(Aus dem Hallerianum, Bern.)

0smotisehe Methoden zur Bestimmung von Permeabilit/itskonstanten an roten BlutkSrperehen

in physiologisehem Milieu. Von

W. Wilbrandt.

Mit 4 Textabbfldungen.

(Eingegangen ara 11. Oktober 1938.)

Die Arbeiten von M. H. Jacobs 1 haben es erm6glicht, aus dem Ablauf der osmotischen H/~molyse in isotonischen LSsungen permeierender Substanzen Permeabilit~tskonstanten fiir Erythrocyten zu gewinnen. Dabei bat sich jedoch gleichzeitig herausgestellt, dal] diese Ver- suchsanordnung, bei der die Zellen in isotonische Nichtleiterl6sungen gebracht werden, zu weitgehenden ~nderungen in den Eigenschaften der Zellen fiihrt. Sichergestellt ist, dal] dureh Austauseh der einzigen anwesenclen AuBenanionen, n~mlich der OH-Ionen gegen Innenanionen (vor allem CI) erstens das p 2 und zweitens der osmotische Druck 3 im Innern der Zelle stark ver~ndert wird. Ferner kommt es bei den Blut- k6rperchen einer Reihe von Tierarten in Nichtleiterl6sungen zu einem starken Austritt von Salzen, offenbar Kaliumsalzen, was mit dem Anionen- austausch nicht erkls ist und weitere, heure noch unbekannte ~nde- rungen der Zellmembran anzeigt.

Ein Teil dieser Erscheinungen verschwindet, wenn der ~Nichtleiter- 16sung geringe ~Iengen von Salz zugesetzt werden, doch ist nach Ponder 4 das osmotische Verhalten der Blutk6rperchen auch in hypotonischen Salzl6sungen abhorre, sei es auf Grund von Salzaustritt (Ponder) oder einer andersartigen Verschiebung (Jacobs). Quantitative Obereinstim- mung des Zellvolumens mit den osmotischen Gesetzen besteht nach Ponder nur in Serum in einem engen Verdfinnungsbereich. Auch an anderen Zellen bestehen ~hnliche Verh/~ltnisse, z. B. hat Mond ~ gezeigt, daB die von Overton aus osmotischen Versu-chen in reinen Zuckerl6sungen geschlossene Impermeabilit/~t der Muskeln fiir Zucker bel DurehstrSmung mit Ringer-L6sung unter Zuekerzusatz sich nicht best/~tigt.

Es war daher wiinschenswert, eine Versuchsanordnung zu treffen, bei der die Permeabilit/~t der B]utzellen mindestens in Ionenmilieu, wo- mSglieh aber in ihrer nattirlichen Umgebung, dem Serum, gemessen

1 Jacobs, M. H.: J. cellul, a. comp. Physio]. 4, 161 (1934). - - Biol. :Bull. Mat. biol. Labor. Wood's Hole 6~, 178 (1932). - - ~ 2(errer, H.: Pfliigers Arch. ~2~, 724 (1929). - - a Jacobs, M. H. u. A. K. Parpart: Biol. ]3ull. Mar. biol. Labor. Wood's Hole 65, 512 (1933). - - 4 Ponder, E.: The Mammalian l~ed (Jell. Ber]in 1934. - - �87 Mond, 1~.: Ber. Physiol. 96, 646 (1937).

290 W. Wilbrandt: Osmotisehe Methoden zur Bestimmung

werden kann. I n der vor l iegenden Arbe i t werden 8 so]ehe Anordnungen beschrieben, die fiir l angsam eindr ingende 1 Subs tanzen anwendba r sind. Die K i n e t i k des Nindr ingens is t fiir diese Anordnungen bœ worden, so dag Pe rmeab i l i t~ t skons t an t en mi t ihrer t I i l fe erhal~en werden kSnnen. Eine Besehre ibung und Diskussion der technischen Methodik wird voraus- geschickt .

Die optisehe Volummessung.

DaB~ die Lichtdurehl~ss igkei t einer Blutsuspension von der Zahl der n i c h t h ~ m o l y s i e r t e n Zellen abh/~ng~, is t sei~ langem b e k a n n t und wird in verschiedenen Anordnungœ zur opt ischen Verfo]gung der H/~molyse verwertœ Jacob8 ~ beni i tz t dazu eine Vorr ichtung, die im Pr inz ip e twa e inem Sehiehtd icken-Color imeter entspr icht , P o n d e r 3 œ Vaeuum- 10hotozelle, Net ter und Orskov 4 eine Sperrsehiehtphotozel le . I n der von mi t beni i tz ten Anordnung wird nach Net ter und Orskov eine Sperrsehicht- photozel le nnd ein einfaehes Vor lesungsga lvanometer von R u h s t r a t

verwendet .

Ein Cuvettensehieber fiir 4 Cuvetten (Sehiehtdieke 1 cm) befindet sich in varia- blem Abstand von der Photozelle (vgl. unten). Die Liehtquelle wird zut Erzielung guter Liehtkonst•nz aus einer 6-V-Batterie mit hoJaer Ladekapazitgt gespeist. Die Lichtintensit/it kann variiert werden dureh eine improvisierte Blende, bestehœ aus einer vertikalen Messingscheibe, die mit einem Mikroskopstativ �9 verbunden ist nnd mit Itilfe dœ Grob- und Feineinstellungsschrauben des Mikroskops in den Strahlengang gesenkt we�9 kann. Diese Anordnung hat sieh besser bewghrt Ms Irisblenden. Zur Ausschaltung von Intensitiitssehwankungen und Ungleichheiten der Cuvetten wird wie folgt vorgegangen: Alle Cuvetten ( I~IV) werden zun~chst mit Wasser gefiillt. I I wird in den Strahlengang gebraeht, diœ Liehtintensitgt auf einen Galvanometœ von 100 eingestellt und dgnn der Aussehlag bel EinsehMtung von Cuvette I gemessen. Das ist der ,,Cuvettenwert" ftir II . Ent- sprechend erhitlt man die ,,Cuvettenwerte" Itir I I I und IV. Vor jeder Messung der Lichtdurchlhssigkeit einer Suspension mit einer der Cuvetten I I - - I V wird nun Cuvette I mit Wasser geftil]t eingeschaltet und die Liehtintensits auf den ,,Cuvetten- wert" der betreffenden Cuvette eingestellt.

Zur Reinigung der Cuvetten bat sieh eine mit der Wasserstrah]pumpe verbundene lest an der Apparatur angebraehte Saugpipette bew~hrt, mit der eine Verunreiiaigung der Cuvettenaul~enfl~ehe vermieden und Zeit gespart werden kann.

Die Anordnung kann aueh fiir eolorimetrisehe Bestimmungen ben~tzt werden und bat sieh z. B. fiir Phosphatanalysen bewahrt. Seriœ kSnnen sehneller und mit mindestens gleicher Genauigkeit ausgeftihrt werden wie mit einem Colorimeter.

Bezfiglich der Auswertuny der Ablesung bel Bintsuspensionen ftir Permeabilit&ts- bestimmungen soli hier knrz auf einige Punkte hingewiesen werden, die bisher nicht immer geniigend in Betraeht gezogen wurden. Die Lichtdurchl~issigkeit ist riel weniger dureh Absorption Ms durch Streuung gesehwacht. Die Absorption spielt gegenfiber der Streuung eine zu vernachlassigende Rolle. Der Photostrom hangt daher entseheidend vom Abstand zwischen Suspension nnd Photozelle ab. Ist dieser klein, so erhalt die Photozelle einen grogen Teil des naeh allen Seiten

1 Vgl. S. 293. - - e Jaeobs, M. H.: Bioll. ]~ull. Mat. biol. Labor. Wood's Ito]e ~8, 104 (1930). - - a Ponder, E.: The ~[ammalian tled Cell. Berlin 1934. - - 4 Netter, H. u. S. Or.sl~ov: Pflfigers Arch. 231, 135 (1932).

von Permeabilit&tskonstanten an roten BlutkSrperchen. ~9~

ausgestrahlten Streu]ichtes und umgekehrt. Abb. 1 zeigt, dal~ dies e Abhi~ngigkeit bel kleinen Abst~nden sehr steil ist. Man muB Mso, um reproduzierbare Ablesungen zu bekommen, den Abstand Cuvette-Photozelle konstant haltcn. Die Wahl des geeigneten Abstandes h~ngt von den Versuchsbedingungen ab. t Ia t man in Gebieten hochgradiger I{hmo]yse k]eine ~nderungen des ttiimolysegrades zu messen, so erh&lt man mit grogem Abstand die beste Empfindlichkeit. Arbeitet man in Gebieten geringer tt&molyse oder tibe�9 den gesamten H&mo]ysebereich, so ist kleiner Abstand angezeigt. Die Kurvenscharen in Abb. 2a, die mit zunehmend verdfinnten Sus- pensionen bel verschiedenen Abst~tnden aufgenommen sind, lassen das deutlich erkennen.

Abb. 1 zeigt ferner, daB auch die Lichtdurchl~ssigkeit eines H~molysates noch abstandsabhangig ist und erst nach Zentrifugieren abstandsunabh~ngig wird, d. h.

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6

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I 0 ~# 20 30 ~0 .fo 60 yo 80 9O 7OO

Absty de," Cuvette von de,," Photozelle mm. Abb. 1. Beziehung zwisehe�9 Lichtdurchl~ssigkeit und Abstand der Cuvet~te von 4er

Photozelle. _4 Abstan4 Null zwisehen Cuvettenmitte ~md Photozelie (extrapoliert).

dag auch die Blutschatten noch streuen. Diese Tatsache, zusammen mit der schon von Orskov 1 und Parpar t 2 angegebenen und ausgeniitzten Abhangigkeit der Licht- durchl~ssigkeit vom Volumen der nicht h&molysierten Ze]len (s. Abb. 2b) 1N]t es nicht korrekt erscheinen, wie es vielfach geschieht, aus der Lichtdurchl~ssigkeit eines tt~molysates die Zahl der nichths Zellen zu ermitte]n, unter Verwendung einer Eichkurve, die durch Verdfinnung einer Blutsuspension in iso- tonischer KochsMzlSsung gewonnen wurde. ]Jber den Fehler, der durch Nicht- beachtung des Ze]lvolumens entsteht, unterrichtet Abb. 2a und 2b. Schwellung der Zellen bel konstan~er Zahl in 0,6 isotonischer LSsung (subh~tmolys ~ndert den Photostrbm ebenso wie Abnahme der Zah] der Ze]len um 25--35 ~ Ira Permea- bilit~tsverst~ch ist der Fehler noch etwas gr5ger, weil in h~mo]ytischen Konzen- trationen, d .h . mit noch etwas st~�9 Schwellung gearbeitet wird. An diesem Punkt scheitert bisher auch die schon von Jacobs 3 und von Netter und Ors]~ov y vor- gesch]agene photoe]ektrische Blutk5rperchenzah]ung.

D ie V e r w e n d u n g de r L i c h t d u r c h l ~ s s i g k e i t s m e s s u n g ftir P e r m e a b i l i t ~ t s -

b e s t i m m u n g e n e r fo lg t d a h e r ara b e s t e n n i c h t d u r c h B e s t i m m u n g d e r Z a h l de r h i~molys ier ten Zel len, sonde rn du rch B e s t i m m u n g des r e l a t i v e n

10rs]cov, S . : Biochem. Z. 279, 241 (1935). - - 2 Parpart , A. K. : J. cel]u], a. comp. Physiol. 7, 153 (1935). - - 3 l. c. 1930. - - 4 ]. c. 1932.

292 W. Wilbrandt: Osmotische Nethoden zur Bestimmung

Volumens der Zellen, bezogen auf ihr Ausgangsvolumen, wie es auch bei Jacobs fiir die Bestimmung von Permeabilit~tskonstan~en gesehieht.

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Abb. 2 ~. A b h g n g i g k e i t des P h o t o s t r o m s v o n 4er Zah l der Zellen bei v e r s c h i e d e n e m A b s t a n d

zwischen Cuve t t e n n d Photozel le .

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~on/sck ]

10 gO $0 GO 50 60 ™ 80 00 100 Pe/. Zellenzakl

Giiltigkeig des Boyle-van't Ho]/schen Gesetzes vorausgesetzt, kann eine Eichkurve fiir die Beziehung zwischen rel~tivem Volumen nnd Licht-

Abb. 2 b. Abh~,ngigkei~ des P h o t o s t r o m s v o n der Z a h l de r Zel len bei v e r s c h i e d e n e m Zel

v o l u m e n u n 4 v e r s e h i e d e n e m A b s t a n 4 zwischen C u v e t t e u n d Photozel le .

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durehlgssigkeit (Volumeiohkurve) leicht duroh Anfnahme einer Xurve der osmotischen Resistenz gewonnen werden. Die Komplikaeion der

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von Permeabilit/~tskonstanten an roten Blutk6rperchen. 293

Blutschatten und der Schwellung der Zellen f/illt dann heraus. Bei kleiner Zunahme des relativen Zellvolumens sind die Zel]en nur gesehwollen, bel gr6Beren ist ein Teil Mmolysiert und dureh Blutsehatten ersetzt, aber jedem relativen Volumen kommt ein bestimmter, untar Umst/tnden dureh alle diese Faktoren beeinfluBter Wert dœ Liehtdurahls zu. Da die l%ktoren siah bei der Aufnahme der Eichkurve ebenso auswirken wie ira Permeabilit/ttsversueh, ist die Liehtdurahl~issigkeit ein empirisahes, aber eindœ MaB �9 dus relative Zellvolumen.

Es k6nnen zwei Ver�9 beniitzt werden.

1. Die direkte Volumbestimmunq. Es wird zun/tehst aine Volumeiehkurve aufgenommen. Man bestimlnt

dazu die Lichtdurahl~issigkeit von Blutsuspensionen in versehiedenen KoahsMzkonzentrationen C, bereehnet dus relative Zellvolumen V naeh dem Boyle-van't Ho//sehen Gesetz

V C = V~r = 1 (1)

(C 1 = Isotonie - ] nnd V 1 = 1 gesetzt) und trfigt V gegen die Lieht- durahl~ssigkeit auf. Dann kann in einem Permeabilit~ttsversueh, in dem die Zellen in einer Suspension des gleiehen Misehverh/tltnisses sehwellen, zu jedem Zeit, punkt aus der Liehtdurahl~ssigkeit der Suspension und der Volumeiehkurve dus relative Volumen bestimmt werden, dus die Zellen erreieht haben.

2. Indirekte Volumbestimmung, durch Bestimmung des osmotisch wirksamen Jnhaltes der Zelle.

Gleichung (1) gilt bai Konstanz der osmotiseh wirksamen Menge ira Erythrocyten. Andert sich diese, so gndert sich das Produkt C V pro- portional, tI/~It man C konstant, d. h. h/imolysiert man immer in einer Koehsalzl6sung derselben Konzentration (,,Testl6sung"), so muB bei zu- nehmendem osmotischem Inhalt, also bel Eindringen einer Substanz in die Zel]e, V proportional der eingedrungenen Menge zunehmen. Man kann daher das Eindringen dureh die ~nderung des relativen Zell- volumens V verfolgen. Hat dieses zu Anfang den Wert Vo und dringt in ein Blutk6rperchen, das anfangs die osmotisch wirksame Menge 1 enth/~lt, die Menge Sein , so ist

V 8 § oder S - - V--Vo Vo - 1 Vo (2)

Man wghlt zweekm~flig ftir C die Konzentration, in der das unbehandelte Blut gerade beginnt zu h/imolysieren. Voraussetzung des Vorgehens ist, dag die Substanz, vergliehen mit Was~er, sehr tangsam permeiert. Dann ist die Einstellung des osmotisehen Gleichgewichts in der Testl6sung praktisch vollendet, bevor der osmotisehe Inhalt durch Austritt von Permeans in die KoehsMzl6sung nennenswert abnimmt. Als Grenzwœ der Permeabilit/tt ffir diese Voraussetzung sowie ftir die Anwendbarkeit der im folgenden abgeleiteten Formeln kann nach Jacobs 1 die Permeabilit/it

x 1. c. 1934.

294 W. Wilbrandg: Osmotische Methoden zur Bestimmung

ftir eine Substanz gelten, in deren isotoniseher L6sung die It~tmo- lysezeit mindestens 100mal so lang ist wie in Wasser.

Pcrmeabilitiitsbestimmung in Suspension mit direkter u Als Ansgangsl6sung dient eine Blutsuspension 1:10 in isotonischer,

schwaeh mit Phosphat gepufferter Koehs~lzl6sung. Zur Aufnahme der Volumeichkurve wird je 1 ecm der Suspension mit 9 cern hypotoniseher KoehsalzlSsung verschiedener Konzentrationen gemiseht. (Das mit der Suspension einge�9 KoehsMz mul3 natiirlieh bei der Volumberechnung berficksiehtigt werden.) Frit den Perme~bilitgtsversueh wird ein Volumteil der Suspension mit 9 Volumteilen einer L6sung gemiseht, die Permeans in beliebiger und Salz in hypotoniseher Konzentration œ Das Sehwellen der Zellen in dieser LSsung Mrd photometriseh verfolgt.

Die Kinetik des Eindringens I~Bt sich aus dem Ansatz von Jacobs leicht unter der vereinfachenden Annahme bereehnen, daB die Substanz vergliehen mit Wasser langsam i3ermeiert, so dag stets osmotisches Gleiehgewieht angesetzt werden k~nn. Es sei C s die Konzentration des Permeans augen, Cm die Salzkonzentration auGen, S die zut Zeit t ein- gedrungene Menge Permeans, V das mit Wasser gœ Volmnen der Zelle (vgt. S. 295) zut Zeit t, K die Permeabilit/~tskonstante, angebend die Menge Substanz, die pro Zeiteinheit und pro Einheit Konzentrations- differenz in eine Zelle eindringt. (In dieser Konstan™ ist die als konst~nt angesehene Oberfl/iehe der Zelle enthalten. Die Annahme der Oberfl/%hen- konstanz reehtfertigt sieh dureh die besondere Gestalt der Etyrhroeyten, die beim Sehwe]len einf~ch ihre Bikonk~vit~t verlieren [Jacobs]l.)

Die Einheiten seien ffir das Volumen das Anfangsvolumœ einer Zelle, fiir die osmotisehe Konzentration die Isotonie, ftir die Menge somit der osmotiseh wirks~me Anfangsinhalt einer Zelle, fiir die Zeit 1 Min.

Dann gilt naeh dem Ficksehen Gesetz fiir den station~ren Diffusions- zustand (tiber die Anwendburkeit des Fickschen Gesetzes vgl. Wilbrandt 2)

dSdt -- K ( C s - S ) (3)

(Die Augenkonzen~ration darf als konstant angesehen werden, da das Volumen der Zellen nur 1/~o0 des ges” Suspensionsvolumens ist.) Ferner gilt n~ch der oben g› Annahme, daB stets osmotisches Gleiehgewieht herrseht, die Beziehung

s + 1 _ c,~~ + cs (4) v

Aus (3) und (4) erh~lt man

dS __ K(Cs 8 d t (~�9 Cs!) (5)

1 Jacobs, M. H.: Biol. Bull. Mar. biol. Labor. Wood's Hole 62, 178 (i932). - - J. cellul, a. comp. Physiol. 4, 161 (1934.--~ Wilbrandt, W.: Erg.Physiol. 40, 204 (1938).

von Permeabilit/~~skonstanten an ro~en Blutk6rperchen. 295

Die I n t e g r a t i o n dieser Gleichung f i ihr t zu

~~~1 [ ~ ' C m (61 K t = c ~ - - S

was nach Auswer tung der I n t e g r a t i o n s k o n s t a n t e n (f/ir t ~: 0 wird S = 0) t ibergeht in

K t - - C m + C s In Cs S Cm ~ (�99 - - Cm S) �99 (7)

Subs t i tu t ion von S dureh V nach Gle ichung (4) e rg ib t

K t - - C~ + C~ In C~ (Cm -~ Cs) V ~- 1 ™ ~ (C,. + C~) (1--Cm V) Cm (8)

Spezial�8 von Gleichung (8) s ind die osmotisehe Schwellung in re inen isotonischen oder n ieht isotonisehen PermeanslSsungen, ohne Salzan- wesenheit . I m Fa l l der isotonisehen Permeans l6sung (C m = 0, C s = 1) geht (8) t ibœ in

1 K t = 2 (V2 - - 1). (9)

(berechnet aus Gleichung (5), weil Einse tzen von C m = 0 in (8) zu einem unbes t immten Ausdruck ftihrt.) Diese Gleichung ist ident isch mi t der von Jacobs 19341 ftir die gleichen Bedingungen entwickel ten Formel .

I n n icht i so tonischer Permeans l6sung (Cm = 0, Cs =7 ~ 1) erfolgt die Schwellung nach der Gleichung

1 (V 2 C 2 1), (10) K t = ~ G

die ebcnfalls und aus dem gleichen Grund aus der Gleichung (5) ab- gele i te t ist.

Aus den Versuchsbeding¨ (Cm, Cs) und dem zu t Zei t t gœ Volumen V l~Bt sich somit die Pe rmeab i l i t~ t skons t an te berechnen.

Eine Bemerkung ist zu machen liber die Rolle des sog. ,,nichtlSsenden Raums:' der Zellen. V ist der ,,16sende Raum" und nicht das Gesamtvolumœ der Zellen. Dasselbe gilt aber �9 die in der Volumeichkurve enthaltenen Werte von V, so dal3 die Gr6Be des 16senden Raumes bei Bœ der Eichkurve wieder heraus~/~llt und keine Annahmen liber sie gemacht werden miissen. Ebenso sind die Verh~ltnisse bei der ira n~chsten Abschnitt bœ Mœ wahrend in der letzten Ableitung �9 Vollblut sowohl der 15sende Raum als auch dus wahre Zellvolumen auftret~en, so daB das Verh~tltnis der beiden Gr61]en eingesetzt werden muB.

Als Vor~efl dieses VeIoEahrens gegeniiber der t�9 in isotonischer Permeans- 16sung ist aul~er der Ann/~herung an physiologische Bedingungen durch den Elektro- lytgehalt des Mediums noch zu nennen, dal? man die Versuchsbedingungen so w/ihlen kann, dag man wi~hrend des ganzen Versuchs ira maximalen Emp�9 bereich der Methode arbeitet. Wahlt man ni~mlich als C m eine (ohne Permeanszusatz) �9 vollst/~ndig hamolysierende Konzentration und nimmt man C s so groB, daB C m q-C se ine : gerade beginnend hKmolysierendœ Konzen~ra~ion entspricht~, so verl/iuf$ der ganze Versuch in dem Bereich, in dem (durch die H~molyse) die Licht- durchl~issigkei~ bel Volumzunahme maximal ver~ndœ wird. Man bat dann noch den weiteren Vortefl, mi$ sehr kleiner Permeanskonzentration zu arbeiten. Bel der

1 1. c. 1934.

296 W. Wilbr~ndt: Osmotische Methoden zur Bestimmung

tt~molyse in isotonischer LSsung dagegen verl~tuft nur ein Teil des Versuches in gutem Empfindlichkeitsbereich.

Abb. 3 zeigt einen Permeabilitgtsversuch init Glycerin (C s ~ 0,4, C m = 0,6) an Rinderblut bei 200 C nach diesem Verf~hren. a) Ist die Volumeichkurve, b) die ans dieser und den gemessenen Lichtdurch]~ssigkeiten gœ234 Volumenzeit- kurve. Die ffir die einzelnen Me~punkte berechneten Werte von I™ sind bei jedem Mel3punkt angegeben. Die I™ ist beh'iœ

450

~ / 7

o 1,8 i,z $q ~. 1,6 1,y 2,o o qo 8o 720 lco 2og 24~ z8o : : V-relTo/umen ";-" Min,

Abb. 3. Perm• von l ~ i n d e r b h t k 6 r p e r c h e n fiir Glycer in bel 20 ~ b e s t i m m t m i t d i r ek te r Volummessung . Die e i n g e k ] a m m e r t e n Zah]en geben die e r r echne ten

Pe r lneab i l i t~ t skons t an ten an.

3. P e r m e a b i l i t 6 t s b e s t i m m u n g in S u s p e n s i o n durch M e s s u n g des osmot i schen Inha l t e s .

AusgangslSsung ist auch hier eine Suspension 1 : 10 in physiologischer Kochsalz- oder t r Mit dieser wird die Volumeichkurve ebenso hergestellt wie bel der vorhergehenden Methode, nur mit dem Unterschied, d~B nur der steile Teil der Kurve beniitzt wird. Fiir den Versuch wird eine gleichartige Suspension hergestellt, die jedoch in der physiologischen KochsalzlSsung noch Perme~ns in kleiner Konzentration gelSst enth~lt. (Ich habe meist mit 1/10 isotonisch gearbeitet.) Von dieser Suspension wird in regelmitI~igen Zeitabst~nden je 1 ccm mit 9 cern der TestlSsung gemischt und naeh Erreiehung des Gleichgewichtes photo- metriert. Die Temperatur der Testl5sung mull konstant sein und es ist zweckm~l~ig, sie tiefer als Zimmertemperatur zu ha]ten, da der H~molyse- grad mit sinkender Temperatur zunimmt ( Jacobs 1) und man so von ~_nderungen der Zimmertemperatur (bei der photometriert wird) unab- hs wird. Ieh halte meist die zu photometrierenden Suspensionen in eisgekiihltem Wasserbad, doch ist d~s bei guter Konst~nz der Zimmer- temper~tur nieht un bedingt nStig. Wichtig ist, dall nieht vor Erreichung des Gleichgewichtes photometriert wird. Die Zeit bis zum Gleichgewicht hi~ngt von Blutart und Temperatur ab und muB ausprobiert werden.

1 Jacobs, M . H.: The Amer. N~turalist 62, 289 (1928).

von Permeabilit~tskonstanten an roten Blutk6rperchen. 297

Die Berechnung der eingedrungenen Menge aus der Lichtdurchli~ssigkeit erfolgt mit Hilfe der Volumeichkurve nach Gleichung (2).

Die Kinetik des Eindringens berechnet sich ebenso wie bel der Permea- bilit~tsbes~immung in Suspension mit direkter Volummessung (siehe vorigen Absehnitt). Da jedoch das tatsiichliehe Volumen der Zellen nicht gemessen wird, sondern die eingedrungene Menge S, so wird die Gleichung (7) benfitzt (vor der Substitution von S dureh V). Diese nimmt fiir Suspensionen in isotonischer SalzlSsung (C m = 1) die einfachere ~ o r 1TI a n

K t = ( C s + l ) ln Cs S. (11) Cs - - S

Die indirekte Volummessung bat mehrere Vorteile. Erstens sind die Versuehsbedingungen physiologischer. Die Suspensionen sind be- ziiglich Salz isotoniseh, und die Konzentration des Permeans kann, ver- glichen mit der Salzkonzentration, sehr klein sein. Aul~erdem k6nnen die BlutkSrperchen ira physiologischen Medium, dem Serum, untersucht werden (siehe n~chsten Abschnitt), was sicher das beste Vorgehen ist. Da sich in diesem Fall die Kinetik etwas anders berechnet, wird er in einem besonderen Absehnitt behandelt. Zweitens kann man auch hier die Versuchsbedingungen durch passende Wahl von Cs bzw. Z (s. u.) so einriehten, dal] man dureh den ganzen Versuch mit der maximalen Empfindtichkeit der optischen Methodik arbeitet. Ein Nachtefl liegt darin, dag fiir jede Ablesung pipettiert werden mule. Dadureh erhSht sich die Streuung, so dag sich eine grSI~ere Zahl von Ablesungen empfiehlt.

Abb. 4a zeigt einen Versuch mit Glycerin an Rinderblut bel 300 C nach dieser Methode. An jedem Mel3punkt ist wieder die errechnete Konstante angegeben. Die Konstanz ist befriedigend. Betreffend die ~bereinstimmung mit andern Methoden siehe Tabelle 1.

4. Permeabilitditsbestimmung an VoUblut mit Messung des osmotischen Inhalts.

Dieses Vorgehen kommt den physlologischen Bedingungen ara n~chsten, hat nur den Nachtefl einer etwas komplizierteren Berechnung der Kinetik.

Zu 10 Volumteilen Vollblut wird 1 Volamteil physiologische Kochsalz15sung zu- gegeben und mit je 0,1 ccm dieser Mischung in 10 ccm hypotonischer Kochsalz- 15sung die Volumeichkurve aufgenommen. ~fir den Versuch werden 10 Volumteile Vollblut mit 1 Volumtefl Permeansl6sung (zwischen 1/2 und 3fach isotonisch) in physiologischer KochsalzlSsung gemischt und von dem Gemisch (das auf konstanter Temperatur gehalten wird) in regelm~Bigen Abst~nden je 0,1 ccm in 10 ccm Test- 15sung fibergeftihrt. ])as weitere VorgeJaen zur Bestimmung von S ist dasselbe wie beim vorhergehenden Ver�9

Die Berechnung der Kinetik ist hier dadurch etwas komplizierter, dag ers~ens die AuBenkonzentration w~hrend des Eindringens nicht kon- stant bleibt und zweitens aul~er dem 15senden Raum auch das wirkliche

P�8 Arch. f. d. ges. Physiol. Bd. 241. 20

298 W. Wilbrandt: Osmotische Methoden zur Bestimmuag

Volumen der Zelle in die Berechnung eingeht. Wird als Efl~ei t des Volumens wieder das Anfangsvolumen einer Zelle gew/ihlt, um eine mit den besprochenen identische Konstante zu erhalten, und ist die Anzahl der Zellen ira Gesamtvolumen = n, so ist es zweckm~l~ig, den einer Zelle entsprechenden Anteil (l/n) des Gesamtvolumens (nach Zugabe der PermeanslSsung) der Berechnung zugrunde zu legen. In diesem Raum, der als A bezeichnet werde, sei die Gesamtmenge des zugegebenen Per- means = Z, der ,,nicht 15sende Raum" der Zelle sei----L, der gesamte ,,15sende Raum" (einschliei~lich des L6sungsraumes auBerhalb der Zelle) daher --~ ( A - L) ~ B. Die iibrigen Bezeichnungen und Einheiten seien dieselben wie in den vorherigen Berechnungen. Dann ist die der Gleichung (3) entsprechende Beziehung (Geschwindigkeit des Eindringens):

4 S - - K ( Z - S d t ~ vS) (12)

und die der Gleichung (4) entsprechende Beziehung (osmotisches Gleich- gewicht)

(Z - - S) -F ( B - - l ) _ S + 1 (13) B - - V V

(B - - 1 ist die Sal,menge aul~erhalb der Zelle). Aus (12) und (13)erh~lt man nach Elimination von V und Integration in den Grenzen t-----0 und t ~ t :

( ~) ' ~~~~~§ ) Kt~-(1--B)(B+Z)lnB2 1 ~- ™ 2 - - ( B + Z) - - \B- (B+Z) 1 S. (14)

Ist der H~matokritwert des B]utes vor Zugabe des Permeans = h und ist die Konzentration des Permeans in der zugesetzten LSsung ~ p (d. h. p • isotonisch), so ist in den verwendeten Einheiten

1-~L A : 1,1- ~ (15a)

B - 1,1 L ~ _ _ L (15b)

Z ---- 0,1 p 1 + L (15 c) h

h ist experimentell bestimmbar, L nicht. Man kann nun fiir L einen Wert, z. B. den Anteil der Trockensubstanz (vgl. A . V. Hi l l 1) einsetzen (ffir 35% Trockensubstanz und 100% ,,freien" Wassers wiirde L, dr, die Einheit des Volumens der ,,L6sende Raum" ist, = 0,54) und mit den so erhalfenen Werten von B und Z Gleichung (14) auswerten. Da jedoch die Frage des ,,nicht 15senden Raumes" ira Erythro6yten noch durchaus un- gekliirt ist (vg]. z. B. Parpar t und Shull2), ist ein ~nderer Weg vielleicht nach dem heutigen Kenntnisstand zweckm~Biger. Nach Erreichung des

Gleichgewichtes (d~t= 0 ) i s t Z - - S S (16) B - - V V"

1 HiU, A. V.: Proc. roy. Soc. Lond. B 106, 477 (1930). - - ~ Parpart, A. K. u. J. C. Shull: J. cellul, a. comp. Physiol. 6, 137 (1935).

von Permeabilit~tskonstanten an roten Blutk6rperchen. 299

Daraus und aus Gleichung (13) e rg ib t sich ftir che Gle ichgewichtswer te

Ve und S e V e ~- 1 (17a)

Z Se -- B (17b)

Se is t also, da sowohl in Z als auch in B che Gr5fie L en tha l t en ist , von L abh/ingig. Man k a n n d a h e r che exper imente l l be s t immbare Gr5Be Se

a in 5'uoEensian I

o,o~ y ~

~ o

~ o, os -(o,o8~)

*'~/[o�87 O ~ 8 lZ 7# 20 ge Min. 0

S}

2 $ 8 10 12 ~zMin. Abb. 4 a und b. Permeabilitat von'Rinderblutk6rperchen fiir Glycerin bel 300, bestin3mt durch l~r des osmotischen Iuhalts. Die eingeklammorten Zahlen geben die e~rechneten

Permeabilitœ en an.

beni i tzen, u m L zu el iminieren. (15c) und (14):

K t =

Man erh/~lt dann aus (17b), (15b),

(E--0,1 la) (1 -}- Se)bi ( 1 - - S ) E $2 o,1 p _ ~ _ + 0,2 v (1 + s~)

[ E (2 + se) _ 1) s , (18) -}- [0,1 p (I ~- Se)

wo E = 0,1 p - - Se (i,I ~ h ) . In den G]eichungen (14) und (18) is~ das quadratische G]ied von S praktisch zu vernach]iissigen. Ffir den Fa]] isotonischer PermeanslSsung (p = l) nehmen dann che Gleichungen (14) und (18) bei einem H~mato- kritwer~ von 0,4 che ein�9 Form an

K t = - - 0,805 ] n (1 - - 9,6 S) - - 0,483 S (14a) (L--- -0 ,54 angenommen en t sp rœ 35% Trockensubs tanz und 100% ,,freien Wassers" ) .

( S) 1--14Se-- 7Se2 S (1Sa) K t = - - 7 (Se + S~ 2) I n 1 - - ~ + 1 -~ Se "

Abb. 4 b zeigt einen Versuch mi t dieser M e t h o d e . (R inde rb lu t , Glycer in 300 C.)

20*

300 W. Wilbrandt: Osmotische Methoden zur Bestimmung

Tabelle 1 enthi~lt che Mittelwerte der Permeabilit/~tskonstanten von Rinderblut fiir Glycerin, mit den 3 Methoden gewonnen. Die Uberein- st immung ist befriedigend, d. h. che Permeabillt/it der RinderblutkSrper- chen fiir G!ycerin ist in Serum nicht erheblich anders als in isotoniseher oder hypotonischer KochsalzlSsung. Selbstverst/~ndlich kann diese Be- obachtung nieht verallgemeinert werden. Aus den Versuehen bel 20 0 und 30 0 erreehnet sich ein Temperaturkoeffizient von 3,5. Jacobs, c. s.

1935 (!" e.) �9 Qlo -~ 3,8 (betre�9 che Deutung hoher Temperatur- koeffizienten der Perme~bilit~t, vgL Daniel l i 1. Sie bedeuten nicht notwenchg Teilnahme von chemisehen Prozessen.)

Tabelle 1. P e r m e a b i l i t ~ t s k o n s t a n t e n von R inde rb lu t �9 Glyeerin, mit

den 3 Methoden gewonnen.

I B~ethode I Mittel I II ] III

20 ~ [ 0,031__ 0,~5 0,027 I 0,029 0,090 0,095

~iir die Umrechnung der Konstanten au�9 absolute Einheiten ist auBer der ~n- derung der Einheit von Konzentration, Volumen und Menge zu beriicksichtigen, dal~ in der Konstante K noch die Ober- fl~che des Erythrocyten enthalten ist. Nimmt man mit Jacobs 2 fiir die Ober- fl~che des RinderblutkSrperchens 77 #2 und �9 sein Volnmen 44 #a un, so ergibt sich, dag iiir K ~ 1 durch einen Quer- schnitt von 1 #2 pro Minute und pro Mola- rit~t Konzentrationsdifferenz 0,57 �9 10 -15

Mole durchtreten, d. h. dal~ die mit den beschriebenen Methoden gefundenen Werte von K zur Umwandlung in absolute Einheiten mit dem Faktor 0,57.10 -15 zu multiplizieren sind.

Aus Tabe!le 1 ergibt sich so fiir che absolute Permeabili ts der RinderblutkSrperchen fiir Glycerin bel 20 o ein Wœ von 0,017.10 -1�87 Jacobs 3 rand b~i H/~molyse in isotoniseher GlycerinlSsung eirmn Wert von 0,011.10 -ls. Die Erkl/irung fiir che scheinbare ErhShung der Permeabilit/~t durch Elek t ro ly te ist von Jacobs, Parpar t und Corson 4

aus�9 diskutiert worden.

Zusammenfassung. Die Verwendung von Lichtdurchl/issigkeitsmessungen fiir osmotische

H/~molyseversuehe wird besprochen. Es wird au�9 che Konsequenzen aus der Tatsache hingewiesen, daf~ che Lichtintensit/~t ira wesentlichen durch Streuung und nicht durch Absorption vermindert wird: Die gemessene Intensit~t ist abhs vom Abstand zwischen Suspension und Photo- zelle, �9 vom Volumen der Zellen und von der Z~hl der Blutk6rperchen. Die meist beniitzte Abh/~ngigkeit von der Zahl der intakten Zellen ist daher durch weitere Faktoren kompliziert, und es empfiehlt sich, Per-

Danielti, J. •. u. H. Davson: J. cellul, a. comp. Physiol. 5, 495 (1935). - - Jacobs, M. H.: Biol. Bu]l. Mar. bioL Labor. Wood's Hole 62, 178 (1932). - -

3 Jacobs, .M~ H.: 1. e. 1934. - - 4 Jacobs, M. H., A . K . Parpart u. S. Corson: J. cellul, a. comp. Physiol. 9, 177, 13 (1937).

von Permeabilit/~tskonstanten an roten Blutk6rperchen. 30]

meabilit/~tsmessungen nicht au�9 der Bestimmung der Zahl der intakten Zellen, sondern des relativen Volumens der Zellen zu basieren. Die ver- wendete photoelektrische Anordnung wird kurz geschildert.

Es werden drei Methoden entwickelt, mit denen die Permeabilit~t von Blutk6rperchen �9 ]angsam eindringende Substanzen in hypotoni- schen Salz]5sungen, isotonischen Salz]Ssungen u n d i n Vol]blut gemessen werden kann. Die Kinetik der Permeation wird ftir diese Methoden be- rechnet und es werden Formeln entwickelt, mit denen aus den Versuchs- daten Permeabilit/~tskonstanten erhalten werden kSnnen.

F/ir die Permeabflig~t von RinderblutkSrperchen �9 Glycerin ergeben die drei Methoden tibereinstimmende Werte, d. h. in diesem Fall ist die Permeabflit~t in hypotonischer Salzl5sung, isotonischer SalzlSsung und Serum etwa gleich. Rie absolute Permeabilit/~tskonstante ergibt sich bei 200 zu 0,017 • 10 -15 Mot//t2/Minute/Molarit/it Konzentrations- differenz. Unter Berticksichtigung der von Jacobs, Glassmann und Corson gefundenen und diskutierten 1Nichtleiterwirkung au f die osmotische H/~molyse in isotonischen NichtleiterlSsungen stimmt dieser Wert mit den frtiher von Jacobs gefundenen etwa iiberein.