CINETICA DE HIDRÓLISIS ENZIMATICA EN CARNE DE POLLO USANDO ALCALASA

3

6

Arismendi 1, Urrutia 1 y Almonacid 1

9

1 Departamento de Ingeniería Química y Ambiental; Universidad Técnica Federico Santa María 12

Autores: C. Arismendi 15

Urrutia

Correo: cristobal.arismendi@gmail.com

Andres.urrutiaf@alumnos.usm.cl 18

Resumen

En la presente investigación se realizo el estudio de una cinética de hidrólisis enzimática de

pechugas de pollo, conociendo el contenido proteico exacto de estas para fijarlo como la concentración 21

de sustrato para la reacción, con la enzima comercial Alcalasa 2.4 L, a través del método de Ph-Stat.

Se realizaron diferentes experiencias, variando la concentración de sustrato y manteniendo fija

la concentración de enzima añadida y viceversa, para ser analizados cualitativamente y luego evaluar 24

un modelo cinético de inhibición y ajustarlo al set de variables estudiadas.

Los datos obtenidos mostraron una presencia a enzima constante, de una inhibición de sustrato a

una concentración mayor de 50 g/L, observando una disminución en la velocidad inicial de la reacción 27

a mayores concentraciones de la señalada.

Analizando los datos a concentración de sustrato constante, se determino que la reacción

obedece a la cinética de Michaelis Menten, ya que la velocidad inicial de la reacción se comparo con la 30

concentración inicial de enzima y se encontró una relación lineal entre ellas, como corresponde en las

bioreacciones modeladas a través de esta cinética.

Se estudio la influencia de otras inhibiciones, concluyendo que la velocidad de reacción 33

disminuye a medida que disminuye la concentración de enlaces peptídicos y también que la

inactivación enzimática no sucede en la reacción.

Se dedujo un modelo desarrollado en base al modelo de la cinética química de inhibición por 36

sustrato el cual se trato de ajustar a las variables medidas, lo cual no se consiguió con buenos

resultados, por lo que se concluyo que suposiciones realizadas en la deducción del modelo fueron

erróneas. 39

Introducción

La pechuga de pollo tiene un alto contenido proteico (22% en peso) y un bajo contenido de 42

grasas (3%) comparado con el tuto de pollo (18 % de proteínas y 5% grasa) y las alas (18% proteínas y

18% grasa) (TACO 2004). Además, la proteína de animal presenta un perfecto equilibrio de

aminoácidos esenciales que deben ser incluidos en la dieta ya que el organismo no es capaz de 45

sintetizarlos por sí mismo.

Según Barbut (2002), nuevos productos procesados de aves de corral (por ejemplo, las vienesas

de aves) han sido introducidos en el mercado en los últimos años, debido a los bajos precios de las 48

materias primas. Con el fin de ser competitivos, las industrias de aves de corral deberán desarrollar

nuevos productos para satisfacer las nuevas demandas de los consumidores y aumentar la rentabilidad.

Así, la hidrólisis de las proteínas de la carne de pollo podría ser una solución alternativa para obtener 51

productos con mayor valor agregado.

La hidrólisis de proteínas se puede lograr usando enzimas, ácidos o bases, pero la hidrólisis

enzimática es muy preferible a los métodos químicos para aplicaciones alimentarias. Las enzimas 54

proteolíticas se usan para disolver o descomponer la proteína muscular, lo que distingue dos fracciones,

la soluble y la insoluble. La fracción insoluble puede contener grasa y otros materiales no deseados y

puede ser utilizado en alimentos para animales. La fracción soluble contiene la proteína hidrolizada con 57

perfiles péptido bien definidos y un bajo contenido de grasa. Durante este proceso, los aminoácidos son

liberados, con esto mejora el sabor de la carne. Los hidrolizados de proteínas pueden ser utilizados

como potenciadores del sabor, ingredientes funcionales, aditivos o simplemente un potenciador de 60

alimentos con bajas de proteínas.

Los hidrolizados de proteínas se aplican principalmente en el manejo nutricional de las personas

que no pueden digerir todo / proteína intacta. Hidrolizados rico en péptidos de bajo peso molecular, 63

sobre todo di y tri-péptidos con lo menos posible los aminoácidos libres, se ha demostrado que tiene

más usos dietéticos debido a sus altos valores nutricionales y terapéuticos (Bhaskar y otros, 2007). Las

proteínas hidrolizadas también muestran reducción de la reactividad inmunológica, y se puede utilizar 66

en las fórmulas para lactantes hipoalergénicos (Mahmoud, 1994). Por otra parte, los péptidos, que se

absorben fácilmente, pueden ser una fuente de nitrógeno en la nutrición para deportistas y péptidos de

alto valor biológico son atractivos como un suplemento de proteínas en general en una amplia variedad 69

de dietas (Sliyt y otros, 2005).

Proteólisis enzimática y la disolución de proteínas a partir de diversas fuentes han sido

ampliamente estudiados, como el del salmón rojo, el camarón de tratamiento de residuos, las víseras de 72

ovino, la carpa herbívora, y el caracol de barro (Sathivel y otros, 2005; Holanda y Netto 2006; Bhaskar

yotros, 2007, 2008; Wasswa y otros, 2007; Xia y otros, 2007). Sin embargo, hay poca información

disponible sobre la hidrólisis enzimática de la carne de pollo. 75

Las variables más importantes en la reacción enzimática son la concentración de la enzima y la

especificidad de la enzima, la temperatura de reacción y el pH y la naturaleza del sustrato proteico

(Adler-Nissen, 1985). Es importante saber cuál de estos factores son críticos, ya que la optimización de 78

los parámetros de proceso para la hidrólisis enzimática de la carne es esencial para desarrollar un

proceso económico y óptimo.

Como objetivo de la investigación se buscara encontrar un modelo que se ajuste a la cinética de 81

hidrólisis enzimática, y ver si es posible validarlo estadísticamente. También se analizaran

cualitativamente las experiencias más descriptivas y claras, con el fin de estimar el comportamiento de

sistema a diferentes concentraciones tanto de enzima como sustrato y ver posibles situaciones 84

presentadas en las reacciones de hidrólisis enzimática. Se evaluara el método experimental

cualitativamente para ver si es de fácil implementación y buena generación de datos validos.

Materiales y Métodos 87

Mecanismo de reacción planteado

El mecanismo de reacción planteado incluye inhibición por sustrato como se muestra en la

siguiente reacción. 90

93

donde E y S son las enzimas y sustratos libres; ES ES2 son complejos enzima sustrato; P es el producto 96

final; k1,k2,k3,k-1,k-3 son tasas de reacción.

Cabe destacar que es una reacción acompetitiva. La reacción correspondiente puede ser

determinada por la etapa de reacción irreversible: 99

1. ESk=dt

dP=V 20

Al asumir que la reacción se encuentra en estado estacionario, el balance de masa para los

complejos [ES] y [ES2] pueden ser escritas según: 102

2. 0233211 =ESk+SESkESk+kSEk=dt

ESd

3. 02332 =ESkSESk=

dt

ESd

Por lo que la concentración del complejo [ES2] se puede definir como usando la ecuación 3: 105

4.IK

SES=SES

k

k=ES

3

3

2

donde:

K1 = 3

3

k

k (constante de inhibición por sustrato) 108

La cantidad de enzima inicial se encuentra presente en tres estado: libre E, formando el

complejo ES y formando el complejo ES2.

Por lo que, al utilizar las ecuaciones 2,28 y 2,32, la concentración de enzima libre [E] queda: 111

5.2ESESe=E

6.2ESESe=E

La concentración del complejo ES se determina utilizando la ecuación 2., usando las ecuaciones 114

4. y 6., esta se reordena formando la siguiente ecuación:

7.

m

I

K+K

S+S

eS=ES

2

donde: 117

Km = 1

1

k

K+k 2 (constante de Michaelis)

Por lo que la variación de producto en el tiempo se define según:

8.

m

I

max

K+K

S+S

VS=

dt

dP2

120

donde:

Vmax = k2 * eo (velocidad máxima)

La tasa de reacción r será determinada por la reacción irreversible: 123

9. r = S0 * dt

dx= k2 * [ES]

Si se asume estado estacionario y que la cantidad de enzima presente (e), se encuentra en forma

libre (E) y formando complejos (ES) y (ES2), la ecuación anterior queda: 126

10.r = S0 * dt

dx=

m

I

max

K+K

S+S

VS2

Si el proceso de inhibición por sustrato controla la reacción:

11.I

mK

SS+K

2

129

La ecuación se reduce a

12.SS

KeK=

dt

dx I

0

02

Sabiendo que la cantidad de sustrato es igual al sustrato inicial menos el producto generado y 132

separando variables para su integración podemos obtener una relación algebraica que nos relaciona la

cantidad de producto con el tiempo:

13.PSS

KeK=

dt

dP I

0

2

0

02 =S0 * dt

dx 135

14. tKeK=PS

PS I02

2

02

02

Por lo que se espera que, la tasa de reacción, a pH y temperatura constantes, dependa de la

concentración de enzima y sustrato iniciales en la mezcla a hidrolizar. 138

La variación del grado de hidrólisis en el tiempo, se representa como:

dt

DHd=

dt

dx

La cantidad de producto obtenido, se puede medir utilizando el grado de hidrólisis (DH), ya que 141

este representa el porcentaje de péptidos hidrolizados; por lo que la variación del producto durante el

transcurso de la reacción se puede representar como:

dt

DHdS=

dt

dP0 144

Las curvas de grado de hidrólisis versus el tiempo presentan un comportamiento exponencial.

Ellas indican que la tasa de reacción r disminuye al aumentar el tiempo de reacción y el grado de

hidrólisis. Esto puede ser modelado utilizando la siguiente expresión: 147

PSS

KeK=

dt

DHd I

2

0

3

0

02

P= DHS0

Separando variables e integrando se obtiene la siguiente expresión: 150

tKeK=DHS

DHS I02

23

03

02

Materia Prima

Pechuga de pollo fresca fue adquirida de la empresa Faenadora Súper Pollo (Lo miranda y San 153

Vicente, Chile) y congelada para su posterior uso. Las características de la carne fue obtenida del

catalogo de la empresa según requerimientos de las actuales normas nacionales y se detallan en la

tabla 1. 156

Tabla 1

Característica (%)

Proteína Total 21,25%

Humedad 76,07%

Grasa 1,38%

Cenizas 1,27%

*Corresponde a la media pechuga de pollo. Deshuesada y sin piel. Con hematomas leves.

Hidrólisis enzimática 159

El experimento se llevo a cabo en un reactor batch de 1000-mL con baño termorregulado y se

uso el método de pH stat, descrito por Adler-Nissen (1985). La materia prima fue descongelada y toda 162

la grasa y nervios visibles fueron extraídos, luego fue molida en un procesador de alimentos y

mezclada con 500-mL de agua destilada. La mezcla fue llevada a temperaturas y pH optimizados por

L.E. Kurozawa. K.J. Park, M.D. Hubinger (2008) en valores de 52,5 °C y 8,00 respectivamente. Se 165

variaron la proporción Enzima/Sustrato y Carne/Agua. Luego se añade la enzima diluida en 10-mL de

agua destilada y a 52,5 °C. Las pruebas consistieron en mantener constante el pH usando NaoH cada un

minuto los primeros 20 minutos y luego cada unos 5 minutos hasta generalmente completar la hora de 168

análisis. Luego se inactivo la enzima en un baño termorregulado a 90 °C por 15 minutos.

Determinación del grado de hidrólisis

EL grado de hidrólisis (DH) fue obtenido por el método pH-stat y definido como el porcentaje 171

del ratio entre los enlaces peptídicos aun disponibles (h) y los enlaces peptídicos iniciales (htotal)(Adler-

Nissen 1985). Se de acuerdo a la siguiente ecuación:

DH (%) = totalh

h* 100 =

total

b

hαMP

NB* 100 174

Donde B es el consumo de NaOH (mL) para mantener el pH constante durante la reacción; Nb

es la normalidad de la base; MP es la masa de proteína (g); htotal es el numero de enlaces peptídicos en

la proteína del sustrato (7,6 mEq/g); y α es el grado de disociación del grupo α-NH2 que se expresa 177

como:

α = pKpH+101

1

Los valores de pK varían significativamente con la temperatura y pueden ser estimados como a 180

continuación (Kristinsoon y Rasco, 2000):

pK = 7,8 +T

T

298

298* 2400

donde T es la temperatura (K). 183

Ensayo de inactivación de enzima

Para probar la existencia o inexistencia de inactivación enzimática, se agrego enzima fresca pasados 1

hora de reacción y se sigue analizando con el mismo método (añadiendo base). 186

Ensayo de agotamiento de sustrato

Con el fin de estudiar la posibilidad de que exista agotamiento en la concentración de enlaces

peptídicos hidrolizables que afecta la cinética de la reacción, se añadió sustrato fresco pasados 50 189

minutos de reacción y se sigue agregando base como indica el método pH-stat.

192

195

198

201

Resultado y discusión

Grado de hidrólisis 204

Los primeros experimentos fueron realizados con una concentración de enzima de 2,97 [g/L],

variando la concentración de sustrato. La figura 1. muestra las curvas correspondientes para 3

concentraciones de sustrato distintas. 207

Figura 1.

Nótese que al aumentar el contenido de sustrato el grado de hidrólisis la velocidad inicial de

reacción disminuyen; esto implica que el sustrato ejerce una acción negativa sobre el grado de 210

hidrólisis al llegar a cierta concentración, lo que da indicios de inhibición por sustrato.

Para comprobar esto se realiza un gráfico con las velocidades iniciales de la reacción (figura 2.)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

Grado de Hidrolisis

Concentracion de sustrato variable e=2,21[g/l]

[S] [g/l] 45,9287848605578

[S] [g/l] 49,9185137884976

[S] [g/l] 50,5358268006481

[S] [g/l] 53,8842139902219

tiempo [s]

%D

H

Figura 2. 213

De la figura 2 se deduce que la velocidad de reacción disminuye a concentraciones de sustrato

altas como consecuencia de la inhibición por sustrato. La máxima velocidad inicial, se observa a una

concentración de sustrato en un rango entre 46 y 50,5 g/L. 216

Para estudiar el efecto de la concentración de enzima sobre la cinética de la reacción, se

realizaron ensayos con concentración de sustrato constante (49,92 g/L) variando la concentración de

enzima como se muestra en la figura 3. 219

Figura 3.

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

Grado de Hidrólisis

Concentración de enzima variable So=49,92 [g/L]

[E] [g/l] 2,0226024775909

[E] [g/l] 2,2175565654749

[E] [g/l] 2,24497978822644

tiempo [s]

%D

H

45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

Velocidad Inicial vs Concentración inicial de Sustrato e

S0 [g/l]

V[%

/s]

222

Para demostrar que existe una dependencia (como se observa en la figura 4.) entre la velocidad

inicial de reacción y la concentración inicial de enzima, se comprueba que la reacción se comporta

según lo descrito por Michaelis y Menten. 225

Figura 4.

En general, al graficar el grado de hidrólisis versus el tiempo, se observa que existe una velocidad de 228

reacción, esto se puede atribuir a uno de los siguientes fenómenos:

a. Una disminución en la concentración de enlaces peptídicos hidrolizables. 231

b. Inhibición enzimática

c. Inactivación enzimática

234

2 2,05 2,1 2,15 2,2 2,25 2,3

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

f(x) = 0,18x - 0,31R² = 0,98

Velocidad inicial vs Concentracion inicial de enzima Eo

Eo [g/L]

V[%

/s]

Con el fin de estudiar la primera posibilidad, se realizo un experimento en el cual, durante la

reacción, se añadió sustrato (130g). Si existiese una disminución en la concentración de péptidos

hidrolizables, se observaría un aumento en el grado de hidrólisis después de la adicionó del sustrato 237

fresco (figura 5).

240

Figura 5.

Existe un cambio notable en la reacción, por lo que la primera hipótesis es correcta.

243

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Grado de hidrolisis

Adición de sustrato

tiempo [s]

%D

H

La inactivación enzimática, hipótesis c, se estudio agregando enzima fresca 1 hora después de

comenzada la reacción en un tiempo determinado como se muestra en la figura 6.

Figura 6. 246

El gráfico sugiere que no existe inactivación enzimática para la reacción.

Determinación de Parámetros para Ajustar los Resultados Obtenidos

A partir de cada experiencia realizada se ajusto una curva para predecir su comportamiento y 249

luego poder comparar con el modelo planteado. Si se despejase el valor del grado de Hidrólisis para el

modelo planteado, en función de las demás variables, se podría obtener un modelo que correlacionara

las variables medidas en función del grado de hidrólisis. 252

En la tabla 2 se presentan el Parámetros de Ajuste para cada experiencia, estos debiesen estar en

función de las demás variables, vale decir, Eo, So y k2 y KI (A = 2·k2·KI), entregando el valor de R2. 255

Esto se realizo asignando un valor A talque genere la menor cantidad de error Cuadrático para los

tiempos medidos.

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Grado de hidrolisis

Adición de enzima

Columna E

tiempo [s]

%D

H

Tabla 2. 258

Experiencia Eo So A ΣR2/n

2,02260248 49,7595428 16,1 1,4

2,21755657 45,9287849 6 0,96843245

2,21755657 49,9185138 11,2 1,19163112

2,21755657 50,5358268 6,3 0,51218133

2,21755657 53,884214 4,4 0,61308594

2,24497979 49,9185138 6,1 0,53821358

Los bajos valores de la suma de los errores cuadrados llevan a analizar que los ajustes

generados dan una buena aproximación de las cinéticas estudiadas. El las figuras 8 y 9 se muestran los 261

valores teóricos para los casos anteriormente estudiados (a sustrato constante y enzima constante

luego).

264

267

Figura 8 270

Figura 9

273

Observando las figuras presentadas, se ve que el comportamiento no es igual al presentado

experimentalmente, esto significa que ajuste desarrollado no es completamente valido y el modelo no

se puede validar estadísticamente con el ajuste planteado, por lo que se debe evaluar otra forma de 276

ajuste para poder validar el modelo y encontrar el parámetro que relacione correctamente al modelo

planteado.

279

Conclusiones

El análisis cualitativo del comportamiento del grado de Hidrólisis en función de la

concentración de sustrato, revela una inhibición por sustrato, ya que al estimar las velocidades iniciales 282

a una concentración de enzima constante, en un momento al aumentar la concentración de sustrato, el

valor de la velocidad máxima empieza a descender, mostrando un comportamiento equivalente a una

inhibición por sustrato. 285

Por otro lado el comportamiento a sustrato constante, muestra que la reacción obedece la

cinética de Michaelis Menten, ya que se muestra una dependencia lineal de la concentración de enzima

en función de la velocidad máxima de reacción, situación que sucede en este tipo de cinéticas. 288

Se concluyo que la disminución de la velocidad de reacción, entre otros supuestos que no se

pudieron demostrar, es dependiente, de la concentración de enlaces peptidicos hidrolizables, debido a

que al agregar más sustrato (vale decir más enlaces peptidicos dispuestos a hidrolizarse) cuando la 291

reacción ya tiende a ser constante hacia un grado de hidrólisis, el sistema muestra una disminución

brusca del pH mostrando una aumento en la velocidad de Hidrólisis a la llevada antes de la adición de

mas sustrato. Esto indica el aumento de concentración de enlaces posibles de hidrolizar. 294

También esta disminución de la velocidad se concluyo que no depende de una inactivación

enzimática, ya que al agregar más enzima cuando la ciné tica lleva un tiempo donde la velocidad del

grado de hidrólisis se torna constante, el comportamiento sigue igual por lo que todavía la enzima está 297

trabajando con la misma actividad, solo que la disminución del sustrato disponible a hidrolizar genera

que no pueda tener una mayor velocidad.

El ajuste realizado en base al modelo desarrollado, no entrega buenos resultados comparables 300

con los estudios experimentales, pudiendo implicar un mal desarrollo estadístico del modelo, asignando

parámetros de ajuste inadecuadamente, o que las hipótesis planteadas, para la determinación del

modelo no son completamente correctas y es más conveniente desarrollar el modelo con una 303

descripción completa y sin despreciar términos en los balances y expresiones desarrolladas.

La configuración del equipo utilizado permitió controlar la reacción de hidrólisis enzimática de

proteínas, de forma relativamente sencilla y precisa; sin embargo, si no se realiza una mezcla 306

homogénea agua-pollo, los resultados obtenidos cambian considerablemente y afectan la

reproducibilidad de los mismos. Un sistema automático de titulación, permitiría obtener datos más

precisos del grado de hidrólisis. 309

El mecanismo de la hidrólisis enzimática de proteínas de pechuga de pollo, es un conjunto de

reacciones en paralelo que involucran inhibición acompetitiva por sustrato. La inhibición por sustrato

se presentó a concentraciones superiores a 50 g/L, donde a máxima velocidad alcanzada en este punto 312

fue de 0,089 % DH/s.

La homogenización de la mezcla, durante el proceso de reacción, es un parámetro importante

que debe ser estudiado para optimizar los costos de operación, ya que la viscosidad de la mezcla 315

cambia con el tiempo.

Los hidrolizados obtenidos deben ser analizados para determinar la d istribución de pesos

moleculares, y así, poder estimar los parámetros operacionales, que maximicen la producción de 318

péptidos con las características deseadas.

321

Referencias 324

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342