PapilloCheck high-risk - Greiner Bio-One · Greiner Bio-One GmbH Maybachstr. 2 72636 Frickenhausen Alemanha 4 °C 8 °C 60 ... Adição do modelo DNA/reação da PCR ..... 41 12.3

Fabricado na Áustria PERIGO

Greiner Bio-One GmbHMaybachstr. 2 72636 FrickenhausenAlemanha

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Your Power for Health

Kit para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 (PapilloCheck®) ou dos tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 (PapilloCheck® high-risk) em amostras cervicais

Para utilização em diagnóstico in vitroapenas por pessionais de laboratório

PapilloCheck®

PapilloCheck® high-riskInstruções de Uso

HPV DNA-Chip

Revisão: BQ-013-09/Março de 2016



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PapilloCheck® e PapilloCheck® high-risk – Instruções de usoRevisão: BQ-013-09/Março de 2016

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INFORMAÇÕES DE DIREITOS DE AUTORInstruções de Utilização do Kit de Ensaio PapilloCheck®

©Copyright 2015 da Greiner Bio-One

Greiner Bio-One GmbHMaybachstr. 2, 72636 Frickenhausen, AlemanhaTelefone: +49 (0) 7022 948-0, Fax: +49 (0) 7022 [email protected], www.gbo.com

AvisoTodos os direitos reservados.

As informações contidas neste documento estão sujeitas a alteração a qualquer momento e sem aviso prévio. É proibido copiar ou reeditar este documento em qualquer forma ou formato sem aprovação por escrito da Greiner-Bio-One GmbH.

Direito de marca comercial registradaOs nomes comerciais e as etiquetas utilizadas pertencem ao respetivo proprietário.

Informações importantes para o usuárioPara a correta utilização do Kit de Ensaio PapilloCheck®, é necessário que o usuáro leia e siga cuidadosamente este manual de instruções.

O fabricante não assume qualquer responsabilidade por qualquer utilização deste sistema de ensaio que não esteja descrita neste documento, nem por modificações que o usuário possa ter feito ao sistema de ensaio.

UTILIZAÇÃO PREVISTAO PapilloCheck® é um kit para diagnóstico e destina-se a ser utilizado para a deteção qualitativa e a genotipagem de 24 tipos do vírus do papiloma humano nas preparações de DNA provenientes de esfregaços cervicais humanos. O kit destina-se a ser utilizado apenas por pessoal habilitado.

O PapilloCheck® high-risk é um kit para diagnóstico e destina-se a ser utilizado para a deteção qualitativa e a genotipagem de 14 tipos do vírus do papiloma humano de alto risco (HrHPV) nas preparações de DNA provenientes de esfregaços cervicais humanos. O kit destina-se a ser utilizado apenas por pessoal habilitado.

O PapilloCheck® cumpre os requisitos da Diretiva 98/79/CE, relativa aos dispositivos médicos para diagnóstico in vitro, e, portanto, exibe a marca CE de conformidade. Qualquer resultado de diagnóstico obtido utilizando o PapilloCheck® deve ser interpretado em combinação com outros resultados clínicos ou laboratoriais.

Os Kits de Ensaio PapilloCheck® destinam-se apenas a utilização em laboratório, não para utilização para outras finalidades.Estes produtos destinam-se apenas a usuárioes profissionais, como técnicos ou médicos com formação em técnicas de biologia molecular.

Exceto se indicado o contrário nestas Instruções de uso, o nome PapilloCheck® é utilizado para ambas as variantes, o PapilloCheck® e o PapilloCheck® high-risk.



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!GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS

pt Código do lote

Não reutilizar

Data de validade

Consultar as Instru-ções de Utiliza-ção

Número de catá-logo

Fabri-cante

Não utilizar caso a emba-lagem esteja danifica-da

Limite de tempera-tura

Con-teúdo suficiente para <n> ensaios

Pictogramas GHS com as palavras-sinal PERIGO ou

AVISO

pt Marcas CE

Disposi-tivo mé-dico para diagnós-tico in vitro

Conser-var num local escuro

Aviso im-portante

!I V D



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ÍNDICE

1. CONTEÚDO DO KIT .....................................................................................................6

2. CONSUMÍVEIS, KIT E MATERIAIS NECESSÁRIOS....................................................7

3. ENVIO E CONSERVAÇÃO ............................................................................................ 9

4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA ................................................................................10

5. DESCARTE DE RESÍDUOS ........................................................................................11

6. INTRODUÇÃO .............................................................................................................12

6.1 Informações Gerais .......................................................................................................... 126.2 Tipos de HPV detectáveis com o PapilloCheck® ........................................................... 126.3 Princípio do ensaio ........................................................................................................... 136.4 Desenho da microplaca PapilloCheck® ........................................................................... 15

6.4.1 Esquema da microplaca PapilloCheck® ..............................................................................15

6.4.2 Controles na microplaca ......................................................................................................16

7. INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO PARA O FLUXO DE TRABALHO DO PAPILLOCHECK® .......................................................................................................18

7.1 Instruções gerais .............................................................................................................. 187.2 Separação de salas .......................................................................................................... 187.3 Avisos e precauções ........................................................................................................ 19

7.3.1 Prevenção de contaminação ...............................................................................................19

7.3.2 Instruções de manuseamento de microplacas ....................................................................19

7.3.3 Precauções gerais ...............................................................................................................19

7.3.4 Medidas de biossegurança .................................................................................................20

8. PROCESSO PAPILLOCHECK® ................................................................................... 21

8.1 Coleta de amostra e extração de DNA ............................................................................ 218.1.1 Coleta de amostra ...............................................................................................................21

8.1.2 Extração de DNA .................................................................................................................23

8.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ......................................................................... 238.2.1 Preparação do termmocidador ...........................................................................................24

8.2.2 Tratamento da Uracilo-N-Glicosilase (UNG) .......................................................................24

8.2.3 Preparação da reação de PCR ............................................................................................25

8.3 Hibridização e lavagem .................................................................................................... 278.3.1 Preparação e configuração ..................................................................................................27

8.3.2 Hibridização .........................................................................................................................28

8.3.3 Lavagem e secagem ............................................................................................................30

8.4 Escaneamento e avaliação da microplaca PapilloCheck® ............................................. 32

9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS .................................................................................33

10. ASSISTÊNCIA TÉCNICA .............................................................................................34



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11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DO PAPILLOCHECK® ............................. 35

11.1 Desempenho analítico do PapilloCheck® ....................................................................... 3511.1.1 Sensibilidade analítica .........................................................................................................35

11.1.2 Especificidade analítica – tipos de HPV ..............................................................................36

11.1.3 Especificidade analítica – Organismos não HPV .................................................................36

11.2 Repetibilidade (Intrarreprodutibilidade) ........................................................................... 3611.3 Reprodutibilidade ............................................................................................................. 3711.4 Robustez ........................................................................................................................... 3711.5 Desempenho Clínico do PapilloCheck® .......................................................................... 38

12. PROTOCOLO CURTO PAPILLOCHECK® .................................................................. 40

12.1 Sala 2: PCR - Preparação da mistura de reação ............................................................ 4012.2 Sala 2: PCR - Adição do modelo DNA/reação da PCR .................................................. 4112.3 Sala 3: Hibridização - Preparação/Reação de hibridização ........................................... 4212.4 Sala 3: Lavagem e secagem/Escaneamento e avaliação .............................................. 43

Importador e distribuidor : Greiner Bio-One Brasil Produtos Médicos Hospitalares Ltda.Av. Affonso Pansan, 1967 - Vila Bertini - CEP.13.473-620 - Americana - SP

FONE - (0xx)(19)-3468-9600 FAX - (0xx)(19)-3468-9601CNPJ 71.957.310 / 0001-47 – site: www.gbo.com

Responsável Técnico: Dra. Maria Gabriela Bazanelli - CRF-SP n° 32.288Registro ANVISA/MS Nº: 10290310039



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1. CONTEÚDO DO KIT

Kit de Ensaio PapilloCheck® e PapilloCheck® high-risk1

Conteúdo Quantidade

PapilloCheck® (REF. 465 060)

PapilloCheck® PCR MasterMix 5 x PapilloCheck® PCR MasterMix2 5 x 300 µl

Caixa de lâminas PapilloCheck®, 5 x 12 Arrays

1 x Caixa de lâminas PapilloCheck®, com 5 microplacas PapilloCheck®3, cada uma com 12 arrays, para 60 amostras

1

Tampão de Hib. PapilloCheck® 2 x Tampão de Hibridização PapilloCheck® 2 x 1000 µl

Conc. TAMP. A PapilloCheck® 2 x Tampão de lavagem A PapilloCheck®, concentrado

2 x 40 ml

Conc. TAMP. B PapilloCheck® 1 x Tampão de lavagem B PapilloCheck®, concentrado

1 x 15 ml

Folheto Baixar Instruções de uso 1

PapilloCheck® high-risk (REF. 505 060)

PapilloCheck® high-risk PCR Master-Mix

5 x PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix 5 x 300 µl

Caixa de lâminas PapilloCheck® high-risk, 5 x 12 Arrays

1 x Caixa de lâminas PapilloCheck® high-risk, com 5 microplacas PapilloCheck® high-risk3, cada uma com 12 arrays, para 60 amostras

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Tampão de Hib. PapilloCheck® high-risk

2 x Tampão de Hibridização PapilloCheck® high-risk

2 x 1000 µl

Conc. TAMP. A PapilloCheck® high-risk

2 x Tampão de lavagem A PapilloCheck® high-risk, concentrado

2 x 40 ml

Conc. TAMP. B PapilloCheck® high-risk

1 x Tampão de lavagem B PapilloCheck® high-risk, concentrado

1 x 15 ml

Folheto Baixar Instruções de uso 1

1 Um Kit de Ensaio PapilloCheck® ou PapilloCheck® high-risk é suficiente para a análise de 60 amostras.2 Contém todos os componentes necessários para PCR, exceto para a Taq Polimerase de DNA e a Uracilo-N-Glicosilase.3 Uma microplaca PapilloCheck® contém 12 microarrays PapilloCheck®. Nestas Instruções de Utilização, as palavras

microplaca(s) e lâmina(s) são utilizadas como sinônimos.



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2. CONSUMÍVEIS, KIT E MATERIAIS NECESSÁRIOS

Recomenda-se a utilização de PapilloCheck® em combinação com os consumíveis, kit e materiais indicados e apenas por profissionais habilitados.

Consumíveis Cat. Greiner Bio-One N.º Quantidade

Kit de Ensaio PapilloCheck® 465 0601 kit

para 60 reações

Kit de Ensaio PapilloCheck® high-risk 505 0601 kit

para 60 reações

PapilloCheck® Collection Kit 465 0751 kit

para 50 amostras

Kit de Extração de DNA oCheck®/ Preparação com UmaColuna

515 0401 kit

para 50 preparações

Ponteiras com filtro sem DNase para micropipetas, esterilizadas4

0,5 µl a 10 µl0,5 µl a 20 µl10 µl a 100 µl10 µl a 200 µl100 µl a 1000 µl

765 288774 288772 288739 288750 288

96/96096/96096/96096/96060/600

Tubo de polipropileno de 50 ml5

Tubo de reação de 1,5 ml 210 261616 201

25/450500/4000

Pipetas de plástico para pipetador

Pipeta de 10 mlPipeta de 25 mlPipeta de 50 ml

607 180 ou 607 160760 180 ou 760 160786 180 ou 768 160

1/2001/2001/200

4 Alguns dos tamanhos de ponteiras mencionados são opcionais, dependendo das micropipetas disponíveis.5 Apenas necessário se não estiver disponível uma centrifugadora de lâminas.



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Consumíveis Cat. Greiner Bio-One N.º Quantidade

CheckScanner™ 862 070 1

CheckReport™Software Basic 862 080 1

Plug-in do CheckReport™Software PapilloCheck® 862 081 1

Plug-in do CheckReport™Software PapilloCheck® high-risk

862 088 1

Sistema de PC, incluindo CheckReport™Software eplug-in do PapilloCheck® ou PapilloCheck® high-risk

862 910 1

Pacote Inicial CheckScanner™ (CheckScanner™, sistema de PC, CheckReport™Software, plug-in do PapilloCheck® ou PapilloCheck® high-risk)

862 170 1

Câmara de Hibridização oCheck® com suporte de lâminas 447 070 1

Pega magnética para suporte de lâminas 447 001 1

Caixa de lavagem oCheck®6 447 020 1

Enzimas necessárias

• Taq Polimerase: 5 U/µl da Polimerase do DNA HotStarTaq® (Qiagen; 203203, 203205, 203207, 203209)• Uracilo-N-Glicosilase: 1 U/µl da Uracilo-DNA Glicosilase (Thermo Scientific; #EN0361, #EN0362)

Consumíveis adicionais necessários

• Água de grau PCR• Água purificada• Luvas descartáveis• DNA Away™ (Thermo Scientific; nº 7008, nº 7009, nº 7010)• Utilize apenas tiras de 8 tubos adequadas e compatíveis com PCR, tubos ou placas simples recomendados pelo

fabricante do termoclador utilizado.• Para otimizar o fluxo de trabalho recomenda-se a utilização de tiras de 8 tubos.

Kit adicional necessário

• Microcentrifuga para tubos de reação de 1,5 e 2 ml• Centrifuga para tubos de polipropileno de 50 ml• Microcentrifuga para tubos de reação simples de 0,2 ml ou tiras de 8 tubos para PCR • Termociclador para PCR: GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems) Termociclador Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems) peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnology GmbH)• Banho-maria (50 °C)• Micropipeta (diferentes gamas de 1 a 1000 µl)• Multipipeta de 8 canais (gama: 5 a 50 µl), por ex., Brand Transferpette®-8 (Brand)• Pipetador para pipetas de vidro e de plástico• Agitador de vórtex• Racks para diferentes tubos de reação• Timer• Descartador de resíduos

Material adicional necessário

• Computador (para requisitos do sistema, consulte as Instruções de uso do CheckScanner™ e do CheckReport™Software)

6 Para o processo de lavagem de PapilloCheck® são necessárias três caixas de lavagem oCheck®.



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3. ENVIO E CONSERVAÇÃO

O envio do kit de ensaio PapilloCheck® é efetuado à temperatura ambiente. No entanto, o kit tem de ser conservado imediatamente após a receção entre 4 a 8 °C e deve ser protegido da luz. Mantenha a caixa de lâminas com as microplacas PapilloCheck® no saco com fecho com dessecante sempre fechado. Todos os componentes devem ser conservados na embalagem do kit original para evitar a mistura de lotes. Sendo conservado corretamente, o Kit de Ensaio PapilloCheck® e os seus componentes podem utilizar-se até à data de validade indicada. Além disso, nestas condições, a duração não diverge do prazo de validade após a primeira abertura do kit e dos seus componentes.

A conservação do kit de Ensaio PapilloCheck® entre 4 a 8 °C pode resultar na precipitação de sais no Tampão de Hibridização e Tampão B. Os precipitados têm de ser dissolvidos antes da utilização deixando-os equilibrarem à temperatura ambiente (18 a 25 °C) e submetendo o tubo/frasco a mistura e ao agitador de vórtex.

Conservação do produto

Kit de Ensaio PapilloCheck® 4 a 8 °C, protegido da luz

Kit de Ensaio PapilloCheck® high-risk 4 a 8 °C, protegido da luz



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4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA

O Kit de Ensaio PapilloCheck® destina-se apenas a utilização no laboratório, não para utilização como medicamento, em casa ou para outras finalidades. As microplacas para DNA devem ser utilizadas num ambiente sem poeiras. O depósito de poeiras e outras partículas nas lâminas pode originar resultados insatisfatórios ou inválidos.

! Utilize sempre uma avental de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de proteção e cumpra as instruções de segurança fornecidas nesta seção.

Informação sobre Regulamentação:Os componentes seguintes do Kit de Ensaio PapilloCheck® contêm substâncias nocivas e perigosas:

Componente do kit

Quantidade Conteúdo perigoso

Classificação em

conformidade com o

regulamento (CE)

Nº 1272/2008

Pictograma GHS e palavra-

sinal

Advertências de perigo e recomendações de prudência

Tampão de Hibridização PapilloCheck®, tiocianato de guanidina, 20 a 60%, Nº CAS 593-84-0

toxicidade aguda, oral (categoria 4), toxicidade aguda, inalação (categoria 4), toxicidade aquática crônica (categoria 3), corrosivo para a pele (categoria 1c)

PERIGO

H302H332H314

H412

P273P280

P305+ P351+P338

EUH032

Nocivo por ingestão.Nocivo por inalação.Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves.Nocivo para os organismos aquáticos com efei-tos duradouros.

Evitar a libertação para o ambiente.Utilizar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial.SE ENTRAR EM CONTATO COM OS OLHOS: enxaguar cuidadosamente com água durante vá-rios minutos. Se usar lentes de contato, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar.

Informações suplementares sobre os perigos (UE): Em contato com ácidos libera gases muito tóxicos.

Tampão B PapilloCheck®, dodecil sulfato de sódio, < 20%, Nº CAS 151-21-3

irritação cutâ-nea (categoria 2), lesões oculares graves (categoria 1) PERIGO

H315H318P280

P305+ P351+P338

Provoca irritação cutânea.Provoca lesões oculares graves.Usar vestuário de proteção/proteção ocular/pro-teção facial.SE ENTRAR EM CONTATO COM OS OLHOS: enxaguar cuidadosamente com água durante vá-rios minutos. Se usar lentes de contato, retire-as, se tal lhe for possível. Continuar a enxaguar.

A versão atual da Ficha de Dados de Segurança para este produto pode ser baixada a partir do sítio da Internet Greiner Bio-One: www.gbo.com Know-How & Services Download-Center



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5. DESCARTE DE RESÍDUOS

Após a lavagem e a secagem da microplaca PapilloCheck®, as soluções de lavagem I e II podem ser eliminadas sem quaisquer precauções especiais. Elimine a microplaca PapilloCheck® utilizada, os componentes não utilizados do kit e a mistura de hibridização não utilizada com os resíduos químicos do laboratório.

Siga todos os regulamentos nacionais, estatais e locais relativos à eliminação.



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6. INTRODUÇÃO

6.1 Informações Gerais

A infeção persistente com um vírus do papiloma humano (HPV) cancerígeno verifica-se virtualmente em todos os casos de câncer cervical – o segundo câncer mais comum nas mulheres a nível mundial7. Até à data, identificaram-se mais de 100 tipos de HPV, dos quais cerca de 40 tipos são transmitidos sexualmente e infetam a mucosa genital. Os tipos de HPV cervical estão classificados como um grupo de alto risco (HPV de alto risco, hrHPV) e de baixo risco (HPV de baixo risco, hrHPV). Enquanto os tipos de HPV de alto risco estão associados a um maior risco de desenvolvimento de câncer cervical, os tipos de HPV de baixo risco causam sobretudo verrugas genitais benignas8. Contudo, mesmo no grupo de alto risco, o risco relativo para o desenvolvimento de câncer ou neoplasias intraepiteliais cervicais (CIN) depende do tipo9. Cerca de 70% de todos os casos de câncer cervical estão ligados a uma infeção persistente com HPV 16 ou 18. Os tipos de baixo risco mais predominantes são o HPV 6 e 11. Com base na ligação quase puramente etiológica entre o HPV cancerígeno e o câncer cervical, os testes para o hrHPV estão a ser considerados como um rastreio primário do câncer cervical10.

6.2 Tipos de HPV detectáveis com o PapilloCheck®

O PapilloCheck® permite a identificação de 18 tipos de alto risco e 6 de baixo risco do vírus do papiloma humano (HPV) (Tabela 1), enquanto o PapilloCheck® high-risk permite a identificação de 14 tipos de alto risco do vírus do papiloma humano (hrHPV) (Tabela 2).

Tabela 1: Tipos de HPV detectáveis com o PapilloCheck®

HPV 16 HPV 45 HPV 59 HPV 6





HPV 39 HPV 58 HPV 82 HPV 44/HPV 55*

* O PapilloCheck® não permite a diferenciação entre o HPV 44 e o HPV 55.

Tabela 2: Tipos de hrHPV detectáveis com o PapilloCheck® high-risk

HPV 16 HPV 51

HPV 18 HPV 52

HPV 31 HPV 56

HPV 33 HPV 58

HPV 35 HPV 59

HPV 39 HPV 66

HPV 45 HPV 68

7 Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1):12-9., Sexually Transmitted Infections 76:80-87

8 Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1–17.9 Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specific implications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K1-16.

10 Meijer, C.J. et al. (2009). Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer. 124(3):516-20.



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6.3 Princípio do ensaio

O PapilloCheck® é um kit de ensaio baseado em microarray para a deteção e genotipagem de um fragmento do gene E1 do genoma do vírus do papiloma humano (HPV). O processo de ensaio está resumido na Figura 1.

Antes da análise PapilloCheck®, o DNA tem de ser extraído de uma amostra de esfregaço cervical. A coleta de amostras e a extração de DNA não fazem parte do Kit de Ensaio PapilloCheck®. Os produtos dedicados para a coleta de amostra (PapilloCheck® Collection Kit) e a extração de DNA (Kit de Extração de DNA oCheck®) também estão disponíveis na Greiner Bio-One e têm de ser adquiridos em separado (consulte as informações sobre aquisição no capítulo 2).

Após a extração do DNA genómico viral e humano de uma amostra cervical, um fragmento 350 bp do gene viral E1 é amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) na presença de um conjunto de primers específicos do HPV. Na mesma reação, um fragmento do gene humano de cópia simples ADAT1 (adenosina deaminase 1 específica de RNA t humano) é amplificado para checar a presença de material de amostra humano na amostra cervical (controle da amostra) e um modelo de controle interno presente no PapilloCheck® PCR MasterMix é amplificado para checar o desempenho da PCR (controle da PCR). Além disso, o PapilloCheck® PCR MasterMix contém dUTP. Assim, a potencial contaminação cruzada de reações de PCR anteriores pode ser eliminada através da utilização do tratamento com Uracilo-N-Glicosilase (UNG) (consulte o capítulo 8.2.2).

Os produtos para PCR são então hibridados para sondas específicas de DNA e controles na microplaca associados à superfície da microplaca PapilloCheck®. Cada microplaca contém 12 microarrays de DNA, que permitem a análise simultânea de 12 amostras cervicais. Durante a hibridização, o DNA ligado é marcado com fluorescênia e o DNA não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes. Controla-se a eficácia da hibridização (controle da hibridização).

Por último, a microplaca PapilloCheck® é escaneado, analisada e avaliada automaticamente utilizando o CheckScanner™ e o CheckReport™Software, respectivamente (consulte as informações sobre aquisição no capítulo 2). O CheckScanner™ é um scanner a laser bicolor (comprimentos de onda de excitação de 532 nm e 635 nm), que permite a detecção do sinal fluorescente gerado pela presença dos produtos de amplificação específicos do HPV bem como dos controles (consulte o capítulo 6.4.2). O CheckReport™Software permite a visualização, a análise e a avaliação dos resultados e mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos tipos de HPV detectados como dos controles num relatório detalhado.

O relatório indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de hrHPV ou 14 tipos de HrHPV detectáveis e os controles abrangentes na microplaca tornam a análise altamente confiável.



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1. Reação da PCR

2. Hibridização

3. Lavagem e secagem

4. Escaneamento e escaneamento

ou

Figura 1: Processo do ensaio PapilloCheck®

1. Reação da PCR: após a extração de DNA, um fragmento 350 bp do gene viral E1 e os fragmentos de dois objetivos de controle são amplificados através de PCR. Os produtos de amplificação são então hibrizados para sondas de DNA complementares na microplaca.

2. Hibridização: cada tipo de HPV é detectado por uma sonda de DNA específica presente em cinco réplicas. Durante a hibridização, introduz-se o marcador com fluorescênta.

3. Lavagem e secagem: o DNA não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes.4. Escanameamento e análise: A microplaca PapilloCheck® é escaneada, analisada e avaliada utilizando o CheckScanner™ e CheckReport™Software. É criado um relatório que indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos tipos de HPV detectáveis.



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6.4 Desenho da microplaca PapilloCheck®

6.4.1 Esquema da microplaca PapilloCheck®

Cada microplaca PapilloCheck® ou PapilloCheck® high-risk contém 12 microarrays designados como poço A1 a B6. Em cada poço, uma microplaca simples que inclui diferentes sondas é pontuada. Cada microplaca simples é delimitada por uma borda elevada. Cada sonda é pontuada em cinco replicatas. O esquema da microplaca está ilustrado na Figura 2. Os controles na microplaca descritos são explicados mais à frente no capítulo 6.4.2.

controle da orientação

HPV 31HPV 18HPV 16HPV 11HPV 6


controle da hibridação

HPV 44/55HPV 43

Controle da PCR



controle da amostra

HPV 82HPV 73

controle da orientação



controle da hibridação

HPV 44/55HPV 43

Controle da PCR



controle da amostra

HPV 82HPV 73

a) cana

l ver

mel

ho (6

35 n

m)

cana

l ver

de (5

32 n

m)

b)

c)

Figura 2: Desenho da microplaca PapilloCheck®

a) Esquema da microplaca PapilloCheck®. b) e c) Imagens apresentadas pelo CheckReport™Software para os dois comprimentos de onda de excitação diferentes utilizados para escaneamento (b) do canal vermelho: 635 nm; c) canal verde: 532 nm) e esquemas da disposição do microarray PapilloCheck®. Indicam-se as sondas específicas para o tipo do HPV e os controles na microplaca.



4 °C

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6.4.2 Controles na microplaca

O desenho da microplaca de DNA PapilloCheck® inclui controles abrangentes na microplaca. Vários sistemas de controle monitoram todos os passos mais importantes tanto do ensaio como do processamento da microplaca, incluindo a qualidade das amostras e a extração de DNA (controle da amostra), a qualidade de reação da PCR (controle da PCR), a eficácia da hibridização (controle da hibridização), bem como a homogeneidade da coloração e a qualidade de impressão (controle da orientação e controle da impressão). Para além da presença ou ausência de tipos de HPV, o CheckReport™Software mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos controles como dos tipos de HPV detectados num relatório detalhado. Para a leitura dos diferentes controles, utilizam-se os dois comprimentos de onda de excitação do CheckScanner™. Para o controle do desempenho do ensaio (controle da amostra e da PCR), utiliza-se o canal vermelho (comprimento de onda de excitação de 635 nm), enquanto a qualidade da hibridização e da microplaca (controle da hibridização, da orientação e da impressão) é avaliada no canal verde (comprimento de onda de excitação de 532 nm).

Controle da amostraO PapilloCheck® monitora a qualidade da amostra e/ou da extração de DNA amplificando um fragmento do gene humano de cópia simples ADAT1 (adenosina deaminase 1 específica de tARN humano). Se estiver presente DNA humano numa quantidade adequada no DNA extraído da amostra cervical, é gerado um sinal fluorescente nas colorações de controle da amostra.

Se não ocorrer amplificação de ADAT1 ou esta for insuficiente, o CheckReport™Software indica que o controle da amostra "falhou". Esta situação tem duas consequências diferentes, dependendo do sinal das colorações específicas do agente patogênico. Se a amostra for positiva para HPV, a análise permanece válida. Neste caso, o controle da amostra falho é um resultado direto da competição entre o DNA concomitante e um excesso do DNA-alvo durante a PCR. Se, por outro lado, a amostra for negativa para o HPV, o CheckReport™Software indica que a análise "falhou" devido fraca na coleta da amostra (quantidade insuficiente de células na amostra) e/ou extração de DNA ineficaz. Neste caso, é recomendável repetir a análise começando com a extração de DNA ou, se necessário, coletar uma nova amostra (consulte o capítulo 9).

Controle da PCRO PapilloCheck® também monitora o desempenho da PCR. A amplificação de um modelo de controle interno presente no PapilloCheck® PCR MasterMix gera um sinal nas colorações de controle da PCR na microplaca PapilloCheck®. A qualidade da reação de amplificação também é automaticamente avaliada pelo CheckReport™Software. Se o desempenho da PCR se situar abaixo de um limite predefinido, o CheckReport™Software indica que o controle da PCR "falhou" e tem de repetir-se a análise (consulte o capítulo 9).

Se a quantidade de DNA do HPV na amostra for muito elevada, o sinal fluorescente das colorações de controle da PCR pode ser baixo ou mesmo não estar presente devido à concorrência durante a reação da PCR. Neste caso, o sinal fluorescente para, pelo menos, uma sonda de DNA específica tem de exceder um limite predefinido para o ensaio ser considerado válido.

Controle da hibridizaçãoO PapilloCheck® monitora a eficácia da hibridização através da utilização de uma sonda fluorescente marcada no Tampão de Hibridização PapilloCheck®, que hibridiza para sequências específicas de DNA na microplaca PapilloCheck®. Uma eficácia de hibridização adequada resulta em sinais fluorescentes em cada coloração de array. Os resultados de cinco colorações de controle da hibridização na microplaca PapilloCheck® também são avaliados pelo CheckReport™Software.



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Controle da orientação e da impressãoAs colorações de controle da orientação da microplaca PapilloCheck® geram sinais fluorescentes independentemente da eficácia do processo de hibridização. Estas colorações são utilizadas no CheckReport™Software como pontos de orientação para uma detecção correta da coloração, o que é um pré-requisito para a análise correta dos sinais. O controle de impressão na microplaca PapilloCheck® monitora a presença e a hibridização das colorações. Para além disso, a qualidade do processo de impressão é controlada através da presença de um sinal fluorescente verde em cada coloração da microplaca (controle da impressão).



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7. INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO PARA O FLUXO DE TRABALHO DO PAPILLOCHECK®

A seguinte descrição do fluxo de trabalho é igual para a aplicação dos produtos PapilloCheck® e PapilloCheck® high-risk. Siga a descrição para o PapilloCheck® utilizando apenas componentes do Kit de Ensaio PapilloCheck®. Siga a descrição para o PapilloCheck® high-risk utilizando apenas componentes do Kit de Ensaio PapilloCheck® high-risk.

7.1 Instruções gerais

Quando se implementam as técnicas modernas atualmente utilizadas em biologia molecular num laboratório, devem ter-se em conta as instruções seguintes para garantir a máxima segurança do pessoal do laboratório e resultados de alta qualidade.

A execução de técnicas de biologia molecular, como extração de DNA, amplificação e deteção dos produtos de amplificação, requer pessoal devidamente habilitado. Para além disso, é necessário um fluxo de trabalho limpo e bem estruturado para prevenir resultados errados, tais como os que ocorrem devido à degradação ou contaminação de DNA através dos produtos de amplificação. Para garantir isto, é necessário separar as áreas de extração, amplificação e deteção conforme descrito no capítulo 7.2.

Cada área deve estar equipada com kit, consumíveis, avental e luvas em separado. Nunca transfira avental, luvas ou kit de laboratório de uma área para outra.

7.2 Separação de salas

A Figura 3 mostra um exemplo de como um laboratório pode ser separado em três seções distintas. Uma sala utiliza-se apenas para a extração de DNA, outra para a preparação e realização de reações de PCR e a última destina-se a hibridização e análise. Cada sala utiliza-se exclusivamente para a aplicação ou técnica indicada, para evitar a contaminação de amostras. A utilização de codificação de cores pode ser vantajosa para evitar a troca acidental de kit e consumíveis entre as áreas.

Sala 1 Sala 2 Sala 3

Figura 3: Separação de salas para processamento manualSala 1: Todo o processo de extração de DNA tem de executar-se nesta sala.Sala 2: Nesta sala, prepara-se e divide-se a mistura de reação para PCR em alíquotas (de preferência sob uma proteção para

PCR). A adição das amostras de DNA extraídas na sala 1 tem de efetuar-se num espaço separado dentro da sala 2.Sala 3: Na terceira sala de laboratório, ocorre a reação de hibridização e realizam-se os passos de lavagem e secagem da

microplaca. Para além disso, utiliza-se o CheckScanner™ em conjunto com o CheckReport™Software para a análise final do ensaio PapilloCheck®.

! Não se deve trocar nem kit nem consumíveis entre as diferentes salas de laboratório e espaços. Portanto, as duplicações de kit e consumíveis são uma necessidade e devem ter sido consideradas ao equipar o laboratório.



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7.3 Avisos e precauções

7.3.1 Prevenção de contaminação

• As aventais de laboratório têm de ser usadas durante os procedimentos e são necessários conjuntos diferentes de aventais para cada sala de laboratório.

• Limpeza do laboratório: O local de trabalho tem de ser descontaminado com DNA-AWAY™ (Thermo Scientific) ou qualquer outra solução de limpeza adequada antes e depois do trabalho.

• As luvas têm de ser usadas durante cada passo da análise e têm de ser mudadas com frequência, especialmente durante a extração de DNA.

• Tubos de amostra: Nunca toque no interior da tampa do tubo de reação. Para evitar contaminação cruzada, abra um tubo de cada vez.

• Pipetagem: Têm de utilizar-se ponteiras com filtro adequadas para micropipetas com proteção contra aerossóis (sem DNase, RNase e DNA humano, esterilizadas). As ponteiras das pipetas devem ser sempre trocadas entre transferências de líquidos.

7.3.2 Instruções de manuseamento de microplacas

• As microplacas para DNA devem utilizar-se num ambiente sem poeiras. Deve evitar-se a deposição de poeiras e de outras partículas na superfície das microplacas.

• Não toque na zona de hibridização na superfície da microplaca.

• Apenas o lado etiquetado da microplaca se destina a hibridização.

• Não utilize canetas marcadoras para a identificação de microplacas de DNA, pois causam fluorescência não específica na microplaca.

• As microplacas de DNA destinam-se a uma única utilização. As microplacas hibridadas não podem ser reutilizadas.

• Guarde as microplacas não utilizadas na caixa original dentro do saco com fecho fornecido com dessecante.

7.3.3 Precauções gerais

• No momento da chegada, verifique se os componentes do kit têm danos. Se um dos componentes estiver danificado (por ex., frascos de tampão), contate o seu distribuidor local Greiner Bio-One. Não utilize componentes do kit danificados, pois a sua utilização pode levar a um fraco desempenho do kit.

• Não utilize o kit após o prazo de validade.

• Não misture reagentes de diferentes lotes.

• Não utilize reagentes fora do prazo de validade.

• Utilize apenas kit/reagentes fornecidos com o kit e os recomendados pelo fabricante.

• Deve efetuar-se uma calibração/manutenção regular em todo o kit, como, por exemplo, termociclador de PCR ou pipetas.

• A pipetagem de quantidades pequenas de líquido na faixa do microlitro é um desafio. Portanto, tenha cuidado para pipetar com a maior precisão possível.

• Para evitar a contaminação microbiana dos reagentes, tenha cuidado ao retirar as alíquotas dos tubos de reagentes.

• Os reagentes não utilizados e os resíduos têm de ser eliminados em conformidade com as diretrizes federais e estatais.

7.3.4 Trabalhar em segurança



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• Use sempre avental de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de proteção!

• Os kits destinam-se apenas a diagnóstico in vitro e devem ser utilizados exclusivamente por pessoal treinado na prática de laboratório de diagnóstico in vitro.

• Tenha cuidado ao manusear amostras biológicas que podem conter material potencialmente infeccioso. Para minimizar o risco de infeção de material potencialmente infeccioso, recomenda-se trabalhar em condições de fluxo laminar até a lise das amostras estar concluída. Manuseie e elimine todas as amostras biológicas como se fossem capazes de transmitir agentes infecciosos.

• Evite o contato direto com as amostras biológicas, bem como respinger ou pulverizar. Use sempre avental, luvas e óculos de proteção quando trabalha com amostras biológicas.

• Nunca pipete soluções com a boca.

• Não coma, beba, fume nem aplique produtos cosméticos nas áreas de trabalho.

• Lave as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes.

A versão atual da Ficha de Dados de Segurança para este produto pode ser baixada a partir do sítio da Internet Greiner Bio-One:www.gbo.com Know-How & Services Download-Center

21PapilloCheck® e PapilloCheck® high-risk – Instruções de usoRevisão: BQ-013-09/Março de 2016

8. PROCESSO PAPILLOCHECK®

O capítulo seguinte descreve dentalhadamente os diferentes passos de trabalho que, resultam na realização de um relatório detalhado, indicando claramente a presença ou ausência de um ou mais dos tipos de HPV detectáveis em cada amostra cervical analisada. A Figura 4 mostra os diferentes passos de trabalho necessários. Também indica o subcapítulo correspondente que descreve o passo do ensaio específico. Os passos de trabalho têm de ser executados pela ordem descrita neste capítulo. Cada passo específico com intervenção é indicado por uma seta azul .

!A coleta de amostras, a extração de DNA e a análise com o CheckReport™Software não fazem parte do Kit de Ensaio PapilloCheck®. Portanto, a descrição destes passos de trabalho é resumida neste capítulo. Para informações mais detalhadas, consulte as Instruções de uso correspondentes, por exemplo, do PapilloCheck® Collection Kit, do Kit de Extração de DNA oCheck® e do CheckReport™Software.

8.1 Coleta de amostras e extração de DNA

8.1.1 Coleta de amostras

A coleta de amostras não faz parte do Kit de Ensaio PapilloCheck®. Um kit de coleta dedicado a amostras cervicais (PapilloCheck® Collection Kit) também está disponível na Greiner Bio-One (consulte as informações sobre aquisição no capítulo 2).

O PapilloCheck® foi validado utilizando o DNA preparado com o Kit de Extração de DNA oCheck® proveniente de esfregaços cervicais humanos colhidos através de um dos sistemas ou meios de coleta seguintes:

• PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha)

• PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, EUA)

• Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA)

• STM™ (Qiagen, Hilden, Alemanha)

• Easyfix (VWR, RDNAor, PA, EUA)

• Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, França)

Para mais informações sobre os meios de transporte adequados ou os sistemas de extração de DNA, contate o seu distribuidor local Greiner Bio-One ou consulte o site da Internet Greiner Bio-One: www.gbo.com Know-How & Services Download-Center


Capítulo 8.1.2 Extração de DNA

Kit de extração de

DNA oCheck®

Capítulo 8.3.2 Hibridização

Capítulo 8.2 PCR

Capítulo 8.4 Escaneamento e avaliação

Capítulo 8.3.3 Lavagem e secagem

ou

Figura 4: Apresentação dos diferentes passos de trabalho do PapilloCheck®


8.1.2 Extração de DNA

A extração de DNA não faz parte do Kit de Ensaio PapilloCheck®. Deve realizar-se a extração de DNA antes da análise PapilloCheck® utilizando o Kit de Extração de DNA oCheck®, também fornecido pela Greiner Bio-One (consulte o capítulo 2). Cumpra rigorosamente as Instruções de Utilização quando utilizar o Kit de Extração de DNA oCheck®.

Para a extração de DNA com o Kit de Extração de DNA oCheck®, pipetar 250 µl de solução de amostra.

As amostras de esfregaços cervicais humanos que são colhidas • com o PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha)

• em meio de coleta PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, EUA)

• em Easyfix (VWR, RDNAor, PA, EUA) ou

• Cyt-ALL (Alphapath, Mudaison, França)

podem ser processadas diretamente.

As amostras cervicais que são colhidas em • meio de coleta Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) têm de ser lavadas antes da utilização:

centrifugue 250 µl da amostra durante 5 minutos a 11 000 x g e volte a suspender a pellet em 250 µl de água destilada. Posteriormente, podem processar-se os 250 µl com o Kit de Extração de DNA oCheck®.

As amostras cervicais que são colhidas em • meio de coleta STM™ (Qiagen, Hilden, Alemanha) têm de ser diluídas: utilize 100 µl da amostra

e adicione 150 µl de água destilada. Podem processar-se os 250 µl de amostra diluída com o Kit de Extração de DNA oCheck®.

Regra geral, se a amostra do esfregaço cervical parecer ser muito concentrada e já estiver agregada, a amostra tem de ser diluída e homogeneizada antes de se iniciar a extração de DNA!

As amostras de esfregaços cervicais que sejam muito diluídas e não apresentem células visíveis devem ser concentradas para se obter um rendimento mais elevado de células para extração de DNA: centrifugue até 1000 µl da amostra durante 5 minutos a 11 000 x g e volte a suspender a pellet em 250 µl de água destilada. Posteriormente, podem processar-se os 250 µl com o Kit de Extração de DNA oCheck® ou DNA CheckExtractor.

!Este passo de concentração só é adequado para amostras de esfregaços cervicais que foram colhidas com o PapilloCheck® Collection Kit, em meio de coleta PreservCyt®, Easyfix e Cyt-All ou em meio de coleta Surepath™. Se se utilizou o meio de coleta STM™, não é possível uma concentração através de centrifugação.

8.2 Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A PCR é um método muito sensível que pode detectar quantidades extremamente pequenas de DNA. Devem tomar-se precauções especiais para evitar a contaminação da reação (consulte o capítulo 7). A Polimerase HotStarTaq® e a Uracilo-N-Glicosilase são necessárias, mas não são fornecidas com o Kit de Ensaio PapilloCheck® e têm de ser adquiridas em separado (consulte o capítulo 2).

!O Kit de Ensaio PapilloCheck® foi validado utilizando Polimerase HotStarTaq® da Qiagen e Uracilo-N-Glicosilase da Thermo Scientific (consulte o capítulo 2). A utilização destas enzimas é obrigatória para se obter o desempenho esperado.


8.2.1 Preparação do termociclador

O Kit de Ensaio PapilloCheck® foi validado com os seguintes termocicladores: • GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems)

• Termociclador Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems)

• peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH).

! É imprescindível utilizar um dos termocicladores mencionados acima para se obter o desempenho esperado.

O programa do termociclador de PCR PapilloCheck® encontra-se resumido na Tabela 3.

Tabela 3: Programa do termociclador de PCR PapilloCheck®

Tempo Temp. °C Nº de ciclos

20 min 37 °C 1

15 min 95 °C 1

30 s25 s45 s

95 °C55 °C72 °C

40

30 s45 s

95 °C72 °C

15

Pausa 10 °C ∞

Para além disso, têm de definir-se os parâmetros de execução seguintes para cada termociclador. Para uma descrição sobre como definir estes parâmetros, consulte as Instruções de uso do respetivo termociclador.

GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems)Defina o volume de reação para 26 µl, a velocidade de rampa para "9600" e utilize uma temperatura da tampa de 103 °C.

Termociclador Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems)Utilize a ferramenta Método de Conversão do Termociclador Veriti™ de 96 Poços para entrar no programa PCR PapilloCheck® e selecione "9600 Emulation Mode". Defina o volume de reação para 26 µl e a temperatura da tampa para 103 °C.

peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH)Utilize o programa PCR pré-programado PapilloCheck® “PapilloCheck.js” fornecido em conjunto com o termociclador. Normalmente o programa pode ser aberto usando o seguinte caminho: local/Scripts/GreinerBioOne/PapilloCheck.js.

8.2.2 Tratamento da Uracilo-N-Glicosilase (UNG)11

O PapilloCheck® PCR MasterMix contém dUTP que se inclui nos produtos de amplificação durante a PCR PapilloCheck®, tornando os produtos da PCR suscetíveis à degradação pela UNG. A UNG cliva o produto da PCR em locais onde se incluiu um resíduo de desoxiuridilato. Os produtos da PCR clivados não serão amplificados numa reação posterior.

Assim, pode utilizar-se um tratamento da UNG para eliminar a potencial contaminação cruzada de reações de PCR anteriores11.

11 A aquisição de PapilloCheck® faz-se acompanhada de uma licença limitada com os Números de Patente Norte-americanas 5 035 996, 5 683 896, 5 945 313, 6 287 823 e 6 518 026, e as patentes estrangeiras correspondentes.


Dilua a Uracilo-N-Glicosilase 1:200 em água de grau PCR. Utilize uma diluição recente de UNG para cada preparação de reação de PCR PapilloCheck® (consulte o capítulo 8.2.3). Não volte a utilizar a UNG diluída.

Misture a diluição de UNG cuidadosamente com o agitador de vórtex durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes.

A concentração original da Uracilo-N-Glicosilase é 1 U/µl. Portanto, a concentração da diluição é 0,005 U/µl.

! O Kit de Ensaio PapilloCheck® foi validado utilizando a Uracilo-N-Glicosilase da Thermo Scientific (consulte o capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho esperado.

Adicione 1 µl desta diluição a cada reação de PCR PapilloCheck® (consulte o capítulo 8.2.3, Tabela 4).

Esta quantidade é suficiente para eliminar a contaminação cruzada de PCR. Tenha cuidado para não utilizar uma solução de UNG de concentração mais elevada, pois isso poderia ter um efeito adverso sobre o desempenho da PCR, resultando numa sensibilidade reduzida do PapilloCheck®.

Regra geral, para o tratamento da UNG, a mistura de reação de PCR é incubada durante 20 minutos a 37 °C. Posteriormente, a UNG é inativada por um passo de incubação adicional de 15 minutos a 95 °C. Estes dois passos já estão incluídos na PCR PapilloCheck® e correspondem aos dois primeiros passos do programa do termociclador (consulte a Tabela 3). Durante o segundo passo (15 minutos a 95 °C) ocorre tanto a inativação da Uracilo-N-Glicosilase como a ativação da Polimerase HotStarTaq®.

!O sistema UNG incorporado da PCR PapilloCheck® eliminará apenas a contaminação cruzada com produtos da PCR provenientes de reações anteriores da PCR. Não se consegue eliminar outra contaminação, por exemplo que ocorra durante a preparação da amostra, extração de DNA ou adição de modelo de PCR. Portanto, ainda é necessário cumprir as instruções e precauções especiais para evitar a contaminação descrita no capítulo 7.

8.2.3 Preparação da reação de PCR

Com a exceção da Polimerase HotStarTaq® e da Uracilo-N-Glicosilase, o PapilloCheck® PCR MasterMix já contém todos os componentes necessários para executar a reação de PCR (tampão de PCR, MgCl2, dNTP, iniciadores, modelo de controle da PCR).

Geralmente, o processo de preparação da PCR PapilloCheck® pode ser dividido em duas partes: a preparação da mastermix final adicionando enzimas ao PapilloCheck® PCR MasterMix e a preparação da reação de PCR final adicionando DNA extraído como modelo.

! Validou-se o Kit de Ensaio PapilloCheck® utilizando a Polimerase HotStarTaq® da Qiagen (consulte o capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho esperado.

A preparação da mastermix final é executada da melhor forma num ambiente protegido, por exemplo, com uma proteção para PCR, para evitar a contaminação da reação.

Prepare a mastermix final (que consiste em PapilloCheck® PCR MasterMix, Polimerase HotStarTaq® e Uracilo-N-Glicosilase) para a quantidade necessária de reações de PCR, conforme descrito na Tabela 4.


Para analisar amostras múltiplas, a mastermix final deve ser preparada num lote (na quantidade necessária para todas as análises). Para ajustar atendendo às variações de volume durante a pipetagem, recomenda-se aumentar o número de reações (n) em 1 por cada microplaca (=n+1), por exemplo, prepare um volume de mastermix final para 13 reações de amplificação se for necessário testar 12 amostras (consulte a Tabela 4). Utilize sempre um frasco de PapilloCheck® PCR MasterMix para as reações de uma microplaca.

!Recomenda-se a inclusão de um controle negativo para cada lote da mastermix final preparada. Como controle negativo, pode utilizar-se o tampão de eluição de DNA do kit de extração de DNA apropriado ou água de grau PCR.

Misture a mastermix final cuidadosamente com o agitador de vórtex durante 2 segundos e, depois, reduzindo a rotação ou através de pipetagem várias vezes.

Divida a mastermix final em alíquotas através de pipetagem de 21 µl para cada reação de PCR para um tubo de reação de PCR de 0,2 ml de parede fina.

Efetue a adição do DNA modelo num espaço de trabalho separado do da preparação da mastermix final (consulte o capítulo 7.2).

Para a preparação da mistura de reação, adicione 5 µl de extrato de DNA a cada mastermix final e misture com o agitador de vórtex durante 2 segundos e, depois, reduzindo a rotação ou através de pipetagem várias vezes. O volume total de uma reação de PCR é de 26 µl.

Coloque os tubos de reação no termociclador e inicie a reação de PCR utilizando o programa do termociclador descrito no capítulo 8.2.1 (Tabela 2).

! Após a conclusão da PCR, os produtos de amplificação devem ser utilizados imediatamente para hibridização ou conservados no escuro a ≤ -20 °C durante uma semana.

Tabela 4: Preparação da reação de PCR PapilloCheck®

1 reação13 reações

(1 microplaca)26 reações

(2 microplacas)39 reações

(3 microplacas)52 reações

(4 microplacas)

PapilloCheck®

PCR MasterMix19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl

Polimerase do DNA HotStar-Taq® (5 U/µl)

0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl

Uracilo-N-Glicosilase(Diluição de 1:200, 0,005 U/µl)

1 µl 13 µl 26 µl 39 µl 52 µl

Volume total antes da adição da amostra de DNA (mastermix final)

21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl

Extrato de DNA proveniente da amostra cervical (modelo de DNA)

5 µl

Volume total por reação (reação de PCR final)

26 µl


8.3 Hibridização e lavagem

8.3.1 Preparação e configuração

Comece com os preparativos necessários para a hibridização e os passos de lavagem pelo menos 30 minutos antes do início do processo de hibridização para garantir que todos os componentes necessários estejam à temperatura ambiente.

Para dissolver os potenciais precipitados nos tampões de hibridização e lavagem, deixe-os à temperatura ambiente durante 30 minutos e misture bem antes de utilizar.

Conservar o Kit de Ensaio PapilloCheck® entre 4 a 8 °C pode resultar em precipitação de SDS no Tampão de Hibridização e no Tampão B. Deixe as soluções equilibrarem à temperatura ambiente e depois agite o tubo no agitador de vórtex ou agite o frasco até qualquer precipitado ficar dissolvido.

Prepare a Câmara de Hibridização oCheck®: coloque um toalhete de papel úmido na Câmara de Hibridização e feche a tampa para criar uma atmosfera saturada de umidade.

Para evitar a evaporação do pequeno volume de mistura de hibridização utilizada na microplaca, é necessário executar a hibridização numa atmosfera saturada de umidade. Uma Câmara de Hibridização dedicada para a análise PapilloCheck® está disponível na Greiner Bio-One (consulte o capítulo 2).

Incube a quantidade necessária de microplacas PapilloCheck® na Câmara de Hibridização preparada à temperatura ambiente durante, pelo menos, 10 minutos.

!O suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridização contém um ímã apenas numa das duas extremidades. Se menos de quatro microplacas PapilloCheck® forem hibridizadas em paralelo, tenha o cuidado

de encher o suporte de lâminas com microplacas PapilloCheck® a partir do lado oposto do ímã. Caso contrário, as microplacas PapilloCheck® não ficarão cobertas com líquido durante o processo de lavagem.

Prepare as soluções de lavagem I, II e III de acordo com as instruções seguintes.

Preparação das soluções de lavagem I, II e III: Prepare a mistura da solução de lavagem para as soluções de lavagem I, II e III adequada ao

número de microplacas PapilloCheck® que são analisadas, como ilustrado na Tabela 5.

Divida em alíquotas três volumes iguais da mistura da solução de lavagem em três caixas de lavagem separadas oCheck® e identifique-as no rótulo como solução de lavagem I, II e III. Cada caixa de lavagem oCheck® contém uma escala gravada, que indica a quantidade correta de solução de lavagem necessária para até 4 microplacas. Utilize esta escala para verificar a quantidade de tampão.

Pré-aqueça a solução de lavagem II a 50 °C em banho-maria com a temperatura controlada durante, pelo menos, 20 minutos antes de utilizar. Certifique-se de que o nível de enchimento do banho-maria seja igual ao nível de enchimento da solução de lavagem II.

Tabela 5: Preparação da mistura da solução de lavagem

Número de microplacas PapilloCheck®

Componentes 1 2 3 4

Água purificada 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml

PapilloCheck® Tampão A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml

PapilloCheck® Tampão A 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml

Volume total 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml


!Nunca utilize novamente as soluções de lavagem, pois isto pode originar uma acumulação do produto de lavagem da PCR que possivelmente interfere com os resultados do PapilloCheck®. Utilize soluções de lavagem novas para cada ensaio.A mistura da solução de lavagem preparada pode conservar-se até uma semana à temperatura ambiente. Verifique se ocorreu precipitação de SDS. Caso tenha ocorrido, aqueça a mistura da solução de lavagem até que o precipitado esteja dissolvido e novamente equilibrado à temperatura ambiente. Em seguida, prepare a experiência de hibridização seguinte.

8.3.2 Hibridização

A hibridização tem de ser efetuada à temperatura ambiente entre 20 e 25 °C. Os passos de trabalho principais para a hibridização dos produtos da PCR da reação da PCR PapilloCheck® na microplaca PapilloCheck® são apresentados na Figura 5.

Misture os produtos da PCR antes de utilizar. Centrifugue brevemente.

! Se os produtos da PCR foram conservados a ≤ -20 °C até à hibridização, primeiro descongele os produtos da PCR antes de misturar e, em seguida, continue conforme descrito.

Agite o Tampão de Hibridização no agitador de vórtex antes de utilizar. Centrifugue brevemente.

Transfira 30 µl do Tampão de Hibridização PapilloCheck® para um novo tubo de reação de uma tira para PCR de 8 tubos. Caso seja mais conveniente, também pode ser utilizado um novo poço de uma placa de PCR.

Adicione 5 µl do produto da PCR ao Tampão de Hibridização e misture com o agitador de vórtex ou através de pipetagem várias vezes.

Centrifugue brevemente.

Transfira 25 µl da mistura de hibridização para cada poço da microplaca utilizando os seis canais de uma pipeta multicanal. Evite a formação de bolhas!

Recomenda-se processar seis amostras em paralelo utilizando uma multipipeta de 8 canais e tiras para PCR de 8 tubos (consulte a Figura 5). Isto aumenta a eficiência de manuseamento, a velocidade, reduzindo, assim, o risco de evaporação. Se for necessário processar mais de uma lâmina de uma vez, é obrigatória a utilização de uma multipipeta para se conseguir um tempo de hibridização correto.

! Evite a formação de bolhas!

Se possível, hibridize todos os 12 poços de uma microplaca. Caso se processem menos de 12 amostras, deixe vazios os poços não utilizados. Os poços não utilizados numa microplaca processada não podem ser utilizados para amostras no futuro.

! Manuseie a microplaca cuidadosamente para evitar derramar a mistura de hibridização. O derrame pode originar contaminação cruzada das amostras e resultados falso positivos.

Incube a microplaca durante exatamente 15 minutos à temperatura ambiente entre 20 e 25 °C dentro da Câmara de Hibridização preparada numa atmosfera escura saturada de umidade. Tenha cuidado para não mover a Câmara de Hibridização durante a processo.


!Nunca altere o tempo ou a temperatura de incubação da reação de hibridização, pois isso pode ocasionar a perda de intensidade do sinal fluorescente ou um aumento da fluorescência não específica.

Não exponha as microplacas hibridadas à luz solar direta.

Prepare uma atmosfera saturada de umidade na Câmara de Hibridização.

Incube a quantidade necessária de microplacas PapilloCheck® na Câmara de Hibridização preparada à temperatura ambiente (consulte o capítulo 8.3.1).

Misture 30 µl do Tampão de Hibridização PapilloCheck® num tubo de reação de 0,2 ml de uma tira para PCR com 5 µl do produto da PCR. Misture cuidadosamente.

Transfira 25 µl da mistura de hibridização para cada poço da microplaca PapilloCheck® utilizando uma pipeta multicanal.

Feche a Câmara de Hibridização e incube a microplaca PapilloCheck® durante exatamente 15 minutos à temperatura ambiente entre 20 e 25 °C.

Figura 5: Passos de trabalho do processo de hibridização


8.3.3 Lavagem e secagem

O kit especial fornecido pela Greiner Bio-One permite a lavagem paralela de até quatro microplacas PapilloCheck® (consulte o capítulo 2). O kit adicional necessário para o processamento das microplacas PapilloCheck® inclui três caixas de lavagem oCheck® e uma pega para o suporte magnético de lâminas da Câmara de hibridizadas.

Os diferentes passos de trabalho são mostrados na Figura 6.

Retire cuidadosamente o suporte magnético de lâminas que contém as lâminas hibridadas da Câmara de Hibridização.

Coloque o suporte de lâminas diretamente na caixa de lavagem oCheck® que contém a solução de lavagem I. Certifique-se de que o lado magnético fica virado para cima.

Fixe a Pega oCheck® no suporte de lâminas e dê início ao primeiro dos três passos de lavagem.

Lave a microplaca à temperatura ambiente na solução de lavagem I movimentando-a rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos. Os arrays devem permanecer sempre cobertos com solução de lavagem.

Lave a microplaca durante 60 segundos na solução de lavagem II a 50 °C, movimentando vigorosamente para cima e para baixo o suporte de lâminas.

Lave a microplaca à temperatura ambiente na solução de lavagem III movimentando-a rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos.

Retire imediatamente qualquer líquido da superfície da microplaca através de centrifugação. Se utilizar uma microcentrifugadora especial para microarrays, centrifugue durante 1 minuto. Se utilizar uma centrifugadora aplicável aos tubos de 50 ml, coloque cada microplaca PapilloCheck® lavada num tubo de 50 ml e centrifugue à temperatura ambiente durante 3 minutos a 500 x g.

A microplaca PapilloCheck® está, então, pronta para escaneamento e deve ser esceneada de imediato. Para a limpeza das caixas de lavagem oCheck®, enxague várias vezes com água após cada processo de lavagem e secagem para conduir.


Primeiro passo da lavagem Retire cuidadosamente o suporte magnético

de lâminas da Câmara de Hibridização.

Coloque rapidamente o suporte de lâminas na caixa de lavagem oCheck® com solução de lavagem I

Fixe a pega oCheck®

Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem I à temperatura ambiente durante 10 segundos movimentando para cima e para baixo o suporte de lâminas

Segundo passo da lavagem Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em

solução de lavagem II em banho-maria a 50 °C durante 60 segundos movimentando para cima e para baixo o suporte de lâminas.

Terceiro passo da lavagem Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck®

em solução de lavagem III à temperatura ambiente durante 10 segundos movimentando para cima e para baixo o suporte de lâminas

Secagem Retire imediatamente qualquer líquido da

superfície das microplacas PapilloCheck® através de centrifugação

3 minutos500 g

1 minutovelocidade

máx.

ou

Figura 6: Passos de trabalho do processo de lavagemDiferentes passos de lavagem e processo de secagem antes da análise da microplaca PapilloCheck® com o CheckScanner™ e o CheckReport™Software.


8.4 Escaneamento e avaliação da microplaca PapilloCheck®

Coloque a(s) microplaca(s) PapilloCheck® no CheckScanner™ e continue com o escaneamento conforme descrito em detalhe no Guia do Usuário do CheckReport™Software.

Para informações mais detalhadas sobre a instalação do CheckScanner™ e do CheckReport™Software, bem como os requisitos de sistema do computador, consulte as Instruções de uso correspondentes do CheckScanner™ e do CheckReport™Software.

Sempre que analisar dados utilizando o CheckReport™Software, certifique-se de que a versão do CheckReport™Software instalada no seu computador corresponde à versão indicada no kit PapilloCheck® utilizado atualmente. Se as versões não corresponderem, atualize o CheckReport™Software. A versão mais recente do Software pode ser baixada a partir do site da Internet Greiner Bio-One:www.gbo.com Know-How & Services Download-Center



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



33

9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS

Se ocorrer uma das mensagens de erro seguintes durante o escaneamento da microplaca ou se a análise PapilloCheck® falhar devido a controles específicos na microplaca, continue conforme descrito abaixo. Não hesite em contatar o seu distribuidor local Greiner Bio-One se tiver dúvidas ou dificuldades durante a utilização do PapilloCheck®.

Para a resolução de problemas com outros passos do ensaio como, por exemplo, extração de DNA, consulte as respetivas Instruções de Utilização.

PROBLEMA e causa Comentários e sugestões

MENSAGEM DE ERRO "COULD NOT READ BARCODE" (NÃO FOI POSSÍVEL LER O CÓDIGO DE BARRAS)

Código de barras danificado Verifique se o código de barras está danificado. Introduza o código de barras manualmente quando aparecer a janela apropriada.

A microplaca não foi carregada corretamente

Verifique a orientação da microplaca e faça o escaneamento da microplaca na orientação correta.

MENSAGEM DE ERRO "MISSING SPOTS" (COLORAÇÕES EM FALTA), Controle DA IMPRESSÃO FALHOU OU Controle DA ORIENTAÇÃO FALHOU

Poeira na microplaca Repita a hibridização do(s) produto(s) da PCR noutra microplaca.

Formação de bolhas de ar durante a transferência de líquido na microplaca

Repita a hibridização do(s) produto(s) da PCR noutra microplaca. Pipete cuidadosamente para evitar a formação de bolhas.

Controle DE Hibridização FALHOU

Temperatura incorreta da solução de lavagem II

O segundo passo da lavagem tem de ser realizado a 50 °C. Certifique-se de que a solução de lavagem II seja aquecida a 50 °C.

Temperatura incorreta do banho-maria

O segundo passo da lavagem tem de ser realizado a 50 °C. Verifique a temperatura do banho-maria. Certifique-se de que a temperatura do banho-maria esteja a 50 °C. Se necessário, comprove a temperatura com um termômetro.

Preparação errada da mistura de hibridização

Repita a preparação da mistura de hibridização com os volumes corretos e hibridize os produtos da PCR noutra microplaca.



4 °C

8 °C

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465 060505 060



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PROBLEMA e causa Comentários e sugestões

CONTROLE DA PCR FALHOU

Não existe adição da Polimerase do DNA HotStarTaq® ao PapilloCheck® PCR MasterMix

Repita a análise PapilloCheck® começando a preparação da reação da PCR.

Adição de uma Polimerase do DNA HotStarTaq® que não funciona corretamente ao PapilloCheck® PCR MasterMix


Adição da Uracilo-N-Glicosilase não diluída ao PapilloCheck® PCR MasterMix


Mastermix final não foi misturada o suficiente

Repita a análise PapilloCheck® começando a reação da PCR. Tenha cuidado para misturar cuidadosamente a mistura de reação.

Inibidores da PCR presentes na amostra

Repita a extração de DNA e a análise PapilloCheck®.

Hibridização executada sem adição de produto da PCR

Repita a hibridização.

Mistura de hibridização final não foi misturada o suficiente

Repita a hibridização.

Problemas com o cicladortérmico

Utilize apenas cicladores térmicos validados em combinação com o PapilloCheck®.

Controle DA AMOSTRA FALHOU

Não existe adição de DNA da amostra à mastermix final

Repita a análise PapilloCheck® começando a reação da PCR.

Preparação do DNA falhou Repita a extração do DNA.

Não existe material suficiente da amostra

A coleta da amostra falhou. A amostra é muito clara. Concentre a amostra de acordo com a descrição do capítulo 8.1 e repita a extração de DNA ou repita a coleta da amostra.

PCR E/OU CONTROLES DA AMOSTRA NÃO FALHARAM MAS EXIBEM UM VALOR DE RELAÇÃO SINAL/RUÍDO DE 0

Este resultado é classificado como válido se o CheckReport™Software detectar pelo menos um tipo de HPV na amostra com um sinal acima de um limite definido. A amostra e/ou o controle da PCR podem então mostrar sinais fluorescentes baixos ou mesmo ausentes devido a competição durante a PCR.

10. ASSISTÊNCIA TÉCNICA

Se tiver dúvidas, ou dificuldades relativamente aos produtos da Greiner Bio-One, não hesite em contatar o seu distribuidor local Greiner Bio-One ou o departamento de assistência técnica [email protected], composto por cientistas experientes com ampla prática e experiência teórica em biologia molecular.



4 °C

8 °C

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35

11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO DO PAPILLOCHECK®

11.1 Desempenho analítico do PapilloCheck®

11.1.1 Sensibilidade analítica

Para avaliar a sensibilidade analítica, o limite de detecção (LoD95 = número mais pequeno de cópias de DNA-alvo que pode ser detectado em 95% dos casos) foi estabelecido utilizando plasmídeos de referência para cada tipo de HPV detectável que contém a região E1 visada pelo PapilloCheck®. Para a análise do genótipo do HPV, plasmídeos específicos foram reforçados no meio de transporte, incluindo células de uma linha celular humana (células HEK) como fundo. Foi extraído DNA de cada amostra e posteriormente analisado com o Kit PapilloCheck®. O LoD95 foi calculado para cada genótipo do HPV individualmente utilizando 2 séries de diluição independentes e análise Probit. O LoD95 definido foi verificado com uma terceira série de diluição para cada genótipo do HPV. Os limites de deteção para os diferentes genótipos do HPV são resumidos na Table 6.

Tabela 6: Sensibilidade analítica do PapilloCheck®

Genótipo do HPV*

Limite de Deteção (LoD95) para o PapilloCheck®

[cópias/PCR]**

Limite de Deteção (LoD95) para o PapilloCheck®

[cópias/extração]***

HPV 6 30 600

HPV 11 20 400

HPV 16 10 200

HPV 18 320 6400

HPV 31 50 1000

HPV 33 90 1800

HPV 35 190 3800

HPV 39 50 1000

HPV 40 20 400

HPV 42 50 1000

HPV 43 30 600

HPV 44 20 400

HPV 45 90 1800

HPV 51 20 400

HPV 52 70 1400

HPV 53 60 1200

HPV 55 20 400

HPV 56 50 1000

HPV 58 160 3200

HPV 59 290 5800

HPV 66 40 800

HPV 68 30 600

HPV 70 30 600

HPV 73 2250 45000

HPV 82 40 800

* Plasmídeo específico do genótipo do HPV com 104 células HEK humanas como fundo em PreservCyt™ (Hologic). ** LoD95 por reação da PCR calculado a partir do LoD95 por extração (consulte ***)*** LoD95 com base na análise probit, incluindo o sistema de Extração de DNA oCheck® recomendado da Greiner Bio-One



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



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11.1.2 Especificidade analítica – tipos de HPV

O PapilloCheck® foi testado relativamente à especificidade analítica utilizando os plasmídeos de referência específicos do genótipo do HPV. Os seguintes genótipos do HPV foram testados com 105 cópias/reação da PCR:

HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 71, HPV 73, HPV 81, HPV 82, HPV 84, HPV 85.

Detectaram-se as hibridações cruzadas seguintes:

O HPV 55 dá um sinal na sonda do HPV 44. Por conseguinte, o CheckReport™Software exibe um resultado combinado para HPV 44/HPV 55. O HPV 13 pode reagir de forma cruzada com a sonda do HPV 11, mas não resulta num sinal falso positivo pois o HPV 13 não está presente nas amostras cervicais.

11.1.3 Especificidade analítica – Organismos não HPV

O PapilloCheck® foi testado relativamente à especificidade analítica utilizando o seguinte organismo não HPV (1 ng de DNA genómico/reação da PCR):

Bacteroides ureolyticus, Bacteroides uniformis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium adolescentis, Chlamydia trachomatis, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterobacter faecium, Enterobacter durans, Enterobacter faecalis, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus micros, Proteus hauseri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Trichomonas vaginalis, Candida albicans

Não foram detectados sinais não específicos com o PapilloCheck®

11.2 Repetibilidade (Intrarreprodutibilidade)

A repetibilidade mede a variação de desempenho entre as diferentes execuções num laboratório. Para avaliar a repetibilidade de ensaio, foi extraído DNA de 4 amostras, cada uma com um modelo de HPV diferente (HPV 16, HPV 18, HPV 31 ou HPV 45) num fundo de células humanas, utilizando o Kit de Extração de DNA oCheck® manual e analisado com o Kit PapilloCheck®. Cada amostra foi analisada em 6 réplicas independentes e em 3 execuções independentes. Por conseguinte, foram testadas 18 réplicas de cada amostra e, no total, 72 amostras por avaliação de repetibilidade. Todas as amostras foram testadas pelo mesmo usuário, com o mesmo kit e respectivos lotes. Além de que a avaliação de repetibilidade descrita foi efetuada em 3 locais de ensaio, pelo que, no total, foram executadas 216 análises. Foi alcançado um acordo de 100% para cada um dos 3 ensaios de repetibilidade (consulte a Tabela 7).

Tabela 7: Resultados dos ensaios de repetibilidade com o PapilloCheck®

Local do Ensaio Concordância

Local do Ensaio 1 100%





4 °C

8 °C

60

465 060505 060



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11.3 Reprodutibilidade

A repetibilidade mede a variação de desempenho entre as diferentes execuções em diferentes laboratórios. Para avaliar a repetibilidade de ensaio, mais uma vez, foi extraído DNA de 4 amostras, cada uma com um modelo de HPV diferente (HPV 16, HPV 18, HPV 31 ou HPV 45) num fundo de células humanas, utilizando o Kit de Extração de DNA oCheck® manual e analisado com o Kit PapilloCheck®. O processo foi executado em paralelo em 3 locais de ensaio diferentes. Cada amostra foi analisada em 6 réplicas independentes e 3 execuções independentes em cada local de ensaio. Por conseguinte, foram testadas 18 réplicas de cada amostra e, no total, 72 amostras por local de ensaio. Cada local de ensaio utilizou kit diferente (CheckExtractor™, ciclador PCR, CheckScanner™) e diferentes lotes de kit. No total, foram testadas 216 amostras. Foi alcançado uma concordância de 100% para os resultados dos diferentes locais de ensaio.

11.4 Robustez

Para avaliar a robustez do sistema de ensaio PapilloCheck® consideraram-se variações dos parâmetros seguintes:

• Temperatura de hibridização• Tempo de hibridização• Temperatura de lavagem

Todos os ensaios foram executados em 3 réplicas com elevadas concentrações do modelo (105 cópias/reação da PCR de plasmídeo de referência do HPV) e com uma concentração do modelo próxima do limite de deteção (concentração dependente do genótipo do HPV). Os ensaios foram executados para cada genótipo do HPV detectável com o PapilloCheck®. Os intervalos dos valores dos parâmetros determinados nos quais é possível uma deteção robusta do HPV encontram-se resumidos na Tabela 8.

Tabela 8: Robustez do PapilloCheck®

Parâmetro Intervalo

Temperatura de hibridi-zação

18-25 °C

Tempo de hibridização 13 a 17 minutos

Temperatura de lavagem 48-52 °C



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



38

11.5 Desempenho Clínico do PapilloCheck®

Para determinar o desempenho clínico do ensaio PapilloCheck® e PapilloCheck® high-risk em termos de sensibilidade e especificidade clínicas, realizou-se um estudo comparativo utilizando o PapilloCheck® e o ensaio GP5+/6+-PCR EIA12. Para este estudo, analisaram-se amostras de 1437 mulheres representativas com citologia normal (grupo de controle) com mais de 40 anos de idade (idade média, 49 anos; faixa etária dos 40 aos 60 anos) e 192 mulheres representativas (idade média, 34 anos; faixa etária dos 30 aos 60 anos) com lesões CIN3+ histologicamente confirmadas (grupo de casos). Todas as amostras utilizadas neste estudo foram colhidas originalmente durante a fase do estabelecimento da linha de base a partir de mulheres no grupo de intervenção do ensaio de implementação com controle aleatório baseado na população, POBASCAM13.

Após restringir a análise PapilloCheck® aos 14 tipos de HPV de alto risco visados pelo GP5+/6+-PCR-EIA e pelo novo PapilloCheck® high-risk, o PapilloCheck® teve uma sensibilidade clínica para ≥ CIN3 de 95,8% (184/192; 95% IC 92,8-98,8) e uma especificidade clínica para ≥ CIN2 de 96,7% (95% IC 95,7-97,7). Em comparação, estes valores foram 96,4 % (185/192; 95 % IC: 93,9-98,9) e 97,7 % (95 % IC: 96,9-98,5), respectivamente, para GP5+6+-PCR-EIA (consulte a Tabela 9 e 10).

Tabela 9: Comparação dos resultados de PapilloCheck® (14 tipos de HPV de alto risco visados pelo PapilloCheck® high-risk) e GP5+/6+ PCR-EIA estratificados para controles e casos.

PapilloCheck®

(14 tipos de HPV de alto risco)

GP5+/6+-PCR/EIA Total

- + -

Controles -+

total

1386 (96,5%)18 (1,3 %)

1404 (97,7 %)

4 (0,3 %)29 (2,0 %)36 (2,3 %)

1390 (96,7 %)47 (3,3 %)

1437

Casos -+

total

4 (2,1 %)3 (1,6 %)7 (3,6 %)

4 (2,1 %)181 (94,3 %)185 (96,4 %)

8 (4,2 %)184 (95,8 %)

192

Tabela 10: Sensibilidade e especificidade clínicas de PapilloCheck® e GP5+/6+-PCR-EIA (resultados para um ou mais dos 14 tipos de HPV de alto risco: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 ou 68).

14 HPV de alto risco PapilloCheck® GP5+/6+

Sensibilidade Clínica para ≥ CIN3 95,8 % 96,4 %

Especificidade Clínica para ≥ CIN2 96,7 % 97,7 %

12 Comparison of the clinical performance of PapilloCheck® human papillomavirus detection with that of the GP5+/6+-PCR-enzyme immunoassay in population-based cervical screening. Hesselink AT, Heideman DA, Berkhof J, Topal F, PolRP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol. março de 2010; 48(3):797-801. Epub 30 de dezembro de 2009.

13 Bulkmans, N. W., L. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, A. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R.H. Verheijen, K. Groningen, M. E. Boon, H. J. Keuning, M. van Ballegooijen, A. J. van den Brule e C. J. Meijer. 2004. POBASCAM, a population-based randomized controlled trial for implementation of high-risk HPV testing in cervical screening: design, methods and baseline data of 44,102 women. Int. J. Cancer 110:94–101.



4 °C

8 °C

60

465 060505 060



39

Para avaliar a reprodutibilidade do ensaio PapilloCheck® com amostras clínicas, foi realizado um estudo em 2012 nos Países Baixos e na Alemanha. No estudo foram utilizadas amostras cervicais obtidas de uma coorte de 10 000 mulheres que participaram em rastreios regulares de citologia cervical na província de Utrecht dos Países Baixos. Utilizando um conjunto definido de 550 amostras pré-testadas, o PapilloCheck® mostrou uma reprodutibilidade intralaboratorial e um acordo interlaboratorial de 97,6% e 94%, respectivamente. Os conjuntos de dados da avaliação de reprodutibilidade foram resumidos nas Tabelas 11 e 12.

Tabela 11: Reprodutibilidade Intralaboratorial

PapilloCheck® 1.ª vez pos.PapilloCheck® 1.ª vez

neg.

PapilloCheck® 2.ª vez pos. 147 6

PapilloCheck® 2.ª vez neg. 7 390

Resultados:Reprodutibilidade [%]: 97,3Intervalo de confiança inferior [%] = 96,3Kappa = 0,941

Tabela 12: Acordo Interlaboratorial

PapilloCheck® 1.ª vez pos.PapilloCheck® 1.ª vez

neg.

PapilloCheck® 2.ª vez pos. 123 2

PapilloCheck® 2.ª vez neg. 31 394

Resultados:Reprodutibilidade [%]: 94Intervalo de confiança inferior [%] = 92,1Kappa = 0,842


40

P R O T O C O L O C U R T O

PapilloCheck® e PapilloCheck® high-risk - Instruções de usoRevisão: BQ-013-09/Março de 2016

12. PROTOCOLO CURTO PAPILLOCHECK®

12.1 Sala 2: PCR - Preparação da mistura de reação

Dilua a Uracilo-N-Glicosilase 1:200 em água de grau PCR

Misture cuidadosamente a diluição da UNG

Prepare a mastermix final para a quantidade necessária de reações da PCR

1reação

13reações(1 micro-

placa)

26reações(2 micro-placas)



PapilloCheck®

PCR MasterMix19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl

Polimerase HotStar Taq® (5 U/µl)

0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl

Uracilo-N-Glicosilase(Diluição de 1:200, 0,005 U/µl)

1 µl 13 µl 26 µl 39 µl 52 µl

Volume total antes da adição da amostra de DNA

21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl

Misture cuidadosamente a mastermix final

Divida em alíquotas a mastermix final: adicione 21 µl da mistura de reação a cada reação da PCR num tubo de reação da PCR de 0,2 ml de uma tira para PCR.

PCR

Sala 2


41



12.2 Sala 2: PCR - Adição do modelo DNA/ reação da PCR

Adicione 5 µl do modelo de DNA a cada reação da PCR.

Misture cuidadosamente.

Inicie a reação da PCR com o programa do termociclador preparado.

Tempo Temp. °C Nº de ciclos

20 min 37 °C 1

15 min 95 °C 1

30 s25 s45 s

95 °C55 °C72 °C

40

30 s45 s

95 °C72 °C

15

Pausa 10 °C

PCR

Sala 2


42



12.3 Sala 3: Hibridização - Preparação/ Reação de hibridização

! Inicie os preparativos pelo menos 30 minutos antes da hibridização.

Dissolva os potenciais precipitados na hibridização e nos tampões de lavagem e misture bem

Prepare a mistura da solução de lavagem para a quantidade de microplacas PapilloCheck® que vão ser analisadas.

Número de microplacas PapilloCheck®

Componentes 1 2 3 4

Água destilada/desionizada

140 ml 280 ml 420 ml 560 ml

PapilloCheck® Tampão A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml

PapilloCheck® Tampão B 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml

Volume total 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml

Divida em alíquotas a mistura da solução de lavagem em três caixas de lavagem oCheck®

Pré-aqueça a solução de lavagem II em banho-maria a 50 °C

Incube a quantidade de microplacas PapilloCheck® que vão ser analisadas numa Câmara de Hibridização preparada à temperatura ambiente

Misture os produtos da PCR e centrifugue brevemente

Misture o Tampão de Hibridização e centrifugue brevemente

Misture 30 µl de Tampão de Hibridização PapilloCheck® com 5 µl de produto da PCR

Misture cuidadosamente e centrifugue brevemente

Transfira 25 µl da mistura de hibridização para cada poço da microplaca PapilloCheck® utilizando uma pipeta multicanal

Evite a formação de bolhas

Incube a microplaca PapilloCheck® durante exatamente 15 minutos à temperatura ambiente de 20 a 25 °C

Hibrid. e Lavagem

Sala 3


43



12.4 Sala 3: Lavagem e secagem/ Escaneamento e avaliação

Retire o suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridização

Coloque o suporte de lâminas na caixa de lavagem oCheck® com solução de lavagem I

Fixe a pega oCheck®

Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem I à temperatura ambiente durante 10 segundos

Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem II pré-aquecida em banho-maria a 50 °C durante 60 segundos

Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem III à temperatura ambiente durante 10 segundos

Retire qualquer líquido da superfície da microplaca PapilloCheck® através de centrifugação

3 minutos500 g

1 minutovelocidade

máx.

ou

Faça o escaneamento da(s) microplaca(s) PapilloCheck® com o CheckScanner™

Faça o escaneamento e a análise conforme descrito no Guia do Usuário do CheckReportTMSoftware

Gere relatórios

Hibrid. e Lavagem

Sala 3

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PapilloCheck high-risk - Greiner Bio-One · Greiner Bio-One GmbH Maybachstr. 2 72636 Frickenhausen Alemanha 4 °C 8 °C 60 ... Adição do modelo DNA/reação da PCR ..... 41 12.3