日本薬物動態学会学会賞受賞講演日本薬物動態学会学会賞受賞講演

「薬物の腸管膜透過に関する機構論的解析」「薬物の腸管膜透過に関する機構論的解析」

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20052005年年1010月月2222日日　　　　　　　　　　　　　　　（マウイにて）　　　　　　　　　　　　　　　（マウイにて）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　東京薬科大学薬学部東京薬科大学薬学部

　　　　　　　　　　　　　　　薬物動態制御学教室　　　　　　　　　　　　　　　薬物動態制御学教室

　　　　　　　　　　　　　　　林　正弘　　　　　　　　　　　　　　　林　正弘

　　　　　　

薬物腸管吸収研究に取り組んで薬物腸管吸収研究に取り組んで3030年年

薬物吸収機構研究薬物吸収機構研究

　　・・ParacellularParacellular RouteRouteとの出会いとの出会い

　・吸収促進剤の作用機構研究の始まり　・吸収促進剤の作用機構研究の始まり

　・　・ParacellularParacellular RouteRouteの変化に関する生理学的機構の変化に関する生理学的機構

　・忘れてはいけない　・忘れてはいけないTranscellularTranscellular RouteRouteの変化の変化

　・トランスポーターと吸収促進剤　・トランスポーターと吸収促進剤

　・病態時における　・病態時におけるParacellularParacellular　　RouteRouteとと

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　TranscellularTranscellular RouteRoute透過性の変化透過性の変化

膜透過ルートとその解析法

・電気生理学の重要性

・Voltage Clamp法　　Pm vs. ξ・Impedance解析　　　Impedance vs. Frequency

・透過ルートの寄与率を評価可能

・吸収促進剤による透過ルートの変化を定量化

Paracellular Routeとの出会い

Rb

TJ

LISRL

RtjRa

MV

Paracellular RouteTranscellular Route

MV: Microvilli

LIS: Lateral intercellular spaceRa, Rb: Mucosal and serosal resistancesRtj, RL: Junctional and intercellular resistances

TJ: Tight Junction

Two Permeation Routes and Electric Resistances in Intestinal EpitheliumTwo Permeation Routes and Electric Resistances in Intestinal Epithelium

吸収促進剤の生理学的作用機構

・Paracellular Routeへの作用機構　　Tight Junctionの開口

・吸収促進剤

　Caprate (C10)Decanoylcarnitine (DC)　Tartaric Acid (TA)

・Caco-2細胞とラット腸管膜

吸収促進剤の生理学的作用機構

PIP2 PLC

IP3 + DAG

Ca 2+ pool

Ca 2+

CaM Ca 2+

MLCK activation

Myosin-phosphorylation C

ontr

acti

on o

f ac

tin

fila

men

t

Cadherin

Cadherin

Sodium caprate (C10)

Ca 2+ rich domain

Cadherin

Cadherin

ZO-1OcculudinClaudinEx

pan

sion

Decanoylcarnitine (DC)

Uptake Process(OCT2)

Depletion of ATP

Ca 2+ pool

Dearrangement ofCytoskeletal system

　C10とDCのTJ開口機構

Tartaric acid Intracellular acidosis ATP depletion

Increase of Ca2+ Ca2+-ATPase inhibition

Calpain activation Phospholipase activationActomyosin activation

Opening of TJ Protein degradation and Cytoskeletal destabilization PKC activation

酒石酸 (Tartaric acid)のTJ開口機構

吸収促進剤の生理学的作用機構

・Transcellular Routeの変化　膜Perturbation

・吸収促進剤　Caprate (C10)

・ＢＢＭを蛍光ラベル(膜タンパクと脂質部分)　蛍光偏光度（P value)測定　　　→　膜Perturbation

吸収促進剤の生理学的作用機構

Protein Lipid

DPH

ANS ANS

12-AS

DNS-ClNH2

FITC EMA, DNS-Cl

SH

Sites Labelled by Fluorescent Probes

2-AS

①Paracellular Routeの変化： Tight Junction (TJ) の開口

②Transcellular Routeの変化：　　　P-glycoprotein (P-gp) : Drug excretion pump function　　　　　　　　　　　　　　　　　　　の変化

lumen blood stream

●①

●②

吸収促進剤と P-Glycoprotein (P-gp)

促進剤：

Tartaric Acid (TA)

cont

rol

5 mM

D-TA

5 mM

D-TA

pH7.4 pH4.5co

ntro

l5 m

MD-

TA

cont

rol

(HCl)

5 mM

D-TA

pH7.4 pH4.5

cont

rol

(HCl)

5 mM

D-TA

pH3.5

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

●R

m( ratio of control )

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

00.2

0.40.60.8

11.21.41.6

1.82

●R

m( ratio of control )

CL

(µL/

min

/cm

2 )

CL

(µL/

min

/cm

2 )

Rat Colon Rabbit Colon

pH dependent effects of tartaric acid on permeation clearance (CL) of Rhodamine123 in the serosal (S) to mucosal (M) direction and Rm

cont

rol

(HCl)

・高濃度(20mM)のTAはTight　Junction開口作用を持つが、低濃度(5mM)のTAはP-gp機能の抑制を示した。このP-gpへの作用は、pH依存性を有しており、細胞内アシドーシスが関係している可能性が示された

・上記のP-gpへの作用は、他の促進剤ピロチオデカンにも見出された。

Tartaric Acid (TA) の作用機構

・細胞系 : Caco-2 cell monolayers

・脂質過酸化剤 : tertiary-butyl hydroperoxide (t-BuOOH)

・評価系 : in vitro 拡散チャンバー

・in vitro 障害モデル :

　酸素再供給

in vivo

in vitro

　虚血

低酸素

　再灌流

t-BuOOH (1hr) (1hr)

membraneA B

Apical (A)

Basal (B)

虚血再灌流障害モデル虚血再灌流障害モデル

・ Transcellular route の評価 : P-gp基質である Rhodamine123 の膜透過性

・ Paracellular route の評価 : Tight Junctionにおける膜抵抗　(TEER)

0.5 mM1.0 mM2.0 mM5.0 mM

control

TEE

R ( %

of

init i

a l v

a lue

)

Time ( min )

0102030405060708090

100110

0 15 30 45 60 control 0.5 1.0 2.0 5.00.00.20.40.60.81.01.21.41.61.8 * **

*

***

******

****

****

A → BB → A

Perm

eabi

lity

(x10

-5cm

/sec

)Effects of t -BuOOH on TEER (% of initial value) and permeability of Rhodamine 123 in Caco-2 cell monolayers. Results represent means and S.E. *p<0.1, **p< 0.05, ***p<0.01, ****p<0.001 compared with control conditions.

t -BuOOH

t –BuOOH (mM)

TEE

R ( %

of

init i

a l v

a lue

)

Time ( min )

t -BuOOHalone

+ 5.0 mM+ 10 mM

+ 2.5 mM

+ 30 mM

control(no additive)

control(no additive)+ 1.0 mM

t -BuOOHalone

+ 0.5 mM

+ 0.1 mM

Time ( min )

(A) Tiron (O2● - scavenger) (B) DFO (iron ion chelater)

0102030405060708090

100110

0 15 30 45 600

102030405060708090

100110

0 15 30 45 60

Effects of Tiron (A) and DFO (B) on TEER reduction caused by 0.5 mM t -BuOOH in Caco-2 cell monolayers. Results represent means and S.E.

Data represents mean ± S.E. (n=6~10 for each condition).

(*p<0.05, ***<0.001 compared with control)

00.5

11.5

22.5

33.5

4

CTRL I/R 50g I/R 100g

CLe

ileum

(µL/

min

/cm

)

0

0.5

1

1.5

2

0 10 20 30 40 50 60 70Time (min)

Cum

ultiv

e ex

sorb

ed a

mou

nt(n

g/cm

)CTRLI/R50gI/R100g

****

Effects of in situ ischemia-reperfusion treatment on exsorption of Rhodamine 123 in rat ileum

In vitro障害モデル

・脂質過酸化により、Tight Junctionが開口する・上記機構には、スーパーオキシドや鉄イオンが

　関与している

・脂質過酸化の程度が増大すると、Tight　Junction開口に加えて、P-Glycoprotein機能も低下する

In situ障害モデル・P-Glycoproteinの機能低下は、in situモデルにより、確認された

虚血再灌流障害のまとめ

感染症モデル正常ラット結腸では

実際に得られた結果

・粘膜側および奨膜側からLPSの構造認識を介したFITC-LPSの取り込み過程が存在し、さらにCD14およびTLR4やScavenger receptorも関与している・細胞内へ取り込まれたFITC-LPSはP-gpおよび

mrpによって粘膜側へ排泄される

（背景）　水溶性高分子Lipopolysaccharide (LPS)は、Paracellular routeでわずかに透過可能→敗血症時には腸管由来のLPSが血中に出現→ Paracellular route以外にもTranscellular routeを介した能動的な透過機構の存在の可能性

FITC-LPS Permeability through Rat Colonic Epithelial Cells in Normal and Disease Conditions

Colonic Epithelial Cells

FITC-LPS: 0.5µg/mLn: 7-15 *P<0.01, **P<0.005 vs. Normal

Perm

eatio

n co

effic

ient

(x10

-4cm

/s)

Rm

(% of initial value)

Normal Disease Normal Disease

M to S S to M

0

0.5

1

1.5

2

0

20

40

60

80

100

** *

(M) (S)

LPS Infection

Normal: Saline i.p. Disease: Unlabeled-LPS (O111: B4) 10mg/kg i.p４時間後に結腸部を摘出　→　透過実験

The Effect of Verapamil on the FITC-LPS Permeability through Rat Colonic Epithelial Cells in Disease Conditions

M to S S to M Colonic Epithelial Cells(M) (S)

0

100

200

300

400

NormalDisease

+VerapamilNormal

Disease

+Verapamil

P-gp

LPS Infection

Perm

eatio

n co

effic

ient

(% o

f Nor

mal

)

*

*

FITC-LPS: 0.5mg/mL Verapmail: 1mM n: 3-15, *P<0.005

LPS Infection

CD14TLR4

P-gpmrp

SR

Normal Conditions

LPSLPSMucosal Serosal

Disease ConditionsMucosal Serosal

感染症におけるLPSの腸管膜透過のまとめ

●感染症時において、LPSの透過性は変動し、 その機構には、Receptorによる取り込み機構の低下（粘膜側）、消失（漿膜側）および排泄型Transporterの発現レベルもしくは機能の亢進が関与する

●腸管からのLPSの解毒・排泄を介した感染症の新たな治療および予防法の確立へと繋がる重要な基礎情報となり得る

•酒石酸：

TJの開口→障害↑で P-gp機能低下

•感染症： ReceptorおよびTransporterの発現レベルの変動 → LPSの透過性変動

•潰瘍性大腸炎：

P-gp機能低下　→濃度↑で TJの開口

・虚血再灌流障害：

TJの開口→炎症↑でP-gp機能低下

吸収促進剤投与時および病態時の吸収制御因子の変動

薬物吸収を制御する腸管膜の変化機構

Physiological Change Pathological Change

　Tight Junctionの開口

　P-gpの機能、発現の低下 or 亢進

謝辞

・粟津荘司（東京薬科大学名誉教授）********************** ********************・東京薬科大学薬学部　　堀江利治（千葉大学教授）　　水間　俊（助教授）

　　富田幹雄（講師）　　柳樂眞友子（助手）・東京理科大学薬学部　　芳賀　信（助教授）　　奥平和穂（東邦大学講師）　　海保房夫（講師）

*********************************************・東京薬科大学大学院生

　・花野　学　　（東京大学名誉教授）

　

　

・東京理科大学大学院生

電気生理学　 ・山下伸二　　（摂南大学教授）　 ・高村喜代子　（東京薬科大学名誉教授）　・楠　文代　 （東京薬科大学教授）