Embed Size (px)
Citation preview
custombiotech.roche.com
Japan Phone +81 3 6634 1046Fax +81 3 5479 [email protected]
Asia Pacific Phone +65 6371 6638Fax +65 6371 6601 [email protected]
Please contact your local CustomBiotech representative
Europe, Middle East, Africa, Latin AmericaPhone +49 621 759 8580Fax +49 621 759 [email protected]
United States Phone +1 800 428 5433, ext. 14649 (toll-free)Fax +1 317 521 4065 [email protected] Canada Phone +1 450 686 7050Fax +1 450 686 7012 [email protected]
Published byRoche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße 11668305 MannheimGermany
© 2018 Mycoplasma Biosafety Services GmbH, Roche Diagnostics GmbH
All rights reserved.
Regulatory Disclaimer For further processing only.
Mycoplasma Biosafety Services GmbHBioTech Center MuthgasseMuthgasse 11/21190 ViennaAustria
Phone +43 136 720 450Fax +43 136 720 453 [email protected]
mycoplasma.cc
Contact address from Mycoplasma Biosafety Service
Sebastian Machado Weber, Dr. Andreas Rohwer, Alexander Bartes, Christina Krause, Raphael GreinerRoche CustomBiotechDr. Carl-Ulrich Zimmermann, Dr. Martina Sauert, Martin Vronka, Dr. Sandra Buczolits, Prof. Dr. Renate RosengartenMycoplasma Biosafety Services GmbH
技术报告
前言生物制药的支原体检测：当前的监管、挑战和趋势
从传统培养到基于 NAT 的自动化高通量检测的转变
生物制药产品（也被称为生物制品或大分子药物）的
支原体污染是由生产过程中的细胞培养污染引起的，
会给患者带来潜在的健康风险。支原体几乎能够影响
细胞培养的每一个参数，并且通常仅产生微小的可见
变化，对于制药产业来说，它们是一种无法掌控的、
可造成潜在损害的因素。因此，监管部门要求制造商
检测自己生产的生物制品，确保被放行出厂的产品中
都不含支原体。全球大多数药物监管部门都发布了提
供支原体检测方案的相关指南，有些还对快速NAT（核
酸扩增技术）检测方法的验证提出了一些建议。但这
些有关快速支原体检测的建议并不一致，导致这类检
测对于药企而言成为一项挑战。
2018 年 1 月
custombiotech.roche.com
仅用于进一步加工处理使用。
不可直接用于体外诊断程序。
MYCOTOOL是属于罗氏的商标。
上海市自由贸易试验区希雅路330号7号厂房第二层Ⅰ部位电话 021-3397 1000传真 021-3397 1888邮编 200131邮箱 [email protected]
PR
OM
A ID
: 003
062
有效
期至
：20
19年
8月31
日
工业原料部门
技术报告2 | | 3
前言
Roche CustomBiotech MycoTOOL 支原体实时 PCR 分析试剂盒（MycoTOOL qPCR – http://go.roche.com/mycotool）联合手动抽提试
剂盒 QC Sample Preparation Kit，或 Roche MagNA Pure 96/ MagNA Pure 24 样本制备系统可进行高效的生物制品支原体检测。这
种基于 NAT 的方法具有可自动化和速度快的优点，本文的目的在于为 NAT 快速支原体检测方法的验证和实施提供指导和建议。
1. 对支原体进行简单地介绍。此外，还讨论了生物制品生产
中和支原体污染相关的过程。
2. 对当前用于支原体检测的药典方法和非药典方法进行了介
绍和举例描述。其中，对药典规定的培养法和指示细胞培
养法，以及基于 NAT 的快速检测法进行了详细的介绍。
3. 讨论了在支原体快速检测法的应用过程中需要考虑的监管
方面的问题。并讨论了欧洲药典（EP 2.6.7.）1、美国药典（USP
<63>）2 和日本药典（JP 第 17 版）3 等监管指南。
4. 针对特定产品的 NAT 快速检测方案验证和项目的方案设计
进行说明，并为每个步骤提供了相关建议。这一章的内容
涉及到一套完整流程的各个相关步骤，从供应商调查，到
开展可行性和验证研究，再到日常检测的实施都被纳入其
中。
5. 最后一章的总结与概述描述了基于 NAT 的快速支原体检测
法的长期应用前景。并讨论了将这种快速方法应用在早期
报警系统和批放行检测中的竞争优势，以及这些替代检测
系统能够为生物制药产业带来的新机遇和受益。
借助罗氏诊断和罗氏制药的专业技术，CustomBiotech
为您的生物制药、细胞治疗或体外诊断业务提供高质
量的原料、仪器和服务，全面满足您独特的质量和管
理需求。
了解更多信息：
(http://go.roche.com/custombiotech)
Mycoplasma Biosafety 是一家合约研究机构和服务提供
商，专业致力于为生物制药产品开发满足 GMP 规定
的支原体检测方法，同时也是行业内支原体学科的技
术引领者。
借助于传统的培养方法和新型的快速 PCR 分析法，
Mycoplasma Biosafety 能够提供全面的支原体检测服
务——支原体检测与检测方法验证开发，生产支原体
培养基以及参考标准品。
了解更多信息
(http://go.roche.com/mbs)
章节概览 关于我们
技术报告
技术报告2 | | 3
目录
引言������������������������������ 4
细胞培养中的支原体����������������������� 5
生物药品生产过程中的支原体������������������� 6
支原体检测方法概述����������������������� 8
非药典检测法�������������������������� 8
药典检测法��������������������������� 9
基于 NAT 的方法 ����������������������� 13
监管概述��������������������������� 17
罗氏 MycoTOOL qPCR 检测方案的逐步验证和实施 ��������� 19
总结与概述�������������������������� 22
附录����������������������������� 23
术语表���������������������������� 24
参考文献��������������������������� 26
目录
技术报告
技术报告4 | | 5
0.1 μm 1 μm 10 μm 100 μm
引言
“支原体”通常被用作柔膜细菌类中所有细菌的惯用名（在古
英语中，mollis =“软”, cutis =“皮肤”）（图 1）。柔膜细菌
的特点是没有细胞壁，基因组规模小（0.5–2.2 兆碱基对），且
GC（鸟嘌呤 - 胞嘧啶）含量低（20–40 mol%）。由于基因组较小，
支原体具有宿主依赖性，需要在人类及其他脊椎动物、植物和
昆虫等多种宿主的体内或体表作为共生物或病原体存活。这种
微生物在有氧或缺氧条件下都可以增殖。它们都具有多晶细胞
形态学 ( 螺原体除外，这种支原体属具有螺旋式结构 )，还有些
支原体（Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae）
有突出的终端，形状类似于烧瓶。
由于基因组较小，所以支原体完全缺乏或部分缺乏几种常见
的代谢途径，必须从环境中获取必要的营养物（氨基酸、核
苷碱基和脂肪酸），以寄生方式生存 7。
柔膜细菌
枝原体目
支原体科 甾原体科 螺原体科 虫原体科 厌氧原体科
虫原体属支原体属 * 脲原体属 * 甾原体属 * 螺原体属 中间原体属 厌氧原体属无甾醇原体属
甾原体 虫原体目 厌氧原体目
引言
纲
目
科
属
根 据 种 类 的 不 同， 支 原 体 可 以 在 液 体 培 养 基 中 以 单 细 胞
（Mycoplasma arthritidis） 或 聚 合 物（Acholeplasma laidlawii,
Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma fermentans）的形式生长 4。
由于没有细胞壁，所以支原体对青霉素等以细胞壁作为靶点的抗
生素具有抵抗性。此外，液体培养基中的支原体还可以在固体表
面形成生物膜，比如玻璃或塑料表面等，由此产生另一种抵抗
水平，也就是对消毒剂和环境应力条件的抵抗 5。第一种支原体
于 1896 年在 Institute Pasteur 培养成功，它是从患有胸膜肺炎的
牛体内分离出来的，后来被称为丝状支原体丝状亚种 / 小菌落型
（Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC）6。
图 1：柔膜细菌类。用紫框标注的微生物属与生物制药产品的生产过程具有相关性。
* 该属含有普遍存在于人类中的支原体。来源：Authors，2017。
长期以来，支原体的病原体特性一直被人们低估。出于这个原
因，也没有开发出适用的分子诊断方法。不过近年来的情况发
生了很大的改变，支原体培养技术和分子检测技术的进展快速，
并得到了越来越广泛的接受和应用 8。
技术报告4 | | 5
0.1 μm 1 μm 10 μm 100 μm
引言
除了在临床检测中的意义获得不断提高，支原体对细胞培养的
影响也已经得到了极大的关注。它们天然寄存于植物和动物的
组织里，而各种细胞培养基都含有来源于植物或动物的补充剂。
同时支原体的体积很小，平均只有 0.1–0.8 μm（图 2），由于
没有细胞壁且形状可变，所以支原体很容易通过标准灭菌过滤
器，和培养基或原料添加剂一起进入细胞培养过程。
最常见的两个污染源是实验室人员和已经受到污染的细胞培养
物，这些污染物通过交叉污染作用在生产过程中继续传递 9。
由于支原体在标准光学显微镜设置下是不可见的，而且通常不
会使细胞培养物的状态发生明显变化，所以一般很难观察到污
染的发生。然而，它们的存在却会影响细胞的生长和代谢，进
而对宿主细胞表达的治疗性蛋白产生影响。
生物药
生物制药产品（也被称为生物制品）是生产和提取自细菌、
酵母、哺乳动物细胞系或哺乳动物等生物来源的医药产
品。疫苗、血液成分、重组蛋白、基因治疗、组织以及
用于治疗的细胞都属于这个类别。它们含有核酸、蛋白、
糖以及由这些物质构成的复合物，与人体内天然存在的
分子完全相同或者具有相似性。与化学合成药物（通常
指的是小分子）不同，生物制品的分子量要大得多，通
常是小分子药物的 100 倍以上。用哺乳动物细胞系进行
生物制药生产通常使用基因工程技术开发出表达生物大
分子的真核细胞系（如 CHO 或 HEK293），然后进行收获、
纯化和制剂。如图 3 所示。
由于生产流程十分复杂，所以生物制药产品的生产和产
品放行都面临着独特的挑战。首先，细胞系可能会被支
原体污染，因此批放行之前需要先进行支原体检测。其次，
由于生物制品采用过滤法除菌，所以存在支原体或病毒
穿过滤膜的潜在风险。第三，污染物可能会通过原料进
入细胞培养物。正因为如此，支原体检测尤其是早期报
警系统（也称为过程控制）是十分必要的质量控制技术，
以期尽快尽早地发现污染物。
细胞培养中的支原体
图2：不同微生物的相对大
小。 来 源：Authors, 2017.
作者通过这张图进行了应
用展示，该应用已经被纳
入知识共享协议 CC BY 3.0
（http://creativecommons.
org/licenses/by/3.0/）， 即
使包含相关链接的文献可
能拥有某些权利，也能在
协议许可的范围内使用。
病毒(0.05-0.1 μm)
支原体细胞(0.1-0.8 μm)
酵母细胞(3-10 μm)
真核细胞(10-100 μm)
光学显微镜
肉眼
电子显微镜
细菌细胞(1-10 μm)
技术报告6 | | 7
Acholeplasma laidlawii
Mycoplasma arginini
Mycoplasma bovis
Mycoplasma fermentans
Mycoplasma gallisepticum
Mycoplasma hyorhinis
Mycoplasma orale
Mycoplasma salivarium
Mycoplasma synoviae
Spiroplasma citri
尽管理解支原体污染可能造成的生产损失和质量影响、尽管
明白支原体污染的检测是十分必要的过程质控环节，但在实
际生产过程中仍然少有公司对细胞培养物进行监测。研究发
现，在全球范围内的可用细胞系中，其污染率大约是 5–35%10, 11, 12。对于防止细胞培养物被支原体污染的目标而言，只有定
期检测支原体才是最具有实践性和防范作用的手段。
在生产流程中，只有严格的常规性支原体检测才能预防隐蔽
的支原体污染，将它们造成严重后果的风险降到最低 13。由于
相关的检测方法以及对检测结果的解释都需要通过培训和不
断地积累经验才能掌握，所以支原体检测通常无法在生产商
内部有效进行。将支原体的检测工作托付给经验丰富、值得
信任的合同合作伙伴具有很多优势。首先，这种做法可以在
尽可能短的时间内取得有效的检测结果。其次，不需要建立
和维持内部检测部门，从而将更多的资源应用在核心业务上。
最后一个极为重要的优势在于，可以避免因为引入阳性对照
品而导致支原体污染的潜在风险。
生物药品生产过程中的支原体
在生物制药行业，支原体污染产生的影响几乎具有毁灭性，
例如整批产物都必须丢弃，生产车间也必须停产整顿 14。国际
监管机构发布的指南已经阐明，为了确保产品的安全性、纯
度和产品效力，生物制药产品中不能存在支原体污染。因此，
为了确保整个生产流程的平稳，必须尽早实施支原体检测。
图 3 显示的是常见的检测点。人们根据这些不同的检测点开
发了多种支原体检测方法，后文将对它们进行讨论。
细胞治疗
前沿治疗性药物（Advanced therapy medicinal products ,
ATMP）是一类以基因（基因治疗）、体细胞（细胞治疗）
或组织（组织工程）为基础的新型治疗药物。这些前
沿药物为多种疾病提供了新的治疗方法，它们将为患
者带来巨大的福音。细胞治疗通常需要从患者身上分
离细胞，然后进行体外细胞培养，再将细胞注入患者
体内。
与大分子生物制品相比，细胞治疗产品的生产和放行
还面临着其他挑战。首先，其中大部分药物根本无法
灭菌。其次，细胞治疗药物的有效期通常很短，需要
立即注入患者体内。第三，这种药物的批产量通常只
有一倍剂量率，量非常少。在这种情况下，支原体快
速检测法比常规支原体检测法更受欢迎，因为前者所
需的检测样品量相对较少，且对生产批次的放行速度
快于常规支原体检测法。
引言
技术报告6 | | 7
Acholeplasma laidlawii
Mycoplasma arginini
Mycoplasma bovis
Mycoplasma fermentans
Mycoplasma gallisepticum
Mycoplasma hyorhinis
Mycoplasma orale
Mycoplasma salivarium
Mycoplasma synoviae
Spiroplasma citri
在细胞培养或生物制药生产的过程中，经常或可能会出现、
并且被视为主要污染种属的支原体如表 1 所示。对于生产过
程来说，支原体污染产生的影响不仅会导致产品质量下降，
主要来源（与使用以下来源
的原料生产出来的产品相关）Mycoplasma species
已发表报告提到的常见
细胞培养污染物 潜在污染源
原材料
行业要求 必要检测点 推荐的生产过程控制点
监管部门要求
缓冲液制备 细胞培养液 种子培养 发酵 + 澄清 收获 纯化 制剂
引言
图 3：生物制药生产过程中的支原体污染检测点。原料的污染物检测结束之后（灰色圈），加入缓冲液或培养基开始进行细胞培养，此时也需要进
行污染检测（蓝色圈），因为支原体可能会通过细胞系或实验室人员进入生产流程。建议在种子培养和实际发酵过程中开展生产过程控制（淡紫色圈）。
发酵结束时还要进行最后一次检测，这也是监管部门要求开展检测的一个时间点（紫色圈）。在证实了收获液中不含支原体以后，由于产品的纯化
处理是在不含活性微生物的条件下进行的，所以通常不需要再实施检测。来源：Roche CustomBiotech, 2017.
表 1：在细胞培养和生物制药过程中经常、偶尔或可能会检测到的支原体种类。
还会降低表达水平并由此降低产量。质量不佳和支原体污染的
生物制品可能致使患者产生严重的副作用 15, 16。
牛、猪、禽类、植物 是 其他细胞系，牛血清，营养肉汤粉末
牛，绵羊，山羊，猪 是 其他细胞系，牛血清
牛 是 其他细胞系，牛血清
人 是 其他细胞系，人
禽类 否 其他细胞系，鸡胚
猪 是 其他细胞系，猪胰蛋白酶
人 是 其他细胞系，人
人 是 其他细胞系，人
禽类 否 其他细胞系，鸡胚
植物 否 其他细胞系
技术报告8 | | 9
支原体检测方法概述
支原体的检测对于细胞培养过程和生物制药的质量控制而言
是一项挑战，因为只有具备专业技能和丰富经验的工作人员
才能发现它们，尤其是低水平的污染更是如此。在最近十年里，
有两种经典的方法被用于常规支原体检测，它们的灵敏度和
可靠性已经获得了证实：（i）培养法（也被称为琼脂肉汤法），（ii）
指示细胞培养法。有些基于酶或免疫学的非药典分析法具有
速度快和容易实施的优点，但它们的灵敏度都不如培养法。
因此，药典专论认为这些检测方法不能替代常规检测。在过
去几年里，对速度快、灵敏度高且稳健性高的支原体检测法
的需求迫切性日益增加，因为经典培养法的所需时间过长，
非药典检测法
用于检测支原体的非药典方法通常灵敏度较低，无法在监管
要求的支原体污染水平下限进行检测。如果支原体污染的水
平较低，检测的结果有时候还会难以解释。这些检测较易产
生假阴性结果。
直接 DNA 染色
用 DNA（脱氧核糖核酸）特异性荧光染料对细胞培养物直接
染色并进行观察，但不建议将该方法用于检测支原体污染。
这种检测方法能可靠地检测重度污染培养物，但该方法很难
判定被支原体轻度污染的培养物，因为细胞培养物的 DNA 也
可能会产生荧光小点，与支原体具有相似性 17。
基于酶的检测方法
基于酶的分析方法是一种具有选择性的生化检测，其检测原
理在于利用了支原体酶的活性。将这种方法用于常规支原体
检测的前提条件是被检测的酶仅在各种支原体中广泛存在
可能会耽搁产品的放行，并由此产生高昂的费用。EP 指南指出，
如果 NAT 检测方案的灵敏度能达到与经典培养法相同的水平，
并且具有良好的稳健性和特异性，则可以用 NAT 作为支原体
检测方案替代经典培养法。
本章对用于支原体检测的非药典方法和药典方法进行了概述。
并介绍了 NAT 方法及罗氏 MycoTOOL qPCR 检测方案。罗氏
MycoTOOL qPCR 检测方案已经通过了 EP 支原体 NAT 验证指
南规定的所有的必要相关标准，可以替代指示细胞培养法和培
养法。
支原体检测方法概述
并具有活性，而不存在于真核细胞基质中。比如基于荧光素
酶的支原体检测分析 18, 19，虽然这种方法具有速度快（< 20
min）、操作相对容易（两个发光读数）、结果容易解释的特点，
但它们的检测限都达不到药典要求的水平 [<10 CFU（集落形
成单位）/ml]。大多数支原体都可以在 104 - 105 CFU/ml 的滴
度范围内被检测出来 20。
PCR-ELISA 检测Mycoplasma PCR-ELISA 检测方法是一种将细胞培养物中支原
体 DNA 进行 PCR 扩增后与 ELISA（酶联免疫吸附测定法）
相结合的分析法 21。在 PCR 反应过程中，用地高辛标记的核
苷酸被整合到扩增子里，能够在 ELISA 分析中被检测出来。
有文献表明对于特定种类的支原体（如 M. fermentans 和 A.
laidlawii），PCR-ELISA 检测的灵敏度水平可以达到 1-3 个支
原体“微粒”22。但是，这种方法对其他支原体的检测限（LOD）
是每 mL 样本 1000 个支原体“微粒”，无法达到 EP 监管指南
的相关要求。
技术报告8 | | 9
支原体检测方法概述
药典中提及的支原体检测方法涉及了使用液体培养基和固体琼脂培养基的经典微生物培养法，以及采用了分子技术的快速检测方
法。这些方法的摘要见本章内容和表 2。
培养法
在当代分子检测技术出现之前，传统的培养方法一直是微生
物检测的金标准，至今为止，全球范围内仍将它作为支原体
常规检测方案和药典方案（EP、USP 和 JP 监管指南都包含这
种方法）。培养法以支原体的定向培养为基础，使用能够促
进支原体生长的培养基。将需要检测的样本接种到支原体的
液体培养基和琼脂上，在温度为 36 ± 1°C、CO2 含量为 5.5 ±
0.5% 、O2 含量为 3 ± 1%、相对湿度为 90 ± 5% 的微氧条件
下培养，以促进支原体生长。到了初次接种后的第 21 天，将
灵敏度
可达到 0.1 CFU/ml 的检测限
培养期长达 28 天
使用多种培养基对不同的支原体种类进行检测
标准支原体培养基检测不到难培养的 M. hyorhinis cultivar alpha strains
培养期长达 7 天
灵敏度较低
检测结果的可靠性高度依赖于样本制备和 DNA 提取的质量和效率
需要 DNA 提取试剂盒与核酸扩增和检测设备 / 仪器
需要验证与培养法和指示细胞法可比性
成本较低
灵敏度
至少达到 < 10 CFU/ml 的检测限
快速
药典检测法
方法
培养法
指示细胞培养法
基于 NAT 的方法
优势 劣势
表 2：药典支原体检测方法的优点与缺点。
液体培养基的传代培养物接种到琼脂平板上。支原体会在琼
脂培养基上形成微小的集落（直径 < 100–400 μm）。支原体
集落的形态具有多样性，既有典型的煎蛋形，也有较不规则
的形状（图 4）。支原体集落可能非常小，在显微镜下统计
和判断菌落的工作要求实验室工作人员具备相关的经验。图
5 是培养法的示意图。
技术报告10 | | 11
0.2 ml 0.2 ml0.2 ml
0.2 ml
10 ml in
100 ml
day 6-8
day 13-15
day 19-21
day 2-4
支原体检测方法概述
图 4：在不同支原体琼脂培养基上生长的各种支原体形成的集落以及参照野生株。
来源：Mycoplasma Biosafety Services GmbH, Dr. Carl-Ulrich Zimmerman, 2016
由于培养法所需的样本体积相对较大（10 ml），培养期较长（一
共 28 天），所以培养法是灵敏度最高的检测方法之一，其检
测限的理论值和实测值都达到 0.1 CFU/ml，即 1 CFU/10 ml 样
本。这种方法满足 EP 2.6.7 提出的能够在 10 CFU/ml 的支原体
污染水平进行检测的要求，因此目前仍然被全球各国列在监管
文件中用作参照方法。但培养法有一些不足之处，其中最主要
的问题是培养期长达 28 天。这么长的培养期会给很多药物生产
商带来严重的困扰，比如产品放行被推迟，产生高昂的储存费
用，检测原料、细胞系以及上下游处理的过程控制涉及的大量
物流工作，以及由此产生的高昂人工费用等。培养法的另一个
局限性在于需要使用几种不同的生长培养基，因为并非所有类
型的支原体都能在同一种培养基里存活。由此，根据样本来源
技术报告10 | | 11
0.2 ml 0.2 ml0.2 ml
0.2 ml
10 ml in
100 ml
day 6-8
day 13-15
day 19-21
day 2-4
支原体检测方法概述
图 5：Mycoplasma Biosafety 按照 EP 2.6.7. 的要求实施的培养法检测示意图。
取 200 μl 待测样本涂布固体支原体生长培养基上，再取 10 ml 待测样本接种到 100 ml 液体生长培养基中，检测是否存在支原体污染。以没有接
种的培养基作为阴性对照品，接种量≤ 100 CFU 的培养基作为阳性对照品。将液体培养基培养 20–21 天。在接种后第 2–4 天、6–8 天、13–15 天
和 19–21 天，取 200 μl 样本接种的培养基以及阴性对照品和阳性对照品涂布在琼脂培养基上。接种后的琼脂培养基至少要培养 14 天，但对应于
20-21 天传代培养的培养基除外，它们的培养时间为 7 天。来源：Authors, 2017. 作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协
议 CC BY 3.0（http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
阴性质控品
> 14 天
集落计数
样本
集落计数
阴性
质控品
阳性
质控品
的不同，需要同时使用不同的支原体培养基，以扩大可检测的
支原体种类范围。出于这个原因，EP 2.6.7. 建议至少使用两种标
准支原体培养基：用于检测非禽类支原体的 FRIIS 培养基和用
于检测禽类支原体 M. synoviae 的 FREY 培养基。而培养法最大
的局限性可能在于部分支原体菌株的高度苛养性，例如猪鼻支
原体 M. hyorhinis cultivar alpha strains（以 M. hyorhinis DBS 1050
作为参照株）等，由于蛋白胨和酵母产物对其具有生长抑制作
用，导致它们不能在标准培养基里生长 23。这些细胞培养基适
应性菌株的生长情况取决于其各自细胞培养的生境。为了检测
M. hyorhinis cultivar alpha strains，需要用到指示细胞培养法。
技术报告12 | | 13
10 ml
支原体检测方法概述
指示细胞培养法
指示细胞培养法通常以 Vero 或 3T3 细胞系进行检测，但 EP
监管指南也允许使用具有相同效果的生产细胞系检测支原体。
用样本接种指示细胞培养基之后，在 35–38℃的温度下培养，
直至细胞汇合。对于阳性对照品，也可以在存在或不存在被
测 样 本 的 条 件 下， 用 M. orale 和 M. hyorhinis cultivar alpha
reference strain 接种指示细胞系。染色前，先用固定液将传代
荧光显微镜镜检
1 ml样本
阳性质控品
1 ml 样本
口腔支原体
≤ 100 CFU
阳性质控品
1 ml 样本+
猪鼻支原体
≤ 100 CFU
阳性质控品
口腔支原体 ≤ 100 CFU
阳性质控品
猪鼻支原体 ≤ 100 CFU
阴性质控品
培养物固定，再用能够与 DNA 结合的荧光染料染色。支原
体存在的特征是细胞表面的荧光模式呈球形，且周围区域散
发出强烈荧光。细胞质中的线粒体也会被染色，但很容易
就能将它们与支原体区分开来。如果阳性对照品没有呈现
出典型的支原体荧光模式，或者阴性对照品呈现出典型的
支原体荧光模式，则检测无效。图 6 是指示培养法的示意图。
阳性质控品：Vero 细胞 + 猪鼻支原体 阴性质控品：Vero 细胞
图 6：Mycoplasma Biosafety 实施的指示细胞培养法检测。在新鲜制备的 Vero 指示细胞培养物中接种 1 ml 待测样本。准备四份阳性对照品。两份
阳性对照品含有用 1 ml 样本接种的 Vero 细胞，并分别接种不超过 100 CFU 的猪鼻支原体和口腔支原体。另外两份阳性对照品则是不含样本、用不超过 100 CFU 的猪鼻支原体和口腔支原体接种的 Vero 细胞。取后者的这两份阳性对照品涂布在琼脂培养基上，检查支原体活力。阴性对照品为未接种样品和阳性支原体的新鲜制备 Vero 细胞。所有细胞培养物放在 CO2 恒温箱中培养，直至达到 100% 的细胞汇合度为止。然后用缓冲液冲洗细胞层并进行胰酶处理。将脱落的细胞重新悬浮于细胞培养基里，转移至腔室培养玻片，在 CO2 恒温箱里培养，直到细胞密度达到约 50%为止。用新制固定液将细胞层固定两次，然后风干，用 Hoechst 染色法染色后用荧光显微镜进行观察分析。来源：Authors, 2017. 作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协议 CC BY 3.0 （http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
技术报告12 | | 13
10 ml
支原体检测方法概述
培养法和指示细胞培养法都需要很长的时间才能得出结果（培养法需要 28 天，指示细胞培养法需要 7 天），同时由于引入了阳性
对照品或可能的支原体阳性样本，所以这些方法本身就存在导致设备发生支原体污染的风险。
基于 NAT 的方法
在基于 NAT 的方法学中，所有试验都以核酸检测为基础。通
常采用 PCR 技术来进行核酸检测。
PCR
PCR 是一种可用于多个领域的分子生物学方法，包括食品和环
境分析、法医学以及医学诊断等。其原理是对 DNA 进行特异
性的扩增处理，使之达到可以检测的水平。扩增时使用 DNA
聚合酶，用热循环仪进行多个周期的自动化扩增处理。每个扩
增周期都包括三个主要步骤：
1. 加热使双链 DNA(dsDNA) 变性为单链 DNA (ssDNA)。
2. 让 PCR 引物与特定的 ssDNA 位点（例如，特定的目标基因）
相结合。
3. 以退火结合的引物序列为起始点，DNA 聚合酶按照 ssDNA
的序列进行延伸，合成互补的 DNA 序列。
如需了解更多信息，请查看详细的
PCR 流程：
（http://go.roche.com/dnacopy）
如需了解关于常规 PCR 发展为 qPCR
的历史、技术进展情况和其他更多信
息，请访问：
（http://go.roche.com/storypcr）
相比于普通 PCR，实时 PCR（qPCR）能够实时报告 DNA 的扩
增情况。因此，实时 PCR 不需要在 PCR 处理后用凝胶电泳等
方法检测 DNA，大幅降低了在实验室里发生污染的风险，并
且有助于对最终结果进行解释。实时 PCR 使用的探针含有与
短 DNA 序列（18 - 30 个碱基对）相连接的荧光染料。这种探
针在 PCR 的每个扩增循环中都会被纳入新合成的 DNA 互补链。
市场上有多种不同的探针设计可供选择，其中最常见的探针之
一就是 MycoTOOL qPCR 使用的水解探针。在每个 PCR 循环结
束后，这种探针都会以荧光强度的形式报告 DNA 的总量。随
着目标序列的不断扩增，荧光信号的强度也会成比例地升高。
将荧光强度与 PCR 循环数对应作图，就可以得到一条典型的 S
状 qPCR 曲线（见图 7）。
一般而言，经过 30–50 个 PCR 周期的扩增处理后，所得到的
特异性 DNA 扩增子足以用荧光染料染色，进行凝胶电泳分析，
或用其他方法对荧光信号进行检测。
为了开发出灵敏度高、特异性好或者所需时间更短的 PCR 分
析法，需要对 PCR 温度方案进行优化。例如，降落 PCR （TD-PCR）
就是一种很常用的方法，它可以提高 PCR 分析目标基因的特
异性。TD-PCR 中引物在最开始的几个 PCR 循环中可以在较高
的退火温度下与目标 DNA 序列发生具有高度特异性的结合，
从而确保只有特定的 DNA 序列得到扩增。然后逐渐降低退火
温度，使 PCR 效率达到最高水平。TD-PCR 方案可以减少非特
异性 DNA 的合成 24。MycoTOOL qPCR 通过 TD-PCR 技术实现
具有高度特异性的支原体检测。
技术报告14 | | 15
Δ
Rn
54.617
49.617
44.617
39.617
34.617
29.617
24.617
19.617
14.617
9.617
94.617
0.383
5 10 15 20 25 30 35 40 45
(http://go.roche.com/mag96)
(http://go.roche.com/mag24)
支原体检测方法概述
PCR 和 qPCR 的检测灵敏度都很高，如有 DNA 污染的发生，
则容易造成假阳性的报告结果。最常见的污染源是 DNA 模板
自身，以及 PCR 反应结束后产生的 DNA 扩增产物。DNA 分子
可以通过空调系统或实验室人员在实验室里传播。消除这些污
染源最有效的方法是在单独的工作区域或单独的房间里，以单
向工作流的方式完成从采样、样本处理、反应液配置直至 PCR
扩增和 PCR 产物检测的工作流程 25。
MycoTOOL Mycoplasma Real-Time PCR 试剂盒
(MycoTOOL qPCR)
MycoTOOL Real-Time PCR 试剂盒是一种 qPCR 分析法，特别适
用于细胞培养物的支原体检测。它完全满足 EP 2.6.7. 对 NAT 支
原体检测法提出的有关灵敏度（例如，检测限≤ 10 CFU）、
特异性、稳健性以及一致性的要求。并且不需要进行支原体富
集或预培养处理。该试剂盒使用的引物和探针对支原体 16S 核
糖体 DNA 基因具有高度特异性，能够检测 150 多种可以培养
以及不可培养的支原体，包括细胞培养物中的常见支原体污染
物种类以及可能会出现的污染种类，如莱氏衣原体、精氨酸支
原体、发酵支原体、鸡毒支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、
唾液支原体、关节液支原体以及柠檬螺原体（表 1），还有肺
炎支原体和人型支原体等致病性人支原体。
通过 MagNa Pure 24 或 MagNa Pure 96 仪器自动提取 DNA，
然后在 LightCycler 480 II Real-Time PCR 仪器上进行后续 qPCR
检测，这是罗氏提供的一个自动化、高通量的支原体检测方案。
如果样本中的细胞密度范围在 5 × 106 个细胞 /ml 左右，则可
以用 Roche QC Preparation kit 进行手动法的核酸制备；如果待
处理样本的细胞密度范围在 5 × 106 个细胞 /ml 至 1 × 108 个细
胞 /ml 之间，那么可以使用 MycoTOOL Mycoplasma Detection
Prep Kit, High Cell Density 试剂盒进行核酸制备。不含细胞的
样本可以加入 Carrier DNA，以进行有效的核酸抽提，或者在
提取和纯化核酸之前加入非干扰性的生物样本。
从样本采集到得出支原体检测结果的整个工作流程需要 4 - 6
小时，具体取决于整个检测过程的自动化水平和样本的数量。
整个工作流程如图 8 所示。
MagNA Pure 24 和 96 仪器基于磁珠技术，能对来源于
多种起始原料（例如全血、血浆、细胞培养物等）的核
酸进行纯化。如需了解更多有关 MagNA Pure 96 以及
MagNA Pure 24 系统的信息，请浏览下述网页。
图 7：MycoTOOL qPCR支原体检测示例。在最初的 15 个 qPCR 循环里，
基线代表的是初始信号，几乎看不出荧光强度的变化。这种信号可以看作是反应的背景荧光。循环阈值（Cq）指的是样本荧光信号的强度超过背景信号时对应的循环次数。Cq 值越低，样本中的 DNA 含量就越高。来源：Roche CustomBiotech, 2017.
循环
技术报告14 | | 15
ΔR
n
54.617
49.617
44.617
39.617
34.617
29.617
24.617
19.617
14.617
9.617
94.617
0.383
5 10 15 20 25 30 35 40 45
(http://go.roche.com/mag96)
(http://go.roche.com/mag24)
支原体检测方法概述
为了确保结果的有效性，MycoTOOL qPCR 检测方案包含三种
对照品。首先，每个试验都采用了基于质粒的阳性对照品，以
便确证整个 qPCR 流程使用的所有试剂的有效性。其次，采用
H2O 为模板作为 PCR 阴性对照，防止出现假阳性结果。第三
种对照品是基于质粒的回收对照品（Recovery Control，也被
称为外源性内部对照品）；对于各个待测样本，在分离 DNA
之前将回收对照品加入每一份样本，在核酸抽提完成后，在另
图 8：MycoTOOL qPCR 工作流程。按照手动或自动工作流程，配制细胞密度为 5x106 个细胞 /ml 的未处理样本（1 ml）。如果是人工制备样本，
则用 Roche QC Preparation Kit 分离核酸。如果使用自动化核酸分离系统，则选择一款 MagNA Pure 系统纯化样本 DNA。接着，在 LightCycler 480 II Real-Time PCR 系统上进行支原体特异性 qPCR 反应。如果采用紫色的自动化工作流程，即使用 MagNA Pure 96 和 LightCycler 480 II 系统，这个自动化流程满足 EP 2.6.7. 章的要求，并且经过罗氏制药生物技术公司的充分验证。可以在保密协议的规定范围内按要求提供通用验证报告。研究设计和结果的相关摘要见 http://go.roche.com/MycoTOOLqPCR来源：Roche CustomBiotech, 2017.
手动提取 1 ml未处理的样本
Roche QC Preparation Kit400 μl DNA 洗脱液 MagNA Pure 24
200 μl DNA 洗脱液
MycoTOOL 支原体实时荧光定量 PCR 试剂盒Light Cycler 480 II
4 x 20 μl DNA 样本输入 4 x 20 μl DNA 样本输入
MagNA Pure 96( 已有 EP 验证报告 )
自动化系统
样本纯化
一个 PCR 反应管中，用另外一套引物和探针（特异性针对回
收对照品）进行同步扩增。RC 的作用是证实整个工作流程具
有有效性和完整性，包括从 DNA 分离到 PCR 的各个环节。由
于 RC 为加入样本的外源性对照品，所以 MycoTOOL qPCR 不
仅适用于特定的细胞系如 CHO，也适用于生物药品生产常用
的各种细胞系。
技术报告16 | | 17
✓ ✓ ✓ ✓
✓ ✓ (✓)* ✓** ✗ ✗
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
对于一个样本的检测，所有扩增反应都要进行重复管扩增（分别采用 2 份阴性对照品和阳性对照品，4 份 RC- 样本复管检测）。
图 9 显示的是 96 孔 qPCR 反应板的典型布板方案。
对于一个样品中是否存在支原体污染，可靠的结果判断必须满足以下质控检测标准：所有阴性对照品的结果均为阴性，阳性对
照品以及样本的所有 RC 反应得到的结果均为阳性。
支原体预混液：含支原体特异性
引物和探针的 PCR 反应液
回收对照品预混液：含 RC 质粒
特异性引物和探针的 PCR 反应液
样本 阴性质控品 阳性质控品
图 9：MycoTOOL qPCR检测布板方案。在用 MagNA Pure 24/96 仪器进行 DNA 纯化之前，或在手动提取核酸前，在样本中添加规定浓度的 RC 质粒。
根据采用的是自动化或手动的核酸纯化方案的不同，1 ml 样本中抽提纯化获得的 DNA 最终回收在 200 μl 或 400 μl 洗脱液中。对样本的支原体检测需进行 4 管重复，每次使用 20 μl 回收的 DNA。这个样本量相当于原样本体积的 40%。来源：Authors, 2017. 作者通过这张图进行了应用展示，该应用已经被纳入知识共享协议 CC BY 3.0（http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/），即使包含相关链接的文献可能拥有某些权利，也能在协议许可的范围内使用。
支原体检测方法概述
技术报告16 | | 17
✓ ✓ ✓ ✓
✓ ✓ (✓)* ✓** ✗ ✗
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
由于支原体污染会对细胞培养产生明显的影响，所以监管部
门越来越重视支原体的检测。如今，全世界几乎所有国家都
通过立法对生物制药生产的支原体检测进行管理。监管部门
还通过国家药典中关于支原体检测内容的规定赋予其法律约
束力。这些文件对支原体检测方法以及需要监测的产品进行
了相关规定。但是，不同国家推荐的支原体检测方法以及详
细的检测方案各不相同。总的来说，各国对基于 NAT 的检测
法的使用规定存在较大的区别。培养法和指示细胞培养法等
传统的药典方法（见 2.2 章）被视为经过长期考验的黄金标准，
受到所有药典的一致推荐。虽然不同国家的药典在具体的方
法步骤上存在微小差异，但各个国家推荐的基于培养的检测
法都具有大体相似的方案。表 3 列举了部分国家的监管机构，
以及包含有关支原体检测的监管指南的药典。
表 3：欧盟、美国、日本、中国、巴西和阿根廷的卫生监管部门概述，包括相应的监管机构、具有法律约束力的文件（药典）、对 NAT 用于常规支
原体检测的接受程度以及 NAT 验证的质量标准要求。
* USP 的表述是 “ 通过程序证实具有可比性 ”
** 与 EP 2.6.7. 的内容相同。
监管审批系统
卫生部负责对药企开发的医药产品进行科学评估、监
督和安全监测。监管审批部门确保市场上的所有药品
都具有安全性和有效性，且质量合格。人用和动物用
药品的审批和上市许可都要求药企必须满足官方规定
的质量标准，并通过不同的监管机构和委员会加以控
制。药企必须满足的标准由药典规定和发布。药典列
出了药企必须对药品、中间产物以及原料开展的所有
检测，对单个国家或联盟的各个成员国都具有法律约
束力。
监管概述
监管概述
欧洲 26 UK USA 日本 中国 巴西 阿根廷
卫生监管单位欧洲药品
管理局（EMA）
药物和保健产品监管机构（MHRA）
食品药品管理局
（FDA）
日本卫生劳动和福利部
（MHLW）
卫生部（MOH）
巴西卫生部
阿根廷卫生部
药品审批管理机构
人用药品委员会
（CHMP）
由 MHRA 进行国家审批
由 EMA 进行集中审批
食品药品管理局
（FDA）
药品与医疗器械管理署（PMDA）
中国国家食品药品监督管理局
（CFDA）
国家卫生监督局
（ANVISA）
药品管理局（ANMAT）
出版药典欧洲药品
质量管理局（EDQM）
英国药典委员会
美国药典委员会
药品与医疗器械管理署（PMDA）
中国药典委员会
（ChPC）
国家卫生监督局
（ANVISA）
药品管理局（ANMAT）
药典欧洲药典（EP）27 英国药典 28 美国药典
（USP）29日本药典（JP）30
中国药典（ChP）31 巴西药典 32 阿根廷药典 33
支原体检测的NAT 认可
不明确 没有描述 没有描述
NAT 验证要求的相关标准
不明确
技术报告18 | | 19
监管概述
快速支原体检测的情况则非常不一样，例如 NAT。虽然很多
国家的药典都将 NAT 描述为一种有效的支原体检测方法，但
各国为这种方法制定的方案或验证要求却极少具有一致性。
EP 和 JP 等药典详细描述了有关这种方法的验证指南，但其
他国家仅仅只是指出 NAT 是一种经过验证的有效检测方法。
不过，所有国家都要求对这种检测法进行适当的验证，并与
常规支原体检测法进行比较。
还有一些不具备法律约束力的文件也可以为 NAT 支原体检测法的实施提供参考：
(i) 美国注射剂协会（PDA）在 2010 年发表了一篇名为 “ 其他
支原体检测方法 ” 的技术报告。它为快速支原体检测法的新
用户提供指导，并描述了非传统培养法的支原体检测法的分
析流程、分析验证以及可能用途 34。
(ii) 罗氏制药用 MycoTOOL qPCR 检测方案对产品进行放行检
测。该分析的验证按照 EP 2.6.7 章的内容实施，可以在保密
协议的规定范围内按要求提供通用验证报告。研究设计和结
果的相关摘要见 http://go.roche.com/MycoTOOLqPCR。
验证要求 EP 2.6.7.
检测限（LOD）
特异性
稳健性
可比性
与其他所有药典相比，EP 2.6.7. 章描述的 NAT 验证指南最为详细。
基于 NAT 的支原体检测法必须满足四个方面的要求：检测限、
特异性、稳健性和可比性（表 4）。为了对 NAT 方法进行全面
的通用验证，建议还要加入精密性和交叉污染等额外的验证参
数。
检测限的界定要求必须针对每种支原体确定阳性检测临界值（EP 2.6.7. 章提供了用作检测的建议支原体种类）。
每种支原体必须至少进行三次独立的 10 倍梯度稀释液进行检测，且每次检测中每种稀释液浓度都必须制备平
行管进行检测，以使各稀释液浓度的检测结果总共能达到 24 个。阳性临界值指的是至少能够使 95% 的试验运
行检测得到阳性结果的支原体浓度，即至少要取得 23 个有效的阳性检测结果。
NAT 检测的挑战是要使用对多种支原体都具有适用性和特异性的 PCR 引物。往往覆盖的检测种类越多，PCR
引物也越可能检测到其他种类的细菌。例如，革兰氏阳性菌与支原体具有密切的系统进化相关性，PCR 可能
会检测到这种细菌属，从而产生交叉检测的情况（EP 2.6.7. 章列举了一系列需要检测交叉反应性的细菌属）。
需要证实 NAT 检测法是否能够在方法参数发生人为导致的微小变化，或检测方法有所变化时不受影响。EP
2.6.7. 章列举了一些变化示例和需要检测的试验方案。
可比性的评估应包含 NAT 检测法与药典检测法的 LOD 对比。本章规定了以下验收标准：
1) 以 NAT 法代替培养法：需要证实检测限至少达到 ≤ 10 CFU/ml。
2) 用 NAT 法代替指示细胞培养法：对每种被测支原体的检测限都必须至少达到 ≤ 100 CFU/ml 。
3) 在这两种情况下，采用 NAT 法的检测和采用常规方法的检测必须同时进行，以便用相同样本（CFU 可比性）
对它们的 LOD 进行同步评估。
表 4：EP 2.6.7 对验证要求进行了详细总结。如需了解更多详细信息，请直接查看 EP 的 NAT 支原体检测法验证指南。
(iii) 除了 USP 以外，FDA 相关部门还发布了针对特定主题的
指南。FDA 的 CBER 于 1993 年发布了一则名为 “ 对生产生
物制品使用的细胞系进行特征鉴定时需要考虑的几个问题 ”
（PTC）的指南，又在 2010 年发布了 “ 行业指南 ”，为支原体
的检测提供了更多信息，但它们均不具备法律约束力 35, 36。
(iv) 《生物分析方法验证》也是 FDA 发布的一则没有法律约
束力的文件，文件内容对其他支原体检测方法的验证进行了
最佳实践概述。37
技术报告18 | | 19
验证与实施
对于 MycoTOOL qPCR 检测方案在针对特定产品的支原体快速检测和放行中的应用，本章内容对验证和实施这种方法的各个步骤以
及需要考虑的时间进度问题进行了概述。支原体的检测一般包含五个步骤：供应商尽职调查、可行性研究、开发验证方法、开展
验证研究以及递交报告。MycoTOOL qPCR 方法对支原体检测的通用性参数已经由罗氏制药进行验证，实施验证期间罗氏可以在签
订保密协议的前提下按需提供验证报告，以便节省验证时间和成本。图 13 展示的是整个工作流程，下文将对其进行详细叙述。
* 可以将这种服务外包给 CRO，例如
图 10：MycoTOOL qPCR 的实施流程图。流程图的左侧显示的是利用 Roche 提供的通用验证报告（对 CHO 生产流程的验证）实施验证。将
MycoTOOL qPCR 用于非 CHO 流程，或者更改 Roche 通用验证中使用的方法时，需要重新验证 MycoTOOL qPCR 方法。流程图的右侧显示的就是
这个流程，这个流程需要的时间比较长。无论是验证还是常规检测，合约研究机构都可以帮助完成这些检测，如 Mycoplasma Biosafety，可以将这
个流程中的大多数步骤外包给他们。来源：Authors，2017。
快速支原体检测法的实施
供应商
尽职调查
是否需要
使用 Roche 的验证
报告？
可行性研究
可行性研究
验证策略
验证研究
提交
常规检测
验证策略
验证研究
时间较短
时间较长
提交
罗氏 MycoTOOL qPCR 检测方案逐步验证和实施
技术报告20 | | 21
验证与实施
供应商尽职调查 罗氏制药的通用验证报告
这个步骤可能需要花费数日至数月的时间。涉及对市售的支
原体检测试剂盒或对合作开展研究的 CRO 进行尽职调查。过
程中需要参照监管要求考察商业化检测产品的性能参数和质
量标准，并评估支原体检测试剂盒供应商以及 CRO 的实力。
验证开始之前需要先搞清楚如下这些问题：
· 供应商有没有为仪器和试剂的设计及生产提供适当的相关
文件？
· 供应商有没有建立适当的变更控制系统？
· 供应商能不能按要求提供质量和供应协议？
· 供应商的交付是否及时可靠？
· 有没有早期验证研究可供参考？
· 供应商和 CRO 是否可以回应审核问卷？是否允许在它们的
检测机构里进行实际审核？
· 供应商是否为最终用户提供培训计划、现场技术服务、安
装和运行验证服务、预防性维护服务以及技术支持热线？
· 对于针对特定产品的 NAT 验证研究以及采用 NAT 方法的
常规检测，CRO 是否有足够的经验可以保证相关工作顺利
完成？
· CRO 是否提供验证报告、详细的检测方案或类似文档？
· CRO 是否提供技术移交解决方案？
在这个过程中可能还需要进行经济评估或财务评估，以便申
请内部预算（例如提供合理的项目计划书）。由此，必须与
合约服务提供商明确一次性费用（实验室场地费用、仪器费
用、安装费用等）和运营费用（维护、每份样本的检测费用等）
等相关费用的问题。
罗氏制药按照 EP 2.6.7. 的内容（NAT 验证指南）对 MycoTOOL
qPCR 进行了全面的通用验证，验证使用的是特定的仪器
（LightCycler® 480 Instrument II 以 及 MagNA Pure 96， 见 图
10），适用于使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系的相关流程。
一般来说，只要主要流程（包括仪器）不发生变化，FDA 或
EMA 等监管部门就不会要求用户对 MycoTOOL qPCR 进行全面
的再次验证。因此，如果采用一致的工作流程开展针对特定产
品的验证研究，则验证项目中需要使用的样本较少，时间较短。
不过，作出决定之前必须先与监管部门讨论相关的情况。
根据要求，可签订保密协议，并提供
本验证报告。如需查看包含数据总结
的简要报告，请访问以下链接。
(http://go.roche.com/MycoToolqPCR)
技术报告20 | | 21
验证与实施
可行性研究 验证策略
报告递交与常规检测验证研究
这个步骤需要的时间从一周到几个月不等。开展初期的可行
性研究时可以租用仪器设备，或者将研究工作托付给 CRO。
可行性研究的作用是在购买仪器以及投入资金开展验证研
究之前对相关的概念和检测方案进行技术验证，比如考察
MycoTOOL qPCR 与待测产品材料之间是否存在任何技术层面
的不相容性。MycoTOOL qPCR 的验证是用密度为 5x106 个细
胞 /ml 的 CHO 细胞实施的，如果采用其他细胞系或者其他浓
度水平，则必须通过检测来确定是否存在产物基质效应（例如，
PCR 抑制）。可行性研究的另一个目标是评估 LOD 是否能达
到要求的水平，以及需要对 MycoTOOL qPCR 检测方案做出
怎样的调整才能使 LOD 达到目标水平。调整方法可能包括增
加 PCR 反应体积或增加 PCR 循环次数等。
这个步骤需要的时间从一两周到几个月不等。验证策略的作
用是为 MycoTOOL qPCR 验证研究需要实施的所有试验提供
路线图（例如，LOD 测试、稳健性测试、特异性分析）。策
略的内容包括时间表、试验计划、试验实施方以及相关的验
收标准。
如果采用与 Roche 的通用验证报告一致的实验流程，则可以
将通用验证报告作为验证研究的基础，大大减少需要检测的
样本数量，降低研究总体费用。一般来说，在通用验证报告
的基础上，仅需对少数标准进行考察和确认（例如，对指定
种类的支原体参考株的 LOD）。但总的来看有一点很重要的是，
保持与相关的监管部门的沟通和讨论，确认 Roche 通用验证
报告在整个验证流程中可提供的简化验证的作用。
一旦验证报告递交成功并且通过了监管部门的审批，就可以
开展常规检测。根据客户与项目的具体情况，常规检测既可
以交给内部质控专家实施，也可以交给 CRO 公司开展。
这个步骤需要的时间为两个月到几个月。验证研究的作用是
证明 MycoTOOL qPCR 能够始终按照监管要求有效地进行支
原体检测 。这项研究既可以在内部实验室开展，也可以外包
给 CRO 公司。CRO 会按照验证策略的内容进行试验，并将
相关的证据记录在验证报告中。
技术报告22 | | 23
MycoTOOL Mycoplasma Real-Time PCR KitMycoTOOL PCR Mycoplasma Detection Kit
QC Sample Preparation Kit
Residual DNA E. coli Kit Residual DNA CHO Kit
MagNA Pure 96 Instrument
MagNA Pure 24 Instrument
LightCycler® 480 Instrument II
总结与概述
总结与概述
基于 NAT 的自动化快速支原体检测法为生物医药企业提供了革命性的机遇和竞争优势。无论是样本制备和支原体检测试剂盒的最
新进展，还是以满足监管要求为目标，在针对特定产品的验证方面取得的最新进步，都必然会推动这些新的检测系统逐步取代药
典培养法，成为行业内更理想的选择。从最近的发展和趋势来看，预计 EMA 和美国 FDA 等监管部门会在未来几年之内逐步批准将
NAT 快速检测法用于生物制药企业的常规支原体检测。
对于将罗氏 MycoTOOL qPCR 检测方案作为一种基于 NAT 的快速自动化支原体检测法用于生物制药产品的过程控制和批次放行，
本指南对怎样验证和实施这种检测方案进行了特点概述，并提供了具体的建议。
目前，MycoTOOL qPCR 的用户都非常认可这种高度自动化的分析方案。该方案的优势包括操作简单，工作流程短，当天就能给出结果，
对样本进行高通量处理，成本效益高，即使在高细胞密度的 “ 最坏情况 ” 下也不会产生基质干扰效应和 PCR 抑制效应，此外还可
以检测不含细胞的样本。这种自动化支原体检测系统的通用性验证设计和报告，将大大简化各种生物制药产品的产品特异性放行
验证方案。MycoTOOL qPCR 可以用作原料检测、过程控制和最终批次放行的早期报警系统，以便可靠地消除生产过程中存在的支
原体污染风险，提高生产效率和产品质量。
与药典记载的培养法相比，基于 NAT 的自动化 MycoTOOL qPCR 检测法具有明显的优势，而且可以从合约服务实验室的经验丰富
的专家处获取针对特定产品的定制验证方案，因此预计这种方法将来会越来越多地被用于常规支原体检测，也将影响到整个生物
制药产业的质控和批放行标准，以及未来的行业发展。
技术报告22 | | 23
MycoTOOL Mycoplasma Real-Time PCR KitMycoTOOL PCR Mycoplasma Detection Kit
QC Sample Preparation Kit
Residual DNA E. coli Kit Residual DNA CHO Kit
MagNA Pure 96 Instrument
MagNA Pure 24 Instrument
LightCycler® 480 Instrument II
附录
1 个试剂盒(160 次 PCR 反应 )
06495605001用于检测细胞培养物样本中是否存的支原体污染。MycoTOOL 实
时 PCR 试剂盒让支原体检测变得快速、简单和可靠。
1 个试剂盒 05184240001用于检测细胞培养物样本中是否存的支原体污染。MycoTOOL PCR 试剂盒让支原体检测变得快速、简单和可靠。
1 个试剂盒 08146829001 该试剂盒的用途是对核酸进行人工提取和纯化，将处理过的核
酸与 MycoTOOL Mycoplasma Real-Time PCR Kit 或 MycoTOOL PCR Mycoplasma Detection Amplification Kit 配合使用。这款试
剂盒所包含的方案，适用于正常细胞密度与高细胞密度的细胞
培养物样本。另外，它还可以和 Residual DNA CHO 试剂盒与Residual DNA E. coli 试剂盒配合使用。
1 个试剂盒(96 次反应 )
07728735001 用于检测细胞培养物样本中是否含有大肠杆菌产生的残留宿主细
菌 DNA。1 个试剂盒(96 次反应 )
07427689001 用于检测细胞培养物样本中是否含有 CHO 细胞产生的残留宿主
细胞 DNA。
试剂盒
试剂盒
参考标准
包装大小
包装大小
物料号
物料号
物料号
说明
说明
说明
1 台仪器，控制
单元和配件
06541089001 高通量工作站，适用于核酸的全自动纯化处理，可以处理多达96 个样本。
1 台仪器，内置
控制单元和配件
07290519001 高通量工作站，适用于核酸的全自动纯化处理，可以处理多达24 个样本。
1 台仪器(96 反应模块 )
05015278001 速度快，高通量、基于平板的实时 PCR 扩增和检测仪器。
涵盖 EP 2.6.7. 提到的各种支原体株的全套产品：莱氏衣原体 (A. laidlawii)PG8T，精氨酸支原体 (M. arginini) G230T，发酵支原体 (M. fermentans) PG18T，猪鼻支原体 (M. hyorhinis) BTS7T，口腔支原体 (M. orale) CH19299T，肺炎支原体 (M. pneumoniae) FHT，鸡毒支原体 (M. gallisepticum) PG31T，关节液支原体 (M. synoviae) WVU 1853T，柠檬螺原体 (S. citri ) R8-A2T 以及猪鼻支原体 (M. hyorhinis)DBS 1050 α- 亚型。
涵盖 JP 第 17 版提到的 7 种支原体株的全套产品：莱氏衣原体 (A. laidlawii) PG8T，精氨酸支原体 (M. arginini) G230T，发酵支原体 (M. fermentans) PG18T，猪鼻支原体 (M. hyorhinis) BTS7T，口腔支原体 (M. orale) CH19299T，肺炎支原体 (M. pneumoniae) FHT，以及关节液支原体 (M. synoviae) PG20T。
mbsCRS-EP10*
mbsCRS-JP7*
* EMA 和 FDA 批准可用于 NAT 法验证的低 GC/CFU 支原体参考标准品。浓度分为 10、100 和 1000 CFU/100μl，有活株原液、热灭活原液或裂解原液可供选择。
支原体培养基参考标准品
技术报告24 | | 25
HEK
ICH
JP
LOD
MHLW
MHRA
MOH
MycoTOOL qPCR
NAT
PBS
PCR
PDA
PMDA
PTC
QC
qPCR
RC
RNA
SC
ssDNA
TD-PCR
UK
US
USP
ADP
ANMAT
ANVISA
ATP
CBER
CDER
CFU
CHO
ChP
ChPC
Cq
CRO
CFDA
CVM
DNA
dsDNA
EDQM
ELISA
EMA
EP
EU
FDA
G+C
GMP
二磷酸腺苷
药品管理局（阿根廷）
国家卫生监督局（巴西）
三磷酸腺苷
生物制品评价和研究中心（US FDA）
药品评价和研究中心（美国食品药品监督管理局）
集落形成单位
中国仓鼠卵巢（细胞）
中国药典
中国药典委员会
循环阈值
合同研究机构
中国（国家）食品药品监督管理局
兽医医学中心（美国 FDA）
脱氧核糖核酸
双链 DNA
欧洲药品质量管理局
酶联免疫吸附测定法
欧洲药品管理局
欧洲药典
欧盟
美国食品药品管理局
鸟嘌呤 - 胞嘧啶含量
良好生产规范
术语表
术语表
缩写 定义
技术报告24 | | 25
HEK
ICH
JP
LOD
MHLW
MHRA
MOH
MycoTOOL qPCR
NAT
PBS
PCR
PDA
PMDA
PTC
QC
qPCR
RC
RNA
SC
ssDNA
TD-PCR
UK
US
USP
ADP
ANMAT
ANVISA
ATP
CBER
CDER
CFU
CHO
ChP
ChPC
Cq
CRO
CFDA
CVM
DNA
dsDNA
EDQM
ELISA
EMA
EP
EU
FDA
G+C
GMP
人胚肾
国际协调委员会
日本药典
检测限
日本卫生劳动和福利部
药物和保健产品监管机构（UK）
中国卫生部
MycoTOOL 支原体实时荧光定量 PCR 试剂盒
核酸扩增技术
磷酸缓冲盐溶液
聚合酶链反应
注射剂协会
药品与医疗器械管理署
FDA/CBER 指南 1993-Points to Consider
质量控制
实时定量 PCR
回收质控 DNA
核糖核酸
小菌落型
单链 DNA
降落 PCR (Touchdown PCR)
英国
美国
美国药典
术语表
缩写 定义
技术报告26 | | 27
1) European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM), European Pharmacopoeia (EP), 9th Ed., Chapter 2.6.7: Mycoplasmas; 2016
2) United States Pharmacopeial Convention, United States Pharmacopeia – National Formulary (USP-NF), 39th Ed., Chapter 63: Mycoplasma Tests; 2016
3) Pharmaceutical and Medical Devices Agency (PMDA), Japanese Pharmacopoeia (JP), 17th Ed.: Chapter G3 Biotechnological/Biological Products: Mycoplasma Testing for Cell Substrates used for the Production of Biotechnological/Biological Products; 2016
4) Furness G, The growth and morphology of mycoplasmas replicating in synchrony. J Infect Dis 122: 146-158; 1970
5) MacAuliffe L et al., Biofilm formation by mycoplasma species and its role in environmental persistence and survival, Microbiology 152: 913–922; 2006
6) Nocard EIE and Roux E, Le microbe de la péripneumonie. Ann Inst Pasteur 12: 240-262; 1896. (Translated as ‘The microbe of pleuropneumonia’ in Rev Infect Dis 12: 354-358; 1990)
7) Yus E et al., Impact of genome reduction on bacterial metabolism and its regulation. Science 326: 1263-1268; 2009
8) Rosengarten R et al., The changing image of mycoplasmas: from innocent bystanders to emerging and reemerging pathogens in human and animal diseases. In: Mühldorfer I and Schäfer KP (Eds), Emerging Bacterial Pathogens, Contributions to Microbiology, Vol 8, pp 166-185, Karger, Basel; 2001
9) Uphoff CC and Drexler HG, Prevention of mycoplasma contamination in leukemia-lymphoma cell lines. Human Cell, 14: 244-247; 2001
10) Hay RJ et al., Mycoplasma infection of cultured cells. Nature 339: 487-488; 1989.
11) Pawar, V et al., Trends in the incidence and distribution of mycoplasma contamination detected in cell lines and their products. IOM Lett 3: 77, 1994
12) Rottem S and Barile MF, Beware of mycoplasmas. Trends Biotechnol 11: 143-151, 1993
13) McGarrity G, Mycoplasma Infection of Cell Cultures. Springer; 2012
14) Liu S et al. (2000), Development and qualification of a novel virus removal filter for cell culture applications. Biotechnol Progress 16: 425–434; 2000
15) Drexler HG and Uphoff CC, Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology 39:75–90; 2002
16) Zinöcker S et al., Mycoplasma contamination revisited: mesenchymal stromal cells harboring Mycoplasma hyorhinis potently inhibit lymphocyte proliferation in vitro. PLOS One 6: e16005; 2011
17) Young L et al., Detection of mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols 5: 929-934; 2010
18) Pitt A et al., Assay for detecting mycoplasma by measuring acetate kinase or carbama kinase activity. WO2004094656 A1; 2004
19) Slater KJ et al., Mycoplasma detecting methods and materials. US7585644 B2; 2004
20) Biunno I and DeBlasio P, Fundamental principles of a Stem cell biobank. In Tiziana AL and Brevini (Eds), Stem
Cells in Animal Species: From Pre-clinic to Biodiversity, pp 151-166, Human Press; 2014.
21) Roche, Mycoplasma PCR ELISA. REF 11 663 925 910
22) Wirth M et al., Mycoplasma detection by the mycoplasma PCR ELISA. Biochemica 3: 33-35; 1995
23) Gardella RS and Del Giudice RA, Growth of Mycoplasma hyorhinis cultivar alpha on semisynthetic medium. Appl Environ Microbiol 61: 1976-1979; 1995
24) Metzker ML and Caskey CT, Polymerase chain reaction (PCR). eLS; 2009
25) Dieffenbach CW and Dveksler GS, Setting up a PCR laboratory. Genome Research, 3: S2-S7; 1993
26) Containing all countries inside the Schengen Agreement: EU member states and countries of the European Economic Area
27) European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM), European Pharmacopoeia (EP), 9th Ed.; 2016
28) British Pharmacopoeia Commission, British Pharmacopoeia; 2016
29) United States Pharmacopeial Convention, United States Pharmacopeia – National Formulary (USP-NF), 39th Ed.; 2016
30) Pharmaceutical and Medical Devices Agency (PMDA), Japanese Pharmacopoeia, 17th Ed.; 2016
31) Chinese Pharmcopoeia Commission (ChPC), Chinese Pharmacopoeia (ChP); 2015
32) National Sanitary Surveillance Agency (ANVISA), Brazilian Pharmacopoeia. 5th Ed.; 2010
33) Drug Regulatory Authority (ANMAT), Argentine Pharmacopoeia 7th Ed.; 2003
34) Parenteral Drug Association (PDA), Technical Report No. 50, Alternative Methods for Mycoplasma Testing; 2010
35) Food and Drug Administration (FDA), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (PTC), Attachment 2, Recommended Procedures for Detection of Mycoplasma Contamination in Biological Products Produced in Cell Substrates; 1993
36) Food and Drug Administration (FDA), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), Guidance for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications; 2010
37) Food and Drug Administration (FDA), Center for Drug Evaluation and Research (CDER), and Center for Veterinary Medicine (CVM), Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation; 2001
参考文献
参考文献
技术报告26 | | 27
1) European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM), European Pharmacopoeia (EP), 9th Ed., Chapter 2.6.7: Mycoplasmas; 2016
2) United States Pharmacopeial Convention, United States Pharmacopeia – National Formulary (USP-NF), 39th Ed., Chapter 63: Mycoplasma Tests; 2016
3) Pharmaceutical and Medical Devices Agency (PMDA), Japanese Pharmacopoeia (JP), 17th Ed.: Chapter G3 Biotechnological/Biological Products: Mycoplasma Testing for Cell Substrates used for the Production of Biotechnological/Biological Products; 2016
4) Furness G, The growth and morphology of mycoplasmas replicating in synchrony. J Infect Dis 122: 146-158; 1970
5) MacAuliffe L et al., Biofilm formation by mycoplasma species and its role in environmental persistence and survival, Microbiology 152: 913–922; 2006
6) Nocard EIE and Roux E, Le microbe de la péripneumonie. Ann Inst Pasteur 12: 240-262; 1896. (Translated as ‘The microbe of pleuropneumonia’ in Rev Infect Dis 12: 354-358; 1990)
7) Yus E et al., Impact of genome reduction on bacterial metabolism and its regulation. Science 326: 1263-1268; 2009
8) Rosengarten R et al., The changing image of mycoplasmas: from innocent bystanders to emerging and reemerging pathogens in human and animal diseases. In: Mühldorfer I and Schäfer KP (Eds), Emerging Bacterial Pathogens, Contributions to Microbiology, Vol 8, pp 166-185, Karger, Basel; 2001
9) Uphoff CC and Drexler HG, Prevention of mycoplasma contamination in leukemia-lymphoma cell lines. Human Cell, 14: 244-247; 2001
10) Hay RJ et al., Mycoplasma infection of cultured cells. Nature 339: 487-488; 1989.
11) Pawar, V et al., Trends in the incidence and distribution of mycoplasma contamination detected in cell lines and their products. IOM Lett 3: 77, 1994
12) Rottem S and Barile MF, Beware of mycoplasmas. Trends Biotechnol 11: 143-151, 1993
13) McGarrity G, Mycoplasma Infection of Cell Cultures. Springer; 2012
14) Liu S et al. (2000), Development and qualification of a novel virus removal filter for cell culture applications. Biotechnol Progress 16: 425–434; 2000
15) Drexler HG and Uphoff CC, Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology 39:75–90; 2002
16) Zinöcker S et al., Mycoplasma contamination revisited: mesenchymal stromal cells harboring Mycoplasma hyorhinis potently inhibit lymphocyte proliferation in vitro. PLOS One 6: e16005; 2011
17) Young L et al., Detection of mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols 5: 929-934; 2010
18) Pitt A et al., Assay for detecting mycoplasma by measuring acetate kinase or carbama kinase activity. WO2004094656 A1; 2004
19) Slater KJ et al., Mycoplasma detecting methods and materials. US7585644 B2; 2004
20) Biunno I and DeBlasio P, Fundamental principles of a Stem cell biobank. In Tiziana AL and Brevini (Eds), Stem
Cells in Animal Species: From Pre-clinic to Biodiversity, pp 151-166, Human Press; 2014.
21) Roche, Mycoplasma PCR ELISA. REF 11 663 925 910
22) Wirth M et al., Mycoplasma detection by the mycoplasma PCR ELISA. Biochemica 3: 33-35; 1995
23) Gardella RS and Del Giudice RA, Growth of Mycoplasma hyorhinis cultivar alpha on semisynthetic medium. Appl Environ Microbiol 61: 1976-1979; 1995
24) Metzker ML and Caskey CT, Polymerase chain reaction (PCR). eLS; 2009
25) Dieffenbach CW and Dveksler GS, Setting up a PCR laboratory. Genome Research, 3: S2-S7; 1993
26) Containing all countries inside the Schengen Agreement: EU member states and countries of the European Economic Area
27) European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM), European Pharmacopoeia (EP), 9th Ed.; 2016
28) British Pharmacopoeia Commission, British Pharmacopoeia; 2016
29) United States Pharmacopeial Convention, United States Pharmacopeia – National Formulary (USP-NF), 39th Ed.; 2016
30) Pharmaceutical and Medical Devices Agency (PMDA), Japanese Pharmacopoeia, 17th Ed.; 2016
31) Chinese Pharmcopoeia Commission (ChPC), Chinese Pharmacopoeia (ChP); 2015
32) National Sanitary Surveillance Agency (ANVISA), Brazilian Pharmacopoeia. 5th Ed.; 2010
33) Drug Regulatory Authority (ANMAT), Argentine Pharmacopoeia 7th Ed.; 2003
34) Parenteral Drug Association (PDA), Technical Report No. 50, Alternative Methods for Mycoplasma Testing; 2010
35) Food and Drug Administration (FDA), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals (PTC), Attachment 2, Recommended Procedures for Detection of Mycoplasma Contamination in Biological Products Produced in Cell Substrates; 1993
36) Food and Drug Administration (FDA), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), Guidance for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications; 2010
37) Food and Drug Administration (FDA), Center for Drug Evaluation and Research (CDER), and Center for Veterinary Medicine (CVM), Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation; 2001
参考文献
custombiotech.roche.com
Japan Phone +81 3 6634 1046Fax +81 3 5479 [email protected]
Asia Pacific Phone +65 6371 6638Fax +65 6371 6601 [email protected]
Please contact your local CustomBiotech representative
Europe, Middle East, Africa, Latin AmericaPhone +49 621 759 8580Fax +49 621 759 [email protected]
United States Phone +1 800 428 5433, ext. 14649 (toll-free)Fax +1 317 521 4065 [email protected] Canada Phone +1 450 686 7050Fax +1 450 686 7012 [email protected]
Published byRoche Diagnostics GmbH Sandhofer Straße 11668305 MannheimGermany
© 2018 Mycoplasma Biosafety Services GmbH, Roche Diagnostics GmbH
All rights reserved.
Regulatory Disclaimer For further processing only.
Mycoplasma Biosafety Services GmbHBioTech Center MuthgasseMuthgasse 11/21190 ViennaAustria
Phone +43 136 720 450Fax +43 136 720 453 [email protected]
mycoplasma.cc
Contact address from Mycoplasma Biosafety Service
Sebastian Machado Weber, Dr. Andreas Rohwer, Alexander Bartes, Christina Krause, Raphael GreinerRoche CustomBiotechDr. Carl-Ulrich Zimmermann, Dr. Martina Sauert, Martin Vronka, Dr. Sandra Buczolits, Prof. Dr. Renate RosengartenMycoplasma Biosafety Services GmbH
custombiotech.roche.com
仅用于进一步加工处理使用。
不可直接用于体外诊断程序。
MYCOTOOL是属于罗氏的商标。
上海市自由贸易试验区希雅路330号7号厂房第二层Ⅰ部位电话 021-3397 1000传真 021-3397 1888邮编 200131邮箱 [email protected]
PR
OM
A ID
: 003
062
有效
期至
：20
19年
8月31
日
工业原料部门
