018 und rs945713 mit p-Werten von 0,0706 bzw. 0,0588, während die

Haplotypen TCGAT bzw. CTAGC aus Block 1 nur eine nominelle Assoziation zeigten.

Bei den weiblichen Patienten ließ sich weder eine allelische noch eine haplotypische

Assoziation nachweisen. Für die bipolar-affektive Erkrankung wurden keine

Assoziationen, weder auf Einzelmarker- noch auf Haplotyp-Ebene festgestellt, eine

Erklärung dafür ist die möglicherweise unzureichende Größe des Samples.

Die grenzwertige Assoziation der SNPs mit Schizophrenie macht eine pathogenetische

Beteiligung von NOS1AP an Schizophrenie denkbar. Beim Vergleich der vorliegenden

Ergebnisse mit anderen Studien zeigen sich Überlappungen hinsichtlich der assoziierten

SNPs. Manche Untersuchungen lieferten jedoch auch negative Befunde. Gründe dafür

können die differierenden genetischen Hintergründe der Probanden sein, andererseits

auch die phänotypische Heterogenität der Schizophrenie. Im Allgemeinen sind

Assoziationsstudien mit Fall-Kontroll-Samples zwar geeignet, um Gene mit geringem

Effekt aufzudecken, allerdings sind sie auch sehr anfällig für Populationsstratifikation,

welche man auch bei der vorliegenden Studie nicht ausschließen kann. Dennoch sind

Replikationsstudien von positiven Assoziationsbefunden notwendig, um besser

einschätzen zu können, welchen Einfluss das einzelne untersuchte Gen tatsächlich für

die Krankheitsentstehung hat.

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8 Abbildungsverzeichnis

91

8 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1.1: Schematische Darstellung des NMDA-Rezeptors (Albensi 2007)............ 12

Abb. 1.2: Genomische Konfiguration der langen (oben) bzw. kurzen Isoform (unten)

von NOS1AP. Darstellung der Exons durch nummerierte Balken (nach Xu

et al. 2005) ................................................................................................. 26

Abb. 1.3: Interaktion der NOS-I mit NOS1AP und weiteren Adaptorproteinen (nach

Nedvetsky et al. 2002) ............................................................................... 27

Abb. 3.1: Schematische Darstellung eines MALDI-ToF Massenspektrometers (Sauer

2007) .......................................................................................................... 44

Abb. 4.1: LD Struktur Schizophrenie Gesamtstichprobe (D’) .................................. 46

Abb. 4.2: LD Struktur bipolar-affektive Störung Gesamtstichprobe (D’) ................ 48

Abb. 5.1: Assoziation der untersuchten SNPs (rot) und SNPs anderer, ausgewählter

Studien mit Schizophrenie. Umgekehrt logarithmische Auftragung

(signifikant: -log(p;10) > 1,3) .................................................................... 64

Abb. 10.1: LD Struktur Schizophrenie Gesamtstichprobe (D’),vergrößerter Block 1 95

Abb. 10.2: LD Struktur Schizophrenie, Männer (D’).................................................. 95

Abb. 10.3: LD Struktur Schizophrenie, Frauen (D’) ................................................... 96

9 Tabellenverzeichnis

92

9 Tabellenverzeichnis

Tab. 4.1: Schizophrenie Gesamtstichprobe - Einzelmarker...................................... 49

Tab. 4.2: Schizophrenie Gesamtstichprobe - Haplotypen ........................................ 50

Tab. 4.3: Schizophrenie Gesamtstichprobe – Haplotypen (vergrößerter Block 1) ... 51

Tab. 4.4: Schizophrenie Männer - Einzelmarker ...................................................... 52

Tab. 4.5: Schizophrenie Männer - Haplotypen ......................................................... 54

Tab. 4.6: Schizophrenie Frauen - Einzelmarker ....................................................... 55

Tab. 4.7: Schizophrenie Frauen - Haplotypen .......................................................... 56

Tab. 4.8: Bipolar-affektive Erkrankung Gesamtstichprobe - Einzelmarker ............. 57

Tab. 4.9: Bipolar-affektive Erkrankung Gesamtstichprobe - Haplotypen ................ 59

Tab. 10.1: HWE und MAF Schizophrenie Gesamtstichprobe – Einzelmarker .......... 93

Tab. 10.2: HWE und MAF Schizophrenie Männer - Einzelmarker ........................... 93

Tab. 10.3: HWE und MAF Schizophrenie Frauen - Einzelmarker ............................ 94

Tab. 10.4: HWE und MAF Bipolar-affektive Erkrankung Gesamtstichprobe -

Einzelmarker .............................................................................................. 94

10 Anhang

93

10 Anhang

Hardy-Weinberg-Equilibrium und minore Allelfrequenz der untersuchten SNPs

Tab. 10.1: HWE und MAF Schizophrenie Gesamtstichprobe – Einzelmarker SNP Nr. Marker Hardy-Weinberg-Equilibrium

p-Wert Minore Allelfrequenz

1 rs1572495 0,214 0,096 2 rs1538018 0,4001 0,268 3 rs945713 0,7768 0,41 4 rs1415263 1,0 0,394 5 rs4306106 0,8917 0,214 6 rs3924139 0,9071 0,359 7 rs4145621 0,2199 0,454 9 rs1508263 0,8126 0,452 10 rs3751284 0,4479 0,356 11 rs7521206 0,76 0,343 12 rs905721 0,5477 0,344 13 rs348624 0,0065 0,102 14 rs1964052 1,0 0,124

Tab. 10.2: HWE und MAF Schizophrenie Männer - Einzelmarker SNP Nr. Marker Hardy-Weinberg-Equilibrium



10 Anhang

94

Tab. 10.3: HWE und MAF Schizophrenie Frauen - Einzelmarker SNP Nr. Marker Hardy-Weinberg-Equilibrium



Tab. 10.4: HWE und MAF Bipolar-affektive Erkrankung Gesamtstichprobe - Einzelmarker SNP Nr. Marker Hardy-Weinberg-Equilibrium



10 Anhang

95

Kopplungsungleichgewicht Schizophrenie

Abb. 10.1: LD Struktur Schizophrenie Gesamtstichprobe (D’), vergrößerter Block 1

Abb. 10.2: LD Struktur Schizophrenie, Männer (D’)

10 Anhang

96

Abb. 10.3: LD Struktur Schizophrenie, Frauen (D’)

Danksagung

Ganz besonders möchte ich Herrn Prof. Dr. A. Reif für die Überlassung des Themas

und die sehr gute Betreuung meiner Doktorarbeit danken. Er sorgte stets für ein nettes

Arbeitsklima und hat mir mit seinen Anregungen bei der Verfassung dieser Arbeit sehr

geholfen.

Herrn Prof. Dr. J. Deckert danke ich für die Möglichkeit, diese Promotionsarbeit in

seiner Klinik durchführen zu können.

Herrn Priv.-Doz. Dr. C. Kleinschnitz danke ich für die Übernahme des Korreferates.

Ich bedanke mich bei Frau Prof. Dr. C. Freitag für die Erstellung der Statistik.

Mein herzlicher Dank gilt außerdem Frau T. Töpner, die den experimentellen Teil

meiner Arbeit sehr gut betreute und mir im Labor jederzeit mit Rat und Tat zur Seite

stand.

Von ganzem Herzen danke ich meinen Eltern, die mich immer unterstützt und gefördert

haben. Mein größter Dank gilt Matthias für seine unermüdlichen Aufmunterungen und

seinen Rückhalt bei der Verfassung dieser Arbeit und weit darüber hinaus.

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name: Alexandra Kramer

Geburtstag: 04.01.1983

Geburtsort: Göttingen

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Schulbildung

08/1989 – 07/1993 Albani-Grundschule Göttingen

08/1993 – 07/1995 OS Lutherschule Göttingen

08/1995 – 06/2002 Theodor-Heuss-Gymnasium Göttingen

Abschluss: Abitur

Studium

10/2002 – 06/2009 Humanmedizin, Julius-Maximilians-Universität Würzburg

09/2004 1. Teil der ärztlichen Prüfung/Physikum

07/2009 2. Teil der ärztlichen Prüfung

Beruf

Seit 11/2009 Assistenzärztin Pädiatrie, Hannoversche Kinderheilanstalt:

Kinderkrankenhaus auf der Bult, Hannover bzw.

Klinikum Neustadt am Rübenberge

Documents

NOS1AP als Kandidatengen für endogene Psychosen · Aus der Klinik und Poliklinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie der Universität Würzburg Direktor: Prof. Dr