OPTIMASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID ... · Obat herbal perlu memiliki pemastian mutu dengan melakukan standardisasi bahan baku. Ekstrak rimpang kunyit sering menjadi

OPTIMASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR

KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Maria Philomia Christanti Raga

NIM : 168114104

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

HALAMAN JUDUL




SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:


NIM : 168114104

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019


ii

Persetujuan Pembimbing




Skripsi yang diajukan oleh:


NIM : 168114104

Telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

Dr. Christine Patramurti, Apt. tanggal 27 November 2019


iii

Pengesahan Skripsi Berjudul

VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID



Oleh:


NIM : 168114104

Dipertahankan di hadapan Pantia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal: 22 November 2019

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.

Panitia Penguji: Tanda tangan

1. Dr. Christine Patramurti, Apt. ….……................

2. Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. ……………….....

3. Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt. ………………….


iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana

layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiatisme dalam naskah saya,

maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 27 November 2019

Penulis



v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Saya yang bertanda tangan dibawah ini, mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

Nama : Maria Philomia Christanti Raga

Nomor Mahasiswa :168114104

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:




beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,

medistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media

lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya maupun

memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai

penulis.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 27 November 2019

Yang menyatakan

(Maria Philomia Christanti Raga)


vi

ABSTRAK

Obat herbal perlu memiliki pemastian mutu dengan melakukan

standardisasi bahan baku. Ekstrak rimpang kunyit sering menjadi bahan baku obat

herbal. Ekstrak rimpang kunyit mengandung senyawa kurkumin,

demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin, yang disebut kurkuminoid.

Senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit diketahui memiliki banyak efek

farmakologis.

Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian penelitian penetapan kadar

kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit dengan menggunakan metode HPLC fase

terbalik yang terdiri dari tahap optimasi dan validasi. Pada penelitian ini, dilakukan

optimasi metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit menggunakan

metode HPLC fase terbalik. Optimasi dilakukan terhadap berbagai perbandingan

komposisi fase gerak asetonitril: methanol: asam orthofosfat 0,1%: aquabidest, dan

menggunakan fase diam oktadesilsilan (C-18). Parameter yang digunakan adalah

waktu retensi (tR) yang efisien serta bentuk peak yang dinilai dari tailing factor

(TF), efisiensi kolom (N) dan resolusi (Rs).

Hasil penelitian menunjukkan kondisi optimum pada sistem tersebut

berupa fase gerak asetonitril: methanol: aquabidest dengan rasio 65:5:30 dengan

kecepatan alir 1 mL/min dan volume injeksi 20µL pada detektor UV 353. Kondisi

ini dapat memisahkan kurkumin dengan dua bentuk senyawa kurkuminoid lainnya.

Kesimpulannya, kondisi ini memenuhi parameter optimasi yang baik dengan nilai

tR, TF, N dan Rs untuk kurkumin adalah 5,323; 1,257; 9337,874 dan 1,806.

Kata Kunci: Ekstrak rimpang kunyit, HPLC, Kurkumin, Optimasi metode.


vii

ABSTRACT

Herbal medicines need to have quality assurance by standardizing its raw

materials. Turmeric rhizome extract which is often be the raw material for herbal

medicines contains curcumin, demetoxycurcumin and bis-demetoxycurcumin

compounds, called curcuminoids. Curcumin in turmeric extract known to have

many pharmacological effects.

This research is part of a series of researches on the determination of

curcumin levels in turmeric extract using the reverse phase HPLC method

consisting of optimization and validation. In this study, an optimization method of

curcumin analysis was carried out in turmeric extract using the reverse phase HPLC

method. Optimization was carried out on various mobile phases of acetonitrile:

methanol: 0.1% orthophosporic acid: aquabidest and using the octadesylsilan (C-

18) as stationary phase. The parameters used are efficient retention time (tR) and

the peak shape assessed from tailing factor (TF), theoretical plate number (N), the

value of resolution (Rs).

The results show that the optimum condition of the system is a ratio of

acetonitrile: methanol: aquabidest 65:5:30, flow rate of 1mL/min and injection

volume of 20 µL at the UV 353 nm. This condition can separate curcumin with two

other curcuminoid compounds. In conclusion, this condition meets an optimum

criteria with tR, TF, N and Rs value from curcumin are 5,323; 1,257; 9337,874 and

1,806.

Keywords: Turmeric rhizome extract, HPLC, Curcumin, Optimization.


viii

HALAMAN PERSEMBAHAN

There is surely a future hope for you and your hope will not be cut off.

-Proverbs 23:18-

Sujud syukur kusembahkan kepadaMu ya Allah, Tuhan Yang Maha Esa

Dengan ini saya persembahkan karya ini untuk

Kedua orang tua saya yang telah memberikan kasih sayang, doa, dan semangat

baik moril maupun materil

Keluarga yang selalu memberi perhatian, kasih sayang, dan juga doa

Adik-adikku yang selalu menjadi alasan untuk semangat dan selalu mau

mendengarkan segala keluh kesah

Alm. Mbah Kakung, Alm. Oma Pilo dan Alm. Opa Pogon, Alm. Sebastianus

Erwinalis, seorang sepupu yang selalu mendukung dan mendoakan saya selama

kuliah, menyertai saya dari surga

Setiap guru dan dosen, yang dengan sabar mendidik saya selama ini

Teman-teman yang selalu mendukung, menyemangati, merajut memori setiap

harinya, tawa serta suka duka yang setiap hari kita miliki, dan solidaritas yang luar

biasa, seperti sebuah keluarga

Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menjadi tempat saya menimba

ilmu selama ini melalui pembelajaran kontekstual dan aplikatif.


ix

PRAKATA

Puji dan Syukur pada Tuhan Yang Maha Esa penulis panjatkan atas berkat

dan penyertaan-Nya dari awal penyusunan sampai tahap akhir penelitian sehingga

naskah skripsi berjudul Optimasi Metode Analisis High Performance Liquid

Chromatography Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar Kurkumin Dalam Ekstrak

Rimpang Kunyit dapat terselesaikan. Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian

Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. yang berjudul “Microparticles to Potentially Improve

Bioavailability of Curcumin and Antidiabetic Activities in Pre-clnical Studies:

Combinging Solid Dispersion Technology and Metabolism Suppressors”

berdasarkan SK No. 035b/ LPPM USD/ IV/2019.

Dalam proses penyusunan naskah skripsi, penulis menerima banyak

dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin

mengucapkan banyak terima kasih kepada :

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma

2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, dosen pembimbing akademik dan

dosen pembimbing skripsi yang telah berperan seperti orang tua dan senantiasa

memberikan masukan, arahan, serta pendampingan dengan sabar selama masa

perkuliahan.

3. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku dosen penguji yang selalu memberikan

masukan, pendampingan, dan kritik yang membangun,

4. Bapak Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt., selaku dosen penguji yang

senantiasa memberikan kritik, masukan, dan saran yang membangun,

5. Mas Bimo (Laboran Laboratorium Kimia Instrumen Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma), Bapak Bimo (Laboran Laboratorium Analisis

Pusat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma), dan Bapak Kayat (Laboran

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma) yang

telah membantu dan memfasilitasi kegiatan penelitian di laboratorium,

6. Papa, Mama, Adik-adik, Mbah Uti, Alm. Mbah kakung, Oma, Opa, Om dan

tante serta sepupu yang selalu mendoakan dan memberikan dukungan moril,


x

7. Alm. Sebastianus Erwinalis seorang sepupu yang selalu mendukung dan

mendoakan saya selama kuliah, dan yang selalu menyertai saya dari surga,

8. Rekan penelitian Yosua Agung Santoso, Sinta Susanti, dan Christin Nesia

Sukma Wijayanti atas dukungan, solidaritas, suka-duka, dan kerja sama selama

proses penelitian,

9. M. Try Atmono, Desty Sandy Oktoviana Liunokas, Agustina Lilik Endah

Permatahati, Raysha McSeer, Fransisca Ina S.P, Maria Ari Kandela, Ruben

James Sibarani, dan Muhammad Helmi Bachtiar yang selalu memberikan

dukungan, bersedia membantu dan menemani saya selama masa perkuliahan,

10. Yohanes Aryo Gunadji, Yuventa Pariera, Maria Pasifica Ndalo, Laura K.

Theodorus, dan Agustinus Nara Tukan yang selalu menyemangati saya selama

masa perkuliahan dan penelitian,

11. Yemima, Arshyera, Maria, Regita, Herta, Jessica, Elsia, Vani, Justine, dan

Chelsea, Ivan, Bocil, Anton, Krisna selaku teman yang sudah selalu ada menjadi

tempat suka duka sejak sekolah dasar.

12. Aye, Steph, Elsa, Kenia, Dippu, Mas Andri selaku teman KKN yang sudah

banyak memberikan dukungan dan juga motivasi untuk menjalani penelitian

ini.

13. Teman-teman kelas FSM C 2016, teman-teman Farmasi Angkatan 2016,

BLADE 18, FRONTRATION dan segala pihak yang tidak dapat saya sebutkan

satu per satu.

Selama proses penyusunan skripsi penulis menyadari bahwa masih

terdapat banyak kekurangan dalam naskah ini. Oleh karena itu, penulis sangat

terbuka terhadap segala masukan, saran dan kritik yang membangun agar naskah

skripsi ini dapat menjadi lebih baik dan bermanfaat. Akhir kata, semoga naskah

skripsi ini dapat bermanfaat dan berguna bagi pembaca.

Yogyakarta, 27 November 2019

Penulis


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL……………………………………………..…..

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………...…

HALAMAN PENGESAHAN………………………………………..

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………...

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI…………………….

ABSTRAK…………………………………………………………...

ABSTRACT…………………………………………………………...

HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………...

PRAKATA…………………………………………………………...

ii

iii

iv

v

vi

vii

viii

ix

DAFTAR ISI………………………………………………………… xi

DAFTAR TABEL.....………………………………………………... xii

DAFTAR GAMBAR………………………………………………… xiii

DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………….... xiv

PENDAHULUAN…………………………………………………… 1

METODE PENELITIAN…………….……………..…….................. 3

HASIL DAN PEMBAHASAN……..…...…………...……………… 7

KESIMPULAN………..….…………...……………………….……. 22

SARAN………………….....…..………………………...................... 22

DAFTAR PUSTAKA………………...…...…………………………. 23

LAMPIRAN…………….…..…………...…………….……………..

BIOGRAFI PENULIS………………………………………………..

25

43


xii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Tabel penggunaan komposisi dan kecepatan alir

fase gerak……………………….…..…..................

6

Tabel II. Daftar karakteristik fase gerak ……………............ 8

Tabel III. Pegamatan panjang gelombang maksimum dari seri

konsentrasi kurkumin……………………………..

10

Tabel IV. Komposisi fase gerak…………....……….………. 15

Tabel V. Optimasi rasio fase gerak.………..…………...….. 18

Tabel VI. Waktu retensi Kromatogram ekstrak kunyit dengan

konsentrasi 100 µg/mL; 45 µg/mL; dan 15 µg/mL

pada fase gerak optimum…………………………. 21

Tabel VII. Analisis hasil tes kesesuaian sistem baku kurkumin

konsentrasi 10µg/mL…………………................... 22


xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur senyawa kurkumin…………………………… 9

Gambar 2. Spektra seri kurkumin 2 µg/mL; 4 µg/mL; dan 6 µg/mL

pada range pembacaan 200-500 nm…………………… 9

Gambar 3. Overlay spektra kurkumin dan piperin pada range

pembacaaan 200-500 nm……………………………… 11

Gambar 4. Struktur kurkumin…………………………………….. 12

Gambar 5. Struktur demetoksikurkumin………………………….. 12

Gambar 6. Struktur bisdemetoksikurkumin………………………. 12

Gambar 7. Interaksi kukrumin dengan fase diam (Interaksi Van

Der Wals)……………………………………………… 13

Gambar 8. Interaksi kukrumin dengan fase gerak (Interaksi

Hidrogen)……………………………………………… 14

Gambar 9. Kromatogram blanko pada fase gerak optimum

asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v)………….. 19

Gambar 10. Kromatogram baku kurkumin 15 µg/mL pada fase

gerak optimum asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30

v/v)…………………………………………………….. 19

Gambar 11. Kromatogram ekstrak kunyit pada fase gerak optimum

asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30v/v)…………... 20

Gambar 12. Kromatogram ekstrak kunyit dengan konsentrasi

100µg/mL; 45µg/mL dan 15µg/mL pada fase gerak

optimum asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v)... 20


xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Kromatogram optimasi ekstrak rimpang kunyit……… 25

Lampiran 2. Kromatogram blanko…………………………………. 31

Lampiran 3. Kromatogram baku kurkumin………………………... 32

Lampiran 4. Kromatogram ekstrak kunyit pada fase gerak optimum

asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v)………….

33

Lampiran 5. Kromatogram baku kurkumin untuk tes kesesuaian

sistem………………………………………………….

36

Lampiran 6. Perhitungan Indeks polaritas fase

gerak…………………………………………………...

42


1

PENDAHULUAN

Standardisasi merupakan suatu tahap untuk meningkatkan nilai tambah

tanaman obat, sehingga penelitian ke arah pembuatan ekstrak terstandar perlu lebih

diintensifkan mengingat permintaan pasar untuk ekstrak terstandar tanaman obat

semakin meningkat (Pribadi, 2009). Standardisasi perlu dilakukan agar produk

memiliki keterulangan yang sama, membuktikan keamanan serta khasiat/efektivitas

obat herbal secara ilmiah. Salah satu tanaman yang paling sering dimanfaatkan

sebagai obat herbal menurut Badan Pengkajian dan Pengembangan Perdagangan

(2017) adalah kunyit. Kunyit biasa digunakan karena mengandung senyawa aktif

yang memiliki banyak manfaat dan ketersediaan kunyit sangat melimpah di

Indonesia.

Bagian yang biasa dimanfaatkan dari kunyit adalah rimpangnya. Menurut

Meng et al., (2018) dalam rimpang kunyit terdapat banyak senyawa metabolit

sekunder seperti, terpenoid yang menyusun minyak atsiri (monoterpenoid,

sesquiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid), senyawa kurkuminoid yang terdiri dari

kurkumin, bisdemetoksikurkumin dan demetoksikurkumin, senyawa fenolik,

flavonoid, sakarida, steroid, asam lemak dan alkaloid. Kurkumin merupakan salah

satu zat aktif dalam rimpang kunyit yang dilaporkan memiliki banyak manfaat. Jika

dibandingkan dengan senyawa kurkuminoid lain, kurkumin dilaporkan memiliki

efek anti-tumorigenik, anti-oksidan, anti-kanker, anti-inflamasi, efek anti-mikroba,

dan anti-malaria, anti kanker (Ghorbani et al., 2014).

Standardisasi kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit menurut Departemen

Kesehatan Republik Indonesia (2008) dinyatakan dapat dilakukan dengan

menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) densitometri dan dibaca pada Panjang

gelombang 425 nm. Kulkarni et al., (2017) menyatakan pemisahan senyawa

kurkuminoid selain menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT), dapat

menggunakan kromatografi kolom, dan juga high performance liquid

chromatography (HPLC).

Beberapa penelitian melakukan determinasi senyawa kurkumin

menggunakan metode spektroskopi UV-Vis (Murti, Y.B et al., 2019; Hazra et al.,

2015), metode raman spektrometri (Wirasuta et al.,2018) dan juga menggunakan


2

metode kromatografi lapis tipis (KLT) (Setyaningsih et al.,2016). Namun, metode

spektroskopi dikatakan kurang selektif karena tidak dapat memisahkan tiga bentuk

senyawa kurkuminoid sedangkan metode KLT dikatakan kurang sensitif karena

tidak dapat dilakukan untuk pemisahan kurkuminoid dengan kadar yang kecil.

Kekurangan metode-metode tersebut mengarahkan penelitian ini untuk melakukan

standardisasi kurkumin dengan menggunakan metode yang lebih sensitif dan

selektif untuk mengukur dan memisahkan senyawa kurkuminoid yang hampir mirip

sehingga dapat ditentukan kadar kurkumin dalam ekstrak.

Beberapa penelitian menunjukkan bahwa kuantifikasi dari senyawa

kurkuminoid dalam ekstrak rhizoma curcuma longa dapat menggunakan metode

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang hasilnya lebih sensitif,

presisi dan akurat. Metode HPLC yang umum digunakan oleh beberapa penelitian

sebelumnya adalah metode HPLC fase terbalik dengan fase diam yang paling sering

digunakan adalah C18 dan fase gerak yang beragam. Beberapa penelitian

sebelumnya (Jangle dan Throat, 2013; Jayaprakasha dan Lingamullu Jagan Mohan

Rao, 2002; Khismatrao et al., 2018; Sethi et al., 2009; Ali, Haque, dan Salem, 2014;

Setyaningsih et al., 2016) memiliki hasil yang kurang baik dari segi efisiensi waktu,

sehingga penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan metode yang memiliki

keunggulan dalam efisiensi waktu dan juga tetap menghasilkan kromatogram yang

memenuhi syarat. Syarat untuk dikatakan sebagai pemisahan yang optimal dapat

dilihat dari bentuk peak, waktu retensi, nilai resolusi dan reprodusibilitas dari

kromatogram. Waktu retensi yang efisien yaitu < 10 menit, bentuk peak dengan TF

≤ 2, nilai N ≥2000 dan nilai resolusi ≥ 1,5 akan memisahkan dengan lebih baik

(Gandjar dan Rohman, 2017; Günzler dan Williams, 2008; Meyer, 2004).

Penulis mengacu pada penelitian yang digunakan oleh Sethi et al., (2009)

yaitu analisis kurkumin dan piperin dalam plasma manusia dengan metode KCKT

fase terbalik. Penelitian tersebut menggunakan fase diam oktadesilan (C18) dan

komposisi fase gerak asetonitril: metanol: asam trifluoroasetat: aquabidest.

Penelitian oleh Sethi et al., (2009) digunakan sebagai acuan karena penelitian ini

merupakan rangkaian penelitian optimasi dan validasi metode analisis campuran

kurkumin dan piperin menggunakan metode HPLC fase terbalik. Penelitian ini


3

berfokus pada standardisasi senyawa kurkumin. Penelitian ini harus dilakukan

dengan metode yang dapat memisahkan tiga bentuk senyawa dari ekstrak rimpang

kunyit agar senyawa kurkumin dapat dianalisis secara selektif.

Metode yang dilakukan pada penelitian ini memiliki perbedaan pada

komposisi fase gerak. Pada pembuatan metode baru perlu dilakukan tahap optimasi.

Optimasi metode analisis yang dilakukan oleh peneliti bertujuan untuk

mendapatkan kondisi optimal dari instrumen HPLC untuk memisahkan 3 bentuk

kurkuminoid dalam ekstrak rimpang kunyit. Optimasi dilakukan terhadap

komposisi fase gerak. Komposisi fase gerak yang optimal diharapkan dapat

menghasilkan pemisahan optimal yang sesuai syarat.

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas pro analysis,

meliputi ekstrak rimpang kunyit dengan kandungan kurkuminoid 95% (PT.

Phytocemindo Reksa), baku kurkumin tingkat kemurnian 98% (Nacalai Inc.),

metanol gradient grade for liquid chromatography (E. Merck), asam ortofosfat

85% (E. Merck) dan asetonitril gradient grade for liquid chromatography (E.

Merck). Bahan lain yang tidak memiliki kualitas pro analysis meliputi

aquabidestilata. Bahan lainnya diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis

Instrumen Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penilitian ini meliputi seperangkat HPLC merk

Shimadzu dengan detektor UV (LC-2010C HT Shimadzu), kolom C-18 (Knaurer)

dengan dimensi 250 x 4,6 mm dan ukuran pori 5 µm; spektrofotometer UV-1800

(Shimadzu); seperangkat komputer (Dell B6RDZIS Connexant system RD01-D850

A03-0382 JP France S.A.S); printer (HP Deskjet 1000 J110a); ultrasonikator

(RETSCH); neraca analitis ultramicro (RADWAG®) seri UYA 2.3Y dengan

kapasitas timbang maksimal 2,1 g, minimal 0,01 mg, dan d = 0,1 µg; neraca analitis

(Scaltec) dengan kapasitas timbang maksimal 60/210 g, minimal 0,001 g, d = 0,01

mg, dan e = 1 mg; jarum suntik (Terumo); syringe filter 0,45 µm (Ministar®);

pompa vakum; whatman membrane filter dengan ukuran pori sebesar 0,45 µm dan


4

diameter sebesar 47 mm; corong buchner; mikropipet (Socorex); dan peralatan

lainnya diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Instrumen Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta.

Tata Cara Penelitian

Pembuatan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril: metanol: asam orthofosfat

0,1%: aquabidest. Asam orthofosfat 0,1% dibuat dengan cara mengambil 582 µL

asam orthofosfat 85% dengan menggunakan mikropipet. Larutan tersebut

dimasukkan kedalam labu takar 500 mL dan ditambahkan aquabidest hingga tanda.

Masing-masing cairan disaring dengan kertas saring whatman yang dibantu dengan

pompa vakum dan diawaudarakan selama 15 menit. Pencampuran fase gerak

dilakukan di dalam sistem HPLC dengan berbagai perbandingan asetonitril:

metanol: asam orthofosfat 0,1%: aquabidest.

Pembuatan Larutan Baku Kurkumin

Pembuatan Larutan Stok Kurkumin 1000µg/mL

Pembuatan stok dilakukan dengan cara menimbang baku kurkumin

sebanyak kurang lebih 1,0 mg ditimbang seksama. Baku kemudian dilarutkan

dalam mikrotube dengan metanol sampai tanda batas 1 mL sehingga diperoleh

larutan stok kurkumin 1000 µg/mL.

Pembuatan Larutan Intermediet Baku Kurkumin 100 µg/mL

Sebanyak 100 µL larutan intermediet baku kurkumin 1000 µg/mL diambil

kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol sampai tanda batas 1 mL

sehingga diperoleh larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL.

Pembuatan Seri Larutan Baku Kurkumin (konsentrasi 45; 30; 15µg/mL)

Sebanyak 450 µL; 300 µL; 150 µL larutan intermediet baku kurkumin

100µg/mL masing-masing dimasukkan dalam mikrotube, kemudian diencerkan

dengan metanol sampai tanda batas 1 mL sehingga diperoleh seri larutan baku

kurkumin dengan kadar 45 µg/mL; 30 µg/mL dan 15 µg/mL.

Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan

Panjang gelombang maksimum kurkumin ditentukan dengan mengambil

sebanyak 200 µL; 400 µL; 600 µL larutan intermediet baku kurkumin 100µg/mL.


5

Masing-masing larutan dimasukkan dalam labu takar 10 mL, kemudian diencerkan

dengan metanol sampai tanda batas 10 mL sehingga diperoleh seri larutan baku

kurkumin dengan konsentrasi 2 µg/mL; 4 µg/mL; dan 6 µg/mL. Panjang gelombang

juga diukur berdasarkan overlay dengan piperin. Sebanyak 150 µL larutan

intermediet baku kurkumin 100 µg/mL diambil dan dimasukkan dalam mikrotube,

kemudian diencerkan dengan metanol sampai tanda batas 1 ml sehingga diperoleh

seri larutan baku kurkumin dengan konsentrasi 15 µg/mL. Larutan tersebut

kemudian dibaca dengan menggunakan spektrofotometer untuk menentukan

overlay panjang gelombang pengamatan dalam range bacaan 200-500 nm.

Preparasi Ekstrak Kunyit

Ekstrak rimpang kunyit ditimbang sebanyak kurang lebih 10 mg dengan

seksama, kemudian dilarutkan dalam labu takar 10,0 mL dengan metanol hingga

tanda batas sehingga diperoleh larutan ekstrak A dengan konsentrasi 1000 ppm.

Sebanyak 1,0 mL larutan ekstrak A diambil kemudian dilarutkan dengan

menggunakan metanol dalam labu takar 10,0 mL sampai tanda batas sehingga

diperoleh larutan ekstrak B dengan konsentrasi 100 ppm. Sebanyak 450 µL dan 150

larutan ekstrak B diambil kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol pada

mikrotube sampai batas 1 mL sehingga diperoleh larutan ekstrak C dengan

konsentrasi 45 ppm dan 15 ppm. Larutan B (100 ppm) dan larutan C (45 dan 15

ppm) disaring menggunakan millipore dan diawaudarakan selama 5 menit dengan

ultrasonikator. Larutan ekstrak siap diinjeksikan pada sistem HPLC pada kondisi

optimum.

Optimasi Metode Analisis

Optimasi Baku Kurkumin

Larutan baku yang telah dipreparasi diinjeksikan sebanyak 20 µL ke dalam

sistem HPLC fase terbalik dengan pengaturan detektor pada panjang gelombang

pengamatan yang telah ditentukan. Optimasi sistem HPLC fase terbalik dilakukan

dengan beberapa komposisi fase gerak asetonitril: metanol: asam orthofosfat 0,1%:

aquabidest. Data kromatogram yang diperoleh diamati bentuk peak, waktu retensi,

dan resolusi sehingga diperoleh kondisi sistem HPLC fase terbalik yang dapat

memberikan pemisahan kurkumin yang baik dan optimal.


6

Optimasi Pemisahan Tiga Bentuk Kurkuminoid

Larutan ekstrak yang telah dipreparasi diinjeksikan sebanyak 20 µL ke

dalam sistem HPLC fase terbalik dengan pengaturan detektor pada panjang

gelombang pengamatan yang telah ditentukan. Optimasi sistem HPLC fase terbalik

dilakukan dengan beberapa komposisi fase gerak asetonitril: metanol: asam

orthofosfat 0,1%: aquabidest. Data kromatogram yang diperoleh diamati bentuk

peak, waktu retensi, dan resolusi sehingga diperoleh kondisi sistem HPLC fase

terbalik yang dapat memberikan pemisahan kurkumin yang baik dan optimal.

Tabel I. Tabel Penggunaan Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak

Laju Alir Asetonitril Metanol OPA 0,1% Aquabidest

1,0

mL/menit

20 30 2,5 47,5

30 50 - 20

40 30 - 30

30 25 - 45

60 10 - 30

65 5 - 30

Reprodusibilitas Bentuk Peak, Waktu Retensi dan Resolusi Kurkumin dalam

Ekstrak

Larutan ekstrak diinjeksikan pada sistem HPLC dengan komposisi fase

gerak yang optimal, dilakukan replikasi sebanyak tiga kali pada konsentrasi rendah,

tengah dan tinggi. Bentuk peak, waktu retensi dan resolusi dari kromatogram yang

didapatkan kemudian dihitung CV-nya sebagai parameter reprodusibilitas.

Tes Kesesuaian Sistem

Larutan baku kurkumin dengan konsentrasi 10 ppm diinjeksikan pada

sistem HPLC dengan komposisi fase gerak yang optimum, dilakukan replikasi

sebanyak enam kali. Efisiensi kolom (N), tailing factor (TF), dan keterulangan

bentuk peak yaitu AUC dan waktu retensi dari kromatogram yang didapatkan

dilihat sebagai parameter kesesuaian sistem dan dihitung CV-nya.

Tata Cara Analisis Data

Penentuan kondisi optimal dilakukan dengan pengubahan komposisi dari

fase gerak. Hasil yang didapatkan digunakan untuk menetapkan kadar kurkumin

dengan melihat reprodusibilitas bentuk peak, waktu retensi dan resolusi dari

kurkumin dalam ekstrak.


7

Bentuk Peak

Menurut Meyer (2004), syarat peak yang baik adalah memiliki nilai TF ≤2.

Waktu Retensi (tR)

Waktu retensi merupakan selang waktu yang diperlukan analit mulai saat

dinjeksikan sampai keluar dari kolom dan sinyalnya dibaca oleh detektor,

dinyatakan sebagai tR. Apabila tR kurang dari 10 menit, maka pemisahan disebut

efisien.

Resolusi (Rs)

Menurut Meyer (2004) serta Gunzler dan Williams (2008) senyawa analit

terpisah dari senyawa-senyawa lain dengan baik apabila mempunyai nilai resolusi

antar peak terdekat adalah ≥ 1,5.

Theoretical Plate Number (N)

Menurut FDA (1994) dan Kazakevich dan Lobrutto (2007). Semakin besar

harga N dari senyawa maka semakin efisien pula pemisahannya. Nilai N yang baik

dinyatakan bila ≥2000 (FDA,1994).

Reprodusibilitas Bentuk Peak, Waktu Retensi dan Resolusi

Reprodusibilitas Bentuk Peak, waktu retensi, dan resolusi ditentukan dari

%CV. Hasil analisis memiliki reprodusibilitas yang baik apabila nilai CV yang

dihasilkan lebih kecil dari 2% (Gandjar dan Rohman, 2017).

Kesesuaian Sistem

Kesesuaian sistem ditentukan dari %CV dari parameter kromatogram yang

telah ditentukan. Hasil analisis memiliki kesesuaian sistem yang baik apabila nilai

CV yang dihasilkan lebih kecil dari 2%.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian optimasi dan validasi metode

analisis kurkumin dan piperin dalam bentuk sediaan ekstrak yang mengandung

kurkumin dan piperin dengan perbandingan 3:1 menggunakan metode HPLC fase

terbalik. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan standardisasi ekstrak. Pada

proses standardisasi ekstrak, dilakukan penelitian terpisah antara standardisasi

kurkumin dan piperin. Penelitian ini berfokus pada standardisasi senyawa

kurkumin.


8

Pembuatan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah asetonitril, metanol,

asam orthofosfat, dan aquabidest. Fase gerak dipilih dengan melalui beberapa

pertimbangan yaitu, kelarutan sampel pada fase gerak, polaritas, transmisi cahaya

dari fase gerak, indeks bias dari fase gerak, viskositas, titik didih, kemurnian dan

stabilitas, kemanan dan pH fase gerak (Günzler dan Williams, 2008). Berdasarkan

pertimbangan untuk memilih fase gerak, peneliti memutuskan untuk menggunakan

komposisi fase gerak asetonitril: metanol: asam orthofosfat 0,1%: aquabidest.

Pemilihan fase gerak ini mengacu pada penelitian yang digunakan oleh

Sethi et al., (2009) dengan komposisi fase gerak asetonitril: metanol: asam

trifluoroasetat: aquabidest. Metanol dan asetonitril digunakan sebagai komponen

campuran fase gerak karena metanol dan asetonitril dapat melarutkan senyawa

kurkuminoid (Priyadarsini, 2014). Komposisi asetonitril dan metanol banyak

digunakan untuk HPLC fase terbalik karena memiliki tekanan kecil. Fase gerak ini

juga memiliki UV Cut off di bawah panjang gelombang yang digunakan. Asam

orthofosfat digunakan untuk menjaga pH dari kurkumin yang stabil pada

lingkungan asam (Tonnesen dan Karlsen, 1985). Asam orthofosfat memiliki pH

yang tidak serendah asam trifluoroasetat sehingga dapat menghindari terjadinya

korosi pada kolom karena pH fase gerak yang terlalu asam. Berikut merupakan

tabel daftar karakteristik fase gerak yang digunakan:

Tabel II. Daftar Karakteristik Fase Gerak

Fase Gerak Polaritas Kekuatan

solven

Konstanta

Dielektrik

UV

Cut off

Indeks

bias

Viskositas

Asetonitril 5,8 0,65 37,5 190 1,341 0,34

Metanol 5,1 0,95 32,7 205 1,326 0,54

Aquabidest 10,2 80,0 1,333 0,89

(Günzler dan Williams, 2008).


9

Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Kurkumin

Penentuan panjang gelombang pengamatan pada penelitian ini dilakukan

dengan mengukur serapan dari kurkumin dalam pelarut metanol menggunakan

spektrofotometer UV-Vis.

Gambar 1. Struktur senyawa kurkumin

Kurkumin memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada strukturnya

(Gambar 1). Kromofor merupakan gugus atau atom dalam senyawa organik yang

mampu menyerap sinar UV dan sinar tampak sedangkan auksokrom merupakan

gugus fungsional yang memiliki elektron bebas, kurkumin memiliki gugus

kromofor pada dua sistem cincin aromatik dan auksokrom pada gugus -OCH3 dan

-OH yang memiliki elektron bebas sehingga kurkumin dapat memberikan serapan

pada daerah sinar visibel.

Gambar 2. Spektra seri kurkumin 2 µg/mL;4 µg/mL; dan 6 µg/mL pada

range pembacaan 200-500 nm.

Kurkumin 6 µg/mL

Kurkumin 4 µg/mL

Kurkumin 2 µg/mL


10

Tabel III. Pengamatan panjang gelombang maksimum dari seri

konsentrasi Kurkumin

Konsentrasi Kurkumin

(µg/mL)

Panjang Gelombang

Maksimum (nm) Absorbansi

2 424,90 0,159

4 424,90 0,351

6 424,90 0,538

Pada pengamatan panjang gelombang digunakan tiga seri konsentrasi

kurkumin yaitu 2, 4, dan 6 µg/mL untuk mengamati bentuk spektra kurkumin dan

melihat apakah perbedaan konsentrasi dapat mempengaruhi nilai panjang

gelombang maksimum (Gambar 2). Panjang gelombang diukur pada daerah

panjang gelombang 200-500 nm dengan detektor sinar UV dan Visibel. Menurut

Departemen Kesehatan Republik Indonesia (2008) dalam Farmakope Herbal

Indonesia dinyatakan bahwa kurkumin memiliki panjang gelombang maksimum

425 nm. Tabel III menunjukkan hasil panjang gelombang maksimum 424,90 dari

semua seri konsentrasi yang digunakan. Pengukuran panjang gelombang

maksimum dalam Farmakope Indonesia edisi V (2014) dimaknai memenuhi syarat

jika kurang dari 1 nm dari panjang gelombang yang ditentukan. Hasil pengamatan

panjang gelombang kurkumin memiliki perbedaan kurang dari 1 nm dari panjang

gelombang teoritis, sehingga sudah sesuai persyaratan. Hal ini menunjukkan bahwa

perbedaan konsentrasi tidak menyebabkan perubahan panjang gelombang kearah

yang lebih besar ataupun lebih kecil. Selain dilakukan pengamatan panjang

gelombang pada senyawa tunggal, dilakukan juga pengamatan panjang gelombang

campuran senyawa kurkumin dan piperin. Hal ini dilakukan karena penelitian ini

merupakan rangkaian penelitian optimasi dan validasi metode analisis kurkumin

dan piperin dalam bentuk sediaan ekstrak yang mengandung kurkumin dan piperin

dengan perbandingan 3:1.

Pada penelitian ini dilakukan penentuan panjang gelombang pengamatan

dengan melihat panjang gelombang overlay, sehingga dapat ditentukan panjang

gelombang pengamatan campuran kurkumin dan piperin. Pada penentuan panjang

gelombang overlay ini, absorbansi kurkumin dan piperin dengan konsentrasi

tertentu dibaca pada range pengukuran 200-500 nm. Gambar 3 menunjukkan


11

daerah overlap antara kurkumin dan piperin. Sebuah titik panjang gelombang

ditentukan dari daerah overlap tersebut untuk mendeteksi kurkumin dan piperin.

Panjang gelombang tersebut harus dapat mendeteksi kurkumin dan piperin

sekaligus dengan optimum.

Panjang gelombang yang ditentukan untuk pengukuran adalah 353 nm.

Penentuan panjang gelombang ini dilakukan pada campuran kurkumin dan piperin

dengan perbandingan 3:1, dengan konsentrasi masing-masing 15 ppm dan 5 ppm.

Kurkumin dan piperin masing-masing memiliki panjang gelombang maksimum

sendiri, namun panjang gelombang pada sistem HPLC tidak mempengaruhi waktu

retensi maupun pemisahan dari analit. Panjang gelombang hanya akan

mempengaruhi respon bacaan peak, sehingga panjang gelombang detektor tidak

harus sesuai dengan panjang gelombang maksimum dari analit.

Gambar 3. Overlay spektra kurkumin dan piperin pada range pembacaan

200-500 nm.

Panjang gelombang pengamatan ini dapat memberikan keuntungan dimana

metode ini dapat digunakan untuk standardisasi kurkumin piperin dalam campuran

dan juga dapat digunakan untuk menentukan kadar kurkumin maupun piperin pada

sediaan dengan komposisi kurkumin dan piperin 3:1 karena tidak ada pengaruh

antara panjang gelombang dengan parameter yang diinginkan seperti tailing factor


12

(TF), resolusi, nilai N maupun waktu retensi. Standardisasi senyawa kurkumin

tunggal juga tetap dapat digunakan dengan mengganti panjang gelombang deteksi

menjadi panjang gelombang maksimum kurkumin.

Optimasi Rasio Fase Gerak

Sistem kromatografi yang digunakan dalam analisis senyawa kurkumin

dalam ekstrak rimpang kunyit adalah sistem kromatografi fase terbalik

menggunakan fase diam oktadesilsilan (C18). Kromatografi fase terbalik artinya

fase diam lebih non polar daripada fase geraknya. Kurkumin merupakan analit yang

bersifat lebih polar daripada senyawa kurkuminoid lainnya namun tetap memiliki

afinitas yang besar terhadap fase diam.

Gambar 4. Struktur kurkumin

Gambar 5. Struktur demetoksikurkumin

Gambar 6. Struktur bisdemetoksikurkumin

Kurkumin memiliki bagian non polar yang berinteraksi dengan fase diam

dan memiliki bagian polar yang berinteraksi dengan fase geraknya. Interaksi yang

kemungkinan terjadi antara kurkumin dan fase diam adalah interaksi Van Der


13

Waals. Oleh karena itu, diperlukan rasio fase gerak yang mampu berinteraksi kuat

dengan kurkumin dan juga mampu mengelusikan kurkuminoid keluar dari kolom.

Waktu retensi kurkumin dan pemisahan dengan senyawa lainnya

dipengaruhi oleh interaksinya dengan fase diam dan fase gerak. Perbedaan dari

kurkumin dengan bentuk isomer lainnya adalah bentuk demetoksikurkumin tidak

memiliki gugus metoksi pada salah satu cincin aromatiknya sedangkan bentuk

bisdemetoksikurkumin tidak memiliki gugus metoksi pada kedua cincin

aromatiknya, perbedaan dalam struktur tersebut yang mengakibatkan perbedaan

kemungkinan interaksi yang terjadi antara senyawa dengan fase diam maupun fase

gerak.

Gambar 7. Interaksi kurkumin dengan fase diam (Interaksi Van Der Waals)

Bagian non polar pada ketiga senyawa kurkuminoid akan berinteraksi

dengan fase diam C18 melalui interaksi Van der Waals (Gambar 7) sehingga

ketiganya dapat tertahan pada fase diamnya. Perbedaan waktu retensi ketiga

senyawa tersebut diduga karena adanya gugus metoksi pada kurkumin yang


14

berinteraksi dengan fase diam sehingga kurkumin dapat tertahan lebih lama pada

fase diam, disusul dengan demetoksikurkumin kemudian bisdemetoksi kurkumin

yang memiliki waktu retensi paling cepat.

Penelitian ini mengacu pada penelitian oleh Sethi et al (2019) dimana

dilakukan pemisahan antara kurkumin dan piperin dalam plasma manusia

menggunakan fase gerak asetonitril: metanol: asam trifluoroasetat: aqua dengan

perbandingan 17,6: 35,3: 0,1: 47,0 v/v dengan laju alir 2,5 ml/min dan fase diam

C18. Fase gerak dibuat dalam 6 komposisi yang berbeda seperti yang tertera dalam

tabel III. Kurkumin yang dialiri fase gerak akan berinteraksi melalui interaksi

hidrogen (Gambar 8). Senyawa kurkuminoid juga harus berinteraksi dengan fase

gerak yang nantinya akan melarutkan dan mengelusikan kurkuminoid keluar dari

fase diam. Kurkuminoid diduga dapat dielusikan keluar dari fase diam karena

adanya interaksi hidrogen antara kurkuminoid dengan fase gerak yang digunakan.

Interaksi hidrogen lebih kuat dibandingkan dengan interaksi Van der Waals

sehingga interaksi kurkuminoid dengan fase gerak lebih kuat daripada interaksi

kurkuminoid dengan fase diamnya, dan kurkuminoid dapat terelusikan dari kolom.

Gambar 8. Interaksi kurkumin dengan fase gerak (Interaksi Hidrogen).

Fase gerak dibuat dalam beberapa komposisi kemudian ditentukan

komposisi fase gerak yang dapat memberikan hasil pemisahan yang paling

optimum untuk kurkumin. Fase gerak pada metode Sethi et al (2019) dimodifikasi

dengan merubah asam trifluoroasetat menjadi asam orthofosfat. Menurut

Setyaningsih et al., (2016) penambahan asam dapat meningkatkan pemisahan dari


15

senyawa kurkuminoid. Hal ini dapat terjadi jika analit asam hadir dalam lingkungan

asam akan menghasilkan proton (H +) yang cukup dalam larutan sehingga analit

asam akan mempertahankan protonnya dan selanjutnya terjadi ion supresi yang

meningkatkan retensi pada HPLC fase terbalik dan membuat pemisahan semakin

baik (Claydon,2015). Penambahan asam juga dapat bersifat korosif pada fase diam

karena dapat melepaskan fase diam dari silika (Claydon,2015), untuk menghindari

hal tersebut fase gerak dimodifikasi dengan menggunakan asam ortofosfat (OPA),

modifikasi ini dijaga agar pH komposisi fase gerak tidak kurang dari 2. Komposisi

fase gerak dibuat agar memiliki pH ±4.

Optimasi fase gerak ditentukan dengan menggunakan ekstrak kunyit yang

mengandung 3 bentuk senyawa kurkuminoid yaitu bisdemetoksikurkumin,

demetoksikurkumin dan kurkumin. Hal ini dilakukan agar dapat dilihat pemisahaan

antara tiga bentuk senyawa kurkuminoid seperti pada tabel IV dan ditentukan

kondisi yang paling optimum. Menurut Meyer (2004), syarat peak yang baik adalah

memiliki nilai TF ≤2, maka pemisahan disebut efisien. Menurut Meyer (2004) serta

Gunzler dan Williams (2008) senyawa analit terpisah dari senyawa-senyawa lain

dengan baik apabila mempunyai nilai resolusi antar peak terdekat adalah ≥ 1,5.

Menurut Kazakevich dan Lobrutto (2007) waktu yang dikehendaki penulis untuk

menghasilkan peak yang efisien dari segi waktu dalam skala industri adalah <10

menit. Semakin besar harga N dari senyawa maka semakin efisien pula

pemisahannya. Nilai N yang baik dinyatakan bila ≥2000 (FDA,1994).

Tabel IV. Tabel Komposisi Fase Gerak

Tabel IV menggambarkan komposisi fase gerak yang digunakan beserta

indeks polaritas dari campuran fase gerak. Tabel V merupakan hasil optimasi fase

gerak yang didapatkan menggunakan komposisi fase gerak dari tabel IV. Pada tabel

Komposisi

Fase

Gerak

Asetonitril Metanol OPA

0,1% Aquabidest

Indeks

Polaritas

I 20 30 2,5 47,5 7,79

II 30 50 - 20 6,33

III 40 30 - 30 6,91

IV 30 25 - 45 7,605

V 60 10 - 30 7,05

VI 65 5 - 30 7,085


16

V konsentrasi ekstrak tidak memiliki ketentuan sehingga dapat digunakan beragam

konsentrasi untuk melakukan optimasi agar dapat dilihat pemisahan dari peak. Hal

ini memiliki syarat bahwa konsentrasi tersebut masih dapat dipisahkan oleh fase

gerak. Berdasarkan tabel V komposisi fase gerak asetonitril: metanol: aquabidest:

asam orthofosfat 0,1% (20:30:47,5:2,5v/v) dengan indeks polaritas 7,79 hanya

menghasilkan 1 peak kurkuminoid yang muncul pada menit ke 11,802.

Kromatogram muncul pada waktu retensi yang kurang dikehendaki karena penulis

menginginkan waktu retensi < 10 menit, selain itu juga komposisi ini belum dapat

memisahkan ketiga bentuk senyawa kurkuminoid. Hal ini diduga karena fase gerak

tidak memiliki eluent strength yang cukup kuat untuk memisahkan kromatogram

menjadi tiga bentuk senyawa kurkuminoid. Eluent strength ini dikatakan kurang

cukup kuat diduga karena komposisi asetonitril yang kurang, sedangkan asetonitril

berperan besar dalam pemisahan karena memiliki eluent strength yang cukup besar.

Meskipun menurut Setyaningsih et al., (2016) penambahan asam dapat

meningkatkan pemisahan dari senyawa kurkuminoid, komposisi ini belum dapat

memisahkan ketiga bentuk senyawa kurkuminoid. Komposisi fase gerak yang

mengandung campuran asetonitril dan fosfat juga diketahui kurang tepat karena

akan cenderung membentuk pengendapan.

Fase gerak selanjutnya dimodifikasi dengan menghilangkan komposisi

asam menjadi fase gerak dengan komposisi asetonitril: metanol: aquabidest. Jumlah

asetonitril pada komposisi ini ditingkatkan untuk meningkatkan eluent strength dan

indeks polaritas dari fase gerak. Pada sistem fase gerak asetonitril: metanol:

aquabidest (30:50:20v/v) dengan indeks polaritas 6,33 mulai dapat muncul

pemisahan ketiga bentuk senyawa kurkuminoid namun belum dapat memisah

dengan sempurna. Metode ini memiliki separasi yang belum begitu baik. Menurut

Meyer (2004) untuk meningkatkan pemisahan dari kromatogram, salah satu hal

yang paling perlu dilakukan adalah memodifikasi fase gerak dengan meningkatkan

indeks polaritas dan eluent strenght. Peningkatan eluent strength dilakukan dengan

menambahkan komposisi asetonitril, sedangkan indeks polaritas dicoba

ditingkatkan dengan merubah komposisi dengan meningkatkan jumlah fase gerak

dengan indeks polaritas yang tinggi. Pada peningkatan indeks polaritas perlu


17

diperhatikan pula jumlah air yang ditambahkan, karena terlalu banyak komposisi

air dapat mengganggu kelarutan kurkumin dalam fase gerak.

Indeks polaritas dari fase gerak kemudian ditingkatkan menjadi 6,91 dengan

komposisi asetonitril: metanol: aquabidest (40:30:30v/v), namun hasil yang

didapatkan masih belum memisah dengan baik. Indeks polaritas kemudian

ditingkatkan lagi menjadi 7,605 dengan fase gerak asetonitril: metanol: aquabidest

(30:25:45v/v), hasil yang didapat hanya muncul 2 peak, hal ini diduga karena terlalu

banyak komposisi air pada fase gerak. Komposisi air yang semakin tinggi dapat

meningkatkan indeks polaritas dari fase gerak, menurunkan interaksi antara

kurkuminoid dengan fase diam sehingga tidak semua bentuk kurkuminoid dapat

berinteraksi dengan fase diam dan juga dapat menganggu kelarutan dari analit.

Fase gerak kemudian diubah lagi komposisinya dengan menurunkan

komposisi air, menjadi asetonitril: metanol: aquabidest (60:10:30 v/v) yang

memiliki indeks polaritas 7,05. Komposisi ini memiliki hasil yang baik, ketiga

bentuk kurkuminoid muncul dan dapat terpisah satu sama lain, selanjutnya untuk

meningkatkan hasil dari pemisahan dilakukan peningkatan indeks polaritas dan

eluent strength dengan menambahkan asetonitril sehingga komposisinya menjadi

asetonitril: metanol: aquabidest (65:5:30v/v), dari perubahan tersebut didapatkan

pemisahan yang baik antara ketiga bentuk senyawa kurkuminoid. Pada sistem

tersebut, bisdemetoksikurkumin memiliki waktu retensi 4,592 dengan nilai resolusi

6,439 dan memiliki tailing factor 1,219 serta nilai N 7855,707. Demetoksikurkumin

memiliki waktu retensi 4,936 dengan nilai resolusi 1,659 dan memiliki tailing

factor 1,264 serta nilai N 9037,903. Kurkumin sendiri memiliki waktu retensi 5,323

dengan nilai resolusi 1,806 dan memiliki tailing factor 1,257 serta nilai N 9337,874.

Komposisi fase gerak ini sudah menghasilkan kromatogram yang memenuhi syarat

sehingga komposisi ini dapat dinyatakan sebagai fase gerak optimum dan dapat

digunakan untuk melakukan standardisasi senyawa kurkumin.


18

Tabel V. Optimasi rasio fase gerak

Keterangan : IP= Indeks Polaritas; tR= Waktu retensi; TF= Tailing Factor; Rs= Resolusi; N = Theoretical Plate Number; B=

Bisdemetoksikurkumin; D= Demetoksikurkumin; K=Kurkumin

Konsentrasi

Ekstrak

Kunyit

(µg/mL)

Komposisi IP Pemisahan tR TF Rs N

15 Acn:Met:Aquabidest:OPA 0.1 %

(20:30:47.5:2.5v/v) 7,79

B - - - -

D - - - -

K 11,802 1,026 19,688 5256,616

45 Acn : Met : Aquabidest

(30:50:20v/v) 6,33

B 4,256 1,114 5,609 5080,728

D 4,861 0 0 0

K 5,350 0,914 0 3422,644


(40:30:30v/v) 6,91

B 8,089 0 1,552 7135,374

D 8,520 0 1,075 7208,492

K 8,989 0 1,140 7307,608


(30:25:45v/v) 7,605

B - - - -

D 6,302 0 4,656 326,949

K 6,634 0 0,763 3812,645


(60:10:30v/v) 7,05

B 5,025 1,066 6,109 8436,052

D 5,379 1,204 1,562 8452,053

K 5,777 1,188 1,644 8522,125

15

Acn : Met : Aquabidest (65:5:30

v/v)

7,085

B 4,592 1,219 6,439 7855,707

D 4,936 1,264 1,659 9037,903

K 5,323 1,257 1,806 9337,874


19

Reprodusibilitas Bentuk Peak, Waktu Retensi, dan Resolusi Peak

Kromatogram

Larutan ekstrak yang diinjeksikan pada sistem komposisi fase gerak optimal

dilihat reprodusibilitas waktu retensi, resolusi, kesesuaian sistem dan bentuk peak

dari kurkuminoid dalam sampel pada tiga konsentrasi ekstrak yang berbeda.

Gambar 9. Kromatogram blanko pada fase gerak optimum

asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v)

Blanko perlu diinjeksikan kedalam sistem sebelum ekstrak rimpang kunyit

diinjeksikan kedalam sistem. Gambar 9 menggambarkan kromatogram blanko yang

diinjeksikan pada sistem fase gerak optimum. Sebelum ekstrak rimpang kunyit

diinjeksikan kedalam sistem HPLC, baku kurkumin terlebih dahulu diinjeksi agar

dapat diketahui secara kualitatif waktu retensi kurkumin. Hal ini dilakukan untuk

menentukan secara kualitatif peak mana yang menunjukkan senyawa kurkumin.

Gambar 10 menunjukkan kromatogram baku kurkumin 15 ppm yang diinjeksikan

pada sistem fase gerak optimum. Peak pada kromatogram tersebut menunjukkan

bahwa kurkumin peak kurkumin muncul pada menit ke 5,349.

Gambar 10. Kromatogram baku kurkumin 15 µg/mL pada fase gerak optimum

asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v)

Kurkumin


20

Ekstrak kunyit 15 ppm diinjeksikan pada fase gerak optimum sehingga

didapatkan kromatogram seperti pada Gambar 11. Dimana bila dibandingkan

dengan baku, peak yang menunjukkan senyawa kurkumin muncul pada menit ke

5,323 sedangkan pada menit ke 4,592 dan 4,936 merupakan peak yang

menunjukkan senyawa bisdemetoksikurkumin dan demetoksikurkumin.

Bisdemetoksikurkumin muncul pada peak yang paling awal karena memiliki

interaksi dengan fase diam yang lebih kecil dibandingkan dengan

demetoksikurkumin. Bisdemetoksikurkumin tidak memiliki gugus metoksi yang

dapat meningkatkan interaksi dengan fase diam, sedangkan demetoksikurkumin

memiliki satu gugus metoksi yang menjadikan demetoksikurkumin lebih tertahan

pada fase diam, disusul dengan kurkumin yang memiliki dua gugus metoksi yang

menahan kurkumin sehingga memiliki waktu retensi yang lebih lama.

Gambar 11. Kromatogram ekstrak kunyit pada fase gerak optimum

asetonitril:metanol:aquabidest (65:5:30 v/v) B= Bisdemetoksikurkumin; D=

Demetoksikurkumin; K=Kurkumin

Gambar 12. Kromatogram ekstrak kunyit dengan konsentrasi 100 µg/mL; 45 µg/mL;

dan 15 µg/mL pada fase gerak optimum asetonitril: metanol: aquabidest (65:5:30) B=

Bisdemetoksikurkumin; D= Demetoksikurkumin; K=Kurkumin

K

B

D

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000uV

B

D

K


21

Gambar 12 merupakan hasil kromatogram dari beberapa konsentrasi ekstrak

kunyit yang diinjeksikan pada fase gerak yang optimum. Kromatogram tersebut

menunjukkan bahwa perbedaan konsentrasi sedikit mempengaruhi waktu retensi.

Tabel VI menunjukan perbedaan waktu retensi yang disebabkan oleh perbedaan

konsentrasi dengan nilai RSD untuk ketiga bentuk senyawa kurkuminoid berturut

turut adalah 0,494; 0,468 dan 0,346. Gambar 12 tersebut menunjukan bahwa

Tabel VI. Waktu retensi kromatogram ekstrak kunyit dengan konsentrasi

100 µg/mL; 45 µg/mL; dan 15 µg/mL pada fase gerak optimum

Keterangan : B= Bisdemetoksikurkumin; D= Demetoksikurkumin;

K=Kurkumin

Kesesuaian Sistem

Kesesuaian sistem biasa diaplikasikan untuk melihat efisiensi kolom,

resolusi dan keterulangan dari sistem kromatografi. Kesesuaian sistem ini berguna

untuk memastikan kemampuan analisis dari metode maupun performa dari

instrumen yang digunakan, tes kesesuaian sistem ini dapat dilakukan secara berkala

guna memastikan metode pengujian dan instrument bekerja dengan baik. Parameter

yang dilihat pada pengujian kesesuaian sistem ini beragam seperti resolusi,

keterulangan (RSD dari respon peak dan waktu retensi), efisiensi kolom (N) dan

tailing factor (TF) (Bose,2014).

Pada penelitian ini penulis menggunakan parameter efisiensi kolom (N),

tailing factor (TF), dan keterulangan yaitu dengan melihat RSD dari AUC dan juga

waktu retensi. Parameter RSD dari AUC dan waktu retensi ini juga dapat membantu

dalam acuan dari waktu retensi dan AUC dari kromatogram karena AUC dan waktu

retensi tidak memiliki nilai optimum yang ditetapkan. Kesesuaian sistem ini

dilakukan pada kondisi fase gerak yang optimum. Larutan baku kurkumin

Konsentrasi Waktu retensi

B D K

15 4,592 4,936 5,323

45 4,547 4.890 5,289

100 4,573 4,913 5,294

X 4,571 4,913 5,302

SD 0,023 0,023 0,018

CV 0,494 0,468 0,346


22

diinjeksikan sebanyak enam kali replikasi untuk melakukan tes kesesuaian sistem.

Menurut USP (2017) CV yang baik memiliki nilai < 2%. Pada tabel VII didapatkan

hasil yang menunjukan bahwa setiap replikasi pada tes kesesuaian sistem memiliki

nilai CV untuk tailing factor sebesar 0,22; Nilai N sebesar 0,63; waktu retensi

sebesar 0,13% dan untuk AUC sebesar 0,56%.

Tabel VII. Analisis Hasil Tes Kesesuaian Sistem Baku Kurkumin

Konsentrasi 10µg/mL

KESIMPULAN

Dari hasil penelitian ini dapat ditarik kesimpulan bahwa kondisi optimum

pada analisis kurkumin dengan metode HPLC fase terbalik menggunakan kolom

C18 (250x4,6 mm, 5µm) yang dapat memisahkan tiga bentuk senyawa kurkuminoid

dalam ekstrak rimpang kunyit adalah fase gerak asetonitril: metanol: aquabidest

(65: 5: 50 v/v) pada kecepatan alir 1,0 mL/menit, menggunakan detektor UV pada

panjang gelombang 353 nm.

SARAN

Perlu dilakukan tahap validasi metode setelah tahap optimasi untuk dapat

dikembangkan pada penetapan kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit.

Replikasi tR AUC Tf N

1 5,65 231654 1,205 8309,94

2 5,64 231993 1,202 8244,12

3 5,66 231806 1,201 8165,74

4 5,65 233889 1,199 8270,25

5 5,65 234457 1,199 8281,56

6 5,64 234157 1,198 8298,79

X 5,65 232992,7 1,200 8261,73

Sd 0,007 1304,06 0,003 52,32

Cv 0,13 0,56 0,22 0,63


23

DAFTAR PUSTAKA

Ali, I., Haque, A., Saleem, K., 2014. Separation and Identification of Curcuminoids

in Turmeric Powder by HPLC Using Phenyl Column. Analytical Methods,

6(8), 2526-2536.

Badan Pengkajian dan Pengembangan Perdagangan, 2017. Info Komoditi Tanaman

Obat.

Bose Anirbandeep, 2014. HPLC Calibration Process Parameters in Terms of

System Suitability Test. Austin Chromatography, 1(2), 1-4.

Claydon, A., 2015. Why is pH important for HPLC buffers?.

https://www.chromacademy.com/chromatography-pH-importance-HPLC-

buffers.html diakses pada 12 November 2019 pukul 19:30 WIB.

FDA, 1994. Reviewer Guidance, Validation of Chromatographic Methods. Center

for Drug Evaluation and Research, U.S. Food and Drug Administration, 26-

28.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2008. Farmakope Herbal Indonesia.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2014. Farmakope Indonesia Edisi V.

Gandjar, I.G., Rohman, A., 2017. Kimia Farmasi: Analisis. Pustaka Pelajar,

Yogyakarta.

Ghorbani, Z., Hekmatdoost, A., Mirmiran, P., 2014. Anti-hyperglycemic and

insulin sensitizer effects of turmeric and its principle constituent curcumin.

International Journal of Endocrinology and Metabolism, 12(4), 1–9.

Günzler, H., Williams, A., 2008. Handbook of Analytical Techniques. Wiley-VCH,

Germany.

Hazra, K., Kumar, R., Sarkar, B. K., Chowdary, Y. A., Devgan, M., Ramaiah, M.,

2015. Uv-Visible Spectrophotometric Estimation of Curcumin in

Nanoformulation. International Journal of Pharmacognosy, 2 (3), 127-130.

Jangle, R.D., Throat, B.N., 2013. Reversed-phase High-performance Liquid

Chromatography Method for Analysis of Curcuminoids and Curcuminoid-

loaded Liposome Formulation. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences,

60-66.

Jayaprakasha, G.K., Lingamullu Jagan Mohan Rao, K.K.S., 2002. Improved HPLC

Method for the Determination of Curcumin, Demethoxycurcumin, and

Bisdemethoxycurcumin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50,

3668–3682.

Kazakevich, Y., Lobrutto, R., 2007. HPLC for Pharmaceutical Scientists. John

Wiley & Sons, Ltd.

Khismatrao, A., Bhairy, S., Hirlekar, R., 2018. Development and Validation of Rp-

Hplc Method for Simultaneous Estimation of Curcumin and Piperine.

International Journal of Applied Pharmaceutics, 10(5), 43.

Kulkarni, S. J., Maske, K. N., Budre, M. P., Mahajan, R. P., 2017. Extraction and

Purification of Curcuminoids from Turmeric (Curcuma longa L.).

International Journal of Pharmacology and Pharmaceutical Technology,

1(2), 81-84.

Meng, F. C., Zhoum Y. Q., Ren, D., Wang, R., Wang, C., Lin, L. G., Zhang, X. Q.,

Ye, W. C., Zhang, Q. W., 2018. Turmeric: A review of Its Chemical

Composition, Quality Control, Bioactivity, and Pharmaceutical Application.


24

Natural and Artificial Flavoring Agnts and Food Dyes, 299-350.

Meyer, Veronika R., 2004. Practical High-Performance Liquid Chromatography.

John wiley & SOns, Ltd.

Murti, Y. B., Hartini, Y. S., Hinrichs, W. L. J., Frijlink, H. W., Setyaningsih, D.,

2019. UV-Vis Spectoscopy to Enable Determination of the Dissolution

Behavior of Solid Dispersions Containing Curcumin and Piperine. J Young

Pharm, 11 (1), 26-30.

Pribadi, E. R., 2009. Pasokan dan Permintaan Tanaman Obat Indonesia Serta Arah

Penelitian dan Pengembangannya. Prespektif, 8 (1), 52-64.

Priyadarsini, K.I., 2014. The chemistry of curcumin: From extraction to therapeutic

agent. Molecules, 19(12), 20091–20112.

Sethi, P., Dua, V.K., Mohanty, S., Mishra, K., Jain, R., Edwards, G., Unit, F., Steel,

R., 2009. Development and Validation of a Reversed Phase HPLC Method for

Simultaneous Determination of Curcumin and Piperine in Human Plasma for

Application in Clinical Pharmacological Studies. Journal of Liquid

Chromatography & Related Technologies, 2961–2974.

Setyaningsih, D., Murti, Y.B., Martono, S., Hinrichs, W.L.J., Hertiani, T., Fudholi,

A., 2016. A Novel Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography

Method To Accurately Determine Low Concentrations Of Curcumin In Rat

Plasma. International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 8(5),

377–386.

Tonnesen, H.H., Karlsen, J., 1985. Studies on curcumin and curcuminoids.

International Journal of Pharmaceutics, 180, 132–134.

Unites States Pharmacopeial Convention, 2017. The United States Pharmacopeia

40 National Formulary 35 (USP40-NF35). Unites States Pharmacopeial

Convention Inc, USA.

Wirasuta, I M., A. G., Dewi., C. I. T.R., Laksmiani, N. P. L., Srinadi, I G. A. M.,

Putra, D. P., 2018. The Prediction of Curcumin Content in the Turmeric

Rhicome with Raman Handheld Spectroscopy. Indonesian Journal of

Pharmaceutical Science and Technology, 5 (3), 88-92.


25

Lampiran 1. Kromatogram Optimasi Ekstrak Rimpang Kunyit

1. Ekstrak rimpang kunyit 15 µg/mL dalam komposisi fase gerak

asetonitril: metanol: OPA 0,1%: aquabidest (20: 30: 47,5: 2,5 v/v)


26


asetonitril: metanol: aquabidest (30: 50: 20 v/v)


27




28




29




30




31

Lampiran 2. Kromatogram Blanko


32

Lampiran 3. Kromatogram Baku Kurkumin


33

Lampiran 4. Kromatogram Ekstrak Kunyit pada Fase Gerak Optimum

asetonitril: metanol: aquabidest (65:5:30)

1. Kromatogram ekstrak kunyit dengan konsentrasi 100 µg/mL


34



35



36

Lampiran 5. Kromatogram Baku Kurkumin untuk Tes Kesesuaian Sistem

1. Kromatogram kesesuaian sistem 1


37



38



39



40



41



42

Lampiran 5. Perhitungan Indeks Polaritas Fase Gerak

1. Komposisi fase gerak asetonitril: metanol: aquabidest: OPA 0,1%

(20:30:47,5:2,5 v/v)

(20

100𝑥 5,8) + (

30

100𝑥5,1) + (

50

100 𝑥10,2) = 7,79

2. Komposisi fase gerak asetonitril: metanol: aquabidest

(30:50:20 v/v)

(30

100𝑥 5,8) + (

50

100𝑥5,1) + (

20

100 𝑥10,2) = 6,33


(40:30:30 v/v)

(40

100𝑥 5,8) + (

30

100𝑥5,1) + (

30

100 𝑥10,2) = 6,91


(30:25:45 v/v)

(30

100𝑥 5,8) + (

25

100𝑥5,1) + (

45

100 𝑥10,2) = 7,605


(60:10:30 v/v)

(60

100𝑥 5,8) + (

10

100𝑥5,1) + (

30

100 𝑥10,2) = 7,05


(65:5:30 v/v)

(65

100𝑥 5,8) + (

5

100𝑥5,1) + (

30

100 𝑥10,2) = 7,085


43

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Optimasi Metode Analisis

High Performance Liquid Chromatography Fase Terbalik

pada Penetapan Kadar Kurkumin dalam Ekstrak Rimpang

Kunyit” memiliki nama lengkap Maria Philomia Christanti

Raga. Penulis lahir di Bekasi tanggal 21 Desember 1998

sebagai anak pertama dari 4 bersaudara dari pasangan IJanus

Raga dan Chatarina Aan Purwati Dinastiwi. Pendidikan

formal yang pernah ditempuh penulis adalah menyelesaikan

Pendidikan TK Bina Kasih (2002-2004), SD ST. Bellarminus Bekasi (2004-2010),

SMP ST. Bellarminus Bekasi (2010-2013), dan SMA ST. Bellarminus Bekasi

(2013-2016). Penulis melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2016. Selama menempuh Pendidikan di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma penulis terlibat dalam berbagai

kegiatan dan organisasi, antara lain Pengurus Jaringan Mahasiswa Kesehatan

Indonesia Komisariat Sanata Dharma (2016), Badan Eksekutif Mahasiswa Farmasi

sebagai Humas CP JMKI (2017). Selain itu penulis pernah menjadi steering

committee pada acara FACTION #3 (2018) dan Titrasi (2018), Panitia Titrasi

sebagai pendamping kelompok (dampok) (2017), Panitia Pharmacy Performance

(2016) sebagai sponsorship, dan juga aktif dalam organisasi tingkat nasional

Jaringan Mahasiswa Kesehatan Nasional sebagai staff nasional dirjen medfohum

(2017-2019). Pada bidang akademik penulis pernah menjadi asisten dosen

Praktikum Biokimia (2018), Praktikum Kimia Analisis (2018 dan 2019). Penulis

pernah mendapatkan juara 1 Lomba OSCE tingkat Nasional “PHARMANATION”

dan juga mendapat gelar “best bedah jurnal” juga pernah terlibat sebagai anggota

tim dalam Program Kreativitas Mahasiswa Penelitian yang didanai oleh Direktorat

Jendral Pendidikan Tinggi (2017).


Documents

OPTIMASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID ... · Obat herbal perlu memiliki pemastian mutu dengan melakukan standardisasi bahan baku. Ekstrak rimpang kunyit sering menjadi